Vyhláška o veterinárních požadavcích na živočichy pocházející z akvakultury a produkty akvakultury, produkty rybolovu a živé mlže a o veterinárních podmínkách jejich dovozu ze třetích zemí

Diagnostické postupy k potvrzení VHS a IHN při podezření na výskyt nákazyČÁST II

Pro diagnózu IHN a VHS je nezbytné provést jeden nebo několik z následujících postupů:

1. - A. konvenční izolace viru s následnou sérologickou identifikací viru,
2. - B. izolace viru se simultánní sérologickou identifikací viru,
3. - C. další diagnostické metody (IFAT, ELISA).

Potvrzení prvního výskytu VHS a/nebo IHN v hospodářstvích ve schválených oblastech nesmí být založeno výhradně na metodě C. Musí být použita též metoda A nebo B.

K tkáňovému materiálu určenému pro virologické vyšetření může být v některých případech nutné připojit doplňkový materiál pro bakteriologické, parazitologické, histologické nebo jiné vyšetření, aby mohla být provedena diferenciální diagnóza.

1. A. Konvenční izolace viru s následnou sérologickou identifikací viru
   1. I.1 Odběr vzorků

      K vyšetření je nutno vybrat minimálně deset ryb s typickými příznaky onemocnění IHN, popř. VHS.

   1. I.2 Příprava a způsob balení vzorků z ryb

      Viz část I odd. I. odst. 3

   1. I.3 Odběr doplňkového diagnostického materiálu

      Viz část I odd. I. odst. 4.

   1. II. Příprava vzorků pro virologické vyšetření

      Viz část I odd. II.

   1. III. Virologické vyšetření

      Viz část I odd. III.

   1. IV. Identifikace viru

      Viz část I odd. IV.

1. B. Izolace viru se simultánní sérologickou identifikací viru
   1. I.1 Odběr vzorků

      Viz část II kap. A. odd. I. odst. 1.

   1. I.2 Příprava a způsob balení vzorků z ryb

      Viz část I odd. I. odst. 3.

   1. I.3 Odběr doplňkového diagnostického materiálu

      Viz část I odd. I. odst. 4.

   1. II.1 Homogenizace orgánů

      Viz část I odd. II.odst. 2.

   1. II.2 Odstřeďováníní homogenátu

      Homogenát se odstřeďuje v odstředivce chlazené na 2 až 5°C při 2000 až 4000x g po dobu 15 minut. Supernatant se odebírá a ošetřuje čtyři hodiny při 15°C antibiotiky (např. gentamycinem v dávce 1 mg/ml) nebo filtruje na membráně s nízkou schopností vázat proteiny a velikostí pórů 0,45 μm.

   1. II.3 Ošetření supernatantu diagnostickými antiséry

      Antibiotiky ošetřená či membránou filtrovaná suspenze orgánů je zředěna médiem buněčné kultury v poměru 1:10 a 1:1000 a inkubována 60 minut při 15°C se stejnými podíly reagencií, jaké jsou vyjmenovány v části I odd. IV. odst. 2.

   1. III.1 Buněčné kultury a média

      Viz část I odd. III. odst. 1.

   1. III.2 Inokulace buněčných kultur

      Z každé směsi viru se sérem (připravené podle části II kap. B. odd. II. odst. 3) jsou inokulovány minimálně dvě buněčné kultury od každé buněčné linie dávkami 50 μl.

   1. III.3 Inkubace buněčných kultur

      Viz část I odd. III. odst. 1.

   1. III.4 Mikroskopické vyšetření

      Inokulované buněčné kultury se denně prohlížejí při zvětšení 40× až 150×, aby byl zjištěn výskyt cytopatického efektu (CPE). Jestliže jedno z použitých antisér zabrání vzniku CPE, může být virus považován za prokázaný.

      Jestliže ani jedno z použitých antisér nezabrání vzniku CPE, je nutno uplatnit identifikační metody podle části I odd. IV.

   1. III.5 Subkultivace

      Jestliže po sedmi až deseti dnech nevznikne žádný CPE, musí být provedena subkultivace z kultur inokulovaných supernatantem s přídavkem média (viz část II kap. B. odd. II. odst. 3) podle části I odd. III. odst. 5.

1. C. Jiné diagnostické postupy

   Supernatant připravený podle postupu uvedeného v části I odd. II. odst. 2 může být vyšetřen metodou IFAT podle části I odd. IV. odst. 3 popřípadě metodou ELISA podle části I odd. IV. odst. 4. Tyto rychlé vyšetřovací metody musí být doplněny virologickým vyšetřením podle bodu A nebo B do 48 hodin po odběru vzorku, jestliže

   1. a) je výsledek vyšetření negativní,
      1. nebo
   1. b) je výsledek vyšetření pozitivní u materiálu, představujícího první případ vypuknutí IHN nebo VHS ve schválené oblasti.

   Tkáňový materiál může být vyšetřen dalšími diagnostickými metodami (např. RT-PCR, IF v kryokatových řezech materiálu nebo imunohistochemickým vyšetřením materiálu fixovaného formalínem). Tyto postupy musí být vždy doplněny inokulací nefixovaného tkáňového materiálu do buněčných kultur.

Důkaz nepřítomnosti VHS a/nebo IHN v oblastech či hospodářstvích v neschválených oblastechČÁST III

Zásady a kritéria pro úřední program veterinární kontroly

1. 1. Program veterinární kontroly může být iniciován
   1. - buď podle úředně uznaného programu eradikace nákaz virem VHS a/nebo IHN včetně odstranění všech ryb v hospodářství, čištění, dezinfekce a uchování v tomto stavu před znovuoživením rybami ze schválených hospodářství, nebo
   2. - v hospodářstvích s chovem ryb, v nichž se ještě nevyskytla žádná infekce virem VHS nebo IHN.

1. 2. Program veterinární kontroly se musí opírat o klinická a laboratorní vyšetření.
2. 3. Program musí zahrnovat dvě klinická veterinární vyšetření ročně podle směrnic v části I.
3. 4. U minimálně jednoho vyšetření prováděného každoročně je nutno v každém hospodářství odebrat 30 vzorků rybích tkání a/nebo ovariální tekutiny. Vzorky je nutno odebrat, připravit a podrobit laboratornímu vyšetření podle částí I, II a IV.
4. 5. Program veterinární kontroly je nezbytné provádět minimálně čtyři roky ve všech hospodářstvích oblasti, která má být schválena, nebo v hospodářství v neschválené oblasti, která má být schválena.
5. 6. Aby mohl být na základě tohoto programu hospodářství/oblasti úředně přiznán status schváleného hospodářství / oblasti, nesmějí se vyskytnout ani nesmí být zjištěny žádné případy VHS nebo IHN (nesmí dojít ani ke klinické infekci, ani být izolovány viry).

Postup titrace pro ověření vnímavosti buněčných kultur k infekcímČÁST IV

Doporučené postupy pro titraci podle části I odd. III. odst. 3:

Je nutno použít nejméně dva izoláty viru VHS a jeden izolát viru IHN. Izoláty by měly reprezentovat nejdůležitější skupinu virů v EU. Např. v případě viru VHS je nutno vybrat jeden patogenní izolát viru, který se vyskytuje u pstruha duhového žijícího ve sladké vodě a jeden patogenní izolát viru, který se vyskytuje u kambaly velké žijící ve slané vodě, a v případě viru IHN je nutno vybrat jeden patogenní evropský kmen viru z pstruha duhového. Měly by být použity definované izoláty pocházející z členských států. Referenční laboratoř Společenství pro nákazy ryb může dát k dispozici referenční izoláty.

Šarže virů se získávají z několika málo pasáží buněčných kultur (buněčné linie BF-2 nebo RTG-2 v případě viru VHS a buněčné linie EPC nebo FHM v případě viru IHN), které jsou kultivovány v kultivačních lahvích pro buněčné kultury. Je nutno použít médium buněčných kultur s minimálně 10 % séra. Pro inokulaci použijte nízký poměr infekčních virových partikulí k počtu buněk v kultuře (< 1).

Pokud je CPE úplný, virus se získává odstřeďováním supernatantu buněčné kultury při 2000× g po dobu 15 min., filtruje se na membráně (0,45 μm) za sterilních podmínek a distribuuje se v označených zkumavkách, které je možno použít pro zmrazování. Virus se uchovává při teplotě – 80⁰ C.

Týden po zmražení se tři zkumavky s každým virem nechají rozmrazit ve studené vodě a suspenze viru se titrují a kontrolují se příslušné buněčné linie. Při podezření na sníženou vnímavost buněčných linií se každý izolát viru nechává roztát a titruje se minimálně každých šest měsíců.

Postupy titrace je nutno podrobně popsat a pokaždé provést stejným způsobem.

Titrace se zředěním až do konečného bodu by měla zahrnovat minimálně šest opakování každého kroku ředění. Výsledky dosažené touto titrační metodou se srovnají s titry předtím získanými. Pokud poklesne titr jednoho ze tří izolátů viru o faktor 2 log nebo více ve srovnání s původním titrem, neměla by buněčná linie již být použita pro výzkumné účely.

Pokud se v laboratoři používají různé buněčné linie, měla by být každá z nich vyšetřována zvlášť.

Záznamy je nutno archivovat minimálně deset let.

Akronymy a zkratkyČÁST V