Platné znění

Vyhláška, kterou se stanoví základní metody pro zkoušení toxicity chemických látek a chemických přípravků

vyhlášené znění

  1. 1 METODA je v souladu s právem Evropských společenství.2)
    1. 1.1 Princip metody
      1. 1.1.1 Výchozí úvahy

        Je třeba pečlivé zvážit všechny dostupné informace o dané látce s cílem snížit na minimum testování látky. Přihlíží se k následujícím informacím.

        1. a) Fyzikálně-chemické vlastnosti a chemická reaktivita. Např. silně kyselé nebo zásadité látky, které - jak je možno očekávat - vyvolají v oku pH rovné či menší 2 nebo pH rovné či větší 11,5, není třeba testovat, pokud lze očekávat závažná poškození. Je třeba vzít v úvahu také alkalickou nebo kyselou rezervu.
        2. b) Výsledky spolehlivě validizovaných alternativních studií; látky s prokázanými potenciálně leptavými nebo silně dráždivými vlastnostmi nemají být dále testovány na dráždivost pro oko, protože lze předpokládat, že tyto látky budou mít závažné účinky na oko při testování touto metodou.
        3. c) Výsledky ze studií kožní dráždivosti. Látky, které vykazovaly zřejmé leptavé nebo výrazně dráždivé účinky na kůži ve studii kožní dráždivosti, není třeba dále testovat na dráždivost pro oko, protože lze předpokládat že budou mít na oči závažné účinky.

        Testovaná látka se v jednorázové dávce aplikuje do jednoho oka několika pokusným zvířatům, přitom neexponované oko slouží jako kontrola. Ve stanovených intervalech se odečte a vyhodnotí stupeň podráždění a reakce se dále popíše, aby bylo možno provést úplné posouzení účinku. Doba pozorování musí být dostatečně dlouhá, aby bylo možné jednoznačně zhodnotit také vratnost nebo nevratnost pozorovaných účinků.

        Zvířata se závažnými a přetrvávajícími příznaky utrpení a bolesti je třeba humánním způsobem utratit.

    1. 1.2 Popis metody
      1. 1.2.1 Příprava

        24 hodin před testem se u každého z předběžně vybraných pokusných zvířat provede vyšetření obou očí. Zvířata, u kterých se zjistí podráždění očí, oční defekt nebo poškození rohovky se z experimentu vyloučí.

      1. 1.2.2 Experimentální podmínky
        1. 1.2.2.1 Pokusná zvířata

          Ačkoliv se používají různé druhy pokusných zvířat, doporučuje se dávat přednost zdravému dospělému albinotickému králíkovi.

        1. 1.2.2.2 Počet zvířat

          Jestliže se očekávají výrazné účinky, je třeba zvolit test na jediném zvířeti. Jestliže výsledky tohoto testu na jednom králíkovi naznačují, že látka má výrazně dráždivé (reversibilní účinek) nebo leptavé (ireversibilní účinek) účinky pro oko při použití popsaného postupu, není třeba další testování oční dráždivosti u dalších zvířat. K vyšetření specifických aspektů mohou být případně testována další zvířata.

          V ostatních případech je třeba použít nejméně tří zvířat. Vyjasnění nejednoznačných nálezů může vyžadovat použití dalších zvířat.

        1. 1.2.2.3 Úroveň dávek

          Při testování kapalin se používá dávka 0,1 ml. U tuhých látek, past a zrnitých látek je třeba použít objem 0,1 ml nebo hmotnost cca 0,1 g (hmotnost je vždy třeba uvést). Jedná-li se o tuhou nebo hrubě zrnitou látku, je třeba ji rozemlít na jemný prášek. Objem homogenní látky se stanoví až po opatrném zhutnění, např. poklepáváním na měrnou nádobku.

          U látek uzavřených ve sprejích s pumpou nebo tlakových aerosolových nádobkách je třeba vystříknout a sebrat 0,1 ml látky a instilovat ji do oka podle popisu pro kapaliny.

        1. 1.2.2.4 Doba pozorování

          Délku doby pozorování není možno stanovit rigorózně. Musí být tak dlouhá, aby bylo možno posoudit vratnost nebo nevratnost pozorovaných účinků. Normálně však stačí 21 dnů po aplikaci studované látky.

      1. 1.2.3 Popis postupu

        Zvířata je třeba přechovávat jednotlivě v klecích. Testovaná látka se aplikuje každému zvířeti do spojivkového vaku jednoho oka tak, že se spodní víčko lehce odchlípne od oční bulvy. Víčka se pak asi na 1 sekundu lehce k sobě přidrží, aby se žádná látka neztratila. Druhé oko, na které se látka neaplikuje, slouží jako kontrolní.

        Jestliže se předpokládá, že látka může vyvolat přílišnou bolest, lze před instilací testované látky použít lokální anestetikum. Aby bylo zajištěno, že následkem anestetika nedojde k významným změnám v reakci na testovanou látku, je třeba pečlivě zvolit typ, koncentraci a dobu aplikace lokálního anestetika. Stejným způsobem se musí anestezovat i kontrolní oko.

        Oči pokusných zvířat je možno vymývat nejdříve 24 hodiny po aplikaci testované látky. Po 24 hodinách je možno oči znovu vypláchnout.

        U některých látek, které při této testovací metodě vyvolají podráždění, je možno provést další zkoušky s použitím králíků, kterým se brzy po instilaci látky vymyjí oči. V těchto případech se doporučuje použít 3 králíky. Půl minuty po instilaci se oči vymývají rovněž po půl minuty s použitím takového objemu kapaliny a rychlosti průtoku, aby nedošlo k poškození.

        1. 1.2.3.1 Pozorování a vyhodnocení

          Oči se vyšetřují po 1, 24, 48 a 72 hodinách. Neprojevují-li se po 72 hodinách žádné příznaky očních lézí, je možno zkoušku ukončit. Dobu pozorování je třeba prodloužit, pokud přetrvává postižení rohovky nebo jiné příznaky podráždění oka tak, aby bylo možno posoudit vývoj změn a jejich vratnost či nevratnost. Vedle pozorování na rohovce, duhovce a spojivce je třeba zaznamenat a uvést ve zprávě i jiné zjištěné léze.

          Intenzitu reakce oka je třeba při každém vyšetření stanovit podle stupnice v tabulce č. 7 příloze a zaznamenat.

          Vyšetřování reakcí je možno usnadnit použitím binokulární lupy, ruční štěrbinové lampy, očního mikroskopu nebo jiných vhodných zařízení. Po zaznamenání pozorování po 24 hodinách je možno oči některých nebo všech zvířat vyšetřit mimoto ještě fluoresceinem.

  1. 2 ÚDAJE

    Údaje se sestaví do tabulky. Z ní musí být pro každé pokusné zvíře patrný stupeň podráždění v daném intervalu pozorování. Je třeba uvést popis stupně a charakteru podráždění, přítomnost závažných lézí a všechny mimooční účinky.

  1. 3 PROJEKT POKUSU, PROTOKOL POKUSU A ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA

    V souladu se s příslušnými právními předpisy9) musí být zpracován projekt pokusu a o průběhu pokusu je nutno vést protokol.

    1. Zpráva o průběhu pokusu obsahuje následující informace:
      1. - údaje o zvířatech (druhu, kmen, původ, podmínky chovu, potrava atd.,
      2. - experimentální podmínky (včetně relevantních fyzikálně-chemických vlastností testované látky),
      3. - v tabelární formě výčet dráždivých nebo leptavých účinků pro jednotlivá zvířata při každém pozorování (např. po 1, 24, 48 a 72 hodinách),
      4. - popis všech zjištěných závažných lézí,
      5. - podrobný popis intenzity, charakteru a vratnosti zjištěného podráždění a poleptání, včetně postižené oblasti rohovky,
      6. - popis metody hodnocení pro jednotlivé časové body (1, 24, 48 a 72 hod.), např. štěrbinová lampa, oční mikroskop, fluorescein atd.,
      7. - popis všech zjištěných mimoočních místních účinků.

    Diskuse výsledků.

    Závěry.

    Tabulka č. 7

    Stupnice změn na oku

    Tabulka č. 7 Stupnice změn na oku
    RohovkaHodnota
    Opacita: stupeň zakalení
    (pro vyhodnocení se bere místo s nejvyšším zakalením)
    Bez ulcerací a opacity0
    Roztroušené nebo difúzní oblasti opacity (jiné než lehké zakalení normálního lesku), detaily duhovky jsou jasně viditelné1
    Lehce rozeznatelná průsvitná oblast, detaily duhovky poněkud nejasné2
    Perleťové oblasti, nejsou viditelné žádné detaily duhovky, velikost pupily je stěží rozeznatelná3
    Opakní (neprůhledná) rohovka, duhovka v důsledku opacity nerozeznatelná4
    Spojivky
    Zarudnutí: hodnotí se místo s nejvyšší intenzitou na víčkové nebo bulbární spojivce ve srovnání s kontrolním okem
    Cévní kresba normální0
    Některé cévy jeví zřetelné rozšíření, městnání (hyperémie)1
    Difúzní, karmínová barva, jednotlivé cévy jsou jen obtížně rozeznatelné2
    Difúzní intenzivní červená barva3
    Chemosis: víčka, mžurka
    Bez zduření0
    Jakékoliv zduření přesahující normál (včetně mžurky)1
    Zjevné zduření s částečnou everzí víček2
    Zduření víček s oční štěrbinou uzavřenou asi na polovinu3
    Zduření víček s oční štěrbinou uzavřenou více než na polovinu4
    Duhovka
    Normální0
    Zřetelně prohloubené brázdy, kongesce, zduření, lehká cirkumkorneální hyperémie nebo městnání; jeden z těchto symptomů nebo kombinace různých symptomů; duhovka ještě reaguje na světlo (zpomalená reakce se hodnotí jako pozitivní)1
    Žádná reakce na světlo, krvácení, silná destrukce (jeden nebo všechny symptomy)2

B.6 SENZIBILIZACE KŮŽE

  1. 1 METODA je v souladu s právem Evropských společenství.4)
    1. 1.1 Úvod
      1. Poznámky:

        Citlivost a detekční schopnost testů pro zjišťování látek s potenciálním senzibilizačním účinkem na lidskou kůži jsou považovány za významné pro klasifikační systém toxicity v oblasti veřejného zdravotnictví.

        Neexistuje jediná testovací metoda, která by dostatečně spolehlivě identifikovala všechny látky s potenciálním senzibilizačním účinkem pro lidskou kůži a která by se hodila pro všechny látky.

        Při volbě testu je třeba uvažovat faktory jako např. fyzikální charakteristiky látky, včetně schopnosti průniku kůží.

        Testy na morčatech lze rozdělit na testy s adjuvans, ve kterých je alergický stav potencován rozpuštěním nebo suspendováním testované látky ve Freundově kompletním adjuvans (FCA), a na testy bez adjuvans.

        Testy s adjuvans se zdají být přesnější v predikci pravděpodobného senzibilizačního účinku pro lidskou kůži než metody bez Freundova kompletního adjuvans, a proto se jim dává přednost.

        Maximalizační test na morčatech (Guinea-pig Maximization Test - GPMT) je velmi rozšířený test s adjuvans. Ačkoliv k odhalení schopnosti látky vyvolat senzibilizační reakci existuje několik dalších metod, je GPMT považován za preferovanou techniku s adjuvans.

        U mnoha skupin chemických látek jsou testy bez adjuvans (přednost se dává Buehlerovu testu) považovány za méně citlivé.

        V určitých případech lze zdůvodnit volbu Buehlerova testu s povrchovou aplikací spíše než intradermální injekci používanou v maximizačním testu na morčatech. Pro použití Buehlerova testu je třeba uvést odborné důvody.

        V této metodické kapitole jsou popsány maximalizační test na morčeti (GPMT) a Buehlerův test. Lze použít i jiných metod, pokud jsou spolehlivě validizované a pokud jsou odborné důvody pro jejich použití.

        Pokud skríningový test provedený uznávanou metodou dá pozitivní výsledek, je možno testovanou látku označit jako potenciální senzibilizátor bez dalšího testování na morčatech. Při negativním výsledku je však nutné provést test na morčeti, tak jak je popsán v této metodické kapitole.

    1. 1.2 Definice

      Senzibilizace kůže: (alergická kontaktní dermatitida) je imunologicky zprostředkovaná kožní reakce na látku. U člověka mohou být reakce charakterizované svěděním, zarudnutím kůže, otokem, pupenci, puchýřky, bulami (velkými puchýři) nebo kombinací těchto příznaků. U jiných živočišných druhů se mohou reakce lišit a může být zjištěno pouze zarudnutí nebo otok.

      Indukční expozice: experimentální expozice subjektu testované látce se záměrem navodit stav přecitlivělosti.

      Indukční období: období nejméně jednoho týdne po indukční expozici, v průběhu kterého se může rozvinout stav přecitlivělosti.

      Provokační expozice (challenge): experimentální expozice subjektu dříve vystaveného testované látce po indukčním období pro stanovení, zda subjekt odpoví reakcí přecitlivělosti.

    1. 1.3 Referenční látky

      Citlivost a použité experimentální metody by měla být ověřována každých šest měsíců s použitím látek, o kterých je známo, že mají mírný až středně silný senzibilizační účinek pro kůži.

      U správně provedeného testu se očekává reakce na mírné/střední senzibilátory nejméně 30 % u metody s adjuvans, a nejméně 15 % u metody bez adjuvans.

      1. Přednost se dává následujícím látkám:
        Tabulka č. 7 Stupnice změn na oku B.6 SENZIBILIZACE KŮŽE
        Číslo CASČíslo EINECSchemický názevgenerický /obchodní název
        101-86-0202-983-32-hexyl-3-fenyl-2-propenalalfa-hexylcinnamaldehyd
        149-30-4205-736-82-merkaptobenzothiazolkaptax
        94-09-7202-303-5Ethyl ester kyseliny p-aminobenzoovébenzokain

        Mohou nastat okolnosti, kdy při dostatečném odborném zdůvodnění mohou být použity jiné kontrolní látky splňující výše uvedená kritéria.

    1. 1.4 Princip testovací metody

      Pokusná zvířata jsou nejprve exponována testované látce intradermálními injekcemi případně epidermální aplikací (indukční expozice). Po období 10 až 14 dnů (indukční období), v průběhu kterého se může rozvinout imunitní reakce, jsou zvířata exponována provokační dávce. Rozsah a stupeň kožní reakce na provokační expozici u testovaných zvířat je porovnáván s rozsahem a stupněm reakce u kontrolních zvířat, která podstoupí klamnou expozici v době indukce a je jim aplikována provokační dávka.

    1. 1.5 Popis testovacích metod

      Jestliže je považováno za nezbytné odstranit testovanou látku, provede se to s použitím vody nebo vhodného rozpouštědla tak, aby nebyla narušena vzniklá kožní reakce nebo integrita pokožky.

      1. 1.5.1 Maximalizační test na morčatech (GPMT)
        1. 1.5.1.1 Příprava

          Pokusná zvířata jsou vybrána s ohledem na druh, pohlaví, a stáří v souladu s ustanovením § 15 zvláštního právního předpisu10) a označena tak, aby byla možná identifikace jednotlivých zvířat. Dobu navykání stanoví § 10 zvláštního právního předpisu.10) Před testem se zvířata náhodně rozdělí do expozičních a kontrolních skupin. Odstranění srsti se provede stříháním, holením nebo chemickou depilací, v závislosti na použité testovací metodě. Je třeba dbát na to, aby nedošlo k poškození kůže. Zvířata se zváží před zahájením testu a na konci testu.

        1. 1.5.1.2 Experimentální podmínky

          Pokusná zvířata jsou vybrána s ohledem na druh, pohlaví, a stáří v souladu s ustanovením § 15 zvláštního právního předpisu10) a označena tak, aby byla možná identifikace jednotlivých zvířat. Dobu navykání stanoví § 10 zvláštního právního předpisu.10)

          1. 1.5.1.2.1 Pokusná zvířata

            Používají se běžné laboratorní kmeny albinotických morčat.

          1. 1.5.1.2.2 Počet a pohlaví

            Lze použít samce i samice. Samice musí být nullipary a nesmí být březí. Exponovanou skupinu tvoří nejméně 10 zvířat a nejméně 5 zvířat je třeba v kontrolní skupině. Použije-li se menšího počtu než 20 testovaných a 10 kontrolních morčat a není možné dojít k závěru, že testovaná látka je senzibilizátor, doporučuje se testování na dalších zvířatech, aby se dosáhlo celkového počtu nejméně 20 testovaných a 10 kontrolních zvířat.

          1. 1.5.1.2.3 Dávkové úrovně

            Koncentrace testované látky použitá pro každou indukční expozici se upraví na takovou úroveň, kterou zvířata celkově dobře snášejí a která je nejvyšší působící mírné až střední podráždění kůže. Jako provokační koncentrace se použije maximální koncentrace, která u nesenzibilizovaných zvířat nevyvolává podráždění kůže. V případě potřeby je možno vhodné koncentrace stanovit v předběžném pokusu na dvou nebo třech zvířatech. Pro tento účel lze uvážit použití zvířat, kterým bylo aplikováno FCA.

        1. 1.5.1.3 Popis postupu
          1. 1.5.1.3.1 Indukce

            Den 0 - Testovaná skupina

            1. Následující 3 dvojice subkutánních injekcí, každá po 0,1 ml, se podají do lopatkové oblasti zbavené srsti symetricky podle střední linie:
            Tabulka č. 7 Stupnice změn na oku B.6 SENZIBILIZACE KŮŽE Den 0 - Testovaná skupina
            Injekce 1:Freundovo kompletní adjuvans (FCA) smíšené s vodou nebo fyziologickým roztokem v objemovém poměru 1:1;
            Tabulka č. 7 Stupnice změn na oku B.6 SENZIBILIZACE KŮŽE Den 0 - Testovaná skupina
            Injekce 2:testovaná látka ve vhodném vehikulu ve zvolené koncentraci;
            Tabulka č. 7 Stupnice změn na oku B.6 SENZIBILIZACE KŮŽE Den 0 - Testovaná skupina
            Injekce 3:testovaná látka ve zvolené koncentraci připravená ve směsi FCA s vodou nebo fyziologickým roztokem v objemovém poměru 1 : 1.

            Pro injekci 3 se látky ve vodě rozpustné rozpustí před smísením s FCA ve vodné fázi. Látky rozpustné v lipidech nebo látky nerozpustné se rozptýlí v nezředěném FCA. Konečná koncentrace testované látky pro injekci 3 má být stejná jako pro injekci 2.

            Injekce 1 a 2 se aplikují blízko sebe a co nejblíže hlavě, zatímco injekce 3 směrem ke kaudální části testovací plochy.

            Den 0 - Kontrolní skupina

            1. Následující 3 dvojice subkutánních injekcí, každá po 0,1 ml, se podají do stejných míst jako u testovaných zvířat:
            Tabulka č. 7 Stupnice změn na oku B.6 SENZIBILIZACE KŮŽE Den 0 - Testovaná skupina Den 0 - Kontrolní skupina
            Injekce 1:Freundovo kompletní adjuvans (FCA) smíšené s vodou nebo fyziologickým roztokem v objemovém poměru 1 : 1;
            Tabulka č. 7 Stupnice změn na oku B.6 SENZIBILIZACE KŮŽE Den 0 - Testovaná skupina Den 0 - Kontrolní skupina
            Injekce 2:neředěné vehikulum;
            Tabulka č. 7 Stupnice změn na oku B.6 SENZIBILIZACE KŮŽE Den 0 - Testovaná skupina Den 0 - Kontrolní skupina
            Injekce 3:Směs vehikula (50 %, váha/ objem) se směsí FCA/vody nebo fyziologického roztoku v poměru 1 : 1 (objem / objem).

            5. - 7. den - Testované a kontrolní skupiny

            Přibližně dvacet čtyři hodin před lokální indukční aplikací, jestliže látka není dráždivá pro kůži, se na testovací plochu po důkladném ostříhání případně oholení natře 0,5 ml 10 % laurylsulfátu sodného ve vazelíně, za účelem navození místního podráždění.

            6. - 8. den - Testovaná skupina

            Testovací plocha se zbaví srsti. Testovanou látkou ve vhodném vehikulu je napuštěn filtrační papír (2 x 4 cm), který se pak přiloží na testovací plochu a fixuje pomocí okluzívního obvazu na dobu 48 hodin. Výběr vehikula se řídí odbornými důvody; pevné látky jsou jemně rozetřeny a převedeny do vhodného vehikula; kapaliny lze aplikovat přímo.

            6. - 8. den - Kontrolní skupina

            Testovací plocha se znovu zbaví srsti. Samotné vehikulum se nanese a zafixuje podobně jako u exponované skupiny na dobu 48 hodin.

          1. 1.5.1.3.2 Provokace

            20. - 22. den - Testované a kontrolní skupiny

            Boky exponovaných i kontrolních zvířat jsou zbaveny srsti. Na jeden bok zvířete je aplikována testovaná látka v plátku nebo v komůrce a na druhý bok se stejným způsobem aplikuje pouze vehikulum (pokud je to třeba). Plátky se pomocí okluzívního obvazu udržují v kontaktu s kůží po 24 hodiny.

          1. 1.5.1.3.3 Pozorování a vyhodnocení: testované a kontrolní skupiny
            1. - přibližně 21 hodin po odstranění náplasti se provokační plocha vyčistí, důkladně ostříhá případně oholí a v případě potřeby depiluje;
            2. - přibližně po dalších třech hodinách (přibližně 48 hodin od začátku aplikace provokační dávky) se pozoruje kožní reakce a zaznamenává se podle stupnice uvedené v dodatku;
            3. - přibližně 24 hodin po tomto pozorování se provede druhé pozorování a záznam reakce kůže (72 hodin).

            Doporučuje se systém „slepého odečtu“ u testovaných i kontrolních zvířat, kdy pozorující osoba neví, které zvíře bylo senzibilizováno a které je kontrolní.

            Pokud je k vyjasnění výsledků nutná druhá provokace (tj. opakovaná provokace), provede se přibližně o týden později, v případě potřeby znovu s kontrolní skupinou s vehikulem. Opakovanou provokaci lze také provést na původní kontrolní skupině.

            Všechny kožní reakce a neobvyklé nálezy, včetně celkových reakcí, které jsou důsledkem indukčních a provokačních postupů se zaznamenávají podle stupnice Magnussona / Kligmana v tabulce č. 8. K objasnění sporných nálezů je možno použít dalších technik, jako např. histopatologického vyšetření nebo měření tloušťky kožních řas.

      1. 1.5.2 Buehlerův test
        1. 1.5.2.1 Příprava

          Zdravá mladá dospělá albinotická morčata se aklimatizují na laboratorní podmínky po dobu aspoň 5 dnů před zahájením testu. Před testem se zvířata náhodně rozdělí do expozičních a kontrolních skupin. Odstranění srsti se provede stříháním, holením nebo chemickou depilací, v závislosti na použité testovací metodě. Je třeba dbát na to, aby nedošlo k poškození kůže. Zvířata se zváží před zahájením testu a na konci testu.

        1. 1.5.2.2 Experimentální podmínky
          1. 1.5.2.2.1 Pokusná zvířata

            Používají se běžné laboratorní kmeny albinotických morčat.

          1. 1.5.2.2.2 Počet a pohlaví

            Lze použít samce a/nebo samice. Samice musí být nullipary a nesmí být březí.

            Použije se minimálně 20 zvířat v testované skupině a nejméně 10 zvířat v kontrolní skupině.

          1. 1.5.2.2.3 Dávkové úrovně

            Koncentrace testované látky použitá pro každou indukční expozici se upraví na takovou úroveň, která vyvolá mírné ale ne však silné podráždění kůže. Jako provokační koncentrace se použije maximální koncentrace, která u nesenzibilizovaných zvířat nevyvolává podráždění kůže. V případě potřeby je možno vhodné koncentrace stanovit v předběžném pokusu na dvou nebo třech zvířatech.

            Pro testované látky rozpustné ve vodě je vhodné použít vodu nebo zředěný nedráždící roztok detergentu jako vehikula. Pro jiné látky je preferován 80 % roztok etanol / voda pro indukci a aceton pro provokaci.

        1. 1.5.2.3 Postup
          1. 1.5.2.3.1 Indukce

            Den 0 - Testovaná skupina

            Jeden bok je zbaven srsti (důkladně ostříhán). Systém plátkového testu se dokonale nasytí testovanou látkou ve vhodném vehikulu (výběr vehikula se řídí odbornými důvody; kapaliny lze případně aplikovat přímo).

            Plátkový test je přiložen na testovací plochu a přidržován v kontaktu s kůží překrývacím plátkem nebo komůrkou a vhodným obvazem po dobu 6 hodin.

            Systém plátkového testu musí být okluzívní. Vhodný je bavlněný polštářek, ať už kruhový nebo čtvercový, s plochou přibližně 4 - 6 cm2. Je preferováno přidržení s použitím vhodné fixace, aby se zajistila okluze. Jestliže je použito obvázání, mohou být nutné další expozice.

            Den 0 - Kontrolní skupina

            Jeden bok je zbaven srsti (důkladně ostříhán). Na testovací plochu je naneseno pouze vehikulum, a to podobným způsobem jako u testované skupiny. Plátkový test je přiložen na testovací plochu a přidržován v kontaktu s kůží překrývacím plátkem nebo komůrkou a vhodným obvazem po dobu 6 hodin. Pokud je možno prokázat, že negativní kontrolní skupina není nutná, lze použít čisté kontrolní skupiny bez aplikace.

            6. - 8. a 13. - 15. den -Testovaná a kontrolní skupina

            Stejná aplikace jako v den 0 se provede na stejnou testovací plochu na tomtéž boku (zbavenou případně srsti) 6.-8. den a znovu 13.-15. den.

          1. 1.5.2.3.2 Provokace

            27. - 29. den - Testovaná a kontrolní skupina

            Neošetřený bok testovaných a kontrolních zvířat je zbaven srsti (důkladně ostříhán). Okluzívní plátek obsahující příslušné množství testované látky v maximální nedráždivé koncentraci se aplikuje na zadní část neošetřeného boku testovaných a kontrolních zvířat. Na přední část neošetřeného boku testovaných a kontrolních zvířat se případně může aplikovat okluzní plátek s vehikulem. Překrývací plátky nebo komůrky jsou přidržovány v kontaktu s kůží vhodným obvazem po dobu 6 hodin.

          1. 1.5.2.3.3 Pozorování a hodnocení

            Přibližně 21 hodin po odstranění plátku se provokační plocha zbaví srsti;

            přibližně o tři hodiny později (přibližně 30 hodin po aplikaci provokačního plátku) se pozorují kožní reakce a zaznamenávají podle stupnice uvedené v dodatku;

            přibližně po dalších 24 hodinách (tj. přibližně 54 hodin po aplikaci provokačního plátku) se kožní reakce znovu pozorují a zaznamenají.

            Doporučuje se systém „slepého odečtu“ u testovaných i kontrolních zvířat, kdy pozorující osoba neví, které zvíře bylo senzibilizováno a které je kontrolní.

            Pokud je k vyjasnění výsledků nutná druhá provokace (tj. opakovaná provokace), provede se přibližně o týden později, v případě potřeby znovu s kontrolní skupinou s vehikulem. Opakovanou provokaci lze také provést na původní kontrolní skupině.

            Všechny kožní reakce a neobvyklé nálezy, včetně celkových reakcí, které jsou důsledkem indukčních a provokačních postupů se zaznamenávají podle stupnice Magnussona/Kligmana (viz dodatek). K objasnění sporných nálezů je možno použít dalších technik, jako např. histopatologického vyšetření nebo měření tloušťky kožních řas.

  1. 2 SBĚR A ZÁZNAM ÚDAJŮ (GPMT A BUEHLERŮV TEST)

    Údaje se sestaví do tabulky, ze které musí být pro každé pokusné zvíře patrná reakce kůže při každém pozorování.

  1. 3 PROJEKT POKUSU, PROTOKOL POKUSU A ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA

    V souladu se s příslušnými právními předpisy9) musí být zpracován projekt pokusu a o průběhu pokusu je nutno vést protokol.

    Pokud byl proveden před zahájením testu na morčatech test skríningový, je třeba uvést popis tohoto testu nebo jeho citaci (např. LLNA - test regionálních lymfatických uzlin, MEST - test ztluštění ucha u myší) včetně všech podrobností postupu a výsledků získaných pro testované a referenční látky.

    1. 3.1 Zpráva o průběhu pokusu (GPMT a Buehlerův test)
      1. Zpráva o pokusu obsahuje tyto informace, pokud mohly být získány:
        1. Pokusná zvířata:
          1. - použitý kmen morčat;
          2. - počet, stáří a pohlaví zvířat;
          3. - podmínky chovu, strava atd.;
          4. - hmotnost jednotlivých zvířat na začátku a konci testu.
        1. Experimentální podmínky:
          1. - způsob přípravy místa pro plátkový test;
          2. - podrobné informace o materiálech a technice plátkového testu;
          3. - výsledek pilotní studie se závěrem o indukčních a provokačních koncentracích pro vlastní test;
          4. - podrobné informace o přípravě, aplikaci a odstranění testované látky;
          5. - zdůvodnění výběru vehikula;
          6. - koncentrace a celková množství testované látky a vehikula, použitá pro indukci a provokaci.
        1. Výsledky:
          1. - souhrn výsledků poslední kontroly citlivosti a spolehlivosti (viz 1.3.) včetně použité referenční látky, její koncentrace a vehikula;
          2. - všechna pozorování pro každé zvíře včetně systému klasifikace;
          3. - slovní popis charakteru a stupně pozorovaných účinků;
          4. - všechny histopatologické nálezy.

      Diskuse výsledků.

      Závěr.

    Tabulka č. 8

    Stupnice Magnussona/Kligmana pro hodnocení vyvolaných patologických reakcí

    Tabulka č. 7 Stupnice změn na oku B.6 SENZIBILIZACE KŮŽE Den 0 - Testovaná skupina Den 0 - Kontrolní skupina 5. - 7. den - Testované a kontrolní skupiny 6. - 8. den - Testovaná skupina 6. - 8. den - Kontrolní skupina 20. - 22. den - Testované a kontrolní skupiny Den 0 - Testovaná skupina Den 0 - Kontrolní skupina 6. - 8. a 13. - 15. den -Testovaná a kontrolní skupina 27. - 29. den - Testovaná a kontrolní skupina Tabulka č. 8 Stupnice Magnussona/Kligmana pro hodnocení vyvolaných patologických reakcí
    0žádná viditelná změna
    1slabé nebo skvrnité zarudnutí kůže
    2středně výrazné a splývající zarudnutí kůže
    3intenzívní zarudnutí a zduření kůže

B.7 SUBAKUTNÍ TOXICITA ORÁLNÍ (28 DENNÍ OPAKOVANÁ APLIKACE)

  1. 1 METODA je v souladu s právem Evropských společenství.4)
    1. 1.1 Princip testovací metody

      Testovaná látka se podává denně po 28 dní v odstupňovaných dávkách několika skupinám pokusných zvířat orálně, a to každé skupině 1 úroveň dávky. Během období podávání se zvířata denně pečlivě pozorují, aby se zjistily příznaky toxicity. Pitva se provede u všech zvířat, která uhynou nebo jsou utracena během pokusu; také zvířata, která přežijí konec pokusu, se utratí a pitvají.

      Tato metoda klade větší důraz na neurologické účinky jako na specifické výsledné účinky; důraz je kladen na potřebu pečlivého klinického pozorování zvířat, aby bylo získáno co nejvíce informací. Metoda by měla odhalit chemické látky s neurotoxickým potenciálem, u nichž může být nezbytné další hlubší zkoumání tohoto aspektu. Metoda může upozornit na imunologické účinky a toxicitu pro reprodukční orgány.

    1. 1.2 Popis metody
      1. 1.2.1 Příprava

        Pokusná zvířata jsou vybrána s ohledem na druh, pohlaví, a stáří v souladu s ustanovením § 15 zvláštního právního předpisu10) a označena tak, aby byla možná identifikace jednotlivých zvířat. Dobu navykání stanoví § 10 zvláštního právního předpisu.10) Zdravá mladá zvířata se náhodně přiřadí do kontrolní skupiny a jednotlivých experimentálních skupin. Klece jsou uspořádány tak, aby se co nejvíce vyloučil vliv umístění klece.

        Testovanou látku lze podávat sondou nebo v potravě nebo v pitné vodě, podle účelu studie a fyzikálně-chemických vlastností látky.

        Pokud je to třeba, rozpustí nebo suspenduje se testovaná látka ve vhodném nosiči (vehikulu). Doporučuje se nejprve zvážit použití vodného roztoku / suspenze, pak použití roztoku / emulze v jedlém rostlinném oleji (např. kukuřičném) a pak roztoku v jiných nosičích. Pro nevodná vehikula musí být známa jejich toxická charakteristika; pokud není známa, musí být stanovena ještě před testem. Je nezbytné ověřit stabilitu látky v zvoleném vehikulu.

      1. 1.2.2 Experimentální podmínky
        1. 1.2.2.1 Pokusná zvířata

          Při provádění pokusů se upřednostňují potkani, ale je možno použít i jiného druhu hlodavců. Je třeba používat mladých zdravých zvířat z běžně užívaných pokusných kmenů. Samice musí být nullipary a nesmí být březí. Podávání látky by mělo začít co nejdříve po odstavu a v každém případě dříve než zvířata dosáhnou věku 9 týdnů.

          Na začátku studie by nemělo variační rozpětí hmotnosti zvířat (pro každé pohlaví zvlášť) překročit ± 20 % střední hodnoty.

          Pokud má tato studie sloužit jako předběžný pokus před dlouhodobou studií, je třeba v obou studiích použít zvířata stejného kmene a ze stejného zdroje.

        1. 1.2.2.2 Počet a pohlaví

          Pro každou hladinu dávek se použije nejméně 10 zvířat (5 samic a 5 samců). Pokud se zvířata budou zabíjet v průběhu studie, je nutno zvýšit celkový počet zvířat o počet zvířat, která budou zabita před koncem pokusu.

          Mimo to je možno podávat další skupině (satelitní skupině) 10ti zvířat (5 zvířat každého pohlaví) po dobu 28 dnů nejvyšší dávku a během následujících 14 dnů po podávání sledovat vratnost, trvání nebo zpožděný výskyt toxických účinků. Používá se také satelitní skupiny 10 kontrolních zvířat (5 zvířat každého pohlaví).

        1. 1.2.2.3 Volba dávek

          Je třeba použít nejméně tři úrovně dávek a jednu kontrolní skupinu. S výjimkou aplikace testované látky se zachází se zvířaty v kontrolní skupině stejně jako s pokusnými. Používá-li se vehikulum pro usnadnění aplikace, podává se kontrolní skupině stejným způsobem jako pokusným skupinám, a to ve stejném množství, které obdrží skupina, které se aplikuje nejvyšší dávka.

          Pokud se podle dostupných informací nedá očekávat účinek při denní dávce 1000 mg.kg-1 tělesné hmotnosti, je možno provést limitní test. Nejsou-li taková data k dispozici, lze provést předběžnou vyhledávací studii za účelem stanovení dávek.

          Při výběru dávek je třeba vzít v úvahu všechny existující údaje z toxikologických a toxikokinetických studií o testované látce případně látkách příbuzných.

          Nejvyšší úroveň dávky má vyvolat toxické účinky, ale nezpůsobit žádné uhynutí ani velké utrpení. Dále se vyberou dávky v klesající řadě tak, aby umožnily prokázat závislost účinku na dávce. Nejnižší úroveň dávky by neměla vyvolat žádné příznaky toxicity (NOAEL). Obvykle je vhodný dvoj- až čtyřnásobný odstup mezi sousedními dávkami; pokud je potřeba pokrýt větší rozsah dávek, je lepší přidat čtvrtou dávkovou skupinu, než zvolit příliš velký odstup mezi dávkami (např. faktor větší než 10).

          Pokud se testovaná látka podává v potravě nebo pitné vodě, je důležité zajistit, aby podávané množství látky neovlivňovalo výživu a vodní rovnováhu. Podává-li se testovaná látka v potravě, může se použít buď konstantní koncentrace (v ppm) nebo konstantní dávkování ve vztahu k tělesné hmotnosti zvířete; použitou alternativu je třeba uvést. Aplikuje-li se látka sondou, mělo by se tak dít každý den ve stejnou dobu, a dávkování přizpůsobovat změnám tělesné hmotnosti zvířete.

          Pokud má tato studie sloužit jako předběžný pokus před dlouhodobou studií, je třeba v obou studiích použít stejné potravy.

        1. 1.2.2.4 Limitní test

          Neprokáže-li test provedený zde popisovaným způsobem žádné toxické účinky při dávce 1000 mg.kg-1 tělesné hmotnosti za den nebo při takové koncentraci v potravě nebo vodě, která této dávce odpovídá, a pokud toxicita testované látky nevyplývá z analogie s příbuznými látkami, je možno od provedení kompletního testování při třech dávkových úrovních upustit. Toto pravidlo limitního testu platí, pokud údaje o expozici lidí nenaznačují, že je třeba testovat při vyšších dávkách.

        1. 1.2.2.5 Doba pozorování

          Doba pozorování je 28 dní. Zvířata satelitní skupiny jsou pozorována nejméně dalších 14 dnů bez aplikace s cílem zachytit případné zpožděné účinky a pro posouzení přetrvávání nebo vratnosti účinku.

      1. 1.2.3 Popis postupu

        Zvířatům se podává testovaná látka 7 dní v týdnu po dobu 28 dnů, ve zdůvodněných případech 5 dní v týdnu. Denní dávka se podává jednorázově žaludeční sondou nebo vhodnou intubační kanylou. Maximální objem tekutiny, který může být podán najednou, závisí na velikosti zvířete. Objem by neměl normálně přesáhnout 1 ml na 100 g tělesné hmotnosti, v případě vodných roztoků lze podat i 2 ml na 100 g tělesné hmotnosti. Rozdíly v podávaném objemu je třeba minimalizovat upravením koncentrace tak, aby byl podáván týž objem na všech úrovních dávky. Neplatí to u látek dráždivých a leptavých, u kterých je třeba obvykle počítat se stupňovanými účinky při vyšších koncentracích.

        1. 1.2.3.1 Všeobecné pozorování

          Všeobecné klinické pozorování se provádí nejméně jednou denně, nejlépe v tutéž denní dobu a s uvážením doby očekávaného maxima účinku po aplikaci. Zaznamenává se zdravotní stav zvířat. Nejméně dvakrát denně se provede zběžná prohlídka všech zvířat za účelem zjištění morbidity a mortality. Zvířata v agonii a zvířata projevující silnou bolest nebo utrpení jsou vyřazena, utracena humánním způsobem a pitvána.

          Důkladné klinické vyšetření všech zvířat se provede před první aplikací (za účelem intraindividuálního porovnání) a dále nejméně jednou týdně. Toto pozorování se děje mimo chovnou klec v standardním pozorovacím prostoru a nejlépe pokaždé ve stejnou denní dobu. Výsledky pozorování se pečlivě zaznamenávají, nejlépe s použitím skórovacího systému, standardizovaného v testující laboratoři. Je třeba zajistit, aby se podmínky pozorování měnily co nejméně; osoba, provádějící pozorování by nejlépe neměla znát příslušnost zvířat do dávkových skupin.

          Pozorování zahrnuje změny kůže, srsti, očí a sliznic, přítomnost sekretů a exkretů, změny dýchání a vegetativních funkcí (slzení, zježení srsti, velikost zornic) a případně další. Zaznamenávají se změny chůze, polohy, dále reakce na manipulaci, přítomnost klonických a tonických pohybů, stereotypů v chování (vytrvalé čisticí pohyby nebo kroužení) nebo bizarních vzorců chování (např. sebepoškozování, pohyb pozadu).

          Ve čtvrtém týdnu aplikace se otestují reakce na různé senzorické podněty (např. sluchové, zrakové, proprioceptivní), změří se síla úchopu a celková motorická aktivita. Další podrobné informace o postupech, které je možno k testování použít, jsou uvedeny v literatuře (viz Všeobecný úvod, část B).

          Pozorování funkčních poruch ve čtvrtém týdnu aplikace lze případně vynechat, pokud 28-denní studie slouží jako předběžná studie pro následující studii subchronickou (90-denní); v tom případě je pozorování funkčních poruch zařazeno do této dlouhodobé studie. Ovšem i v tomto případě jsou údaje o funkčních poruchách ve čtvrtém týdnu 28-denní studie vhodným východiskem pro výběr dávek pro subchronickou studii.

          Výjimečně lze vynechat pozorování funkčních poruch u skupin vykazujících takové příznaky toxicity, které by při posuzování funkčního stavu zvířete vadily.

        1. 1.2.3.2 Tělesná hmotnost a příjem potravy a vody

          Zvířata se váží nejméně jednou týdně. Spotřeba potravy a vody se měří nejméně jednou týdně, také v případě aplikace v pitné vodě.

        1. 1.2.3.3 Hematologie

          Hematologické vyšetření na konci pokusu zahrnuje stanovení hematokritu, koncentrace hemoglobinu, počtu erytrocytů, celkového a diferenciálního počtu leukocytů, počtu trombocytů a změření srážlivosti krve.

          Krev se odebere těsně před nebo v průběhu utracení zvířete, místo odkud se krev odebrala se zaznamená. Krev se skladuje za vhodných podmínek.

        1. 1.2.3.4 Biochemická analýza

          Biochemická analýz krve za účelem posouzení závažných toxických účinků na tkáně, zvláště na játra a ledviny, se provede u všech zvířat těsně před nebo v průběhu utracení (kromě zvířat uhynulých nebo utracených během pokusu). Doporučuje se nechat zvířata bez potravy přes noc před odběrem krve. Vyšetření nalačno je žádoucí pro řadu měření v séru a plazmě, zvláště pro glukózu. Hlavní důvod pro toto doporučení je to, že u nehladovějících zvířat je vyšší variabilita výsledků, která by mohla maskovat jemné změny a ztížit interpretaci. Na druhé straně, hladovění přes noc by mohlo mít vliv na celkový metabolismus a u aplikace v potravě by zasáhla do pravidelnosti expozice testované látce. Pokud se odebírá krev nalačno, je třeba biochemické vyšetření provést až po pozorování funkčních poruch ve 4. týdnu testu.

          Vyšetření plazmy a séra zahrnuje stanovení sodíku, draslíku, glukózy, celkového cholesterolu, močoviny, kreatininu, celkových proteinů, albuminu, aktivity alespoň dvou enzymů indikujících účinky na jaterní buňky ( jako alaninaminotransferáza, aspartátaminotransferáza, alkalická fosfatáza, gama glutamyltranspeptidáza, sorbitoldehydrogenáza). Změření dalších enzymů (jaterního nebo jiného původu) a žlučových kyselin může v některých případech poskytnout užitečné informace.

          Další možnost je časově definovaný sběr a vyšetření moči během posledního týdne studie: hodnotit je možno vzhled, objem, osmolalitu nebo specifickou hmotnost, pH, bílkoviny, glukózu a krev příp. krvinky.

          Dále je třeba uvážit stanovení nespecifických indikátorů poškození tkání v séru.

          Další charakteristiky je třeba stanovit u látek známých nebo podezřelých z působení na určité metabolické funkce: stanovení vápníku, fosforu, triglyceridů nalačno, lipidů, specifických hormonů, methemoglobinu, aktivity cholinesterázy. Účelnost těchto vyšetření se posuzuje podle příslušnosti do určitých skupin látek nebo případ od případu.

          Obecně je třeba postupovat pružně, brát v úvahu použitý živočišný druh a pozorované nebo očekávané účinky dané látky.

          Pokud nejsou k dispozici údaje o normálních hodnotách některých hematologických nebo biochemických proměnných, je třeba uvážit jejich stanovení ještě před začátkem studie.

        1. 1.2.3.5 Pitva

          U všech zvířat použitých ve studii se provede pitva, zahrnující pečlivé vyšetření vnějšího povrchu těla, všech otvorů, dutiny lební, hrudní a břišní, a jejich obsahu. Játra, ledviny, nadledviny, varlata, nadvarlata, brzlík, slezina, mozek a srdce všech zvířat se řádně očistí od ulpěných tkání a co nejdříve po sekci se zváží ve vlhkém stavu, aby se předešlo vysychání.

          Následující tkáně je třeba přechovávat ve vhodném médiu s ohledem na typ tkáně a plánovaná pozdější histopatologická vyšetření: všechny tkáně s makroskopickými změnami, mozek (reprezentativní oblasti včetně hemisfér, mozečku a mostu), míchu, žaludek, tenké i tlusté střevo (včetně Peyerových plátů), játra, ledviny, nadledvinky, slezinu, srdce, brzlík, štítnou žlázu, průdušnici a plíce (konzervované naplněním fixačním roztokem a pak ponořením), gonády a přídatné pohlavní orgány (např. dělohu, prostatu), močový měchýř, lymfatické uzliny (přednostně jedna pro oblast aplikace a jedna vzdálená pro pokrytí systémových účinků), periferní nerv (n. ischiadicus nebo n. tibialis), nejlépe v blízkosti svalu, řez kostní dřeně (nebo čerstvý nátěr z nasáté kostní dřeně). Podle klinických nebo jiných nálezů je možno zvolit i další tkáně. Každý orgán, který by mohl být cílovým orgánem pro působení testované látky, je třeba uchovat.

        1. 1.2.3.6 Histopatologická vyšetření

          U všech zvířat skupiny, které byla podána nejvyšší dávka, a u zvířat kontrolní skupiny je třeba provést histologické vyšetření uchovaných orgánů a tkání. Pokud se v orgánech a tkáních ve skupině s nejvyšší dávkou objeví poškození způsobená testovanou látkou, je nutno provést histologické vyšetření těchto tkání i u všech skupin s nižšími dávkami.

          Všechny makroskopické léze je třeba vyšetřit.

          U zvířat satelitních skupin, pokud byly do studie zařazeny, je třeba provést histologické vyšetření se zvláštním důrazem na orgány a tkáně, ve kterých se objevily účinky otravy u ostatních exponovaných zvířat.

  1. 2 SBĚR A ZÁZNAM ÚDAJŮ

    K dispozici musí být údaje o každém jednotlivém zvířeti. Navíc jsou veškeré údaje sumarizovány do tabulkové formy, uvádějící u každé testované skupiny počet použitých zvířat, počet zvířat vykazujících příznaky toxicity, počet zvířat uhynulých v průběhu testu nebo utracených z humánních důvodů, dobu úmrtí jednotlivých zvířat, popis toxických příznaků včetně doby nástupu, trvání a závažnosti každého příznaku, počet zvířat vykazujících léze, typ lézí a procento zvířat s jednotlivými typy lézí.

    Výsledky v číselné formě je třeba vyhodnotit vhodnou a uznávanou statistickou metodou. Statistickou metodu je třeba zvolit již při plánování studie.

  1. 3 PROJEKT POKUSU, PROTOKOL POKUSU A ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA

    V souladu se s příslušnými právními předpisy9) musí být zpracován projekt pokusu a o průběhu pokusu je nutno vést protokol.

    1. Zpráva o pokusu obsahuje tyto informace, pokud mohly být získány:
      1. Pokusná zvířata:
        1. - živočišný druh / kmen;
        2. - počet, stáří a pohlaví zvířat;
        3. - zdroj, podmínky chovu, potrava atd.;
        4. - hmotnost jednotlivých zvířat na začátku testu, dále v týdenních intervalech a na konci testu.
      1. Podmínky testování:
        1. - zdůvodnění výběru vehikula, pokud je jiné než voda;
        2. - zdůvodnění výběru dávek;
        3. - podrobné údaje o úpravě testované látky pro aplikaci, případně o přípravě diety, o dosažených koncentracích, stabilitě a homogenitě přípravku;
        4. - podrobné údaje o způsobu aplikace testované látky;
        5. - přepočet z koncentrace látky v dietě nebo vodě (ppm) na skutečnou denní dávku v mg na kg tělesné hmotnosti (pokud jde o aplikaci v dietě nebo vodě);
        6. - podrobné údaje o potravě a kvalitě vody (včetně druhu a zdroje);
      1. Výsledky:
        1. - tělesná hmotnost a její změny;
        2. - spotřeba potravy a vody;
        3. - údaje o toxických reakcích podle pohlaví a dávkové úrovně, včetně popisu příznaků toxicity;
        4. - povaha, závažnost a trvání klinických nálezů, příp. zda jsou vratné nebo nevratné;
        5. - posouzení reaktivity na smyslové podněty, úchopové síly a motorické aktivity;
        6. - výsledky hematologického vyšetření s příslušnými normami;
        7. - výsledky biochemického vyšetření s příslušnými normami;
        8. - tělesná hmotnost při utracení a hmotnosti orgánů;
        9. - pitevní nálezy;
        10. - podrobný popis všech histopatologických nálezů;
        11. - údaje o absorpci, pokud byly získány;
        12. - statistické zpracování výsledků.

      Diskuse výsledků.

      Závěry.

B.8 SUBAKUTNÍ TOXICITA INHALAČNÍ (28 DENNÍ OPAKOVANÁ APLIKACE)

  1. 1 METODA je v souladu s právem Evropských společenství.2)
    1. 1.1 Úvod

      Před pokusem je třeba získat údaje o testované látce: rozdělení velikosti částic, tenze par, bod tání, bod varu, bod vzplanutí a výbušnost (jsou-li stanovitelné).

    1. 1.2 Princip metody

      Několik skupin pokusných zvířat je exponováno studované látce denně po určitou dobu, v odstupňovaných koncentracích, každá skupina jedné koncentraci, a to po 28 dní. Použije-li se pro dosažení vhodné koncentrace testované látky v atmosféře vehikulum, je třeba použít kontrolní skupinu pro vehikulum. Během trvání pokusu se zvířata denně pozorují a zjišťují se příznaky toxických účinků. Zvířata, která během pokusu uhynou, i ta, která přežijí do konce pokusu, se pitvají.

    1. 1.3 Popis metody
      1. 1.3.1 Příprava

        Pokud je třeba, přidá se k testované látce vhodné vehikulum tak, aby v ovzduší vznikla příslušná koncentrace testované látky. Pokud se užije pro usnadnění aplikace vehikulum nebo jiná aditiva, musí být o nich známo, že nemají toxický účinek. Existují-li vhodná historická data, je možno je využít.

      1. 1.3.2 Experimentální podmínky
        1. 1.3.2.1 Pokusná zvířata

          Pokusná zvířata jsou vybrána s ohledem na druh, pohlaví, a stáří v souladu s ustanovením § 15 zvláštního právního předpisu10) a označena tak, aby byla možná identifikace jednotlivých zvířat. Dobu navykání stanoví § 10 zvláštního právního předpisu.10) V pokusech se upřednostňují potkani, nejsou-li známy důvody proti jejich použití. Použijí se mladá zdravá zvířata z běžně užívaných pokusných kmenů. Na začátku studie nemá variační rozpětí hmotnosti zvířat překročit ± 20 % střední hodnoty (pro každé pohlaví zvlášť).

        1. 1.3.2.2 Počet a pohlaví

          Pro každou testovanou skupinu je třeba použít nejméně 10 zvířat (5 samic a 5 samců). Samice musí být nullipary a nesmí být březí. Pokud se plánuje usmrcování zvířat v průběhu studie, je nutno zvýšit celkový počet zvířat o počet zvířat, která budou usmrcena před koncem pokusu. Mimoto je možno exponovat vysoké koncentraci satelitní skupinu 10ti zvířat (5 zvířat každého pohlaví) po dobu 28 dnů a během následujících 14 dnů sledovat vratnost, přetrvávání nebo zpožděný výskyt toxických účinků. Používá se také satelitní skupiny 10 kontrolních zvířat (5 zvířat každého pohlaví).

        1. 1.3.2.3 Expoziční koncentrace

          Použijí se nejméně tři skupiny s různou úrovní koncentrace a jedna kontrolní skupina, případně kontrolní skupina s vehikulem - pokud se užije - v koncentraci stejné jako u skupiny s nejvyšší koncentrací testované látky. S výjimkou aplikace testované látky se se zvířaty v kontrolní skupině zachází stejně jako s pokusnými. Nejvyšší koncentrace má vyvolat toxické účinky, ale nezpůsobit žádné uhynutí nebo jen v malém počtu. Nejnižší koncentrace by neměla vyvolat žádné příznaky toxicity. Pokud existují odhady expozice u člověka, má nejnižší koncentrace tuto hodnotu překračovat. Ideálně by střední koncentrace měla vyvolat toxický účinek na hranicích zjistitelnosti. Aplikují-li se více než 3 úrovně koncentrací, mají být voleny tak, aby vyvolaly odstupňované toxické účinky. Ve skupinách s nízkou a střední koncentrací a v kontrolní skupině by počet uhynutí měl být nízký, jinak je vyhodnocení výsledků obtížné.

        1. 1.3.2.4 Trvání expozice

          Trvání expozice má být 6 hodin denně; v případě specifických požadavků je možné použit i jiných dob expozice.

        1. 1.3.2.5 Expoziční zařízení

          Pro pokusy se zvířaty se používá dynamické expoziční zařízení, které zaručuje proudění vzduchu s výměnou nejméně 12krát za hodinu, aby byl zaručen přiměřený obsah kyslíku a rovnoměrné rozdělení látky v expoziční atmosféře. Použije-li se expoziční box, je třeba ho konstruovat tak, aby se zamezilo co nejvíce shlukování zvířat a aby inhalační expozice testované látce byla co nejvyšší. Pro zajištění stability atmosféry v inhalačním boxu by neměl celkový objem pokusných zvířat přesáhnout 5% objemu boxu. Je možné použít inhalační expozice orálně-nasální, samotné hlavy nebo individuální celotělové expozice; první dva způsoby expozice minimalizují příjem látky jinými cestami.

        1. 1.3.2.6 Doba pozorování

          Pokusná zvířata je třeba denně pozorovat během celého období expozice i zotavení a zaznamenávat toxické účinky. Je třeba zaznamenat dobu uhynutí a čas, ve kterém se objeví a opět odezní toxické účinky.

      1. 1.3.3 Popis postupu

        Zvířata se exponují testované látce denně, 5 - 7 dnů v týdnu, po dobu 28 dnů. Zvířata v satelitních skupinách, která jsou určena k následnému pozorování, jsou pozorována dalších 14 dnů bez aplikace, k posouzení zotavení z otravy nebo přetrvávání toxických účinků. Teplota během experimentu má být 22 °C ± 3 °C. Relativní vlhkost má být mezi 30 % a 70 %, s výjimkou případů, kde to není možné (např. experimenty s aerosoly). Udržování mírného podtlaku uvnitř komory (≤ 5mm vodního sloupce) zabrání unikání testované látky do okolí. Během expozice se nepodává potrava ani voda.

        Používá se dynamický inhalační systém s vhodnou analytickou kontrolou koncentrace. Doporučuje se provést předběžný pokus pro získání potřebných koncentrací. Rychlost průtoku vzduchu je třeba nastavit tak, aby podmínky v celém expozičním boxu byly stejné. Systém musí zaručovat, že stabilních podmínek expozice bude dosaženo co nejrychleji.

        1. Měření nebo monitorování podmínek expozice:
          1. a) Měření průtoku vzduchu (kontinuálně).
          2. b) Skutečná koncentrace studované látky se měří v dýchací zóně. Během jedné expozice se nemá koncentrace odchylovat od střední hodnoty o více než ± 15%. U některých prachů a aerosolů, kde této úrovně regulace není možné dosáhnout, se připouští větší rozsah kolísání. Po celou dobu trvání experimentu mají být koncentrace tak stabilní, jak je to prakticky možné. Pokud se týká částic a aerosolů, měří se distribuce velikosti částic týdně v každé testované skupině.
          3. c) Teplota a vlhkost vzduchu kontinuálně.

        Během expozice a po jejím skončení se pozorování provádějí a zaznamenávají systematicky; každé zvíře má svůj individuální protokol. Všechna zvířata je třeba denně pozorovat na příznaky toxických účinků a zaznamenávat jejich výskyt, stupeň a trvání. Pozorování zahrnuje změny kůže, srsti, očí, sliznic, dýchání a krevního oběhu, změny funkce autonomní a centrální nervové soustavy, somatomotorické aktivity a chování. Hmotnosti zvířat se zaznamenávají týdně. Doporučuje se zaznamenávat týdně i spotřebu potravy. Je třeba zajistit pravidelné prohlížení zvířat, aby pokud možno nedocházelo ke ztrátám zvířat jako např. v důsledku kanibalismu, autolýzy tkání nebo chybného zařazení.

        Po skončení studie se všechna zvířata, která přežila, s výjimkou satelitních skupin, pitvají. Zvířata v agonii, ve značném stresu či trpící bolestí je třeba okamžitě vyřadit, humánně utratit a pitvat.

        1. Na konci pokusu se u všech zvířat včetně kontrolních provedou následující vyšetření:
          1. 1. Hematologické vyšetření má zahrnovat alespoň stanovení hematokritu, koncentrace hemoglobinu, počtu erytrocytů, celkového a diferenciálního počtu leukocytů a srážlivosti krve.
          2. 2. Biochemická analýza krve: k posouzení funkce jater a ledvin stanovit alespoň jeden z těchto parametrů: alaninaminotransferáza v séru (dříve známá jako glutamát-pyruvát-transamináza), aspartátaminotransferáza séra (dříve známá jako glutamát-oxalacetát-transamináza), dusík močoviny, albumin, kreatinin, celkový bilirubin a celkové bílkoviny v séru.

        Mezi další charakteristiky, které mohou být potřebné pro úplné toxikologické hodnocení, patří stanovení: vápníku, fosforu, chloridů, sodíku, draslíku, glukózy nalačno, lipidů, hormonů, acidobazické rovnováhy, methemoglobinu, aktivity cholinesterázy.

        Další biochemické analýzy mohou být v případě potřeby použity pro studium širšího spektra účinků.

        1. 1.3.3.1 Pitva

          U všech zvířat použitých ve studii se provede pitva. Aspoň játra, ledviny, nadledviny, plíce a varlata se co nejdříve po sekci zváží ve vlhkém stavu, aby se předešlo vysychání. Orgány a tkáně (dýchací systém, játra, ledviny, slezina, varlata, nadledviny a srdce, i všechny orgány s makroskopickými změnami nebo změnami velikosti) je třeba přechovávat ve vhodném médiu s ohledem na pozdější histopatologická vyšetření. Plíce je třeba vyjmout bez poškození, zvážit a fixovat vhodným mediem, tak aby se zachovala struktura.

        1. 1.3.3.2 Histopatologické vyšetření

          U všech zvířat skupiny, které byla podána nejvyšší koncentrace, a u zvířat kontrolní skupiny, je třeba provést histologické vyšetření uchovaných orgánů a tkání. Pokud se v orgánech a tkáních ve skupině s nejvyšší koncentrací objeví poškození způsobená testovanou látkou, je nutno provést histologické vyšetření těchto tkání i u všech skupin s nižšími dávkami. U zvířat satelitních skupin je třeba provést histologické vyšetření se zvláštním důrazem na orgány a tkáně, ve kterých se objevily účinky otravy u ostatních exponovaných zvířat.

  1. 2 ÚDAJE

    Údaje se sestaví do tabulky. Z ní musí být pro každou experimentální skupinu patrný počet zvířat na počátku pokusu a počet zvířat s jednotlivými formami poškození.

    Všechny zjištěné výsledky je třeba vyhodnotit vhodnou statistickou metodou. Je k tomu možno použít kteroukoliv uznávanou statistickou metodu.

  1. 3 PROJEKT POKUSU, PROTOKOL POKUSU A ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA

    V souladu se s příslušnými právními předpisy9) musí být zpracován projekt pokusu a o průběhu pokusu je nutno vést protokol.

    1. Zpráva o průběhu pokusu obsahuje tyto k informace:
      1. - živočišný druh, kmen, původ, podmínky ustájení, potrava atd.,
      2. - podmínky pokusu:
        1. - popis expozičního zařízení včetně konstrukce, typu, rozměrů, zdroje vzduchu, systému přípravy částic a aerosolů, klimatizačního systému, popis čištění odpadního vzduchu a způsobu umístění zvířat v boxu, pokud je používán. Popsat přístroje pro měření teploty, vlhkosti vzduchu, popřípadě stability koncentrací a distribuce velikosti částic aerosolu,
        2. - údaje o expozici se sestaví do tabulky a uvedou spolu s průměrnými hodnotami a charakteristikou variability (např. směrodatnou odchylkou). Mají obsahovat tyto údaje:
      1. - rychlost průtoku vzduchu inhalačním zařízením;
      2. - teplota a vlhkost vzduchu;
      3. - nominální koncentrace (celkové množství testované látky přiváděné do inhalačního zařízení, dělené objemem vzduchu);
      4. - povaha vehikula, pokud bylo užito;
      5. - skutečná koncentrace v dýchací zóně;
      6. - hmotnostní medián aerodynamického průměru (MMAD) a geometrická směrodatná odchylka (GSD),
      7. - údaje o toxických odpovědích podle pohlaví a podle koncentrací,
      8. - doba uhynutí během experimentu, případně údaj o přežití zvířat do konce sledování,
      9. - popis toxických nebo jiných účinků,
      10. - úroveň bez účinku,
      11. - doba, kdy byly pozorovány jednotlivé abnormální příznaky, a jejich další vývoj,
      12. - spotřeba potravy a vývoj tělesné hmotnosti,
      13. - hematologická vyšetření a jejich výsledky,
      14. - biochemická vyšetření a jejich výsledky,
      15. - pitevní nálezy,
      16. - detailní popis všech histopatologických nálezů,
      17. - statistické vyhodnocení výsledků, kde je to možné.

    Diskuse výsledků.

    Závěry.

B.9 SUBAKUTNÍ TOXICITA DERMÁLNÍ (28 DENNÍ OPAKOVANÁ APLIKACE)

  1. 1 METODA je v souladu s právem Evropských společenství.2)
    1. 1.1 Princip testovací metody

      Testovaná látka se nanáší na kůži denně po 28 dní v odstupňovaných dávkách několika skupinám pokusných zvířat a to každé skupině jedna úroveň dávky. Během období podávání se zvířata denně pozorují, aby se zjistily příznaky toxicity. Zvířata, která uhynou během pokusu, i zvířata, která přežijí konec pokusu, se pitvají.

    1. 1.2 Popis metody
    2. 1.3 Příprava