Vyhláška, kterou se stanoví základní metody pro zkoušení toxicity chemických látek a chemických přípravků, 443/2004 Sb., vyhlášené znění

Předchozí stránka

Pokusná zvířata jsou vybrána s ohledem na druh, pohlaví, a stáří v souladu s ustanovením § 15 zvláštního právního předpisu¹⁰) a označena tak, aby byla možná identifikace jednotlivých zvířat. Dobu navykání stanoví § 10 zvláštního právního předpisu.¹⁰) Krátce před začátkem pokusu se ostříhá srst na zádech pokusných zvířat. Vyholení srsti je rovněž možné, mělo by se však provést cca 24 hodin před experimentem. Ostříhání nebo oholení je potřeba opakovat každý týden. Při střihání nebo holení srsti je třeba dbát na to, aby se nepoškodila kůže (např. abrazí). Pro nanášení se připraví nejméně 10 % povrchu těla. Je třeba vzít v úvahu hmotnost zvířat při rozhodování o velikosti připravované plochy kůže a o velikosti krycího obvazu. Při pokusech s tuhými látkami, které mohou být případně upraveny do práškové formy, je třeba danou látku dostatečně navlhčit vodou, případně vhodným vehikulem, aby byl zaručen dobrý kontakt s kůží. Testované kapaliny se zpravidla aplikují neředěné. Látka se nanáší denně 5 až 7 dnů v týdnu.

1.4 Experimentální podmínky
1. 1.4.1 Pokusná zvířata
  Je možno používat dospělé potkany, králíky nebo morčata. Je možno použít i jiné zvířecí druhy, jejich použití však musí být odůvodněné. Na začátku studie by nemělo variační rozpětí hmotnosti zvířat (pro každé pohlaví zvlášť) překročit ± 20 % střední hodnoty.
  1. 1.4.1.1 Počet a pohlaví
    Pro každou hladinu dávek použít nejméně 10 zvířat (5 samic a 5 samců) se zdravou kůží. Samice musí být nullipary a nesmí být březí. Pokud se plánuje usmrcování zvířat v průběhu studie, je nutno zvýšit celkový počet zvířat o počet zvířat, která budou usmrcena před koncem pokusu. Mimoto je možno podávat další skupině (satelitní skupině) 10ti zvířat (5 zvířat každého pohlaví) po dobu 28 dnů nejvyšší dávku a během následujících 14 dnů po ukončení expozic sledovat vratnost, trvání nebo zpožděný výskyt toxických účinků. Používá se také satelitní skupiny 10 kontrolních zvířat (5 zvířat každého pohlaví).
  1. 1.4.1.2 Dávkování
    Je třeba použít nejméně tři úrovně dávek a jednu kontrolní skupinu nebo - pokud se použilo vehikula - kontrolní skupinu s aplikací vehikula. Doba expozice má být nejméně 6 hodin denně. Nanášení testované látky by se mělo provádět každý den ve stejnou dobu. V intervalech týdenních nebo čtrnáctidenních je třeba aplikovanou dávku přizpůsobovat tak, aby se udržovala stálá hladina dávky ve vztahu k tělesné hmotnosti zvířete. S výjimkou aplikace testované látky se se zvířaty v kontrolní skupině zachází stejně jako s pokusnými. Používá-li se vehikulum pro usnadnění aplikace, podává se kontrolní skupině stejným způsobem jako pokusným skupinám, a to ve stejném množství, které se aplikuje skupině s nejvyšší dávkou. Nejvyšší dávka má vyvolat toxické účinky, ale nezpůsobit žádné uhynutí nebo jen v malém počtu. Nejnižší dávka by neměla vyvolat žádné příznaky toxicity. Pokud existují odhady expozice u člověka, má nejnižší dávka tuto hodnotu překračovat. Ideálně by střední dávka měla vyvolat jen toxický účinek na hranicích zjistitelnosti. Aplikují-li se více než 3 úrovně dávek, mají být vmezeřené dávky voleny tak, aby vyvolaly odstupňované toxické účinky. Ve skupině s nízkou a střední dávkou a v kontrolní skupině by počet uhynutí měl být nízký, jinak je vyhodnocení výsledků obtížné.
    Vede-li aplikace testované látky k těžkému podráždění kůže, je třeba snížit koncentraci, což u vysoké dávkové úrovně může vést k omezení nebo vyloučení ostatních toxických účinků. Došlo-li k těžkému poškození kůže, je dokonce za určitých okolností nutno pokus ukončit a provést jej znova s nižšími koncentracemi.
  1. 1.4.1.3 Limitní test
    Nevyvolá-li při předběžné studii aplikace dávky 1000 mg.kg^-1 nebo vyšší dávky, která odpovídá možné expozici člověka, žádné toxické účinky, není další zkouška nutná.
  1. 1.4.1.4 Doba pozorování
    Všechna zvířata je třeba denně pozorovat na příznaky otravy. Je třeba zaznamenat dobu uhynutí a dobu, kdy se objeví a případně opět odezní příznaky otravy.
1. 1.4.2 Popis postupu
  Zvířata se chovají v klecích po jednom. Exponují se studované látce nejlépe 7 dnů v týdnu po dobu 28 dnů. Zvířata satelitní skupiny, která jsou určena pro následné pozorování, je třeba chovat po dalších 14 dnů bez expozice, aby se mohla pozorovat reparace toxických účinků nebo jejich přetrvávání. Doba expozice činí nejméně 6 hodin denně.
  Testovanou látku je třeba nanášet rovnoměrně na celou plochu, která představuje asi 10 % povrchu těla; u vysoce toxických látek může být tato plocha menší. Látkou je třeba pokrýt co největší část pokusné plochy rovnoměrně v co nejtenčí vrstvě.
  Testovaná látka je po expoziční dobu udržována v kontaktu s kůží pomocí porézního mulového obvazu a nedráždivé náplasti. Testovanou plochu je dále třeba vhodným způsobem překrýt, aby se mulový obvaz a testovaná látka fixovaly a aby se zabránilo orálnímu příjmu. K zamezení požití látky je možno použít i prostředků pro omezení volnosti pohybu, úplnou imobilizaci však nelze doporučit. Jako alternativní metody je možno použít „ochranného límce“.
  Po uplynutí doby expozice se odstraní zbytky testované látky, vodou nebo s použitím jiného vhodného způsobu očištění pokožky.
  Všechna zvířata je třeba denně pozorovat a zaznamenávat příznaky otravy včetně jejich počátku, stupně a trvání. Pozorování zahrnuje změny srsti, kůže, očí a sliznic, a také dýchání a krevního oběhu, změny funkce autonomní a centrální nervové soustavy, somatomotorické aktivity a chování. Hmotnosti zvířat se zaznamenávají týdně. Doporučuje se zaznamenávat týdně i spotřebu potravy. Je třeba zajistit pravidelné prohlížení zvířat, aby pokud možno nedocházelo ke ztrátám zvířat jako např. v důsledku kanibalismu, autolýzy tkání nebo chybného zařazení. Po skončení studie se všechna zvířata, která přežila, s výjimkou satelitních skupin, pitvají. Zvířata v agonii, v těžkém stresu či trpící bolestí je třeba okamžitě vyřadit, humánně utratit a pitvat.
  1. Na konci pokusu se u všech zvířat včetně kontrolních provedou následující vyšetření:
    1. 1. Hematologické vyšetření má zahrnovat alespoň stanovení hematokritu, koncentrace hemoglobinu, počtu erytrocytů, celkového a diferenciálního počtu leukocytů a srážlivosti krve.
    2. 2. Biochemická analýza krve: k posouzení funkce jater a ledvin stanovit alespoň jeden z těchto parametrů: alaninaminotransferáza v séru (dříve známá jako glutamát-pyruvát-transamináza), aspartátaminotransferáza séra (dříve glutamát-oxalacetát-transamináza), dusík močoviny, albumin, kreatinin, celkový bilirubin a celkové bílkoviny v séru.
    Mezi další charakteristiky, které mohou být potřebné pro úplné toxikologické hodnocení patří stanovení: vápníku, fosforu, chloridů, sodíku, draslíku, glukózy nalačno, lipidů, hormonů, acidobazické rovnováhy, methemoglobinu, aktivity cholinesterázy.
    Další biochemické analýzy mohou být v případě potřeby použity pro studium širšího spektra účinků.
  1. 1.4.2.1 Pitva
    U všech zvířat použitých ve studii se provede pitva. Aspoň játra, ledviny, nadledviny, plíce a varlata se co nejdříve po sekci zváží ve vlhkém stavu, aby se předešlo vysychání. Orgány a tkáně např. normální a exponovaná kůže, játra, ledviny, slezina, varlata, nadledviny, srdce i všechny orgány s makroskopickými lézemi nebo změnami velikosti) je třeba přechovávat ve vhodném médiu s ohledem na pozdější histopatologická vyšetření.
  1. 1.4.2.2 Histopatologické vyšetření
    U všech zvířat skupiny, které byla podána nejvyšší dávka, a u zvířat kontrolní skupiny, je třeba provést histologické vyšetření uchovaných orgánů a tkání. Pokud se v orgánech a tkáních ve skupině s nejvyšší dávkou, objeví poškození způsobená testovanou látkou, je nutno provést histologické vyšetření těchto tkání i u všech skupin s nižšími dávkami. U zvířat satelitních skupin je třeba provést histologické vyšetření se zvláštním důrazem na orgány a tkáně, ve kterých se objevily účinky otravy u ostatních exponovaných zvířat.

2 ÚDAJE
Údaje se sestaví do tabulky. Z ní musí být pro každou experimentální skupinu patrný počet zvířat na počátku pokusu a počet zvířat s jednotlivými formami poškození.
Všechny zjištěné výsledky je třeba vyhodnotit vhodnou statistickou metodou. Je k tomu možno použít kteroukoliv uznávanou statistickou metodu.

3 PROJEKT POKUSU, PROTOKOL POKUSU A ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA
V souladu se s příslušnými právními předpisy⁹) musí být zpracován projekt pokusu a o průběhu pokusu je nutno vést protokol.
1. Zpráva o průběhu pokusu obsahuje tyto informace:
  1. - údaje o zvířatech (druh, kmen, původ, podmínkách chovu, krmení atd.),
  2. - experimentální podmínky ( včetně druhu obvazu; okluzívní nebo neokluzívní),
  3. - úrovně dávek (včetně vehikula, pokud se použije) a koncentrace,
  4. - úroveň bez účinku, pokud ji lze stanovit,
  5. - údaje o toxických odpovědích podle pohlaví a dávky,
  6. - doba uhynutí během experimentu, případně údaj o přežití zvířat do konce sledování,
  7. - toxické nebo jiné účinky,
  8. - doba, kdy byly pozorovány jednotlivé abnormální příznaky a jejich další vývoj,
  9. - spotřeba potravy a vývoj tělesné hmotnosti,
  10. - hematologická vyšetření a jejich výsledky,
  11. - biochemická vyšetření a jejich výsledky,
  12. - pitevní nálezy,
  13. - detailní popis všech histopatologických nálezů,
  14. - statistické vyhodnocení výsledků, kde je to možné.
Diskuse.
Závěry.

B.10 MUTAGENITA - TEST CHROMOZÓMOVÝCH ABERACÍ U SAVČÍCH BUNĚK IN VITRO

1 METODA je v souladu s právem Evropských společenství.⁵)

1.1 Úvod
Účelem analýzy chromozómových aberací in vitro je nalézt látky, jež v kulturách savčích buněk způsobují strukturální chromozómové aberace.⁵) Strukturální aberace jsou dvojího druhu: chromozómové a chromatidové. Aberace vyvolané chemickými mutageny jsou většinou chromatidové, dochází však též k aberacím chromozómového typu. Vznik polyploidie může naznačovat, že daná chemická látka je schopna vyvolávat numerické aberace. Tato metoda však není navržena k analýze numerických aberací a běžně se k tomuto účelu nepoužívá. Chromozómové mutace a příbuzné jevy jsou příčinou řady genetických chorob u člověka a existují přesvědčivé doklady toho, že chromozómové mutace a příbuzné jevy, jež způsobují změny v onkogenech a tumorsupresorových genech somatických buněk, hrají úlohu při vzniku rakoviny u člověka a experimentálních zvířat.
Tento test se používá k odhalení možných savčích mutagenů a karcinogenů. Řada chemických látek, které jsou v tomto testu pozitivní, je sice pro savce karcinogenní, není však dostatečná korelace mezi tímto testem a karcinogenitou. Tato korelace závisí na druhu látky a existuje stále více dokladů o tom, že existují chemické látky, jejichž karcinogenní vlastnosti se tímto testem nezjistí, protože zřejmě působí jiným mechanismem než přímým poškozením DNA.
K analýze chromozómových aberací in vitro se mohou použít kultury stabilizovaných buněčných linií, buněčných kmenů nebo primární buněčné kultury. Použité buňky jsou vybrány na základě schopnosti růstu v kultuře, stability karyotypu, počtu chromozómů, jejich diverzity a četnosti spontánních chromozómových aberací.
Testy in vitro vyžadují obecně exogenní zdroj metabolické aktivace. Tento systém metabolické aktivace nedokáže dokonale napodobit podmínky u savců in vivo. Je třeba se vyvarovat podmínek, které by mohly vést k pozitivním výsledkům, jež neodrážejí vnitřní mutagenitu, nýbrž jsou způsobeny změnami pH, osmolality nebo vysokou cytotoxicitou.⁵)

1.2 Definice
Aberace chromatidového typu: strukturální poškození chromozómu, které se projevuje jako zlom jedné, případně obou chromatid, nebo zlom a opětovné spojení mezi chromatidami.
Aberace chromozómového typu: strukturální poškození chromozómu vyjádřená jako zlom respektive jako zlom a opětovné spojení obou chromatid na stejném místě (zahrnuty jsou aberace typu dicentrický chromozóm, prsténčitý chromozóm-ring).
Zlom chromatidy: jako zlom lze hodnotit porušení kontinuity jedné nebo obou chromatid za předpokladu, že vzniklá mezera ve struktuře chromatidy je větší než je šířka poškozené chromatidy. Dále pak v případech, koncový (distální) fragment v místě zlomu je dislokovaný (nebo mimo osu chromatidy), případně jedna chromatida hodnoceného chromozómu je kratší v důsledku delece.
Endoreduplikace: proces, kde po S-fázi replikace DNA nepřechází jádro do mitózy, nýbrž začíná další S-fáze. Výsledkem jsou chromozómy s 4, 8, 16, ... chromatidami.
Gap: achromatická léze menší než šířka jedné chromatidy a s minimálním vybočením chromatid.
Mitotický index: poměr buněk v metafázi dělený celkovým počtem buněk v dané populaci buněk; udává stupeň proliferace této populace.
Numerická aberace: změna počtu chromozómů oproti normálnímu počtu charakteristickému pro použité buňky.
Polyploidie: násobek haploidního počtu chromozómů (n) jiný než diploidní počet (tedy 3n, 4n atd.).
Strukturální aberace: změna chromozómové struktury zjistitelná mikroskopickou analýzou buněčného dělení ve stádiu metafáze, pozorovaná jako delece a fragmenty a výměny.

1.3 Princip metody
Buněčné kultury se vystaví působení testované látky, a to s metabolickou aktivací a bez ní. Ve stanovených intervalech po expozici buněčné kultury testované látce, se metafáze zastaví například Colcemidem® nebo kolchicinem, buňky se sklidí, obarví se a v metafázických buňkách se mikroskopicky zjišťují chromozómové aberace.

1.4 Popis metody

1.4.1 Příprava
1. 1.4.1.1 Buňky
  Je možno použít celou řadu buněčných linií, kmenů nebo primárních buněčných kultur, včetně buněk lidských (například fibroblasty čínského křečka nebo lymfocyty periferní krve člověka či jiného savce).
1. 1.4.1.2 Média a kultivační podmínky
  K udržování kultur je třeba používat vhodná kultivační média a inkubační podmínky (kultivační nádoby, koncentrace CO₂, teplota a vlhkost). U buněčných linií a kmenů je třeba běžným způsobem kontrolovat stabilitu modálního počtu chromozómů a nepřítomnost mykoplasmat v buňkách. V případě kontaminace se buňky nepoužívají. Je třeba znát normální dobu buněčného cyklu a kultivační podmínky.
1. 1.4.1.3 Příprava kultur
  Stabilizované buněčné linie a kmeny: buňky se množí ze zásobních kultur vysetím do kultivačního média v takové hustotě, aby kultury nedosáhly konfluentní vrstvy před dobou sklízení a inkubují se při teplotě 37°C.
  Lymfocyty: ke kultivačnímu médiu obsahujícímu mitogen (např. fytohemoglutinin) se přidá buď plná krev s vhodným antikoagulantem (např. heparinem) nebo separované lymfocyty získané od zdravých jedinců a kultivují se při teplotě 37°C.
1. 1.4.1.4 Metabolická aktivace
  Na buňky se testovanou látkou působí v přítomnosti i v nepřítomnosti vhodného metabolického aktivačního systému. Nejobvyklejší je kofaktory suplementovaná mitochondriální frakce (S9) připravená z jater hlodavců, ovlivněná činidly indukujícími enzymy jako je Aroclor 1254, nebo směs fenobarbitalu a β-naftoflavonu.⁵)
  Konečná koncentrace mitochondriální frakce v médiu činí obvykle 1 – 10 % v/v. Aktivita metabolického aktivačního systému bude záviset na tom, jakého typu je testovaná látka. V některých případech je vhodné použít mitochondriální frakci v několika koncentracích.
  Pro účely endogenní aktivace mohou být použity i geneticky modifikované buněčné linie exprimující specifické aktivační enzymy. Výběr buněčných linií by měl být vědecky ověřen (např. vztahem isoenzymu cytochromu P450 k metabolismu testované látky).
1. 1.4.1.5 Příprava testované látky
  Je-li testovaná látka v pevném stavu, látka se před působením na buňky rozpustí nebo se připraví její suspenze ve vhodném rozpouštědle a případně naředí. Kapalné testované látky se mohou do systému přidávat přímo nebo se předtím ředí. Je třeba používat čerstvé preparáty, ledaže údaje o jejich stabilitě prokazují, že delší skladování neovlivňuje jejich vlastnosti.

1.4.2 Podmínky testu

1.4.2.1 Rozpouštědlo
U zvoleného rozpouštědla nesmí existovat podezření, že by mohlo s testovanou látkou chemicky reagovat, a nesmí narušovat přežívání buněk a aktivitu S9. Používá-li se méně známé rozpouštědlo musí být podpořeno referencemi prokazujícími jeho kompatibilitu. Doporučuje se, aby všude tam, kde je to možné, bylo na prvním místě zvažováno použití jako rozpouštědla vody. Je-li testovaná látka ve vodě nestálá, musí být použité organické rozpouštědlo zcela bezvodé. Voda se dá odstranit molekulárním sítem.

1.4.2.2 Koncentrace
Mezi kritéria, jež se uvažují při stanovování nejvyšší koncentrace, patří cytotoxicita, rozpustnost v systému a změny pH resp. osmolality.
Cytotoxicita se stanoví s metabolickou aktivací i bez ní v hlavním experimentu, přičemž se použije vhodné indikace buněčné integrity a růstu, například stupně konfluence, počet živých buněk, nebo mitotický index. Je vhodné stanovit cytotoxicitu a rozpustnost v předběžných experimentech.
Je třeba použít minimálně tři analyzovatelné koncentrace. Dochází-li k cytotoxicitě, musí tyto koncentrace pokrývat rozsah od maximální do nízké nebo nulové toxicity. To obvykle znamená, že se jednotlivé koncentrace nebudou lišit více než násobkem, který leží mezi hodnotami 2 a √10. V době sklízení buněk musí být při nejvyšší koncentraci pozorován signifikantní pokles konfluentního růstu, počtu buněk, nebo mitotického indexu (vždy o více než 50%). Mitotický index je pouze nepřímou mírou cytotoxických/ cytostatických účinků a je závislý na době uplynulé po expozici testovanou látkou. Je však akceptovatelný pro suspenzní kultury, kde by jiná detekce toxicity byla obtížná a nepraktická. Jako doplňující informace je možno použít také údaje o kinetice buněčného dělení, jako je průměrný generační čas; ten ovšem představuje celkový průměr, který ne vždy odhalí existenci v dělení zpožděných subpopulací buněk. A tak i malé prodloužení průměrného generačního času může znamenat značný odklon od vhodné doby sklízení z hlediska optimálního výtěžku aberací.
U relativně necytotoxických látek činí maximální koncentrace testované látky nejnižší z hodnot 5 μl/ml, 5 mg/ml nebo 0,01 M.
U relativně nerozpustných látek, jež jsou netoxické v koncentracích nižších než je koncentrace při které se již látka nerozpouští, má být nejvyšší použitá koncentrace vyšší než je mez rozpustnosti ve finálním kultivačním médiu na konci kultivace s testovanou látkou. V některých případech – například dochází-li k toxickému účinku při koncentracích vyšších než je nejnižší nerozpustná koncentrace – se doporučuje testovat při několika koncentracích s viditelným srážením. Může být užitečné vyhodnotit rozpustnost na počátku a na konci působení, protože se během expozice může rozpustnost změnit v testovacím systému vlivem přítomnosti buněk, séra, S9 apod. Nerozpustnost se dá zjistit i prostým okem. Sraženina nesmí být na překážku při hodnocení buněk.

1.4.2.3 Negativní a pozitivní kontroly

Do každého experimentu, ať již s metabolickou aktivací nebo bez ní, je třeba zařadit souběžné pozitivní a negativní kontroly (rozpouštědlo, nebo vehikulum). Pokud se aplikuje metabolická aktivace, musí být pozitivní kontrolou látka vyžadující metabolickou aktivaci k vyvolání mutagenního účinku.

Pro pozitivní kontrolu se používá známý klastogen, a to při expozičních úrovních, kde se očekává, že poskytne reprodukovatelný a detekovatelný nárůst aberací nad pozadí, prokazující citlivost testovacího systému.

Koncentrace pro pozitivní kontrolu je třeba zvolit tak, aby účinek byl zřejmý, ale neodhaloval hodnotiteli přímo identitu zakódovaných preparátů. Mezi látky pro pozitivní kontrolu patří například:

B.10 MUTAGENITA - TEST CHROMOZÓMOVÝCH ABERACÍ U SAVČÍCH BUNĚK IN VITRO
Metabolická aktivace	Látka	CAS	EINECS
Ne	methyl methansulfonát	66-27-3	200-625-0
	ethyl methansulfonát	62-50-0	200-536-7
	ethyl nitrosomočovina	759-73-9	212-072-2
	mitomycin C	50-07-7	200-008-6
	4-nitrochinolin-N-oxid	56-57-5	200-281-1
Ano	benz[a]pyren	50-32-8	200-028-5
Ano	Cyklofosfamid monohydrát cyklofosfamidu	50-18-0 6055-19-2	200-015-4

Pro pozitivní kontrolu se mohou použít i jiné vhodné látky. Tam, kde je to možné, je vhodné použít pro pozitivní kontrolu látku ze stejné chemické skupiny.

Pro každý časový interval sklízení kultur je třeba použít i negativní kontrolu, ve které se používá rozpouštědlo nebo vehikulum v kultivačním médiu, zpracované stejným způsobem jako experimentální kultury. Mimoto je rovněž třeba zařadit kontrolu bez jakéhokoliv ovlivnění.

1.4.3 Postup
1. 1.4.3.1 Expozice testovanou látkou
  Na proliferující buňky se působí testovanou látkou za přítomnosti i nepřítomnosti metabolického aktivačního systému. Na lymfocyty je třeba začít působit asi 48 hodin po stimulaci mitogenem.
  Obvykle se pro každou koncentraci používají dvě kultury; a totéž se doporučuje pro negativní kontroly s rozpouštědlem, nebo vehikulem. Pokud lze na základě historických údajů prokázat, že rozdíly mezi duplicitními kulturami jsou minimální, je přijatelné, aby se pro každou koncentraci použila jenom jedna kultura.⁵)
  V případě plynných nebo těkavých látek je třeba uplatnit v testu vhodné postupy, jako je použití neprodyšně uzavřených kultivačních nádob.
1. 1.4.3.2 Doba sklízení kultury
  V prvním experimentu se buňky vystaví testované látce s metabolickou aktivací i bez ní po dobu 3 – 6 hodin a vzorky se odebírají v čase odpovídajícím zhruba 1,5-násobku normální délky buněčného cyklu od začátku expozice.⁵) Pokud jsou při použití aktivačního systému i bez něho výsledky negativní, provádí se další experiment bez aktivace, s kontinuální expozicí až do doby ukončení kultivace odpovídají zhruba 1,5-násobku normálního buněčného cyklu. Některé látky se hodnotí snáze při době expozice delší než je 1,5-násobek délky buněčného cyklu. Negativní výsledky s metabolickou aktivací se posuzují případ od případu. V případech, kdy se potvrzení negativních výsledků nepokládá za nutné, je třeba toto rozhodnutí zdůvodnit.
1. 1.4.3.3 Příprava chromozómů
  Na buněčné kultury se působí Colcemidem® nebo kolchicinem obvykle po dobu 1 – 3 hodin před ukončením kultivace. Každá buněčná kultura se pro přípravu chromozómů zpracovává zvlášť. Příprava chromozómů sestává z ovlivnění buněk hypotonickým roztokem, fixace a obarvení.
1. 1.4.3.4 Analýza
  Všechny preparáty, včetně pozitivních a negativních kontrol, se před mikroskopickou analýzou nezávisle zakódují. Jelikož fixační postupy často vedou k rozbití určitého podílu metafázických buněk a ztrátě chromozómů, musí být u všech typů buněk počet centromer v hodnocených buňkách roven modálnímu číslu ± 2. Pro každou koncentraci a kontrolu je třeba hodnotit minimálně 200 dobře rozprostřených metafází, stejnoměrně z obou kultur, pokud byly použity.V případě, že je počet aberací vysoký, může se počet analyzovaných metafází snížit.
  I když účelem testu je zjistit strukturální chromozómové aberace, je také důležité zaznamenat případnou polyploidii a endoreduplikaci.

2 ÚDAJE
1. 2.1 Zpracování výsledků
  Jelikož experimentální jednotkou je buňka, je třeba vyhodnotit procento buněk se strukturálními chromozómovými aberacemi. Je třeba registrovat jednotlivé typy strukturálních aberací včetně jejich počtu a četnosti u experimentálních i kontrolních kultur. Gapy se zaznamenávají zvlášť, ale obvykle se do celkové četnosti aberací nezahrnují.
  Současně je třeba v testu zaznamenávat také zjištěnou cytotoxicitu v experimentálních i kontrolních kulturách.
  Udávají se data pro jednotlivé kultury. Nakonec se všechna data uvedou v sumární tabulce.
  Verifikace zjevně pozitivních výsledků se nepožaduje. Nejednoznačné výsledky se objasňují dalším testováním, nebo modifikací experimentálních podmínek. O nutnosti potvrdit negativní výsledky bylo pojednáno v odst. 1.4.3.2. V následných experimentech je třeba zvážit modifikaci použitých parametrů tak, aby se rozšířil rozsah posuzovaných podmínek. K parametrům, které lze modifikovat, patří koncentrační intervaly a podmínky metabolické aktivace.
1. 2.2 Vyhodnocení a interpretace výsledků
  Ke zjišťování pozitivního výsledku se používá několik kritérií, například na koncentraci testované látky závislá frekvence buněk s chromozómovými aberacemi. Nejprve je třeba uvážit biologickou významnost výsledků. Při vyhodnocování výsledků testu se mohou použít statistické metody.⁵) Statistická významnost by však neměla být jediným určujícím faktorem pozitivního výsledku.
  Nárůst počtu polyploidních buněk může indikovat, že testovaná látka má schopnost inhibovat mitotické procesy a vyvolávat numerické chromozómové aberace. Nárůst počtu buněk s endoreduplikovanými chromozómy může naznačovat, že testovaná látka má schopnost inhibovat fáze buněčného cyklu.⁵)
  Testovaná látka, při jejímž použití výsledky nesplňují výše uvedená kritéria, se v tomto systému považuje za nemutagenní.
  Ačkoliv většina experimentů vykazuje jasně pozitivní, nebo negativní výsledky, ve výjimečných případech získaná data nedovolují jednoznačné posouzení účinku testované látky. Výsledky mohou být nejisté, nebo diskutabilní bez ohledu na počet opakovaných experimentů. Pozitivní výsledky testu na chromozómové aberace in vitro ukazují, že testovaná látka vyvolává v kultuře savčích somatických buněk strukturální chromozómové aberace. Negativní výsledky ukazují, že za daných experimentálních podmínek testovaná látka v kultuře savčích somatických buněk chromozómové aberace nevyvolává.

3 PROJEKT POKUSU, PROTOKOL POKUSU A ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA
V souladu se s příslušnými právními předpisy⁹) musí být zpracován projekt pokusu a o průběhu pokusu je nutno vést protokol.
1. Ve zprávě o průběhu pokusu je třeba uvést tyto informace:
  1. Rozpouštědlo/ vehikulum:
    1. - zdůvodnění volby rozpouštědla/vehikula
    2. - rozpustnost a stabilita testované látky v rozpouštědle/vehikulu, pokud je známa.
  1. Buňky:
    1. Podmínky pokusu:
      1. Výsledky:
        - známky toxicity, tj. stupeň konfluence, údaje o buněčném cyklu, o počtu buněk,
        - známky srážení,
        - údaje o pH a osmolalitě expozičního média, pokud byly stanoveny,
        - definice aberací, včetně gapů,
        - počet buněk s chromosomovými aberacemi a typy aberací zvlášť pro každou exponovanou a kontrolní kulturu,
        - změny ploidie, pokud byly pozorovány,
        - podle možnosti závislost odpovědi na dávce,
        - případné statistické analýzy,
        - data o souběžné negativní (rozpouštědlo/vehikulum) a pozitivní kontrole,
        - dosavadní data o negativní (rozpouštědlo/vehikulum) a pozitivní kontrole s rozpětími, středními hodnotami a směrodatnými odchylkami.
Diskuse výsledků.
Závěry.

B.11 MUTAGENITA - TEST CHROMOZOMOVÝCH ABERACÍ V KOSTNÍ DŘENI SAVCŮ IN VIVO

1 METODA je v souladu s právem Evropských společenství.⁵)

1.1 Úvod
Účelem analýzy chromozómových aberací u savců in vivo je zjistit strukturální chromozómové aberace vyvolané testovanou látkou v buňkách kostní dřeně zvířat, obvykle hlodavců.⁵) Strukturální aberace mohou být dvojího druhu: chromozómové a chromatidové. Nárůst polyploidie může naznačovat, že daná chemická látka je schopna vyvolávat numerické aberace. Aberace vyvolané chemickými mutageny jsou většinou chromatidové, ovšem k aberacím chromozómového typu dochází rovněž. Chromozómové mutace a příbuzné jevy jsou příčinou řady genetických chorob u člověka a existují přesvědčivé doklady toho, že chromozómové mutace a příbuzné jevy, jež způsobují změny v onkogenech a tumorsupresorových genech, hrají úlohu při rakovině u člověka a v experimentálních systémech.
K tomuto testu se běžně využívají hlodavci. Cílovou tkání v něm je kostní dřeň, protože se jedná o tkáň vysoce vaskularizovanou, obsahující populaci rychle se dělících buněk, jež se dají snadno izolovat a zpracovat. Jiné živočišné druhy a cílové tkáně se v tomto testu nepoužívají.
Tento test na chromozómové aberace je zvláště důležitý při hodnocení mutagenního rizika, protože umožňuje brát v úvahu faktory metabolismu in vivo, farmakokinetiky a procesů reparace DNA, i když zde mohou být mezi živočišnými druhy a mezi tkáněmi rozdíly. Test in vivo je také vhodný pro další analýzu mutagenního efektu, který byl předtím zjištěn testem in vitro.
Existují-li doklady o tom, že se testovaná látka nebo její reaktivní metabolit do cílové tkáně nedostane, není vhodné použití tohoto testu.

1.2 Definice
Aberace chromatidového typu: strukturální poškození chromozómu, které se projevuje jako zlom jedné, případně obou chromatid, nebo zlom a opětovné spojení mezi chromatidami.
Aberace chromozómového typu: strukturální poškození chromozómu vyjádřená jako zlom respektive jako zlom a opětovné spojení obou chromatid na stejném místě (zahrnuty jsou aberace typu dicentrický chromozóm, prsténčitý chromozóm-ring).
Zlom chromatidy: jako zlom lze hodnotit porušení kontinuity jedné nebo obou chromatid za předpokladu, že vzniklá mezera ve struktuře chromatidy je větší než je šířka poškozené chromatidy. Dále pak v případech, koncový (distální) fragment v místě zlomu je dislokovaný (nebo mimo osu chromatidy), případně jedna chromatida hodnoceného chromozómu je kratší v důsledku delece.
Endoreduplikace: proces, kde po S-fázi replikace DNA nepřechází jádro do mitózy, nýbrž začíná další S-fáze. Výsledkem jsou chromozómy s 4, 8, 16, ... chromatidami.
Gap: achromatická léze menší než šířka jedné chromatidy a s minimálním vybočením chromatid.
Mitotický index: poměr buněk v metafázi dělený celkovým počtem buněk v dané buněčné populaci; udává stupeň proliferace této populace.
Numerická aberace: změna počtu chromozómů oproti normálnímu počtu charakteristickému pro použité buňky.
Polyploidie: násobek haploidního počtu chromozomů (n) mimo diploidní počet (tedy 3n, 4n atd.).
Strukturální aberace: změna chromozómové struktury zjistitelná mikroskopickou analýzou buněčného dělení ve stádiu metafáze, pozorovaná jako delece a fragmenty a výměny.

1.3 Princip metody
Zvířata se vhodným způsobem vystaví testované látce a ve vhodnou dobu po působení se usmrtí. Před usmrcením se na ně působí látkou zastavující metafázi (například kolchicinem nebo Colcemidem®). Z buněk kostní dřeně se pak připraví preparáty a v metafázických buňkách se mikroskopicky zjišťují chromozómové aberace.

1.4 Popis metody

1.4.1 Příprava
1. 1.4.1.1 Výběr živočišného druhu
  Běžně se používají potkani, myši a čínští křečci, lze ovšem použít i jakýkoliv jiný vhodný savčí druh. Používají se běžné laboratorní kmeny mladých zdravých jedinců. Hmotnostní rozdíly by při zahájení studie měly být minimální a u každého pohlaví nemají přesahovat ± 20 % průměrné hmotnosti.
1. 1.4.1.2 Podmínky chovu
  Všeobecné podmínky chovu jsou uvedeny ve Všeobecném úvodu v části B, vlhkost by měla být 50 – 60 %.
1. 1.4.1.3 Příprava zvířat
  Pokusná zvířata jsou vybrána s ohledem na druh, pohlaví, a stáří v souladu s ustanovením § 15 zvláštního právního předpisu¹⁰) a označena tak, aby byla možná identifikace jednotlivých zvířat. Dobu navykání stanoví § 10 zvláštního právního předpisu.¹⁰)
1. 1.4.1.4 Příprava dávek
  Je-li testovaná látka v pevném stavu, před podáním zvířatům se rozpustí nebo se připraví její suspenze ve vhodném rozpouštědle nebo vehikulu a případně se zředí. Kapalné testované látky se mohou podávat přímo nebo se před podáváním ředí. Je třeba používat čerstvé preparáty, ledaže údaje o stálosti prokazují, že skladování ji neovlivní.

1.4.2 Podmínky testu

1.4.2.1 Rozpouštědlo/vehikulum
Rozpouštědlo/vehikulum v používaných dávkách nesmí vyvolávat toxické účinky a nesmí s testovanou látkou chemicky reagovat. Používá-li se ne příliš známé rozpouštědlo, musí být jeho použití podpořeno údaji o kompatibilitě s testovanou látkou. Doporučuje se, aby kde je to možné, bylo na prvním místě použito vodné rozpouštědlo/ vehikulum.

1.4.2.2 Kontroly

Do každého testu je třeba pro každé pohlaví zařadit souběžné pozitivní a negativní (rozpouštědlo/vehikulum) kontroly. Je třeba zacházet se zvířaty ve všech skupinách stejně.

Pozitivní kontroly by měly vyvolávat strukturální aberace in vivo při dávkách, kdy lze očekávat jejich detekovatelné zvýšení nad spontánní úroveň. Dávky při pozitivní kontrole se volí tak, aby byly účinky patrné, ale přitom nenapovídaly hodnotiteli totožnost zakódovaného preparátu. Pozitivní kontrolu je možné podávat odlišným způsobem než testovanou látku a vzorek odebírat v jednom časovém intervalu. Kde je to možné, je třeba používat pozitivní kontrolu ze stejné chemické skupiny, jako je testovaná látka. Příklady látek vhodných pro pozitivní kontrolu:

B.10 MUTAGENITA - TEST CHROMOZÓMOVÝCH ABERACÍ U SAVČÍCH BUNĚK IN VITRO B.11 MUTAGENITA - TEST CHROMOZOMOVÝCH ABERACÍ V KOSTNÍ DŘENI SAVCŮ IN VIVO
Látka	CAS	EINECS
ethyl methansulfonát	62-50-0	200-536-7
ethyl nitrosomočovina	759-73-9	212-072-2
mitomycin C	50-07-7	200-008-6
cyklofosfamid cyklofosfamid monohydrát	50-18-0 6055-19-2	200-015-4
triethylenmelamin	51-18-3	200-083-5

Negativní kontroly ovlivněné rozpouštědlem nebo vehikulem a zpracované stejným způsobem jako experimentální skupiny měly by být zařazeny do všech časových intervalů zpracování, pokud nejsou k dispozici přijatelné historické údaje o frekvenci chromozómových aberací a o interindividuální variabilitě mezi zvířaty. Aplikuje-li se u negativních kontrol pouze jeden odběr vzorků, je nejvhodnější dobou první interval odběru vzorků. Mimoto je třeba použít i neovlivněných kontrol, ledaže existují historické nebo publikované údaje prokazující, že zvolené rozpouštědlo, nebo vehikulum nevyvolává žádné nepříznivé nebo mutagenní účinky.

1.5 Postup
1. 1.5.1 Počet a pohlaví zvířat
  V každé experimentální a kontrolní skupině musí být minimálně pět analyzovatelných jedinců každého pohlaví. Pokud v době, kdy se studie provádí, existují údaje o stejném živočišném druhu a použití stejných způsobů expozice prokazující, že mezi oběma pohlavími nejsou v toxicitě podstatné rozdíly, je testování pouze na jednom pohlaví postačující. Tam, kde humánní expozice chemickým látkám může být závislá na pohlaví, jak je tomu například u některých farmaceutických přípravků, provádí se test na zvířatech odpovídajícího pohlaví.
1. 1.5.2 Dávkovací schéma
  Testovanou látku je nejvhodnější podávat jednorázově. Pokud se jedná o objemnou dávku, může se k usnadnění aplikace dávka rozdělit, například na dvě dávky za den podané v rozmezí nanejvýše několika hodin. Jiné režimy dávkování musejí být vědecky odůvodněné.
  Vzorky se odebírají ve dvou různých časových intervalech po podání téhož dne. U hlodavců je první interval odběru vzorků 1,5-násobek normální délky buněčného cyklu (která činí obvykle 12 – 18 hodin) po podání látky. Jelikož doba potřebná pro absorpci a metabolismus testované látky a její vliv na kinetiku buněčného cyklu mohou ovlivnit optimální dobu pro detekci chromozómových aberací, doporučuje se další odběr vzorků po 24 hodinách od prvního odběru. Pokud se v daném dávkovacím režimu látka podává vícekrát než jednou za den, je třeba provést jeden odběr vzorků 1,5-násobkem délky normálního buněčného cyklu po posledním podání látky.
  Před usmrcením se zvířatům intraperitoneálně injikuje vhodná dávka Colcemidu® nebo kolchicinu a následně se z nich ve vhodném intervalu odeberou vzorky. U myší je tento interval zhruba 3 – 5 hodin, u čínských křečků zhruba 4 – 5 hodin. Z kostní dřeně se odeberou buňky a zjišťují se v nich chromozómové aberace.
1. 1.5.3 Dávkování
  Provádí-li se studie ke zjištění rozpětí toxicity, protože nejsou k dispozici žádné vhodné údaje, je třeba ji provádět v téže laboratoři za použití stejného živočišného druhu, kmene, pohlaví a pokusného režimu, jaké se použijí v hlavní studii. Při zjištění toxicity, se užívají pro první časový interval odběru vzorků tři dávky tak, aby pokrývaly rozmezí od maximální toxicity k toxicitě nízké nebo nulové. Pro pozdější časový interval odběru vzorků je pak třeba použít jenom nejvyšší dávku. Ta je definována jako dávka vyvolávající takové známky toxicity, že při vyšších dávkách ve stejném režimu podávání by účinky byly letální. Látky, jež v nízkých netoxických dávkách vykazují specifickou biologickou aktivitu, jako jsou hormony nebo mitogeny, mohou představovat z těchto kritérií pro stanovení dávek výjimky, jež se vyhodnocují individuálně případ od případu. Nejvyšší dávka může být také definována jako dávka, která vede k určitým známkám toxicity v kostní dřeni (např. pokles mitotického indexu o více než 50 %).
1. 1.5.4 Limitní test
  Jestliže test při dávce minimálně 2 000 mg/kg hmotnosti v jedné dávce nebo ve dvou dávkách podaných v jeden den nevyvolává žádné pozorovatelné toxické účinky a jestliže se na základě údajů o látkách s podobnou chemickou strukturou neočekává genotoxicita, nemusí být provedena celá studie za použití tří dávkových úrovní. Pro dlouhodobé studie činí limitní dávka 2 000 mg/kg hmotnosti za den při době trvání do 14 dnů, a 1 000 mg/kg hmotnosti při době trvání delší než 14 dnů. Podle očekávané humánní expozice může být zapotřebí použít v limitním testu vyšší dávkové úrovně.
1. 1.5.5 Aplikace látky
  Testovaná látka se obvykle aplikuje buď žaludeční sondou, nebo intraperitoneální injekcí. V odůvodněných případech jsou přijatelné i jiné způsoby expozice. Maximální objem kapaliny, která se dá sondou nebo injekcí najednou vpravit, závisí na velikosti pokusného zvířete a nemá překročit 2 ml/100g hmotnosti; vyšší dávky musí být zdůvodněné. S výjimkou dráždivých nebo žíravých látek, jež normálně vykazují při vyšších koncentracích horší účinky, je třeba upravit koncentrace látky tak, aby objem byl ve všech dávkových úrovních stejný a minimalizovala se tak objemová variabilita.
1. 1.5.6 Příprava chromozómů
  Okamžitě po usmrcení zvířete se odebere kostní dřeň, působí se ni hypotonickým roztokem a dřeň se fixuje. Suspenze buněk se nakape na podložní sklo a obarví se.
1. 1.5.7 Analýza
  Jakožto míra cytotoxicity se u všech zvířat včetně pozitivních i negativních kontrol stanoví mitotický index pro minimálně 1000 buněk z každého jedince.
  Z každého jedince se analyzuje minimálně 100 buněk. Tento počet je možné snížit při vysokém počtu aberací. Všechny preparáty (včetně pozitivních a negativních kontrol) se před mikroskopickou analýzou nezávisle zakódují. Jelikož při jejich přípravě dochází často k porušení určitého podílu metafází spojeného se ztrátou chromozómů, musí být počet centromer v hodnocených buňkách 2n ± 2.

2 ÚDAJE
1. 2.1 Zpracování výsledků
  Údaje od jednotlivých zvířat se zaznamenávají v tabulce. Experimentální jednotkou je jedinec. U každého zvířete se zaznamenává počet hodnocených buněk, počet aberací na jednu buňku a procento buněk se strukturálními chromozómovými aberacemi. U experimentálních i kontrolních skupin se zaznamenají jednotlivé typy strukturálních chromozómových aberací, jejich počet a četnost. Gapy se zaznamenávají zvlášť a registrují se, ale obvykle se do celkové frekvence aberací nezahrnují. Nejsou-li žádné doklady o tom, že obě pohlaví reagují rozdílně, je možné údaje za obě pohlaví pro statistickou analýzu sloučit.
1. 2.2 Vyhodnocení a interpretace výsledků
  Ke zjišťování pozitivního výsledku se používá několik kritérií, například na koncentraci testované látky závislá frekvence buněk s chromozómovými aberacemi, nebo zřetelný nárůst počtu buněk s aberacemi ve skupině s jednorázovou dávkou při jednom časovém intervalu odběru vzorků. Nejprve je třeba uvážit biologickou významnost výsledků. Při vyhodnocování výsledků testu se mohou použít statistické metody. Statistická významnost by však neměla být jediným určujícím faktorem pozitivního výsledku. Nejednoznačné výsledky je třeba vyjasnit dalším testováním, nejlépe za modifikovaných experimentálních podmínek.
  Nárůst počtu polyploidních buněk může indikovat, že testovaná látka má schopnost inhibovat mitotické procesy a vyvolávat numerické chromozómové aberace. Nárůst počtu buněk s endoreduplikovanými chromozómy může naznačovat, že testovaná látka má schopnost inhibovat fáze buněčného cyklu.⁵)
  Testovaná látka, při jejímž použití výsledky nesplňují výše uvedená kritéria, se v tomto systému považuje za nemutagenní.
  Většina experimentů sice poskytuje jednoznačně pozitivní nebo negativní výsledky, v ojedinělých případech však nelze ze získaného souboru dat vyvodit o aktivitě testované látky definitivní závěr. Výsledky mohou být stále nejednoznačné nebo problematické, i když se experiment několikrát opakuje.
  Pozitivní výsledky testu na chromozómové aberace in vivo ukazují, že testovaná látka vyvolává v kostní dřeni příslušného živočišného druhu strukturální chromozómové aberace. Negativní výsledky ukazují, že za daných experimentálních podmínek testovaná látka v kostní dřeni příslušného živočišného druhu chromozómové aberace nevyvolává.
  Je třeba vzít v úvahu, jaká je pravděpodobnost, že testovaná látka bude široce používána, nebo jakou specifickou cílovou tkáň zasáhne (např. systémová toxicita).

3 PROJEKT POKUSU, PROTOKOL POKUSU A ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA
V souladu se s příslušnými právními předpisy⁹) musí být zpracován projekt pokusu a o průběhu pokusu je nutno vést protokol.
1. Ve zprávě o průběhu pokusu je třeba uvést tyto informace:
  1. Rozpouštědlo/vehikulum:
    1. - zdůvodnění volby vehikula,
    2. - rozpustnost a stabilita testované látky v rozpouštědle/vehikulu, pokud je známa.
  1. Pokusná zvířata:
    1. - použitý živočišný druh/kmen,
    2. - počet, věk a pohlaví jedinců,
    3. - původ, chovné podmínky, strava apod.,
    4. - hmotnost jednotlivých zvířat na počátku testu, včetně hmotnostního rozpětí, průměrů a směrodatných odchylek pro jednotlivé skupiny.
  1. Podmínky pokusu:
    1. - pozitivní a negativní (vehikulum/rozpouštědlo) kontroly,
    2. - údaje ze studie pro určení rozpětí, byla-li provedena,
    3. - zdůvodnění volby velikosti dávky,
    4. - podrobnosti o přípravě testované látky,
    5. - podrobnosti o podávání testované látky,
    6. - zdůvodnění způsobu podávání,
    7. - případně metody k ověření, že se látka dostala do celkového oběhu nebo do cílové tkáně,
    8. - případně převod koncentrace látky v potravě/pitné vodě (ppm) na skutečnou dávku (mg/kg hmotnosti/den),
    9. - podrobnosti o kvalitě potravy a vody,
    10. - podrobný popis podávání testované látky a odběru vzorků,
    11. - metody hodnocení toxicity,
    12. - látka zastavující metafázi, její koncentrace a doba aplikace,
    13. - metody přípravy mikroskopických preparátů
    14. - kritéria pro hodnocení aberací,
    15. - počet analyzovaných buněk na jedno zvíře,
    16. - kritéria, jimiž se studie hodnotí jako pozitivní, negativní nebo nejednoznačná.
  1. Výsledky:
    1. - známky toxicity,
    2. - mitotický index,
    3. - typ a počet aberací pro každého jedince zvlášť,
    4. - celkový počet aberací v dané skupině, jejich průměr a směrodatná odchylka,
    5. - počet buněk s aberacemi ve skupině se středními hodnotami a směrodatnými odchylkami,
    6. - případné změny ploidie,
    7. - vztah dávka-účinek, je-li to možné,
    8. - statistické analýzy, byly-li provedeny,
    9. - údaje ze souběžných negativních kontrol,
    10. - historické údaje z negativních kontrol včetně rozpětí, průměrů a směrodatných odchylek.
    11. - údaje ze souběžných pozitivních kontrol.
Diskuse výsledků.
Závěry.

B.12 MUTAGENITA - IN VIVO MIKRONUKLEUS TEST V SAVČÍCH ERYTROCYTECH

1 METODA je v souladu s právem Evropských společenství.⁵)

1.1 Úvod
Mikronukleus test in vivo u savců slouží ke zjištění poškození, jež testovaná látka způsobuje v chromozómech nebo v mitotickém aparátu erytroblastů; test spočívá v tom, že se analyzují erytrocyty z kostní dřeně nebo z periferní krve zvířat, obvykle hlodavců.
Účelem mikronukleus testu je zjistit látky, jež způsobují cytogenetické poškození, jehož výsledkem je vznik mikrojader představujících chromozómové fragmenty nebo celých chromozómů.
Když z erytroblastu kostní dřeně vznikne polychromatický erytrocyt, jádro je z buňky vyloučeno; případně zbude v cytoplasmě vzniklé mikrojádro. Vizualizace mikrojádra je usnadněna tím, že těmto buňkám jádro chybí. Nárůst četnosti polychromních erytrocytů s mikrojádry je u experimentálních zvířat důkazem poškození chromozómů.
V tomto testu se kostní dřeň hlodavců používá běžně proto, že se polychromní erytrocyty v této tkáni tvoří. Analýza nezralých (polychromních) erytrocytů s mikrojádry v periferní krvi je použitelná u každého živočišného druhu, u kterého bylo prokázáno, že jeho slezina nedokáže erytrocyty s mikrojádry odstraňovat nebo že je tento živočišný druh dostatečně citlivý pro detekci látek způsobujících strukturální nebo numerické chromozómové aberace. Mikrojádra se dají rozlišovat podle řady kritérií, jako je přítomnost či nepřítomnost kinetochoru (centromery), nebo centromerické DNA v mikrojádru. Konečným cílem je stanovení četnosti nezralých (polychromních) erytrocytů s mikrojádry. Také počet zralých (normochromních) erytrocytů v periferní krvi obsahujících mikrojádra v rámci daného počtu zralých erytrocytů lze jako základní hodnotu použít v případě, že se zvířata testují po dobu minimálně čtyř týdnů.
Tento in vivo mikronukleus test u savců je zvláště vhodný k hodnocení rizika mutagenity protože umožňuje zohlednit faktory metabolismu in vivo, farmakokinetiky a procesů reparace DNA, i když zde mohou být mezi živočišnými druhy, mezi tkáněmi a mezi konečným efektem rozdíly. Test in vivo je také užitečný pro další výzkum mutagenního efektu, který byl předtím zjištěn v systému in vitro.
Existují-li doklady o tom, že se testovaná látka nebo její reaktivní metabolit do cílové tkáně nedostane, není použití tohoto testu vhodné.

1.2 Definice
Centromera (kinetochor): oblasti chromozómů, se kterými se během dělení pojí vlákna dělícího vřeténka umožňující organizovaný pohyb dceřiných chromozómů k pólům dceřiných buněk.
Mikrojádro (mikronukleus): malá jádra oddělená od jádra buňky (nucleus) vytvářená během telofáze mitózy, nebo meiózy reprezentovaná opožďujícími se fragmenty chromozómů nebo celými chromozómy.
Normochromní erytrocyt: zralý erytrocyt, jemuž chybějí ribozómy a jenž se dá od nezralých, polychromních erytrocytů odlišit pomocí barviva selektivního pro ribozómy.
Polychromní erytrocyt: nezralý erytrocyt, vývojové stádium, kdy jsou dosud přítomny ribozómy, takže jej lze odlišit od zralých, normochromních erytrocytů pomocí barviva selektivního pro ribozómy.

1.3 Princip metody
Zvířata jsou vhodným způsobem exponována testované látce. Pokud se používá kostní dřeň, zvířata se ve vhodnou dobu po působení látky usmrtí, kostní dřeň se isoluje a připraví se preparáty, jež se obarví (1-7). Pokud se používá periferní krev, odebere se ve vhodné době po působení látky a připraví se nátěry, jež se obarví.⁵) V experimentech, ve kterých se používá periferní krev musí být doba od poslední expozice do zpracování buněk co nejkratší. V preparátech se zjišťuje přítomnost mikrojader.

1.4 Popis metody

1.4.1 Příprava
1. 1.4.1.1 Výběr živočišného druhu
  Pokud se používá kostní dřeň, doporučují se jako pokusná zvířata myši nebo potkani; může však být použit jiný vhodný savčí druh. Používá-li se periferní krev, doporučují se myši. Lze ovšem použít jakýkoliv vhodný savčí druh za předpokladu, že se u něj slezinou neodstraňují erytrocyty s mikrojádry nebo že u něj byla prokázána dostatečná citlivost vůči látkám, jež způsobují strukturální nebo numerické chromozómové aberace. Používají se běžné laboratorní kmeny mladých zdravých jedinců. Hmotnostní rozdíly by při zahájení studie měly být minimální a u každého pohlaví nemají přesahovat ± 20 % průměrné hmotnosti.
1. 1.4.1.2 Podmínky chovu
  Všeobecné podmínky chovu jsou uvedeny ve Všeobecném úvodu.
  Vlhkost by měla být 50 – 60 %.
1. 1.4.1.3 Příprava zvířat
  Zdraví mladí dospělí jedinci se náhodně rozdělí do kontrolní a experimentální skupiny. Jedinci se jednoznačně označí a po dobu minimálně pěti dní se zvířata aklimatizují v laboratorních podmínkách. Klece je třeba uspořádat tak, aby se minimalizovaly případné vlivy toho, jak a kde jsou klece umístěny.
1. 1.4.1.4 Příprava dávek
  Je-li testovaná látka v pevném stavu a je-li to možné, látka se před podáním zvířatům rozpustí nebo se připraví její suspenze ve vhodném rozpouštědle nebo vehikulu. Kapalné testované látky se mohou podávat přímo nebo se před podáváním ředí. Je třeba používat čerstvé preparáty, ledaže údaje o stálosti (stabilitě) prokazují, že skladování ji neovlivní.

1.4.2 Podmínky testu

1.4.2.1 Rozpouštědlo / vehikulum
Rozpouštědlo / vehikulum v používaných dávkách nesmí vyvolávat toxické účinky a nesmí s testovanou látkou chemicky reagovat. Používá-li se nepříliš známé rozpouštědlo, musí být jeho použití podpořeno údaji o kompatibilitě s testovanou látkou. Doporučuje se, aby kde je to možné, bylo na prvním místě použito vodné rozpouštědlo / vehikulum.

1.4.2.2 Kontroly

Do každého testu je třeba pro každé pohlaví zařadit souběžné pozitivní a negativní (rozpouštědlo/vehikulum) kontroly. Je třeba zacházet se zvířaty ve všech skupinách stejně.

U pozitivních kontrol by měla být nalezena mikrojádra in vivo při dávkách, kdy lze očekávat jejich detekovatelné zvýšení nad spontánní úroveň. Dávky při pozitivní kontrole se volí tak, aby byly účinky patrné, ale přitom nenapovídaly hodnotiteli totožnost zakódovaného preparátu. Pozitivní kontrolu je možné podávat odlišným způsobem než testovanou látku a vzorek odebírat v jednom časovém intervalu. Kde je to možné, je třeba používat pozitivní kontrolu ze stejné chemické skupiny, jako je testovaná látka. Příklady látek vhodných pro pozitivní kontrolu:

B.10 MUTAGENITA - TEST CHROMOZÓMOVÝCH ABERACÍ U SAVČÍCH BUNĚK IN VITRO B.11 MUTAGENITA - TEST CHROMOZOMOVÝCH ABERACÍ V KOSTNÍ DŘENI SAVCŮ IN VIVO B.12 MUTAGENITA - IN VIVO MIKRONUKLEUS TEST V SAVČÍCH ERYTROCYTECH
Látka	CAS	EINECS
ethyl methansulfonát	62-50-0	200-536-7
N-ethyl nitrosomočovina	759-73-9	212-072-2
mitomycin C	50-07-7	200-008-6
cyklofosfamid monohydrát cyklofosfamidu	50-18-0 6055-19-2	200-015-4
triethylenmelamin	51-18-3	200-083-5

Negativní kontroly ovlivněné rozpouštědlem nebo vehikulem a zpracované stejným způsobem jako experimentální skupiny měly by být zařazeny do všech časových intervalů zpracování, pokud nejsou k dispozici přijatelné historické údaje o frekvenci buněk s mikrojádry a o interindividuální variabilitě mezi zvířaty. Aplikuje-li se u negativních kontrol pouze jeden odběr vzorků, je nejvhodnější dobou první interval odběru vzorků. Mimoto je třeba použít i neovlivněných kontrol, ledaže existují historické nebo publikované údaje prokazující, že zvolené rozpouštědlo, nebo vehikulum nevyvolává žádné nepříznivé nebo mutagenní účinky.

Používá-li se periferní krev, může být jako souběžná negativní kontrola přijatelný i vzorek odebraný před působením látky, ovšem pouze v rámci krátkodobých studií v periferní krvi (např. 1 – 3 dávky ), kde výsledné údaje leží v očekávaném rozmezí historické kontroly.

1.5 Postup
1.6 Počet a pohlaví zvířat

Následující stránka