Platné znění

Vyhláška, kterou se stanoví základní metody pro zkoušení toxicity chemických látek a chemických přípravků

účinné od 1. 8. 2004V každé experimentální a kontrolní skupině musí být minimálně pět analyzovatelných jedinců každého pohlaví.5) Pokud v době, kdy se studie provádí, existují údaje o stejném živočišném druhu a použití stejných způsobů expozice prokazující, že mezi oběma pohlavími nejsou v toxicitě podstatné rozdíly, je testování pouze na jednom pohlaví postačující. Tam, kde humánní expozice chemikáliím může být závislá na pohlaví, jak je tomu například u některých farmaceutických přípravků, provádí se test na zvířatech odpovídajícího pohlaví.

  1. účinné od 1. 8. 20041.7 Dávkovací schéma

    účinné od 1. 8. 2004Nelze jednoznačně doporučit žádný standardní rozvrh (např. jedna, dvě nebo více dávek v 24-hodinových intervalech). Lze použít delší dávkovací schémata, pokud se v daném experimentu neprokáže pozitivní efekt; v případě negativního výsledku tak dlouho, až se prokáže toxicita, nebo byla použita limitní dávka a podávání pokračovalo až do doby odběru vzorků. Pokud se jedná o objemnou dávku testované látky, může se k usnadnění aplikace rozdělit, například na dvě dávky za den podané v rozmezí nanejvýše několika hodin.

    1. účinné od 1. 8. 2004Test se může provádět dvěma způsoby:

      účinné od 1. 8. 2004(a) Na zvířata se testovanou látkou působí jednorázově. Vzorky kostní dřeně se odeberou minimálně dvakrát, poprvé ne dříve než po 24 hodinách a celkově ne později než po 48 hodinách od podání látky, s vhodnými intervaly mezi odběry vzorků. Pokud se vzorky odeberou dříve než po 24 hodinách, musí to být odůvodněné. Vzorky periferní krve se odeberou minimálně dvakrát, poprvé ne dříve než po 36 hodinách od podání látky, se vhodnými intervaly po prvním odběru vzorku, celkově však nikoli déle než 72 hodiny. Pokud se v některém časovém intervalu zjistí pozitivní odpověď, není již další odběr zapotřebí.

      účinné od 1. 8. 2004(b) Pokud se látka podává dvakrát nebo vícekrát za den (např. dvě nebo více dávek ve 24-hodinových intervalech), odeberou se vzorky v případě kostní dřeně jednou mezi 18 až 24 hodinami po posledním podání látky a v případě periferní krve jednou mezi 36 a 48 hodinami po posledním podání látky.5)

      účinné od 1. 8. 2004Je-li to relevantní, mohou se mimoto použít i další odběrové intervaly.

  1. účinné od 1. 8. 20041.8 Dávkování

    účinné od 1. 8. 2004Provádí-li se studie ke zjištění rozpětí toxicity, protože nejsou k dispozici žádné vhodné údaje, je třeba ji provádět v téže laboratoři za použití stejného živočišného druhu, kmene, pohlaví a pokusného režimu, jaké se použijí v hlavní studii.5) Při zjištění toxicity se užívají pro první časový interval odběru vzorků tři dávky tak, aby pokrývaly rozmezí od maximální toxicity k toxicitě nízké, nebo nulové. Pro pozdější časový interval odběru vzorků je pak třeba použít jenom nejvyšší dávku. Ta je definována jako dávka vyvolávající takové známky toxicity, že při vyšších dávkách ve stejném režimu podávání by účinky byly letální Látky, jež v nízkých netoxických dávkách vykazují specifickou biologickou aktivitu, jako jsou hormony nebo mitogeny, mohou představovat výjimky z těchto kritérií pro stanovení dávek a vyhodnocují se případ od případu. Nejvyšší dávka může být také definována jako dávka, která vede k určitým známkám toxicity v kostní dřeni (např. pokles podílu nezralých erytrocytů z celkového počtu erytrocytů v kostní dřeni resp. periferní krvi).

  1. účinné od 1. 8. 20041.9 Limitní test

    účinné od 1. 8. 2004Jestliže test při dávce minimálně 2000 mg/kg hmotnosti v jedné dávce nebo ve dvou dávkách podaných v jeden den nevyvolává žádné pozorovatelné toxické účinky a jestliže se na základě údajů o látkách s podobnou chemickou strukturou neočekává genotoxicita, nemusí být provedena celá studie za použití tří dávkových úrovní. Pro dlouhodobé studie je limitní dávka 2000 mg/kg hmotnosti za den při době trvání do 14 dnů, a 1000 mg/kg hmotnosti při době trvání delší než 14 dnů. Podle očekávané humánní expozice může být zapotřebí použít v limitním testu dávkové úrovně vyšší.

  1. účinné od 1. 8. 20041.10 Aplikace látky

    účinné od 1. 8. 2004Testovaná látka se obvykle vpravuje buď žaludeční sondou, nebo intraperitoneální injekcí. V odůvodněných případech mohou být přijatelné i jiné způsoby expozice. Maximální objem kapaliny, která se dá sondou nebo injekcí najednou vpravit, závisí na velikosti pokusného zvířete a nemá překročit 2 ml/100 g hmotnosti; vyšší dávky musí být zdůvodněné. S výjimkou dráždivých nebo žíravých látek, jež normálně vykazují při vyšších koncentracích horší účinky, je třeba upravit koncentrace látky tak, aby objem byl ve všech dávkových úrovních stejný a minimalizovala se tak objemová variabilita.

  1. účinné od 1. 8. 20041.11 Příprava kostní dřeně/krve

    účinné od 1. 8. 2004Buňky kostní dřeně se obvykle získávají z femuru nebo tibie okamžitě po usmrcení zvířete. Běžným způsobem se kostní dřeň vyjme z femuru nebo tibie, buňky se izolují a obarví zavedenými metodami. Periferní krev se získává z ocasní žíly nebo jiné vhodné cévy. Krevní buňky se okamžitě za vitálního stavu obarví,5) nebo se zhotoví nátěry, které se posléze obarví. Použitím barviva specifického pro DNA (např. akridinové oranže5) nebo Hoechst 33258 s pyroninem-Y5)) se mohou eliminovat některé z artefaktů vznikajících při použití barviva, které není DNA specifické. Tato výhoda neznamená, že by se nedala použít běžná barviva (např. Giemsa). Lze použít i další systémy – například kolony se sloupcem celulózy k odstranění buněk s jádrem5) – pokud tyto metody jsou v laboratoři rutinně používány pro analýzu mikrojader.

  1. účinné od 1. 8. 20041.12 Analýza

    účinné od 1. 8. 2004U každého jedince se stanoví podíl nezralých erytrocytů z celkového počtu erytrocytů (nezralé + zralé). K tomuto účelu se počítá v případě kostní dřeně minimálně 200 erytrocytů a v případě použití periferní krve minimálně 1000 erytrocytů.5) Všechny preparáty (včetně pozitivních i negativních kontrol) se před mikroskopickou analýzou nezávisle zakódují. U každého jedince se vyhodnocuje minimálně 2000 nezralých erytrocytů a zaznamená se počet erytrocytů s mikrojádry. Doplňující informace lze získat tak, že se mikrojádra analyzují ve zralých erytrocytech. Při analýze preparátů nemá být podíl nezralých erytrocytů z celkového počtu erytrocytů menší než 20 % hodnoty v kontrole. Pokud jsou zvířata exponována kontinuálně po dobu čtyř týdnů nebo delší, lze také počet mikrojader vyhodnotit z minimálně 2000 zralých erytrocytů na každého jedince. Možnou alternativou k manuálnímu vyhodnocování jsou systémy automatické analýzy (analýza obrazu a průtoková cytometrická analýza - flow cytometry), pokud jsou zdůvodněny a validovány.

  1. účinné od 1. 8. 20042 ÚDAJE
    1. účinné od 1. 8. 20042.1 Zpracování výsledků

      účinné od 1. 8. 2004Údaje u jednotlivých zvířat se zaznamenávají do tabulky. Experimentální jednotkou je zvíře. U každého jedince se zvlášť zaznamená počet analyzovaných nezralých erytrocytů, počet nezralých erytrocytů s mikrojádry a podíl nezralých erytrocytů ze všech erytrocytů. Pokud byl test prováděn kontinuálně po dobu čtyř týdnů nebo déle, je třeba uvést také údaje o zralých erytrocytech (pokud byly pořizovány). Podíl nezralých erytrocytů z celkového počtu erytrocytů a případně procento erytrocytů s mikrojádry se udává pro každého jedince. Nejsou-li žádné doklady o tom, že obě pohlaví reagují rozdílně, je možné údaje za obě pohlaví pro statistickou analýzu sloučit.

    1. účinné od 1. 8. 20042.2 Vyhodnocení a interpretace výsledků

      účinné od 1. 8. 2004Ke zjišťování pozitivního výsledku se používá několik kritérií, například na koncentraci testované látky závislý nárůst počtu buněk s mikrojádry nebo zřetelný nárůst počtu buněk s mikrojádry ve skupině s jednorázovou dávkou při jednom časovém intervalu odběru vzorků. Nejprve je třeba uvážit biologickou významnost výsledků. Při vyhodnocování výsledků testu se mohou použít statistické metody.5) Statistická významnost by však neměla být jediným určujícím faktorem pozitivního výsledku. Nejednoznačné výsledky je třeba vyjasnit dalším testováním, nejlépe za modifikovaných experimentálních podmínek.

      účinné od 1. 8. 2004Testovaná látka, při jejímž použití výsledky nesplňují výše uvedená kritéria, se v tomto systému považuje za nemutagenní.

      účinné od 1. 8. 2004Většina experimentů sice poskytuje jednoznačně pozitivní nebo negativní výsledky, v ojedinělých případech však nelze ze získaného souboru dat vyvodit o aktivitě testované látky definitivní závěr. Výsledky mohou být stále nejednoznačné nebo problematické, i když se experiment několikrát opakuje.

      účinné od 1. 8. 2004Pozitivní výsledky mikronukleus testu ukazují, že látka vyvolává tvorbu mikrojader, jako důsledek chromozómového poškození nebo poškození mitotického aparátu v erytroblastech testovaného zvířecího druhu. Negativní výsledky ukazují, že za daných experimentálních podmínek testovaná látka v kostní dřeni příslušného živočišného druhu nevyvolává vznik mikrojader v nezralých erytrocytech.

      účinné od 1. 8. 2004Je třeba uvažovat, jaká je pravděpodobnost, že testovaná látka bude široce používána, nebo jakou specifickou cílovou tkáň zasáhne (např. systémová toxicita).

  1. účinné od 1. 8. 20043 PROJEKT POKUSU, PROTOKOL POKUSU A ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA

    účinné od 1. 8. 2004V souladu se s příslušnými právními předpisy9) musí být zpracován projekt pokusu a o průběhu pokusu je nutno vést protokol.

    1. účinné od 1. 8. 2004Ve zprávě o průběhu pokusu je třeba uvést tyto informace:
      1. účinné od 1. 8. 2004Rozpouštědlo / vehikulum:
        1. účinné od 1. 8. 2004Pokusná zvířata:
          1. účinné od 1. 8. 2004- použitý živočišný druh/kmen,
          2. účinné od 1. 8. 2004- počet, věk a pohlaví jedinců,
          3. účinné od 1. 8. 2004- původ, chovné podmínky, strava apod.,
          4. účinné od 1. 8. 2004- hmotnost jednotlivých zvířat na počátku testu, včetně hmotnostního rozpětí, průměrů a směrodatných odchylek pro jednotlivé skupiny.
        1. účinné od 1. 8. 2004Podmínky pokusu:
          1. účinné od 1. 8. 2004- pozitivní a negativní (rozpouštědlo/vehikulum) kontroly,
          2. účinné od 1. 8. 2004- údaje ze studie pro určení rozpětí, byla-li provedena,
          3. účinné od 1. 8. 2004- zdůvodnění volby velikosti dávky,
          4. účinné od 1. 8. 2004- podrobnosti o přípravě testované látky,
          5. účinné od 1. 8. 2004- podrobnosti o podávání testované látky,
          6. účinné od 1. 8. 2004- zdůvodnění cesty podávání,
          7. účinné od 1. 8. 2004- případné metody k ověření, že se látka dostala do celkového oběhu nebo do cílové tkáně,
          8. účinné od 1. 8. 2004- případný převod koncentrace látky v potravě/pitné vodě (ppm) na faktickou dávku (mg/kg hmotnosti ),
          9. účinné od 1. 8. 2004- podrobnosti o kvalitě potravy a vody,
          10. účinné od 1. 8. 2004- podrobný popis podávání testované látky a odběru vzorků,
          11. účinné od 1. 8. 2004- metody přípravy mikroskopických preparátů,
          12. účinné od 1. 8. 2004- metody měření toxicity,
          13. účinné od 1. 8. 2004- kritéria pro hodnocení nezralých erytrocytů s mikrojádry,
          14. účinné od 1. 8. 2004- počet analyzovaných buněk u každého jedince,
          15. účinné od 1. 8. 2004- kritéria, jimiž se studie hodnotí jako pozitivní, negativní nebo nejednoznačná.
        1. účinné od 1. 8. 2004Výsledky:
          1. účinné od 1. 8. 2004- známky toxicity,
          2. účinné od 1. 8. 2004- podíl počtu nezralých erytrocytů k celkovému počtu erytrocytů,
          3. účinné od 1. 8. 2004- počet nezralých erytrocytů s mikrojádry pro každého jedince zvlášť,
          4. účinné od 1. 8. 2004- průměrný počet ± směrodatná odchylka nezralých erytrocytů s mikrojádry pro každou skupinu,
          5. účinné od 1. 8. 2004- vztah dávka- účinek, je-li to možné,
          6. účinné od 1. 8. 2004- použité statistické analýzy a metody,
          7. účinné od 1. 8. 2004- údaje ze souběžných a historických negativních kontrol,
          8. účinné od 1. 8. 2004- údaje ze souběžných pozitivních kontrol.

    účinné od 1. 8. 2004Diskuse výsledků.

    účinné od 1. 8. 2004Závěry.

účinné od 1. 8. 2004B.13/14 MUTAGENITA - TEST REVERZNÍCH MUTACÍ U BAKTERIÍ

  1. účinné od 1. 8. 20041 METODA je v souladu s právem Evropských společenství.5)
    1. účinné od 1. 8. 20041.1 Úvod

      účinné od 1. 8. 2004Při bakteriálním testu reverzních mutací se používají k detekci genových mutací kmeny Salmonella typh imurium (auxotrofní ve vztahu k aminokyselině histidin) a kmeny Escherichia coli (auxotrofní ve vztahu k aminokyselině tryptofan). Pomocí uvedených systémů lze detekovat genové mutace vzniklé mechanismem substituce, adice nebo delece jednoho nebo několika nukleotidů v chromozómu indikátorových bakteriálních kmenů.5) Princip bakteriálního testu reverzních mutací spočívá v tom, že se zjišťují mutace, které zpětně vracejí mutace přítomné v testovacím kmenu do původního stavu a obnovuje se funkční schopnost bakterie syntetizovat určitou základní aminokyselinu. Takto změněná bakteriální buňka je detekována na základě své schopnosti růst za nepřítomnosti aminokyseliny, kterou vyžaduje mateřský zkušební kmen.

      účinné od 1. 8. 2004Genové mutace jsou u člověka příčinou řady genetických nemocí a existují přesvědčivé doklady toho, že genové mutace v onkogenech a tumorově supresorových genech somatických buněk hrají u člověka a pokusných zvířat roli při vzniku nádorů. Bakteriální test na reverzní mutace je rychlý, levný a relativně jednoduchý. Řada testovacích kmenů se vyznačuje charakteristikami, díky nimž jsou citlivější pro detekci mutací, včetně citlivých sekvencí DNA v místech reverze, zvýšené propustnosti buněk pro velké molekuly a eliminace systémů reparace DNA či posílení takových procesů reparace DNA, jež jsou náchylné k chybám. Specifita testovacích kmenů umožňuje získat některé užitečné informace o typech mutací, jež jsou vyvolány genotoxickými látkami. Pro bakteriální testy reverzních mutací je k dispozici velmi rozsáhlá databáze výsledků pro širokou škálu struktur a byly vypracovány osvědčené metody pro testování chemikálií o různých fyzikálně-chemických vlastnostech, včetně chemikálií těkavých.

    1. účinné od 1. 8. 20041.2 Definice

      účinné od 1. 8. 2004Test reverzních mutací s použitím kmenů Salmonella typhi murium nebo Escherichia coli slouží ke zjištění mutací v kmeni závislém na určité aminokyselině (histidinu resp. tryptofanu), jež vedou ke vzniku kmene, který je na dodávce aminokyseliny zvenku nezávislý.

      účinné od 1. 8. 2004Mutageny vyvolávající substituci páru bází jsou látky způsobující změnu bází v DNA. Při reverzním testu může k takové změně dojít na místě původní mutace nebo na jiném místě bakteriálního genomu.

      účinné od 1. 8. 2004Frameshift mutageny (mutageny vyvolávající posunové mutace) jsou látky, jež způsobují přidání nebo odebrání jednoho nebo více párů bází v DNA, čímž se mění čtecí rámec v RNA.

    1. účinné od 1. 8. 20041.3 Výchozí úvahy

      účinné od 1. 8. 2004V bakteriálním testu se využívají prokaryotické buňky, které se od savčích buněk liší v příjmu látek metabolismu, chromozomální struktuře a procesech opravy DNA.

      účinné od 1. 8. 2004Testy in vitro obecně vyžadují exogenní zdroj metabolické aktivace. Systémy metabolické aktivace in vitro ovšem nedokáží dokonale imitovat savčí podmínky in vivo, takže test neposkytuje přímé informace o mutagenní a karcinogenní potenci dané látky v organismech savců.

      účinné od 1. 8. 2004Bakteriální test reverzních mutací se běžně používá jako prvotní screening genotoxické aktivity a zvláště aktivity vyvolávající genové mutace. Pomocí rozsáhlé databáze se prokázalo, že mnohé chemikálie, které jsou v tomto testu pozitivní, vykazují také v jiných testech mutagenní aktivitu. Existují ovšem i příklady mutagenních látek, jež se tímto testem neodhalí; důvodem tohoto nedostatku může být specifická povaha vyhodnocovaných veličin, rozdíly v metabolické aktivaci nebo rozdíly v biologické dostupnosti. Na druhé straně faktory, jež citlivost bakteriálního testu reverzní mutace zvyšují, mohou vést k tomu, že se mutagenní aktivita testované látky přecení.

      účinné od 1. 8. 2004Bakteriální test reverzních mutací může být nevhodný pro určité třídy chemických látek, jakými jsou například některé silně baktericidní sloučeniny (kupříkladu určitá antibiotika) a látky, o nichž se předpokládá nebo ví, že specificky narušují replikační systém savčích buněk (například některé inhibitory topoizomerázy nebo některá analoga nukleozidů); v takovém případě mohou být vhodnější testy na mutace u savců.

      účinné od 1. 8. 2004Mnohé sloučeniny, jež jsou při tomto testu pozitivní, jsou skutečně karcinogenní pro savce, ovšem korelace není absolutní; závisí na chemické třídě, a existují karcinogeny, které tímto testem odhaleny nejsou, protože působí jiným, negenotoxickým mechanismem nebo mechanismem, který v bakteriálních buňkách neprobíhá.

    1. účinné od 1. 8. 20041.4 Princip metody

      účinné od 1. 8. 2004Suspenze bakteriálních buněk se vystaví působení testované látky za přítomnosti a za nepřítomnosti exogenního systému metabolické aktivace. Při klasické miskové metodě “plate incorporation“ se suspenze smísí s vrchním agarem a vylije na misky s minimální živnou půdou. Při preinkubační metodě se pokusná směs inkubuje a smísí s vrchním agarem a až potom se očkuje na minimální živnou půdu. Při obou metodách se dva až tři dny po inkubaci revertantní kolonie spočítají a výsledek se porovná s počtem spontánně revertujících kolonií na kontrolních miskách s rozpouštědlem.

      účinné od 1. 8. 2004Je popsáno několik postupů pro provedení testu. Z nich nejběžnější jsou klasická misková metoda [“plate incorporation“],5) preinkubační metoda,5) fluktuační metoda5) a suspenzní metoda.5) Jsou také popsány jejich modifikace pro testování plynů nebo par.5)

      účinné od 1. 8. 2004Postupy popsané v rámci metody se týkají hlavně metody plate incorporation a metody preinkubační. Obě tyto metody jsou přijatelné pro experimenty jak s metabolickou aktivací, tak bez ní. Některé látky se detekují účinněji preinkubační metodou; jedná se o chemické třídy, kam spadají alifatické nitrosaminy s krátkým řetězcem, dvojmocné kovy, aldehydy, azobarviva a diazosloučeniny, pyrrolizidinové alkaloidy, alylové sloučeniny a nitrosloučeniny.5) Také bylo zjištěno, že existují určité třídy mutagenů, které se pomocí uvedených standardních procedur vždy neodhalí. Na ty je třeba pohlížet jako na “speciální případy“, k jejichž detekci je třeba použít jiných metod. Byly identifikovány následující “speciální případy“ (spolu s příklady postupů, které se dají pro jejich detekci použít): azobarviva a diazosloučeniny,5) plyny a těkavé chemikálie5) a glykosidy.5) Odchylky od standardního postupu je třeba vědecky zdůvodnit.

    1. účinné od 1. 8. 20041.5 Popis metody
      1. účinné od 1. 8. 20041.5.1 Příprava
        1. účinné od 1. 8. 20041.5.1.1 Bakterie

          účinné od 1. 8. 2004Čerstvé bakteriální kultury se vypěstují do pozdního exponenciálního nebo počátečního stacionárního stadia růstu (zhruba 109 buněk/ml). Kultury v pozdním stacionárním stadiu se nepoužívají. Důležité je, aby kultury použité pro experiment obsahovaly vysoký titr životaschopných bakterií. Titr se dá prokázat buď z historických údajů růstových křivek, nebo v jednotlivých testech stanovením počtu životaschopných buněk očkováním na miskách.

          účinné od 1. 8. 2004Doporučená inkubační teplota činí 37°C.

          1. účinné od 1. 8. 2004Použije se minimálně pět bakteriálních kmenů, které budou zahrnovat čtyři kmeny S. typhi murium (TA1535; TA1537 nebo TA97a nebo TA97; TA98; a TA100); u nichž byla prokázána spolehlivost a reprodukovatelnost výsledků mezi různými laboratořemi. Tyto čtyři kmeny S. typhi murium mají na primárním reverzním místě páry bází GC a je známo, že nemusejí detekovat určité oxidační mutageny, látky vyvolávající křížové vazby a hydraziny. Tyto látky se dají detekovat pomocí kmenů E. coli WP2 nebo S. typhi murium TA102,5) které mají na primárním reverzním místě pár bází AT. Proto je doporučená kombinace kmenů tato:
            1. účinné od 1. 8. 2004- S. typhi murium TA1535,
            2. účinné od 1. 8. 2004- S. typhi murium TA1537 nebo TA97 nebo TA97a,
            3. účinné od 1. 8. 2004- S. typhi murium TA98,
            4. účinné od 1. 8. 2004- S. typhi murium TA100 a
            5. účinné od 1. 8. 2004- E. coli WP2 uvrA nebo E. coli WP2 uvrA (pKM101) nebo S. typhi murium TA102.

          účinné od 1. 8. 2004K detekci mutagenů vytvářejících křížové vazby může být nejvhodnější použít TA102 nebo přidat DNA reparačně proficientní kmen E. coli (např. E. coli WP2 nebo E. coli WP2 (pKM101)).

          účinné od 1. 8. 2004Je třeba použít zavedených postupů přípravy zásobní kultury, ověření markeru a uchovávání. Pro každý zmrazený preparát zásobní kultury je třeba prokázat závislost na aminokyselině nutné pro růst (histidin v případě kmenů S. typhi murium, tryptofan v případě kmenů E. coli). Podobně je třeba zkontrolovat i další fenotypické charakteristiky, a to: přítomnost či nepřítomnost R-faktor plazmidů tam, kde to přichází v úvahu (např. rezistence vůči ampicilinu u kmenů TA98, TA100 a TA97a nebo TA97, WP2 uvrA (pKM101) a rezistence vůči ampicilinu + tetracyklinu u kmene TA 102); přítomnost charakteristických mutací (tj. rfa mutace u S. typhimurium pomocí citlivosti vůči krystalové violeti a uvrA mutace u E. coli nebo uvrB mutace u S. typhimurium pomocí citlivosti na ultrafialové záření).5) Použité kmeny mají mít počet spontánně revertujících kolonií ve frekvenčním rozmezí očekávaném podle historických kontrolních dat dané laboratoře a pokud možno i v rozmezí uvedeném v literatuře.

        1. účinné od 1. 8. 20041.5.1.2 Médium

          účinné od 1. 8. 2004Použije se vhodný minimální agar (např. s Vogelovým-Bonnerovým minimálním médiem E a glukózou) a vrchní agar obsahující histidin a biotin nebo tryptofan umožňující několik dělení buněk.5)

        1. účinné od 1. 8. 20041.5.1.3 Metabolická aktivace

          účinné od 1. 8. 2004Bakterie se působení testované látky vystaví jak za přítomnosti, tak za nepřítomnosti vhodného systému metabolické aktivace. Nejčastěji se používá kofaktorem suplementovaná post-mitochondriální frakce (S9) připravená z jater hlodavců po indukci enzymů látkami jako je Aroclor 12545) nebo kombinace fenobarbitalu a β-naftoflavonu.5) Post-mitochondriální frakce se obvykle používá v koncentracích mezi 5 a 30 % v/v ve směsi S9. Volba a podmínky metabolického aktivačního systému mohou záviset na třídě testované chemikálie. V některých případech může být vhodné použít post-mitochondriální frakci v několika koncentracích. U azobarviv a diazosloučenin může být vhodnější použít redukční systém metabolické aktivace.5)

        1. účinné od 1. 8. 20041.5.1.4 Testovaná látka / příprava

          účinné od 1. 8. 2004Pevné látky se před působením na bakterie rozpustí nebo se připraví jejich suspenze ve vhodném rozpouštědle nebo vehikulu a případně se zředí. Kapalné látky se mohou do pokusného systému přidávat přímo nebo se předtím ředí. Je třeba používat čerstvé preparáty, ledaže údaje o stabilitě prokazují, že jejich delší skladování je přijatelné.

      1. účinné od 1. 8. 20041.5.2 Podmínky testu
        1. účinné od 1. 8. 20041.5.2.1 Pokusné kmeny (viz 1.5.1.1)
        2. účinné od 1. 8. 20041.5.2.2 Koncentrace

          účinné od 1. 8. 2004Ke kritériím, která je třeba vzít v úvahu při stanovení nejvyššího použitého množství testované látky, patří cytotoxicita a rozpustnost v konečné směsi, která se k působení použije.

          účinné od 1. 8. 2004Může být účelné stanovit toxicitu a nerozpustnost v předběžném experimentu. Cytotoxicita se dá zjistit snížením počtu revertantních kolonií, vymizením nebo zmenšením růstu na pozadí nebo pomocí stupně přežití pokusných kultur. Za přítomnosti metabolického aktivačního systému se může cytotoxicita změnit. Nerozpustnost se posuzuje podle srážení v konečné směsi za skutečných pokusných podmínek, viditelného i pouhým okem.

          účinné od 1. 8. 2004Doporučená maximální pokusná koncentrace je u rozpustných necytotoxických látek 5 mg/misku resp. 5 μl/misku. U necytotoxických látek, jež v těchto koncentracích nejsou rozpustné, by jedna nebo několik koncentrací mělo být v konečné pokusné směsi nerozpustných. Testované látky, jež jsou cytotoxické již za koncentrací nižších než 5 mg/misku resp. 5 μl/misku, se testují až do cytotoxické koncentrace. Sraženina nesmí rušit při vyhodnocování.

          účinné od 1. 8. 2004Používá se minimálně pěti různých analyzovatelných koncentrací se zhruba půl-logaritmickým intervalem (tj. √10) mezi jednotlivými body v prvotním experimentu. Zkoumá-li se koncentrační závislost, může být vhodný interval menší. Testování za koncentrací vyšších než 5 mg/misku resp. 5 μl/ misku přichází v úvahu, hodnotí.li se látka obsahující podstatné množství potenciálně mutagenních nečistot.

        1. účinné od 1. 8. 20041.5.2.3 Negativní a pozitivní kontroly

          účinné od 1. 8. 2004Každý test musí zahrnovat i souběžnou kmenově specifickou pozitivní a negativní (rozpouštědlo nebo vehikulum) kontrolu, jak s metabolickou aktivací, tak bez ní. Pro pozitivní kontrolu se volí takové koncentrace, jež prokazují efektivnost daného testu.

          účinné od 1. 8. 2004U testů s metabolickým aktivačním systémem se referenční látka pro pozitivní kontrolu volí podle použitého typu bakteriálního kmene.

          1. účinné od 1. 8. 2004Příklady látek, jež jsou vhodné pro pozitivní kontrolu v testech s metabolickou aktivací, uvádí tabulka:
            účinné od 1. 8. 2004
            B.13/14 MUTAGENITA - TEST REVERZNÍCH MUTACÍ U BAKTERIÍ
            LátkaCASEINECS
            9,10-dimethylantracen781-43-1212-308-4
            7,12-dimethylbenz[a] antracen57-97-6200-359-5
            benz[a]pyren50-32-8200-028-5
            2-aminoantracen613-13-8210-330-9
            cyklofosfamid
            monohydrát cyklofosfamidu            		50-18-0
            6055-19-2            		200-015-4
          1. účinné od 1. 8. 2004Následující látka je vhodnou pozitivní kontrolou při použití metabolické aktivace reduktázami:
            účinné od 1. 8. 2004
            B.13/14 MUTAGENITA - TEST REVERZNÍCH MUTACÍ U BAKTERIÍ
            LátkaCASEINECS
            Kongo červeň573-58-0209-358-4

          účinné od 1. 8. 20042-aminoantracen se nepoužívá jako jediný indikátor účinnosti směsi S9. Pokud se 2-aminoantracen použije, je třeba každou šarži S9 charakterizovat také mutagenem, který vyžaduje metabolickou aktivaci mikrosomálními enzymy, např. benz[a]pyrenem, dimethylbenzantracenem.

          1. účinné od 1. 8. 2004Příklady látek, jež jsou vhodné pro kmenově specifickou pozitivní kontrolu v testech bez exogenního systému metabolické aktivace, uvádí tato tabulka:
            účinné od 1. 8. 2004
            B.13/14 MUTAGENITA - TEST REVERZNÍCH MUTACÍ U BAKTERIÍ
            LátkaCASEINECS
            azid sodný26628-22-8247-852-1TA 1535 a TA 100
            2-nitrofluoren607-57-8210-138-5TA 98
            9-aminoakridin90-45-9201-995-6TA 1537, TA 97 a TA 97a
            ICR 19117070-45-0241-129-4TA 1537, TA 97 a TA 97a
            kumen-hydroperoxid80-15-9201-254-7TA 102
            mitomycin C50-07-7200-008-6WP2 uvrA a TA 102
            N-ethyl-N-nitro-N-nitrosoguanidin70-25-7200-730-1WP2, WP2uvrA a
            WP2uvrA(pKM101)
            4-nitrochinolin-1-oxid56-57-5200-281-1WP2, WP2uvrA a
            WP2uvrA(pKM101)
            urylfuramid (AF2)3688-53-7kmeny obsahující plazmidy

          účinné od 1. 8. 2004K pozitivní kontrole lze použít i jiné vhodné referenční látky. Jsou-li dostupné, je třeba uvážit použití chemikálií se vztahem k chemické třídě.

          účinné od 1. 8. 2004Je třeba použít i negativní kontroly sestávající z rozpouštědla nebo vehikula samotného, bez testované látky, se kterými se jinak zachází stejně jako při použití testované látky. Mimoto se použijí i negativní kontroly bez ovlivnění testovanou látkou, ledaže existují historické kontrolní údaje prokazující, že zvolené rozpouštědlo nevyvolává žádné rušivé či mutagenní účinky.

      1. účinné od 1. 8. 20041.5.3 Postup

        účinné od 1. 8. 2004Při klasické miskové metodě5) bez metabolické aktivace se obvykle smísí 0,05 nebo 0,1 ml testovaného roztoku, 0,1 ml čerstvé bakteriální kultury (obsahující zhruba 108 životaschopných buněk) a 0,5 ml sterilního pufru a 2,0 ml vrchního agaru. V testech s metabolickou aktivací se obvykle mísí 0,5 ml metabolické aktivační směsi obsahující přiměřené množství post-mitochondriální frakce (v rozmezí 5 – 30 % v/v v metabolické aktivační směsi) s 2,0 ml vrchního agaru společně s bakteriemi a testovanou látkou /testovaným roztokem. Obsah každé zkumavky se promísí a nalije na povrch misky s minimálním agarem. Vrchní agar se nechá před inkubací ztuhnout.

        účinné od 1. 8. 2004Při preinkubační metodě5) se testovaná látka / testovaný roztok nechá preinkubovat s pokusným kmenem (obsahujícím zhruba 108 životaschopných buněk) a sterilním pufrem nebo metabolickým aktivačním systémem (0,5 ml) obvykle po dobu 20 min nebo déle při 30 – 37 °C; potom se smísí s vrchním agarem a nalije na misku s minimálním agarem. Obvykle se mísí 0,05 nebo 0,1 ml testované látky / testovaného roztoku, 0,1 ml bakterií a 0,5 ml směsi S9 nebo sterilního pufru s 2,0 ml vrchního agaru. Zkumavky se během preinkubace provzdušňují třepáním.

        účinné od 1. 8. 2004Pro adekvátní odhad variací se pro každou dávku očkují tři misky. Duplicitní očkování je přijatelné, je-li vědecky zdůvodněno. Dojde-li náhodně ke ztrátě misky, nemusí to test nutně znehodnotit.

        účinné od 1. 8. 2004Plynné nebo těkavé látky se testují za použití vhodných postupů, například v zatavených nádobách.5)

      1. účinné od 1. 8. 20041.5.4 Inkubace

        účinné od 1. 8. 2004Všechny misky v rámci daného testu se inkubují při teplotě 37 °C po dobu 48 – 72 hodin, načež se spočítají revertantní kolonie na každé misce.

  1. účinné od 1. 8. 20042 ÚDAJE
    1. účinné od 1. 8. 20042.1 Zpracování výsledků

      účinné od 1. 8. 2004Údaje se prezentují jako počet revertantních kolonií na jednu misku. Rovněž se uvede počet revertantních kolonií jak z negativní kontroly (rozpouštědlo, popřípadě kontrola bez působení, byla-li použita), tak z kontroly pozitivní. Pro testovanou látku i pro pozitivní a negativní kontrolu (resp. bez působení rozpouštědlo) se uvedou počty pro jednotlivé misky a průměrný počet revertantních kolonií na jednu misku včetně směrodatné odchylky.

      účinné od 1. 8. 2004Verifikace zjevně pozitivní reakce se nepožaduje. Nejednoznačné výsledky se objasňují dalším testováním, nejlépe za modifikovaných experimentálních podmínek. Negativní výsledky se musejí potvrdit případ od případu. Pokud se potvrzení negativních výsledků nepovažuje za nutné, je třeba to zdůvodnit. V následných experimentech je třeba zvážit modifikaci studijních parametrů tak, aby se rozšířil rozsah posuzovaných podmínek. Ke studijním parametrům, které se dají modifikovat, patří rozdíly mezi koncentracemi, metoda působení („plate incorporation“ nebo preinkubace v tekutém prostředí) a podmínky metabolické aktivace.

    1. účinné od 1. 8. 20042.2 Vyhodnocení a interpretace výsledků

      účinné od 1. 8. 2004Ke stanovení pozitivního výsledku existuje několik kritérií, například dávkově závislý nárůst ve sledovaném rozmezí a/nebo reprodukovatelný nárůst počtu revertantních kolonií na jednu misku při jedné nebo více koncentracích u minimálně jednoho kmene s metabolickým aktivačním systémem nebo bez něj.5) Jako první se uvažuje biologická relevance výsledků. Jako pomůcku při vyhodnocování výsledků testu je možno využít statistické metody,5) statistická významnost by však neměla být jediným určujícím faktorem pro pozitivní reakci.

      účinné od 1. 8. 2004Testovaná látka, jejíž výsledky výše uvedená kritéria nesplňují, se v tomto testu považuje za nemutagenní.

      účinné od 1. 8. 2004Většina experimentů sice poskytuje jednoznačně pozitivní nebo negativní výsledky, v ojedinělých případech však nelze ze získaného souboru dat vyvodit o aktivitě testované látky definitivní závěr. Výsledky mohou být stále nejednoznačné nebo problematické, i když se experiment několikrát opakuje.

      účinné od 1. 8. 2004Pozitivní výsledky bakteriálního testu na reverzní mutace ukazují, že látka vyvolává genové mutace typu substitucí bází nebo posunových mutací v genomu Salmonella typhi murium resp. Escherichia coli. Negativní výsledky ukazují, že za daných zkušebních podmínek není testovaná látka ve zkušebním druhu mutagenní.

  1. účinné od 1. 8. 20043 PROJEKT POKUSU, PROTOKOL POKUSU A ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA

    účinné od 1. 8. 2004V souladu s příslušnými právními předpisy9) musí být zpracován projekt pokusu a o průběhu pokusu je nutno vést protokol.

    1. účinné od 1. 8. 2004Ve zprávě o průběhu pokusu je třeba uvést tyto informace:
      1. účinné od 1. 8. 2004Rozpouštědlo/vehikulum:
        1. účinné od 1. 8. 2004- zdůvodnění volby rozpouštědla,
        2. účinné od 1. 8. 2004- rozpustnost a stabilita testované látky v tomto rozpouštědle, pokud je známa.
      1. účinné od 1. 8. 2004Kmeny:
        1. účinné od 1. 8. 2004- použité kmeny,
        2. účinné od 1. 8. 2004- počet buněk v kultuře,
        3. účinné od 1. 8. 2004- charakteristika kmene.
      1. účinné od 1. 8. 2004Podmínkytestu:
        1. účinné od 1. 8. 2004- množství testované látky na jednu misku (v mg nebo μl) se zdůvodněním volby dávky a počtu misek pro jednu koncentraci,
        2. účinné od 1. 8. 2004- použitá média,
        3. účinné od 1. 8. 2004- typ a složení sytému metabolické aktivace (včetně kritérií akceptovatelnosti),
        4. účinné od 1. 8. 2004- postupy působení (zpracování).
      1. účinné od 1. 8. 2004Výsledky:
        1. účinné od 1. 8. 2004- známky toxicity,
        2. účinné od 1. 8. 2004- známky srážení,
        3. účinné od 1. 8. 2004- počty na jednotlivých miskách,
        4. účinné od 1. 8. 2004- průměrný počet revertantních kolonií na jednu misku a směrodatná odchylka,
        5. účinné od 1. 8. 2004- vztah dávka-odpověď, je-li to možné,
        6. účinné od 1. 8. 2004- statistické analýzy, byly-li provedeny,
        7. účinné od 1. 8. 2004- údaje ze souběžných negativních (rozpouštědlo/vehikulum) a pozitivních kontrol včetně rozpětí, průměrů a směrodatných odchylek,
        8. účinné od 1. 8. 2004- údaje z historických negativních (rozpouštědlo/vehikulum) a pozitivních kontrol včetně rozpětí, průměrů a směrodatných odchylek.

    účinné od 1. 8. 2004Diskuse výsledků.

    účinné od 1. 8. 2004Závěry.

účinné od 1. 8. 2004B.15 GENOVÉ MUTACE - SACCHAROMYCES CEREVISIAE

  1. účinné od 1. 8. 20041 METODA je v souladu s právem Evropských společenství.1)
    1. účinné od 1. 8. 20041.1 Princip metody

      účinné od 1. 8. 2004Různé haploidní a diploidní kmeny kvasinek Saccharomyces cerevisiae mohou být užity pro určení produkce genových mutací indukovaných chemickými látkami bez a s metabolickou aktivací.

      účinné od 1. 8. 2004Jsou využívány forward mutační systémy u haploidních kmenů, jako je míra vzniku mutací z červených, adenin vyžadujících mutant (ade-1, ade-2) na dvojité, adenin vyžadující bílé mutanty a selektivní systémy jako je indukce resistence ke kanavaninu a cykloheximidu.

      účinné od 1. 8. 2004Nejlépe ověřený reversní mutační systém zahrnuje využití haploidního kmene XV 185-14C s okrovými (ochre) nonsense mutacemi ade 2-1, arg 4-17, lys 1-1 a trp 5-48. Mutace jsou vratné působením mutagenů typu záměny bazí, které indukují mutace ve specifickém místě, nebo okrové supresorové mutace. XV185-14C nese rovněž his 1-7 marker, missense mutaci, revertovanou převážně mutacemi v dalším místě a marker hom 3-10, který je revertován posunovými mutageny.

      účinné od 1. 8. 2004U diploidních kmenů S. cerevisiae je jediným široce využívaným kmenem D7, který je homozygotní pro ilv 1-92.

    1. účinné od 1. 8. 20041.2 Popis metody
      1. účinné od 1. 8. 20041.2.1 Příprava

        účinné od 1. 8. 2004Roztoky testovaných látek a kontrol mají být připraveny těsně před testováním za použití vhodného vehikula. U organických látek ve vodě nerozpustných se nemá užít roztok vyšší než 2 objemová % v organických rozpouštědlech jako je etanol, aceton nebo dimetylsulfoxid (DMSO). Finální koncentrace vehikula nemá významně ovlivnit životnost a charakteristiky růstu.

        účinné od 1. 8. 2004Metabolická aktivace

        účinné od 1. 8. 2004Buňky mají být exponovány testovaným látkám jak v přítomnosti, tak v nepřítomnosti vhodného metabolického aktivačního systému.

        účinné od 1. 8. 2004Nejčastěji užívaným systémem je postmitochondriální frakce připravená z jater hlodavců po aplikaci látek indukujících enzymy a doplněná kofaktory. Užití jiných druhů, tkání, postmitochondriálních frakcí či postupů může být rovněž vhodné pro metabolickou aktivaci.

      1. účinné od 1. 8. 20041.2.2 Experimentální podmínky
        1. účinné od 1. 8. 20041.2.2.1 Testovací kmeny

          účinné od 1. 8. 2004Haploidní kmen XV 185-14C a diploidní kmen D7 jsou nejužívanější pro studie genových mutací. Jiné kmeny mohou být rovněž vhodné.

        1. účinné od 1. 8. 20041.2.2.2 Média

          účinné od 1. 8. 2004Odpovídající kultivační média jsou užívána pro určení počtu přežívajících a mutovaných buněk.

        1. účinné od 1. 8. 20041.2.2.3 Negativní a positivní kontroly

          účinné od 1. 8. 2004Positivní, neovlivněné a rozpouštědlem ovlivněné kontroly jsou používány současně. Pro každou specifickou mutační změnu mají být použity odpovídající positivní kontrolní chemické látky.

        1. účinné od 1. 8. 20041.2.2.4 Koncentrace

          účinné od 1. 8. 2004Má být použito nejméně 5 vhodně zvolených koncentrací. U toxických látek nemá nejvyšší použitá koncentrace redukovat přežití pod 5 - 10 %. Látky ve vodě relativně nerozpustné mají být testovány až po mez rozpustnosti látky za použití vhodných postupů. Nejvyšší koncentrace pro látky netoxické, ve vodě rozpustné, je určena případ od případu.

        1. účinné od 1. 8. 20041.2.2.5 Kultivační podmínky

          účinné od 1. 8. 2004Misky jsou inkubovány po sedm dní při 28 až 30 °C ve tmě.

        1. účinné od 1. 8. 20041.2.2.6 Frekvence spontánních mutací

          účinné od 1. 8. 2004Frekvence spontánních mutací u subkultur má být v rozmezí akceptovaných normálních hodnot.

        1. účinné od 1. 8. 20041.2.2.7 Počet replikací

          účinné od 1. 8. 2004Je nutno použít nejméně tří misek na jednu koncentraci u testu s prototrofními buňkami a u životnosti buněk. U experimentů užívajících markery jako hom 3-10 s nízkou mutační rychlostí musí být počet misek zvýšen, aby byly získány statisticky relevantní údaje.

      1. účinné od 1. 8. 20041.2.3 Popis postupu

        účinné od 1. 8. 2004Ovlivnění kmenů S. cerevisiae je obvykle prováděno ve zkumavce v tekutém prostředí a zahrnuje buď stacionární nebo rostoucí buňky. Základní pokusy mají být provedeny na rostoucích buňkách: 1-5 x 107 buněk/ml je vystaveno testované látce po dobu až 18 h při 28 až 37°C za třepání. Odpovídající množství metabolického aktivačního systému je přidáno v průběhu ovlivnění, pokud je to potřebné. Po skončení ovlivnění jsou buňky centrifugovány, promyty a vyočkovány na vhodné kultivační medium. Po inkubaci jsou počítány přežívající buňky a buňky s indukcí genových mutací.

        účinné od 1. 8. 2004Jestliže je první pokus negativní, má být proveden druhý pokus s buňkami ve stacionární fázi. Jestliže je první pokus positivní, je potvrzen dalším vhodným nezávislým experimentem.

  1. účinné od 1. 8. 20042. ÚDAJE

    účinné od 1. 8. 2004Údaje mají být uspořádány do tabulky a mají zahrnovat počet kolonií, počet mutant, přežívajících buněk a frekvenci mutací. Všechny výsledky mají být potvrzeny nezávislým experimentem. Údaje mají být vyhodnoceny vhodnými statistickými metodami.

  1. účinné od 1. 8. 20043 PROJEKT POKUSU, PROTOKOL POKUSU A ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA

    účinné od 1. 8. 2004V souladu s příslušnými právními předpisy9) musí být zpracován projekt pokusu a o průběhu pokusu je nutno vést protokol.

    1. účinné od 1. 8. 2004Zpráva o průběhu pokusu obsahuje informace o:
      1. účinné od 1. 8. 2004- použitých kmenech,
      2. účinné od 1. 8. 2004- podmínkách testu: buňky ve stacionární fázi nebo rostoucí, složení medií, teplota a trvání inkubace, metabolický aktivační systém,
      3. účinné od 1. 8. 2004- podmínkách vlastního experimentu: hladina expozice, postup a trvání ovlivnění, teplota při ovlivnění, positivní a negativní kontroly,
      4. účinné od 1. 8. 2004- počtu kolonií, počtu mutant, přežívajících buněk a frekvenci mutací, vztahu dávky a účinku, statistické hodnocení údajů pokud je to možné.

    účinné od 1. 8. 2004Diskuse výsledků.

    účinné od 1. 8. 2004Závěry.

účinné od 1. 8. 2004B.16 MITOTICKÁ REKOMBINACE - SACCHAROMYCES CEREVISIAE

  1. účinné od 1. 8. 20041 METODA je v souladu s právem Evropských společenství.1)
    1. účinné od 1. 8. 20041.1 Princip metody

      účinné od 1. 8. 2004Mitotická rekombinace u Saccharomycs cerevisiae může být detekována mezi geny (obecněji mezi genem a jeho centromerou) a uvnitř genů. První případ je nazýván mitotické překřížení a vytváří reciproční produkty, kdežto druhý případ je většinou nereciproční a je nazýván genová konverze. Překřížení je obecně testováno na základě tvorby recesivních homozygotních kolonií nebo sektorů vzniklých u heterozygotních kmenů, genová konverse je testována na základě tvorby prototrofních revertant vzniklých u auxotrofního heteroalelického kmene, který nese dvě různé defektní alely téhož genu. Nejčastěji užívané kmeny pro detekci mitotické genové konverse jsou D4 (heteroalelický v ade 2 a trp 5), D7 (heteroalelický v trp 5), BZ34 (heteroalelický v arg 4) a JD1 (heteroalelický v his 4 a trp 5). Mitotické překřížení produkující červené a růžové sektory může být testováno u D5 nebo D7 (který rovněž měří mitotickou genovou konverzi a reverzní mutace v ilv 1-92). Oba kmeny jsou heteroalelické pro komplementární alely ade 2.

    1. účinné od 1. 8. 20041.2 Popis metody
      1. účinné od 1. 8. 20041.2.1 Příprava

        účinné od 1. 8. 2004Roztoky testovaných látek a kontrol mají být připraveny těsně před testováním za použití vhodného vehikula. U organických látek ve vodě nerozpustných se nemá užít roztok vyšší než 2 objemová % v organických rozpouštědlech jako je etanol, aceton nebo dimetylsulfoxid (DMSO). Finální koncentrace vehikula nemá významně ovlivnit životnost a charakteristiky růstu.

        účinné od 1. 8. 2004Metabolická aktivace

        účinné od 1. 8. 2004Buňky mají být vystaveny působení testovaných látek jak v přítomnosti, tak v nepřítomnosti vhodného exogenního metabolického aktivačního systému. Nejčastěji užívaným systémem je postmitochondriální frakce připravená z jater hlodavců po aplikaci látek indukujících enzymy a doplněná kofaktory. Užití jiných druhů, tkání, postmitochondriálních frakcí či postupů může být rovněž vhodné pro metabolickou aktivaci.

      1. účinné od 1. 8. 20041.2.2 Experimentální podmínky
        1. účinné od 1. 8. 20041.2.2.1 Testovací kmeny

          účinné od 1. 8. 2004Nejužívanější jsou diploidní kmeny D4, D5, D7 a JD1. Užití jiných kmenů může být rovněž vhodné.

        1. účinné od 1. 8. 20041.2.2.2 Média

          účinné od 1. 8. 2004Odpovídající kultivační média jsou užívána pro určení přežívajících buněk a frekvenci mitotické rekombinace.

        1. účinné od 1. 8. 20041.2.2.3 Negativní a positivní kontroly

          účinné od 1. 8. 2004Positivní, neovlivněné a rozpouštědlem ovlivněné kontroly jsou používány současně. Pro každou specifickou mutační změnu mají být použity odpovídající positivní kontrolní chemické látky.

        1. účinné od 1. 8. 20041.2.2.4 Koncentrace

          účinné od 1. 8. 2004Má být použito nejméně 5 vhodně zvolených koncentrací. Musí být brán ohled na cytotoxicitu a rozpustnost. Nejnižší koncentrace nesmí mít vliv na životnost buněk. U toxických látek nemá nejvyšší použitá koncentrace redukovat přežití pod 5 - 10 %. Látky ve vodě relativně nerozpustné mají být testovány až po mez rozpustnosti látky za použití vhodných postupů. Nejvyšší koncentrace pro látky netoxické, ve vodě rozpustné, je určena případ od případu.

          účinné od 1. 8. 2004Buňky mohou být vystaveny působení testované látky buď ve stacionární fázi, nebo během růstu po dobu až 18 h. Kultury dlouhodobě ovlivňované mají být mikroskopicky kontrolovány pro tvorbu spor, jejichž přítomnost test znehodnocuje.

        1. účinné od 1. 8. 20041.2.2.5 Podmínky inkubace

          účinné od 1. 8. 2004Misky jsou inkubovány ve tmě po čtyři až sedm dní při 28-30°C. Misky použité pro průkaz červených a růžových sektorů tvořených mitotickým překřížením mají být umístěny v chladničce (cca 4 °C) po další 1 - 2 dny před počítáním, aby se mohly utvořit odpovídající pigmentované kolonie.

        1. účinné od 1. 8. 20041.2.2.6 Spontánní frekvence mitotické rekombinace

          účinné od 1. 8. 2004Používají se subkultury s frekvencí spontánních mutací v rozmezí akceptovaných normálních hodnot.

        1. účinné od 1. 8. 20041.2.2.7 Počet replikací

          účinné od 1. 8. 2004Je nutno použít nejméně tří misek na jednu koncentraci u testu prototrofních buněk tvořených mitotickou genovou konversí a pro určení životnosti buněk. V případě testování recesivní homozygosity tvořené mitotickým překřížením má být počet misek zvýšen, aby bylo dosaženo dostatečného počtu kolonií.

        1. účinné od 1. 8. 20041.2.2.8 Postup

          účinné od 1. 8. 2004Ovlivnění S. cerevisiae probíhá obvykle jako zkumavkový test v tekutém prostředí a zahrnuje buď stacionární nebo rostoucí buňky. Základní pokusy mají být provedeny na rostoucích buňkách. 1-5 x 107 buněk/ml je vystaveno testované látce po dobu až 18 h při 28 až 37°C za třepání. Odpovídající množství metabolického aktivačního systému je přidáno v průběhu ovlivnění, pokud je to potřebné.

          účinné od 1. 8. 2004Po skončení ovlivnění jsou buňky centrifugovány, promyty a vyočkovány na vhodné kultivační medium. Po inkubaci jsou počítány přežívající buňky a buňky s indukcí mitotické rekombinace.

          účinné od 1. 8. 2004Jestliže je první pokus negativní, má být proveden druhý pokus s buňkami ve stacionární fázi. Jestliže je první pokus positivní, je potvrzen dalším vhodným nezávislým experimentem.

  1. účinné od 1. 8. 20042 ÚDAJE

    účinné od 1. 8. 2004Údaje se zaznamenávají do tabulky, která zahrnuje počet kolonií, počet rekombinací, přežívajících buněk a frekvenci rekombinací.

    účinné od 1. 8. 2004Výsledky mají být potvrzeny v nezávislém experimentu.

    účinné od 1. 8. 2004Údaje mají být vyhodnoceny vhodnými statistickými metodami.

  1. účinné od 1. 8. 20043 PROJEKT POKUSU, PROTOKOL POKUSU A ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA

    účinné od 1. 8. 2004V souladu se s příslušnými právními předpisy9) musí být zpracován projekt pokusu a o průběhu pokusu je nutno vést protokol.

    1. účinné od 1. 8. 2004Zpráva o průběhu pokusu obsahuje následující informace:
      1. účinné od 1. 8. 2004- použité kmeny,
      2. účinné od 1. 8. 2004- podmínky testu: buňky ve stacionární fázi nebo rostoucí, složení medií, teplota a trvání inkubace, metabolický aktivační systém,
      3. účinné od 1. 8. 2004- podmínky vlastního experimentu: hladina expozice, postup a trvání ovlivnění, teplota při ovlivnění, positivní a negativní kontroly,
      4. účinné od 1. 8. 2004- počet kolonií, počet rekombinant, přežívajících buněk a frekvence rekombinací, vztah dávky a účinku, pokud je to možné, statistické hodnocení dat.

    účinné od 1. 8. 2004Diskuse výsledků.

    účinné od 1. 8. 2004Závěry.

účinné od 1. 8. 2004B.17 MUTAGENITA - TEST GENOVÝCH MUTACÍ V SAVČÍCH BUŇKÁCH IN VITRO

  1. účinné od 1. 8. 20041 METODA je v souladu s právem Evropských společenství.5)
    1. účinné od 1. 8. 20041.1 Úvod

      účinné od 1. 8. 2004Test genových mutací in vitro se dá používat ke zjišťování genových mutací vyvolaných chemickými látkami. Mezi vhodné buněčné linie patří myší lymfomové buňky L5178Y, linie CHO, CHO-AS52 a V79 buněk čínského křečka a lidské lymfoblastoidní buňky TK6 (1). U těchto buněčných linií se nejčastěji jako konečný genetický efekt zjišťují mutace v thymidinkináze (TK) a hypoxanthin-guanin fosforibosyltransferáze (HPRT) a v transgenní xanthin-guanin fosforibosyltransferáze (XPRT). Testy mutací v TK, HPRT a XPRT se zjišťují různá spektra genetických změn. Autosomální lokalizace TK a XPRT může umožnit detekci i takové genetické změny (např. velké delece), které se na lokusu HPRT chromozomů X nezjistí.5)

      účinné od 1. 8. 2004K testu na genové mutace v savčích buňkách in vitro se dají použít kultury stabilizovaných buněčných linií nebo buněčných kmenů. Při volbě buněk se berou v úvahu růstové schopnosti dané kultury a stabilita frekvence spontánních mutací.