Platné znění

Vyhláška, kterou se stanoví základní metody pro zkoušení toxicity chemických látek a chemických přípravků

účinné od 1. 8. 2004Pokud je při testování povrchově aktivních látek (detergentů) nebo neutrálních organických látek hodnota TER menší nebo rovna 5 kΩ, lze na této tkáni provést hodnocení průniku (penetrace) barviva. Tímto postupem se zjistí, zda se nejedná o výsledky falešně pozitivní.6)

  1. účinné od 1. 8. 20041.5.3.3.1 Nanesení a odstranění barviva sulforhodaminu B

    účinné od 1. 8. 2004Po prvotním ošetření testovanou látkou se na epidermální povrch všech terčíků nanese na 2 hodiny po 150 μl 10% (w/v) roztoku sulforhodaminu B v destilované vodě. Terčíky kůže se pak zhruba po dobu 10 sekund oplachují prudkým proudem vodovodní vody, která má nejvýše pokojovou teplotu. Tím se má odstranit přebytečné (nenavázané) barvivo. Každý terčík kůže se pak opatrně sejme z PTFE trubice a uloží do nádobky (např. do 20 ml skleněných kyvet pro scintilaci) obsahující 8 ml deionizované vody. Nádobky se po dobu 5 minut jemně třepou, aby se odstranily veškeré zbytky přebytečného (nenavázaného) barviva. Tento oplach se opakuje. Pak se terčíky vyjmou a vloží do nádobek s 5 ml 30 % (w/v) roztoku dodecylsulfátu sodného (SDS) v destilované vodě, kde se přes noc inkubují při teplotě 60°C. Po inkubaci se terčíky vyjmou a zlikvidují a zbývající roztok se odstřeďuje po dobu 8 minut při teplotě 21°C (relativní odstředivá síla ~175). Vzorek 1 ml supernatantu se pak zředí 30 % (w/v) roztokem SDS v destilované vodě v objemovém poměru 1 v 5 (v/v) (tj. 1 ml supernatantu + 4 ml roztoku SDS). Optická denzita (OD) roztoku se měří při cca 565 nm.

  1. účinné od 1. 8. 20041.5.3.3.2 Výpočet obsahu barviva

    účinné od 1. 8. 2004Obsah sulforhodaminu B v terčíku se vypočítá z hodnoty OD (molární extinkční koeficient sulforhodaminu B při 565 nm činí 8,7 . 104; molekulová hmotnost = 580). Obsah sulforhodaminu B se vypočítá pro každý terčík kůže zvlášť a stanoví se průměrná hodnota. Průměrná hodnota navázaného barviva je akceptována za podmínky, že souběžné kontrolní hodnoty spadají do akceptovatelného rozsahu této metody. Za akceptovatelná rozmezí obsahu barviva se u kontrolních látek při této metodě a experimentálním uspořádání považují:

    účinné od 1. 8. 2004
    KontrolaLátkaRozmezí obsahu barviva (μg/ terčík)
    Pozitivní 10 M kyselina chlorovodíková 40 – 100
    Negativnídestilovaná voda15 – 35
  1. účinné od 1. 8. 20041.5.3.4 Doplňující informace

    účinné od 1. 8. 2004Je možné zvolit kratší dobu působení testované látky na terčík kůže (např. 2 hodiny) za účelem rozlišení silně leptajících látek. Ve validizační studii však bylo zjištěno, že test TER přeceňuje leptavé schopnosti některých testovaných látek aplikovaných na terčíky kůže na 2 hodiny,6) jakkoliv umožňuje správnou identifikaci leptajících a neleptajících látek po 24-hodinovém působení.

    účinné od 1. 8. 2004Získané hodnoty TER mohou být ovlivněny vlastnostmi a rozměry zkušební aparatury a experimentálním postupem. Prahová hodnota pro leptavé účinky 5 kΩ byla stanovena na základě údajů získaných na konkrétní aparatuře a při aplikaci postupu uvedeného zde. Pokud by se zkušební podmínky výrazně změnily, mohlo by být třeba použito jiných prahových a kontrolních hodnot. Proto se doporučuje okalibrovat metodiku i prahovou hodnotu otestováním řady referenčních standardů vybraných z látek, jež byly použity při validační studii.6)

  1. účinné od 1. 8. 20041.6 Princip metody - test s modelem lidské kůže

    účinné od 1. 8. 2004Testovaný materiál se nanáší topicky na dobu až 4 hodin na trojrozměrný model lidské kůže, sestávající z rekonstruované epidermis s funkční stratum corneum. Leptající materiál se pozná podle schopnosti vyvolat pokles životnosti buněk stanovené například testem „MTT reduction assay“ (MTT = 3-[4,5-dimetylthiazol-2-yl]-2,5 difenyl tetrazolium bromid) pod prahovou hodnotu definovanou pro danou expoziční dobu. Princip testu vychází z předpokladu, že látky způsobující poleptání kůže jsou ty, které dokáží proniknout skrze stratum corneum (difúzí nebo erozí) a jsou dostatečně cytotoxické, aby přivodily smrt buněk v hlubších buněčných vrstvách.

  1. účinné od 1. 8. 20041.7 Popis metody - test s modelem lidské kůže
    1. účinné od 1. 8. 20041.7.1 Modely lidské kůže

      účinné od 1. 8. 2004Modely lidské kůže mohou pocházet z různých zdrojů, musí však splňovat určitá kritéria. Model musí mít funkční stratum corneum s podkladovou vrstvou živých buněk. Bariérová funkce stratum corneum musí být přiměřeně zachována. To lze prokázat tím, že model bude rezistentní vůči cytotoxicitě po nanesení látek, o nichž je známo, že jsou pro buňky cytotoxické, které však normálně skrze stratum corneum neprocházejí. Model musí za definovaných experimentálních podmínek vykazovat reprodukovatelné výsledky.

      účinné od 1. 8. 2004Životnost živých buněk v modelu musí být dostačující k tomu, aby se dalo dobře rozlišit mezi látkami pozitivní a negativní kontroly. Životnost buněk (měřená například velikostí redukce MTT, tj. OD hodnotou) po expozici látce použité jako negativní kontrola musí ležet v přijatelných mezích pro daný model. Podobně v případě látky pro pozitivní kontrolu (ve srovnání s látkami pro negativní kontrolu) musí hodnoty životnosti spadat do určených mezí. Je velmi důležité, aby bylo prokázáno, že použitý predikční model odpovídá mezinárodnímu validačnímu standardu.6)

    1. účinné od 1. 8. 20041.7.2 Popis postupu
      1. účinné od 1. 8. 20041.7.2.1 Nanesení testovaného materiálu

        účinné od 1. 8. 2004Je-li testovaná látka tekutá, nanese se tak, aby pokrývala povrch kůže (minimální množství 25 μl/cm2). Je-li pevná, nanese se tak, aby pokrývala kůži, a následně se zvlhčí, aby se s kůží zajistil dobrý styk. Pokud je to třeba, pevné látky se před aplikací roztírají na prášek. U metody nanášení musí být prokázáno, že je vhodná pro široký rozsah látek.6) Po uplynutí doby expozice se materiál z povrchu kůže pečlivě smyje fyziologickým roztokem.

      1. účinné od 1. 8. 20041.7.2.2 Měření životnosti buněk

        účinné od 1. 8. 2004K měření životnosti buněk se dá použít jakákoliv validovaná kvantitativní metoda. Nejčastěji se používá redukce MTT, o které bylo prokázáno že v různých laboratořích poskytuje přesné a reprodukovatelné výsledky.6) Terčík kůže se na dobu 3 hodin ponoří do roztoku MTT o koncentraci 0,3 mg/ml při teplotě 20 - 28°C. Vyloučený modrý formazanový produkt se pak extrahuje (extrakce rozpouštědlem) a koncentrace formazanu se stanoví měřením OD při vlnové délce 545 až 595 nm.

      1. účinné od 1. 8. 20041.7.2.3 Doplňující informace

        účinné od 1. 8. 2004Použitý model kůže i přesné dodržení doby působení, promývacího postupu atd. mají na životnost buněk významný vliv. Doporučuje se metodu i predikční model okalibrovat za použití řady referenčních standardů vybraných z látek použitých ve validizační studii ECVAM.6) Je nezbytně nutné, aby bylo prokázáno, že je použitá metoda za použití široké škály látek reprodukovatelná podle mezinárodních standardů jak v rámci dané laboratoře, tak mezi různými laboratořemi. Minimálně musí metoda splňovat kritéria vědecké validity definované dříve6) a výsledky takové validizační studie musí být zveřejněny v takovém vědeckém časopise, ve kterém články před zveřejněním procházejí odbornou revizí.

  1. účinné od 1. 8. 20042 ÚDAJE
    1. účinné od 1. 8. 20042.1 Zpracování výsledků
      1. účinné od 1. 8. 20042.1.1 Test TER na kůži potkana

        účinné od 1. 8. 2004Hodnoty odporu (v kΩ) pro testovaný materiál, pozitivní a negativní kontrolu a pro případné standardní referenční látky se uvádějí v tabelární formě, a to data pro všechny replikace a opakované experimenty, průměrné hodnoty a z nich vyvozená klasifikace.

      1. účinné od 1. 8. 20042.1.2 Test s modelem lidské kůže

        účinné od 1. 8. 2004Hodnoty OD a vypočtené procento životaschopných buněk se pro testovaný materiál, pozitivní a negativní kontroly a případné standardní referenční látky uvádějí v tabelární formě, a to data pro všechny replikace a opakované experimenty, průměrné hodnoty a z nich vyvozená klasifikace.

    1. účinné od 1. 8. 20042.2 Vyhodnocení a interpretace výsledků
      1. účinné od 1. 8. 20042.2.1 Test TER na kůži potkana

        účinné od 1. 8. 2004Pokud je průměrná hodnota TER pro testovaný materiál vyšší než 5 kΩ, je látka neleptající. Je-li hodnota TER nižší nebo rovna 5 kΩ a nejedná se přitom o povrchově aktivní látku (detergent) či neutrální organickou látku, pak testovaná látka leptavé účinky má.

        účinné od 1. 8. 2004U povrchově aktivních látek (detergentů) a neutrálních organických látek, jež poskytují hodnoty TER nepřesahující 5 kΩ, lze provést zkoušku penetrace barviva. Je-li obsah barviva v terčíku vyšší nebo rovný průměrnému obsahu barviva v terčíku při souběžně provedené pozitivní kontrole s 36 % HCl, je testovaná látka skutečně pozitivní a tedy má leptavé účinky, kdežto je-li obsah barviva v terčíku menší, je testovaná látka falešně pozitivní a tedy leptavé účinky nemá.

      1. účinné od 1. 8. 20042.2.2 Test s modelem lidské kůže

        účinné od 1. 8. 2004Hodnota OD pro negativní kontrolu představuje 100 % životaschopnost buněk. Z hodnot OD pro jednotlivé zkušební vzorky se vypočte procentuální životnost vůči negativní kontrole. Hraniční procentní podíl životaschopných buněk, který odděluje látky, které nezpůsobují poleptání kůže, od těch, které poleptání způsobují, respektive odlišuje jednotlivé třídy leptavých vlastností, musí být v predikčním modelu jasně definován předtím, než je metoda validována, a následnou validační studií se musí prokázat, že je tato hraniční hodnota odpovídající.6)

  1. účinné od 1. 8. 20043 PROJEKT POKUSU, PROTOKOL POKUSU A ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA

    účinné od 1. 8. 2004V souladu e s příslušnými právními předpisy9) musí být zpracován projekt pokusu a o průběhu pokusu je nutno vést protokol.

    1. účinné od 1. 8. 2004Ve zprávě o průběhu pokusu je třeba uvést tyto informace:
      1. účinné od 1. 8. 2004Testovaná látka:
        1. účinné od 1. 8. 2004- identifikační údaje, fyzikální stav, popřípadě fyzikálně-chemické vlastnosti; pokud se používají referenční látky, uvedou se tyto údaje i pro ně.
      1. účinné od 1. 8. 2004Podmínky pokusu:
        1. účinné od 1. 8. 2004- podrobný popis použitého postupu,
        2. účinné od 1. 8. 2004- popis a zdůvodnění všech případných modifikací.
      1. účinné od 1. 8. 2004Výsledky:
        1. účinné od 1. 8. 2004- tabulka hodnot odporu (test TER) nebo procentuální podíl životaschopných buněk (test s modelem lidské kůže) pro testovaný materiál, pozitivní a negativní kontroly a případné standardní referenční látky, a to údaje pro všechny replikace respektive opakované experimenty a průměrné hodnoty;
        2. účinné od 1. 8. 2004- popis všech jiných pozorovaných efektů.

    účinné od 1. 8. 2004Diskuse výsledků.

    účinné od 1. 8. 2004Závěry.

    účinné od 1. 8. 2004Obrázek 1

    účinné od 1. 8. 2004Obrázek

    účinné od 1. 8. 2004Obrázek 2

    účinné od 1. 8. 2004Obrázek

účinné od 1. 8. 2004B.41 FOTOTOXICITA - TEST FOTOTOXICITY 3T3 NRU IN VITRO

  1. účinné od 1. 8. 20041 METODA je v souladu s právem Evropských společenství.6)
    1. účinné od 1. 8. 20041.2 Úvod

      účinné od 1. 8. 2004Fototoxicita je definována jako toxická odezva (reakce), k níž dochází, je-li kůže poprvé vystavena určitým chemickým látkám a následně pak světlu, nebo je-li podobně kůže ozářena po celkovém podání určité látky.

      účinné od 1. 8. 2004Informace získané v rámci testu fototoxicity 3T3 NRU in vitro slouží ke stanovení fototoxického potenciálu dané testované látky, tedy ke zjištění, zda daná látka ve spojení s expozicí ultrafialovému a viditelnému záření představuje možné nebezpečí nebo nikoli.

      účinné od 1. 8. 2004Toxikologickým výsledkem testu in vitro je stanovení fototoxicity vyvolané kombinovaným působením látky a světla, tímto testem je možné zjistit sloučeniny, které jsou fototoxické in vivo po celkové aplikaci a distribuci v kůži, a sloučeniny, jež působí jako fotoiritanty po topickém nanesení na pokožku.

      účinné od 1. 8. 2004Test fototoxicity 3T3 NRU in vitro byl vypracován a validován v rámci společného projektu EU/COLIPA z let 1992 - 19976) jakožto validní alternativa in vitro vůči různým používaným testům in vivo. V roce 1996 doporučila pracovní schůze OECD přístup následných in vitro testů pro hodnocení fototoxicity.6)

      účinné od 1. 8. 2004Výsledky testu fototoxicity 3T3 NRU in vitro byly porovnány s akutními účinky fototoxicity/fotoiritace in vivo u zvířat a lidí a bylo zjištěno, že tento test má pro uvedené účinky vynikající predikční schopnosti. Test není navržen k tomu, aby předpovídal jiné nepříznivé účinky, jež mohou z kombinovaného působení látky a světla vzniknout, jako je fotogenotoxicita, fotoalergie nebo fotokarcinogenita, i když řada látek tyto specifické vlastnosti vykazuje, reaguje při testu fototoxicity 3T3 NRU in vitro pozitivně. Test není rovněž uspořádán tak, aby umožňoval hodnocení stupně fototoxicity.

      účinné od 1. 8. 2004Sekvenční přístup testování fototoxicity u chemických látek je přiložen viz dodatek.

    1. účinné od 1. 8. 20041.3 Definice

      účinné od 1. 8. 2004Iradiance: intenzita ultrafialového (UV) či viditelného záření dopadajícího na povrch; měřená ve W/m2 nebo v mW/cm2.

      účinné od 1. 8. 2004Dávka světla: množství (= intenzita × čas) ultrafialového (UV) nebo viditelného (VIS) záření dopadajícího na povrch, vyjádřené v joulech (= W × s) na jednotku povrchu, např. J/m2 nebo J/cm2.

      účinné od 1. 8. 2004Pásma vlnových délek ultrafialového světla: podle doporučení CIE (Commission International de LʹEclairage) se používá označení UVA (315 – 400 nm), UVB (280 – 315 nm) a UVC (100 – 280 nm). Používají se i jiná vymezení: za hranici mezi pásmy UVA a UVB se často považuje 320 nm a UVA se někdy dělí na UV-A1 a UV-A2 s hranicí zhruba u 340 nm.

      účinné od 1. 8. 2004Životaschopnost (viabilita) buněk: parametr, kterým se měří celková aktivita buněčné populace (např. příjem barviva indikujícího živou buňku, neutrální červeně, do buněčných lysozomů), jež podle parametrů měřených daným testem a jeho uspořádání koreluje s celkovým počtem resp. životností (vitalitou) buněk.

      účinné od 1. 8. 2004Relativní životaschopnost (viabilita) buněk: životaschopnost buněk vyjádřená v porovnání s negativními kontrolami (rozpouštědlo), které prošly celou procedurou testu (buď +UV nebo -UV), ovšem bez působení testované látky.

      účinné od 1. 8. 2004Predikční model: algoritmus, kterým se výsledky testu toxicity transformují do predikce toxického potenciálu. V tomto metodickém návodu pro test je možno k transformaci výsledků testu na fototoxicitu 3T3 NRU in vitro k predikci fototoxického potenciálu použít veličin PIF a MPE.

      účinné od 1. 8. 2004PIF (photo irritation factor, fotoiritační faktor): koeficient představující poměr 2 stejně účinných cytotoxických koncentrací (EC50) testované látky získaných v nepřítomnosti (-UV) a v přítomnosti (+UV) necytotoxického UVA/VIS ozáření.

      účinné od 1. 8. 2004MPE (mean photo effect, střední fotoefekt): nová míra odvozená z matematické analýzy kompletního průběhu 2 křivek koncentrace–odezva získaných v nepřítomnosti (-UV) a v přítomnosti (+UV) necytotoxického UVA/VIS ozáření.

      účinné od 1. 8. 2004Fototoxicita: akutní toxická reakce (odezva), která vzniká po první expozici kůže určité látce a následné expozici kůže světlu, nebo reakce která je obdobně navozena ozářením kůže po systémovém podání určité látky.

      účinné od 1. 8. 2004Fotoiritace: nižší úroveň pojmu „fototoxicita“, týkající se pouze těch fototoxických reakcí, k nimž dochází v kůži poté, co na ni působí (topicky nebo orálně přijatá) nějaká látka. Tyto fototoxické reakce vedou vždy k nespecifickému poškození buněk (reakce podobné jako při nadměrném slunění).

      účinné od 1. 8. 2004Fotoalergie: získaná imunologická reaktivita, která se při prvním působení látky a světla neprojevuje, a kdy je zapotřebí jednotýdenní až dvoutýdenní indukční periody k tomu, aby se reaktivita kůže projevila.

      účinné od 1. 8. 2004Fotogenotoxicita: genotoxická reakce (odezva) s genetickými projevy, ke které dochází poté, co byly buňky vystaveny negenotoxické dávce UV/VIS záření a negenotoxické látky.

      účinné od 1. 8. 2004Fotokarcinogenita: karcinogenita vyvolaná opakovanou aplikací světla a látky. Pokud je tumorogeneze vyvolaná UV zářením zesílena látkou, mluvíme o fotokokarcinogenitě.

    1. účinné od 1. 8. 20041.4 Referenční látky

      účinné od 1. 8. 2004Vedle chlorpromazinu jako látky pro pozitivní kontrolu, která je souběžně testována při každé studii, se pro zavedení testu na fototoxicitu 3T3 NRU doporučuje použít jako referenční látky podsoubor z látek, které byly použity při mezilaboratorním porovnávání tohoto testu.6)

    1. účinné od 1. 8. 20041.5 Prvotní úvahy

      účinné od 1. 8. 2004Fototoxické účinky byly pozorovány u řady látek,6) jejichž jediným společným rysem je to, že dokáží absorbovat světelnou energii v oblasti slunečního záření. Podle prvního zákona fotochemie (Grotthausův-Draperův zákon) vyžaduje každá fotoreakce dostatečnou absorpci světelných kvant. Proto by se předtím, než se začne uvažovat o biologickém testování podle tohoto metodického návodu, mělo vždy stanovit absorpční spektrum testované látky v UV/VIS oblasti (například podle zkušební metody OECD č. 101). Pokud je molární extinkční/absorpční koeficient nižší než 10 litrů x mol-1 x cm-1, nemá látka fotoreaktivní potenciál a není třeba ji na škodlivé fotochemické účinky testovat ani testem na fototoxicitu 3T3 NRU in vitro, ani žádným jiným biologickým testem (tabulka č. 9).

    1. účinné od 1. 8. 20041.6 Princip metody

      účinné od 1. 8. 2004Byly zjištěny čtyři mechanismy, kterými může absorpce světla (chemickým) chromoforem vyústit ve fototoxickou reakci,6) přičemž všechny vedou k poškození buněk. Proto je test fototoxicity 3T3 NRU in vitro založen na porovnání cytotoxicity látky testované v přítomnosti a nepřítomnosti necytotoxické dávky UVA/VIS záření. Cytotoxicita se při tomto testu vyjadřuje jako koncentračně závislý pokles příjmu vitálního barviva, neutrální červeně (neutral red, NR),6) 24 hodin po působení testované látky a ozařování.

      účinné od 1. 8. 2004Buňky Balb/c 3T3 se kultivují po dobu 24 hodin tak, aby se vytvořila kultura buněk v jedné vrstvě (monolayer). Pro každou testovanou látku se preinkubují dvě destičky po 96 jamkách s látkou v osmi různých koncentracích po dobu 1 hodiny. Jedna z obou destiček se pak vystaví necytotoxickému UVA/VIS záření v dávce 5 J/cm2 UVA (+UV experiment), druhá destička se uchovává v temnu (-UV experiment). V obou destičkách se pak médium nahradí médiem kultivačním a po dalších 24 hodinách kultivace se pomocí inkorporace neutrální červeně (neutral red uptake, NRU) po dobu 3 hodin stanoví životaschopnost buněk. Pro každou z osmi koncentrací se stanoví relativní životaschopnost buněk, vyjádřená jako procento hodnot u negativních kontrol. K posouzení fototoxického potenciálu se porovnají koncentračně závislé reakce získané v přítomnosti (+UV) a v nepřítomnosti (-UV) záření, obvykle na úrovni EC50, tj. při koncentraci inhibující životaschopnost buněk o 50 % v porovnání s kontrolami bez ovlivnění.

    1. účinné od 1. 8. 20041.7 Kritéria jakosti

      účinné od 1. 8. 2004Citlivost buněk vůči záření UVA, historické údaje: u buněk je třeba pravidelně provádět kontrolu citlivosti vůči záření UVA. Buňky se nasadí v hustotě, která se používá při testu fototoxicity 3T3 NRU in vitro, příští den se vystaví záření UVA v dávce 1 - 9 J/cm2 a další den se testem NRU stanoví životaschopnost buněk. Buňky splňují kritéria jakosti, jestliže jejich životaschopnost po ozáření dávkou UVA záření 5 J/cm2 není nižší než 80 % životaschopnosti kontrolních vzorků uchovávaných v temnu. Při nejvyšší dávce UVA záření 9 J/cm2 nemá být životaschopnost nižší než 50 % životaschopnosti vzorků uchovávaných v temnu. Tato kontrola se provádí zhruba po každé desáté pasáži buněk.

      účinné od 1. 8. 2004Citlivost buněk negativní kontroly vůči záření UVA, běžný test: test splňuje kritéria jakosti, jestliže negativní kontroly (buňky v Earlově vyváženém solném roztoku [Earlʹs balanced salt solution, EBSS] s 1 % roztokem dimethylsulfoxidu (DMSO) nebo ethanolu (EtOH) nebo bez nich vykazují v experimentu (+UVA) životaschopnost minimálně 80% v porovnání s neozářenými buňkami v témž rozpouštědle v rámci souběžného experimentu v temnu (-UVA).

      účinné od 1. 8. 2004Životaschopnost negativních kontrol: absolutní optická hustota (OD540 NRU) měřená v NR extraktu negativních kontrol ukazuje, zda oněch 1 x 104 buněk nasazených v každé jamce rostlo během dvou dnů testu s normální dobou zdvojnásobení. Test splňuje kritéria akceptovatelnosti, je-li průměrná hodnota OD540 NRU u kontrol bez ovlivnění větší nebo rovna 0,2.

      účinné od 1. 8. 2004Pozitivní kontrola: při každém testu na fototoxicitu 3T3 NRU in vitro je třeba provést souběžný test se známou fototoxickou látkou. Při validační studii EU/COLIPA byl jako látka pro pozitivní kontrolu použit chlorpromazin (CPZ); proto se tato látka doporučuje. Pro CPZ testovaný dle standardního protokolu v testu fototoxicity 3T3 NRU in vitro byla definována tato kritéria akceptovatelnosti: CPZ ozářený (+UVA): EC50 = 0,1 – 2,0 μg/ml, CPZ neozářený (–UVA): EC50 = 7,0 – 90,0 μg/ml. Fotoiritační faktor (PIF), tzn. posun hodnoty EC50, má být minimálně 6.

      účinné od 1. 8. 2004Místo CPZ se pro souběžnou pozitivní kontrolu dají použít i jiné známé fototoxické látky, pokud jsou vhodné pro charakteristiku chemické skupiny nebo rozpustnosti testované (hodnocené) látky. V takovém případě je třeba na základě historických dat adekvátně definovat jako kritéria akceptovatelnosti rozsahy hodnot EC50 a PIF nebo MPE (střední fotoefekt).

    1. účinné od 1. 8. 20041.8 Popis metody
      1. účinné od 1. 8. 20041.8.2 Příprava
        1. účinné od 1. 8. 20041.8.2.1 Buňky

          účinné od 1. 8. 2004Při validační studii byla použita stabilizovaná buněčná linie myších fibroblastů Balb/c 3T3 klon 31, a to buď z ATCC nebo z ECACC; ta se proto doporučuje. Podle stejného protokolu se dají s úspěchem použít i jiné buňky nebo buněčné linie, pokud se kultivační podmínky upraví podle jejich specifických potřeb; je však třeba prokázat, že jsou stejně vhodné.

          účinné od 1. 8. 2004U buněk je třeba pravidelně kontrolovat, že nejsou kontaminovány mykoplazmaty, a smí se použít jen v případě, že je výsledek kontroly uspokojivý.

          účinné od 1. 8. 2004Jelikož citlivost buněk vůči UVA záření může s počtem pasáží narůstat, je třeba používat buňky Balb/c 3T3 z pasáže s nejnižším číslem, pokud možno nižším než 100. Citlivost buněk Balb/c 3T3 vůči UVA záření je třeba pravidelně kontrolovat, a to postupem kontroly jakosti popsaným v tomto metodickém návodu.

        1. účinné od 1. 8. 20041.8.2.2 Média a kultivační podmínky

          účinné od 1. 8. 2004Pro rutinní pasážování buněk a během postupu je třeba používat vhodná kultivační média a inkubační podmínky. V případě buněk Balb/c 3T3 se jedná o DMEM (Dulbeccova modifikace Eagleova media) obohacený 10 % séra novorozených telat, 4 mM glutaminu, penicilinem a streptomycinem a o inkubaci ve vlhkém prostředí při teplotě 37°C / 7,5 % CO2. Je nezbytné, aby podmínky kultivace zajišťovaly buněčný cyklus v normálním historickém rozmezí pro dané buňky resp. buněčnou linii.

        1. účinné od 1. 8. 20041.8.2.3 Příprava kultur

          účinné od 1. 8. 2004Buňky ze zmražených zásobních kultur se nasadí v příslušné hustotě v kultivačním médiu a minimálně jednou se před použitím v testu na fototoxicitu 3T3 NRU in vitro pasážují.

          účinné od 1. 8. 2004Pro test fototoxicity se buňky nasadí v kultivačním médiu v takové hustotě, aby na konci testu (tj. kdy se stanovuje životaschopnost buněk 48 hodin po nasazení) nedošlo ke konfluenci (ke splynutí v souvislou, jednolitou vrstvu buněk). V případě buněk Balb/c 3T3 kultivovaných v destičkách s 96 jamkami se doporučuje hustota 1 x 104 buněk v jedné jamce.

          účinné od 1. 8. 2004Pro každou testovanou látku se buňky nasazují identicky na dvě destičky s 96 jamkami, které pak procházejí celým postupem za identických kultivačních podmínek, s výjimkou doby, kdy je jedna z destiček ozařována (+UVA/VIS) a druhá je uchovávána v temnu (–UVA/VIS).

        1. účinné od 1. 8. 20041.8.2.4 Metabolická aktivace

          účinné od 1. 8. 2004Zatímco při všech testech in vitro pro posouzení genotoxického nebo karcinogenního potenciálu je obecným požadavkem použití metabolizujícího systému, není v případě fototoxikologie známa žádná látka, kde by k tomu, aby působila jako fototoxin in vivo nebo in vitro, bylo metabolické transformace zapotřebí. Nepokládá se proto ani za nutné, ani za vědecky odůvodněné, aby se tento test prováděl s nějakým metabolickým aktivačním systémem.

        1. účinné od 1. 8. 20041.8.2.5 Testovaná látka / příprava

          účinné od 1. 8. 2004Testovaná látka musí být před použitím čerstvě připravena, ledaže údaje o její stabilitě prokazují, že se dá skladovat. Pokud je pravděpodobné, že by došlo k fotodegradaci, musí se příprava provádět pod červeným světlem.

          účinné od 1. 8. 2004Látka se rozpustí v pufrovaném solném roztoku, například v Earlově vyváženém solném roztoku (EBSS) nebo ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosfátem (phosphate buffered saline, PBS), který – aby nemohlo dojít k interferenci během ozařování – nesmí obsahovat žádné proteinové složky ani barevné indikátory pH, pohlcující světlo.

          účinné od 1. 8. 2004Pokud je testovaná látka ve vodě omezeně rozpustná, rozpustí se ve vhodném rozpouštědle v koncentraci stonásobně vyšší, než je požadovaná konečná koncentrace, a následně se zředí v poměru 1 : 100 pufrovaným solným roztokem. Pokud se používá rozpouštědlo, musí být přítomno v konstantním objemu 1 % (v/v) ve všech kulturách, tj. ve všech koncentracích testované látky i v negativních kontrolách.

          účinné od 1. 8. 2004Jako rozpouštědlo se doporučuje dimethylsulfoxid (DMSO) nebo ethanol (EtOH). Vhodná mohou být i další rozpouštědla s nízkou cytotoxicitou, například aceton, je však třeba vždy pečlivě zvážit jejich specifické vlastnosti, jako je případná reakce s testovanou látkou, potlačení fototoxického efektu nebo vychytávání radikálů.

          účinné od 1. 8. 2004Aby se napomohlo rozpouštění, dá se použít míchání resp. sonifikace, popřípadě ohřev na 37°C.

        1. účinné od 1. 8. 20041.8.2.6 Ozařování UV světlem / příprava

          účinné od 1. 8. 2004Světelný zdroj: volba správného světelného zdroje a správná filtrace je při testování fototoxicity klíčovým faktorem. Záření v UVA a ve viditelné oblasti je obvykle spojováno s fotosenzibilizací,6) kdežto záření UVB je v tomto směru méně relevantní, je přímo vysoce cytotoxické, přičemž jeho cytotoxicita se při přechodu od 313 nm k 280 nm zvyšuje tisícinásobně.6) Mezi kritéria pro volbu světelného zdroje patří zásadní požadavek, aby emitoval vlnové délky, jež testovaná látka absorbuje, a aby byla světelná dávka (dosažitelná za přiměřenou dobu) postačující ke zjištění známých fotosenzibilizujících látek. Dále nesmějí být použité vlnové délky a dávky nepatřičně poškozující testovací systém – patří sem i vyzařování tepla (infračervená oblast).

          účinné od 1. 8. 2004Za optimální světelný zdroj se pokládají solární simulátory, jimiž se simuluje sluneční záření. Jako tyto simulátory se používají xenonové výbojky a dále (vysokotlaké) rtuťové halogenové výbojky – ty mají tu výhodu, že vyzařují méně tepla a jsou levnější, sluneční světlo však imitují hůře. Jelikož všechny solární simulátory emitují významné množství záření UVB, je třeba záření filtrovat tak, aby se toto vysoce cytotoxické záření dostatečně zeslabilo.

          účinné od 1. 8. 2004Pro test na fototoxicitu 3T3 NRU in vitro je třeba použít spektrum záření, kde se složka UVB prakticky nevyskytuje (UVA:UVB ~ 20 : 1). Příklad spektrálního rozložení filtrovaného záření solárního simulátoru použitého při validační studii testu na fototoxicitu 3T3 NRU in vitro byl publikován.6)

          účinné od 1. 8. 2004Dozimetrie: intenzita světla (iradiance) se musí pravidelně před každým testem fototoxicity kontrolovat pomocí vhodného širokopásmového UV-metru, který musí být kalibrován pro daný zdroj. Funkčnost UV-metru je třeba kontrolovat, k čemuž se doporučuje použít druhý, referenční UV-metr téhož typu a kalibrace. Ideální je, když se v delších intervalech měří spektrální iradiance filtrovaného světelného zdroje a kontroluje se kalibrace širokopásmového UV-metru pomocí spektroradiometru; taková instrumentace ovšem vyžaduje kvalifikovanou obsluhu vyškoleného personálu.

          1. účinné od 1. 8. 2004Při validační studii bylo zjištěno, že dávka UVA záření 5 J/cm2 je pro buňky Balb/c 3T3 necytotoxická a přitom dostatečně silná, aby excitovala i slabě fototoxické látky. Aby se této dávky dosáhlo během 50 minut, musí být iradiance nastavena na 1,666 mW/cm2. Použije-li se jiná buněčná linie nebo jiný zdroj světla, musí se dávka záření UVA upravit tak, aby buňky nepoškozovala a byla dostatečná k průkazu standardních fototoxinů. Doba světelné expozice se vypočítává podle vzorce:
            účinné od 1. 8. 2004
      1. účinné od 1. 8. 20041.8.3 Podmínky testu

        účinné od 1. 8. 2004Maximální koncentrace testované látky nemá převýšit hodnotu 100 μg/ml, neboť všechny fototoxické látky byly detekovány při koncentracích nižších, při vyšších koncentracích se zvyšuje četnost falešně pozitivních výsledků.6) Hodnota pH při nejvyšší koncentraci testované látky musí být přijatelná (oblast pH 6,5 – 7,8).

        účinné od 1. 8. 2004Rozsah koncentrací testované látky při použití světla (+UVA) a bez něj (-UVA) je třeba stanovit v rámci předběžných experimentů. Rozsah a postup koncentrační řady se zvolí tak, aby křivky závislosti koncentrace-odezva byly dostatečně podloženy experimentálními údaji. Používá se koncentrační geometrická řada (s konstantním faktorem ředění).

      1. účinné od 1. 8. 20041.8.4 Popis postupu
        1. účinné od 1. 8. 20041.8.4.1 První den

          účinné od 1. 8. 2004Připraví se suspenze 1 x 105 buněk/ml v kultivačním médiu. Do periferních jamek 96 jamkové mikrotitrační destičky pro tkáňové kultury se odpipetuje po 100 μl samotného média (= slepý pokus), do ostatních jamek se dávkuje po 100 μl buněčné suspenze o denzitě 1 x 105 buněk/ml (=1 x 104 buněk na jamku). Pro každou testovanou látku se připraví dvě destičky – jedna pro stanovení cytotoxicity (-UVA), druhá pro stanovení fotocytotoxicity (+UVA).

          účinné od 1. 8. 2004Buňky se inkubují po dobu 24 hodin (7,5 % CO2, 37 °C), aby se vytvořil semikonfluentní monolayer. Tato inkubační doba umožňuje regeneraci a adherenci buněk a jejich exponenciální růst.

        1. účinné od 1. 8. 20041.8.4.2 Druhý den

          účinné od 1. 8. 2004Po inkubaci se kultivační médium z buněk odstraní a promyje dvakrát objemem 150 μl EBSS/PBS na každou jamku. Přidá se 100 μl EBSS/PBS obsahujícího testovanou látku v příslušné koncentraci nebo jenom rozpouštědlo (negativní kontrola). Testovaná látka se přidává v 8 koncentracích. Buňky s testovanou látkou se inkubují v temnu po dobu 60 minut (7,5 % CO2, 37 °C).

          účinné od 1. 8. 2004Část testu s UVA (+UVA) se provádí tak, že se buňky za pokojové teploty ozařují po dobu 50 minut skrz víčko destičky s 96 jamkami zářením UVA o intenzitě 1,7 mW/cm2 (= dávka 5 J/cm2). Aby nedocházelo ke kondenzaci vody pod víčkem, je třeba použít ventilátoru. Duplicitní destičky (-UVA) se po dobu 50 minut (= expoziční doba UVA) uchovávají za pokojové teploty v temném boxu.

          účinné od 1. 8. 2004Roztok se odstraní a jamky se promyjí dvakrát 150 μl EBSS/PBS. Poté se naplní kultivačním médiem a přes noc (18 - 22 hodin) se inkubují (7,5 % CO2, 37 °C).

        1. účinné od 1. 8. 20041.8.4.3 Třetí den

          účinné od 1. 8. 2004Mikroskopické hodnocení

          účinné od 1. 8. 2004Buňky se prohlédnou pod mikroskopem s fázovým kontrastem. Zaznamenají se změny morfologie buněk způsobené cytotoxickým účinkem testované látky. Tato kontrola se doporučuje, aby se eliminovaly experimentální chyby, ale při vyhodnocování cytotoxicity nebo fototoxicity se tyto záznamy nepoužijí.

          účinné od 1. 8. 2004Test příjmu neutrální červeně (NR)

          účinné od 1. 8. 2004Buňky se promyjí objemem 150 μl předehřátého EBSS/PBS. Promývací roztok se odstraní jemným poklepem. Přidá se 100 μl média s NR a inkubuje se při 37 °C ve zvlhčené atmosféře s 7,5 % CO2 po dobu 3 hodin.

          účinné od 1. 8. 2004Po inkubaci se médium s NR odstraní a buňky se promyjí objemem 150 μl EBSS/PBS, jenž se pak zcela a důkladně odstraní (je také možno destičky zcentrifugovat v obrácené poloze).

          účinné od 1. 8. 2004Přidá se přesně 150 μl roztoku na uvolnění NR (čerstvě připravená směs ethanol/kyselina octová).

          účinné od 1. 8. 2004Mikrotitrační destičky se po dobu 10 minut rychle třepou na třepačce, dokud se NR z buněk nevyextrahuje a nevytvoří se homogenní roztok.

          účinné od 1. 8. 2004Na spektrofotometru se změří optická hustota extraktu NR při 540 nm za použití slepého pokusu jako srovnávacího roztoku. Údaje se uchovají ve vhodném formátu (např. ASCII) pro další analýzu.

  1. účinné od 1. 8. 20042 ÚDAJE
    1. účinné od 1. 8. 20042.2 Kvalita a kvantita údajů

      účinné od 1. 8. 2004Údaje musí umožňovat smysluplnou analýzu vztahu koncentrace-odezva při aplikaci UVA/VIS záření a bez ní. Je-li zjištěna cytotoxicita, koncentrační rozsah a postup jednotlivých koncentrací se nastaví tak, aby se experimentální údaje daly vyjádřit křivkou. Jelikož testovaná látka může být až do definované limitní koncentrace 100 μg/ml v experimentu ve tmě (-UVA) necytotoxická, ale při ozařování (+UVA) vysoce cytotoxická, může dojít k tomu, že se koncentrační rozsahy v obou částech experimentu budou muset řádově lišit, aby byl splněn požadavek adekvátní kvality dat. Pokud není cytotoxicita zjištěna v žádné z obou částí experimentu (ani při -UVA, ani při +UVA), postačuje testování s velkým rozestupem mezi jednotlivými dávkami až do nejvyšší koncentrace.

      účinné od 1. 8. 2004Jsou-li výsledky hraniční – blízko dělicí čáry predikčního modelu – je třeba test pro ověření opakovat.

      účinné od 1. 8. 2004Považuje-li se opakování testu za potřebné, může být důležité pozměnit experimentální podmínky, aby se dosáhlo jasného výsledku. Klíčovou proměnnou v tomto testu je příprava roztoků testované látky, nejvhodnější při jeho opakování je variace těchto podmínek (spolurozpouštědlo, roztírání, sonifikace). Lze také uvažovat o změnách inkubační doby před ozařováním. U látek, jež jsou ve vodě nestálé, může mít významný vliv zkrácení doby.

    1. účinné od 1. 8. 20042.3 Zpracování výsledků

      účinné od 1. 8. 2004Pokud je to možné, stanoví se koncentrace testované látky vedoucí k 50 % inhibici buněčného příjmu NR (EC50). To lze učinit tak, že se na data koncentrace-odezva použije jakákoliv vhodná metoda nelineární regrese (nejlépe Hillova funkce nebo logistická regrese) nebo se použije jiná vhodná metoda proložení.6) Než se hodnota EC50 použije pro další výpočty, je třeba zkontrolovat kvalitu proložení. K výpočtu hodnoty EC50 je také možno použít grafické metody. V tomto případě se doporučuje použít pravděpodobnostní papír (osa x: log, osa y: probit), protože po této transformaci bývá křivka koncentrace-odezva mnohdy téměř lineární.

    1. účinné od 1. 8. 20042.4 Vyhodnocení výsledků (predikční modely)
      1. účinné od 1. 8. 20042.4.2 Predikční model, verze 1: fotoiritační faktor (PIF)
        1. účinné od 1. 8. 2004Pokud se získají úplné křivky koncentrace-odezva jak za přítomnosti (+UVA), tak za nepřítomnosti (-UVA) světla, se fotoiritační faktor (PIF) vypočítá podle vzorce
          účinné od 1. 8. 2004

        účinné od 1. 8. 2004PIF < 5, nepředpovídá žádný fototoxický potenciál, kdežto PIF ≥ 5 fototoxický potenciál předpovídá.

        1. účinné od 1. 8. 2004Je-li látka cytotoxická pouze při +UVA, kdežto při -UVA je necytotoxická, nedá se PIF vypočítat, i když se jedná o výsledek, který indikuje, že látka má fototoxický potenciál. V takovém případě se dá vypočítat tzv. „> PIF“, když se test cytotoxicity (-UV) provede až po maximální zkušební koncentraci (Cmax) a tato hodnota se dosadí do vzorce:
          účinné od 1. 8. 2004

        účinné od 1. 8. 2004Pokud se dá vypočítat pouze „>PIF“, pak každá hodnota > 1 předpovídá fototoxický potenciál.

        1. účinné od 1. 8. 2004Jestliže se nedá vypočítat ani EC50 (-UV), ani EC50 (+UV), protože látka nevykazuje cytotoxicitu až do nejvyšší zkušební koncentrace, je to indikací toho, že látka nemá žádný fototoxický potenciál. V takovém případě se používá formální „PIF = *1“, čímž se charakterizuje výsledek
          účinné od 1. 8. 2004

        účinné od 1. 8. 2004Pokud se dá získat pouze hodnota „PIF = *1“, předpovídá to, že není přítomen žádný fototoxický potenciál.

        účinné od 1. 8. 2004V případech (b) a (c) je třeba při predikci fototoxického potenciálu vzít bedlivě v úvahu koncentrace, jichž se při testu dosáhlo.

      1. účinné od 1. 8. 20042.4.3 Predikční model, verze 2: střední fotoefekt (MPE)

        účinné od 1. 8. 2004Je možno také použít novější verze modelu pro predikci fototoxického potenciálu, vypracovaného za použití dat z validační studie EU/COLIPA6) a odzkoušeného za podmínek slepé studie stanovení fototoxicity in vitro u látek UV filtrů.6) V tomto modelu jsou překonána omezení modelu PIF v těch případech, kde nelze získat hodnotu EC50. V tomto modelu se používá veličina „střední fotoefekt“ (MPE) založená na porovnání celého průběhu křivek koncentrace-odezva. Pro aplikaci modelu MPE byl na Humboldtově univerzitě v Berlíně vyvinut speciální počítačový software, který lze obdržet zdarma.

    1. účinné od 1. 8. 20042.5 Interpretace výsledků

      účinné od 1. 8. 2004Pozitivní výsledek testu (PIF ≥ 5 nebo MPE ≥ 0,1) ukazuje, že daná látka má fototoxický potenciál. Pokud se k tomuto výsledku dojde při koncentracích nižších než 10 μg/ml, je pravděpodobné, že látka bude působit jako fototoxin také za různých expozičních podmínek in vivo. Získá-li se pozitivní výsledek pouze při nejvyšší zkušební koncentraci (100 μg/ml), bude pro posouzení nebezpečnosti nebo fototoxické schopnosti dané látky nejspíše zapotřebí dalších informací. Sem mohou spadat informace o penetraci, absorpci a možné akumulaci látky v kůži, nebo údaje z testování dané látky v jiném potvrzujícím alternativním testu, například za použití modelu lidské kůže in vitro.

      účinné od 1. 8. 2004Negativní výsledek testu fototoxicity 3T3 NRU in vitro (PIF < 5 nebo MPE < 0,1) ukazuje, že testovaná látka není fototoxická pro použité savčí buňky v daných podmínkách. V případech, kdy by se látka dala testovat i při nejvyšší koncentraci 100 ug/ml, negativní výsledek znamená, že látka nemá žádný fototoxický potenciál a fototoxicita in vivo se dá považovat za nepravděpodobnou. V případech, kdy byly při nižších koncentracích získány identické koncentrační závislosti toxické reakce (EC50 +UV a EC50 -UV), je interpretace dat stejná. Naproti tomu pokud nebyla prokázána žádná toxicita (+UV ani -UV) a pro omezenou rozpustnost látky se nedalo dosáhnout koncentrace 100 μg/ml, je možno považovat tento test pro danou látku za ne zcela vhodný a mělo by se uvažovat o jiném, potvrzujícím testu (například s použitím modelu kůže in vitro nebo modelu kůže ex vivo nebo test in vivo).

  1. účinné od 1. 8. 20043 PROJEKT POKUSU, PROTOKOL POKUSU A ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA

    účinné od 1. 8. 2004V souladu se s příslušnými právními předpisy9) musí být zpracován projekt pokusu a o průběhu pokusu je nutno vést protokol.

    1. účinné od 1. 8. 2004Ve zprávě o průběhu pokusu je třeba uvést tyto informace:
      1. účinné od 1. 8. 2004Testovaná látka:
        1. účinné od 1. 8. 2004- identifikační údaje a číslo CAS, je-li známo,
        2. účinné od 1. 8. 2004- fyzikální povaha a čistota,
        3. účinné od 1. 8. 2004- fyzikálně-chemické vlastnosti, jež jsou k provedení testu důležité,
        4. účinné od 1. 8. 2004- stabilita a fotostabilita, jsou-li známy.
      1. účinné od 1. 8. 2004Rozpouštědlo:
        1. účinné od 1. 8. 2004- zdůvodnění volby daného rozpouštědla,
        2. účinné od 1. 8. 2004- rozpustnost testované látky v tomto rozpouštědle,
        3. účinné od 1. 8. 2004- procentický podíl rozpouštědla v působícím médiu (EBSS nebo PBS).
      1. účinné od 1. 8. 2004Buňky:
        1. účinné od 1. 8. 2004- typ a zdroj buněk,
        2. účinné od 1. 8. 2004- nepřítomnost mykoplazmat,
        3. účinné od 1. 8. 2004- číslo buněčné pasáže, je-li známo,
        4. účinné od 1. 8. 2004- citlivost buněk vůči záření UVA stanovená pomocí ozařovacího zařízení, jež se v testu na fototoxicitu 3T NRU in vitro používá.
      1. účinné od 1. 8. 2004Podmínky pokusu (a) - inkubace před ovlivněním a po něm:
        1. účinné od 1. 8. 2004- typ a složení kultivačního média,
        2. účinné od 1. 8. 2004- podmínky inkubace (koncentrace CO2, teplota, vlhkost),
        3. účinné od 1. 8. 2004- doba inkubace (zpracování před ni a po ní),
        4. účinné od 1. 8. 2004- popis a zdůvodnění jakýchkoli změn
      1. účinné od 1. 8. 2004Podmínky pokusu (b) - ovlivnění látkou:
        1. účinné od 1. 8. 2004- zdůvodnění volby koncentrací testované látky, které se použijí v přítomnosti ozařování UV/VIS zářením a bez něj,
        2. účinné od 1. 8. 2004- v případě omezené rozpustnosti testované látky a absence cytotoxicity zdůvodnění nejvyšší testované koncentrace,
        3. účinné od 1. 8. 2004- typ a složení působícího média (pufrovaný solný roztok),
        4. účinné od 1. 8. 2004- doba ovlivňování látkou.
      1. účinné od 1. 8. 2004Podmínky pokusu (c) - ozařování:
        1. účinné od 1. 8. 2004- zdůvodnění volby daného světleného zdroje,
        2. účinné od 1. 8. 2004- spektrální charakteristika záření světelného zdroje,
        3. účinné od 1. 8. 2004- charakteristiky propustnosti/absorpce použitého filtru (filtrů),
        4. účinné od 1. 8. 2004- charakteristika radiometru a podrobnosti o jeho kalibraci,
        5. účinné od 1. 8. 2004- vzdálenost světelného zdroje od testovaného systému,
        6. účinné od 1. 8. 2004- iradiance UVA (v mW/cm2) při této vzdálenosti,
        7. účinné od 1. 8. 2004- doba expozice UV/VIS záření,
        8. účinné od 1. 8. 2004- dávka záření UVA (iradiance x čas) v J/cm2,
        9. účinné od 1. 8. 2004- teplota buněčných kultur během ozařování a kultur souběžně uchovávaných v temnu.
      1. účinné od 1. 8. 2004Podmínky pokusu (d) - test NRU:
        1. účinné od 1. 8. 2004- složení média s NR,
        2. účinné od 1. 8. 2004- doba inkubace s NR,
        3. účinné od 1. 8. 2004- inkubační podmínky (koncentrace CO2, teplota, vlhkost),
        4. účinné od 1. 8. 2004- podmínky extrakce NR (extrakční činidlo, doba extrakce),
        5. účinné od 1. 8. 2004- vlnová délka, při které se spektrofotometricky odečítala optická hustota NR,
        6. účinné od 1. 8. 2004- druhá vlnová délka (referenční), byla-li použita,
        7. účinné od 1. 8. 2004- složení srovnávacího roztoku pro spektrofotometrii (blanku), pokud byl použit.
      1. účinné od 1. 8. 2004Výsledky:
        1. účinné od 1. 8. 2004- životaschopnost buněk při jednotlivých koncentracích testované látky, vyjádřená v procentech vůči průměrné životaschopnosti kontrol,
        2. účinné od 1. 8. 2004- křivky koncentrace-odezva (koncentrace testované látky vs relativní životaschopnost buněk) získané souběžnými experimenty +UVA a -UVA,
        3. účinné od 1. 8. 2004- analýza křivek koncentrace-odezva: podle možnosti výpočet hodnot EC50 (+UVA) a EC50 (-UVA),
        4. účinné od 1. 8. 2004- porovnání obou křivek koncentrace-odezva získaných za použití ozařování UV/VIS světlem - výpočtem buď fotoiritačního faktoru (PIF) nebo středního fotoefektu (MPE),
        5. účinné od 1. 8. 2004- klasifikace fototoxického potenciálu,
        6. účinné od 1. 8. 2004- kritéria akceptovatelnosti testu (a) - souběžná negativní kontrola:
        7. účinné od 1. 8. 2004- absolutní životaschopnost (optická denzita extraktu NR) ozářených a neozářených buněk,
        8. účinné od 1. 8. 2004- historické údaje negativních kontrol, průměr a směrodatná odchylka,
        9. účinné od 1. 8. 2004- kritéria akceptovatelnosti testu (b) - souběžná pozitivní kontrola:
        10. účinné od 1. 8. 2004- hodnoty EC50 (+UVA), EC50 (-UVA) a PIF látky použité pro pozitivní kontrolu,
        11. účinné od 1. 8. 2004- historické údaje látky použité pro pozitivní kontrolu: hodnoty EC50(+UVA), EC50 (-UVA) a PIF, průměry a směrodatné odchylky.

    účinné od 1. 8. 2004Diskuse výsledků.

    účinné od 1. 8. 2004Závěry.

    účinné od 1. 8. 2004Tabulka č. 9

    účinné od 1. 8. 2004Úloha testu fototoxicity 3T3 NRU v sekvenčním přístupu k testování fototoxicity látek

    účinné od 1. 8. 2004Obrázek
    účinné od 1. 8. 2004
  1. účinné od 1. 8. 20041) Směrnice Komise 88/302/EHS, kterou se po deváté přizpůsobuje technickému pokroku Směrnice Rady 67/548/EHS o sbližování zákonů, právních předpisů a správních opatření týkajících se klasifikace, balení a označování nebezpečných látek (L 133 1988).
  2. účinné od 1. 8. 20042) Směrnice Komise 92/69/EHS, kterou se po sedmnácté přizpůsobuje technickému pokroku Směrnice Rady 67/548/EHS o sbližování zákonů, právních předpisů a správních opatření týkajících se klasifikace, balení a označování nebezpečných látek (L 383 A 1992, metoda B.1 zrušena směrnicí 2001/59/ES).
  3. účinné od 1. 8. 20043) Směrnice Komise 93/21/EHS, kterou se po osmnácté přizpůsobuje technickému pokroku Směrnice Rady 67/548/EHS o sbližování zákonů, právních předpisů a správních opatření týkajících se klasifikace, balení a označování nebezpečných látek (L 110 1993).
  4. účinné od 1. 8. 20044) Směrnice Komise 96/54/ES, kterou se po dvacáté druhé přizpůsobuje technickému pokroku Směrnice Rady 67/548/EHS o sbližování zákonů, právních předpisů a správních opatření týkajících se klasifikace, balení a označování nebezpečných látek (L 248 1996).
  5. účinné od 1. 8. 20045) Směrnice Komise 2000/32/ES, kterou se po dvacáté šesté přizpůsobuje technickému pokroku Směrnice Rady 67/548/EHS o sbližování zákonů, právních předpisů a správních opatření týkajících se klasifikace, balení a označování nebezpečných látek (L 136 2000, metoda B13/14, B.39 a B.41 jsou upraveny směrnicí Rady 2001/59/ES).
  6. účinné od 1. 8. 20046) Směrnice Komise 2000/33/ES, kterou se po dvacáté sedmé přizpůsobuje technickému pokroku Směrnice Rady 67/548/EHS o sbližování právních a správních předpisů týkajících se klasifikace, balení a označování nebezpečných látek (L 136 2000).
  7. účinné od 1. 8. 20047) Směrnice Komise 2001/59/ES, kterou se po dvacáté osmé přizpůsobuje technickému pokroku Směrnice Rady 67/548/EHS o sbližování právních a správních předpisů týkajících se klasifikace, balení a označování nebezpečných látek (L 225 2001).
  8. účinné od 1. 8. 20048) § 2 zákona č. 356/2003 Sb., o chemických látkách a chemických přípravcích a o změně některých zákonů.
  9. účinné od 1. 8. 20049) Zákon č. 246/1992 Sb., na ochranu zvířat proti týrání, ve znění zákona č. 162/1993 Sb., zákona č. 193/1994 Sb., zákona č. 243/1997 Sb., zákona č. 30/1998 Sb. a zákona č. 77/2004 Sb.
  10. účinné od 1. 8. 200410) Vyhláška č. 207/2004 Sb., o ochraně, chovu a využití pokusných zvířat.