Platné znění

Vyhláška, kterou se stanoví základní metody pro zkoušení toxicity chemických látek a chemických přípravků

účinné od 1. 8. 2004Testy in vitro obecně vyžadují exogenní zdroj metabolické aktivace. Takový systém metabolické aktivace nedokáže imitovat savčí podmínky in vivo dokonale. Je třeba vzniku takových podmínek, za kterých by výsledky neodrážely vlastní mutagenitu. K pozitivním výsledkům, jež nejsou důsledkem vlastní mutagenity může dojít v důsledku změny pH, osmolality či vysoké cytotoxicity.5)

účinné od 1. 8. 2004Tento test se používá ke screeningu možných savčích mutagenů a karcinogenů. Řada sloučenin, které jsou v tomto testu pozitivní, jsou savčími karcinogeny, neexistuje však dokonalá korelace mezi tímto testem a karcinogenitou. Tato korelace závisí na druhu chemické látky a existuje stále více dokladů toho, že existují karcinogeny, které se tímto testem nezjistí, protože zřejmě působí nějakým jiným, negenotoxickým mechanismem či mechanismem, který v bakteriálních buňkách nepůsobí.5)

  1. účinné od 1. 8. 20041.2 Definice

    účinné od 1. 8. 2004Forward mutace: genová mutace výchozího typu mutantní formy, jež vede ke změně nebo ztrátě enzymatické aktivity kódovaného proteinu.

    účinné od 1. 8. 2004Mutageny vyvolávající substituci páru bází: látky způsobující substituci jednoho nebo několika páru bází v DNA.

    účinné od 1. 8. 2004Frameshift mutageny (mutageny vyvolávající posunové mutace): látky, jež způsobují přidání nebo ztrátu jednoho nebo více párů bází v DNA.

    účinné od 1. 8. 2004Doba fenotypické exprese: období, během kterého jsou z nově zmutovaných buněk odstraňovány nezměněné genové produkty.

    účinné od 1. 8. 2004Frekvence mutací: počet pozorovaných mutovaných buněk dělený počtem živých buněk.

    účinné od 1. 8. 2004Relativní celkový růst: nárůst počtu buněk v čase v porovnání s kontrolní populací buněk; vypočítává se jako součin poměrného suspenzního růstu (v porovnání s negativní kontrolou) a poměrné klonovací účinnosti cloning efficiency (v porovnání s negativní kontrolou).

    účinné od 1. 8. 2004Relativní suspenzní růst: poměrný nárůst počtu buněk během období exprese v porovnání s negativní kontrolou.

    účinné od 1. 8. 2004Životnost (viabilita): klonovací účinnost (cloning efficiency) ovlivněných buněk v době inokulace na miskách v selekčních podmínkách po období exprese.

    účinné od 1. 8. 2004Přežití: klonovací účinnost (cloning efficiency) ovlivněných buněk inokulovaných na miskách na konci působení látky; vyjadřuje se obvykle v porovnání s přežitím kontrolní buněčné populace.

  1. účinné od 1. 8. 20041.3 Princip metody

    účinné od 1. 8. 2004Buňky, deficientní na thymidinkinázu (TK) v důsledku mutace TK+/-→ TK-/-, jsou rezistentní vůči cytotoxickému působení pyrimidinového analogu trifluorthymidinu (TFT). Buňky produkující thymidinkinázu jsou vůči TFT citlivé, což způsobuje inhibici buněčného metabolismu a zastavuje další buněčné dělení. Za přítomnosti TFT proto mohou proliferovat mutované buňky, zatímco normální buňky, obsahující thymidinkinázu, proliferovat nemohou. Podobně jsou buňky s deficientní HPRT nebo XPRT selekčně rezistentní vůči 6-thioguaninu (TG) nebo 8-azaguaninu (AG). Pokud je analog báze nebo sloučenina příbuzná se selekčním činidlem analyzována v některém testu na genové mutace v savčích buňkách, je třeba vlastnosti testované látky bedlivě zvážit. Například je třeba prozkoumat každé podezření na selekční toxicitu testované látky vůči buňkám s mutacemi i bez nich. Testují-li se tedy chemikálie strukturně příbuzné se selekčním činidlem, je třeba potvrdit, že je selekční systém/činidlo vhodné.5)

    účinné od 1. 8. 2004Buňky v suspenzi nebo jednovrstevné kultuře se po vhodnou dobu vystaví působení testované látky s metabolickou aktivací i bez ní a kultivují se ke stanovení cytotoxicity a k detekci fenotypické exprese před výběrem mutantů.5) Cytotoxicita se stanoví obvykle hodnocením relativní klonovací účinnosti (přežití) (cloning efficiency) nebo relativního celkového nárůstu kultur po působení látky. Kultury se ponechají v růstovém médiu po dostatečnou dobu, charakteristickou pro daný lokus a typ buňky, aby mohlo dojít k co nejoptimálnější fenotypické expresi indukovaných mutací. Frekvence mutantů se stanoví inokulací známého počtu buněk v médiu obsahujícím selekční činidlo pro detekci mutovaných buněk a v médiu bez tohoto činidla, ke stanovení klonovací účinnosti (cloning efficiency), (životnosti). Po vhodné inkubační době se kolonie spočítají. Mutační frekvence se odvodí z počtu kolonií mutovaných buněk v selekčním médiu a z počtu kolonií v neselekčním médiu.

  1. účinné od 1. 8. 20041.4 Popis metody
  2. účinné od 1. 8. 20041.5 Příprava
    1. účinné od 1. 8. 20041.5.1.1 Buňky

      účinné od 1. 8. 2004Dá se použít celá řada buněčných typů, včetně subklonů buněk L5171Y, CHO, CHO-AS52, V79 a TK6. U buněčných typů používaných v tomto testu musí být prokázaná citlivost vůči chemickým mutagenům, vysoká klonovací účinnost (cloning efficiency) a stabilní frekvence spontánních mutací. U buněk se kontroluje, zda nejsou kontaminovány mykoplazmaty; infikované buňky se použít nesmějí.

      účinné od 1. 8. 2004Test je třeba naplánovat tak, aby měl zvolenou citlivost a efektivnost (power). Počet buněk, počet kultur a koncentrace testované látky musí těmto definovaným parametrům vyhovovat.5) Minimální počet vitálních buněk, které přežijí expozici a použijí se v jednotlivých stadiích testu, je dán frekvencí spontánních mutací. Obecným vodítkem je, že počet buněk má být minimálně desetinásobkem převrácené hodnoty frekvence spontánních mutací. Doporučuje se však použít alespoň 106 buněk. Měly by být k dispozici adekvátní historické údaje, kterými by se prokázala bezproblémové zvládnutí testu.

    1. účinné od 1. 8. 20041.5.1.2 Média a kultivační podmínky

      účinné od 1. 8. 2004Je třeba použít vhodná kultivační média a inkubační podmínky (kultivační nádoby, koncentraci CO2, teplotu a vlhkost). Média se pro test volí podle selekčního systému a typu buňky. Zvláště důležité je, aby podmínky kultivace zajišťovaly optimální růst buněk během expresní periody a schopnost jak mutovaných, tak nemutovaných buněk tvořit kolonie.

    1. účinné od 1. 8. 20041.5.1.3 Příprava kultur

      účinné od 1. 8. 2004Buňky se namnoží ze zásobních kultur, inokulují do kultivačního média a inkubují při teplotě 37°C. Před provedením testu, je třeba kultury zbavit dříve vzniklých mutovaných buněk.

    1. účinné od 1. 8. 20041.5.1.4 Metabolická aktivace

      účinné od 1. 8. 2004Na buňky se testovanou látkou působí v přítomnosti i v nepřítomnosti vhodného metabolického aktivačního systému. Nejobvyklejší je kofaktory suplementovaná mitochondriální frakce (S9) připravená z jater hlodavců, ovlivněná činidly indukujícími enzymy jako je Aroclor 1254,5) nebo směs fenobarbitalu a β-naftoflavonu.5)

      účinné od 1. 8. 2004Konečná koncentrace mitochondriální frakce v médiu činí obvykle 1 – 10 % v/v. Aktivita metabolického aktivačního systému bude záviset na tom, jakého typu je testovaná chemikálie. V některých případech je vhodné použít mitochondriální frakci v několika koncentracích.

      účinné od 1. 8. 2004Pro účely endogenní aktivace mohou být použity i geneticky modifikované buněčné linie exprimující specifické aktivační enzymy. Výběr buněčných linií by měl být vědecky ověřen (např. vztahem isoenzymu cytochromu P450 k metabolismu testované látky).

    1. účinné od 1. 8. 20041.5.1.5 Příprava testované látky

      účinné od 1. 8. 2004Je-li testovaná látka v pevném stavu, látka se před působením na buňky rozpustí nebo se připraví její suspenze ve vhodném rozpouštědle a případně naředí. Kapalné testované látky se mohou do systému přidávat přímo nebo se předtím ředí. Je třeba používat čerstvé preparáty, ledaže údaje o jejich stabilitě prokazují, že delší skladování neovlivňuje jejich vlastnosti.

    1. účinné od 1. 8. 20041.5.2 Podmínky testu
      1. účinné od 1. 8. 20041.5.2.1 Rozpouštědlo/vehikulum

        účinné od 1. 8. 2004U zvoleného rozpouštědla nesmí existovat podezření, že by mohlo s testovanou látkou chemicky reagovat, a nesmí narušovat přežívání buněk a aktivitu S9.

        účinné od 1. 8. 2004Používá-li se méně známé rozpouštědlo musí být podpořeno referencemi prokazujícími jeho kompatibilitu. Doporučuje se, aby všude tam, kde je to možné, bylo na prvním místě zvažováno použití jako rozpouštědla vody. Je-li testovaná látka ve vodě nestálá, musí být použité organické rozpouštědlo zcela bezvodé. Voda se dá odstranit molekulárním sítem.

      1. účinné od 1. 8. 20041.5.2.2 Koncentrace

        účinné od 1. 8. 2004Mezi kritéria, jež se uvažují při stanovování nejvyšší koncentrace, patří cytotoxicita, rozpustnost v systému a změny pH resp. osmolality.

        účinné od 1. 8. 2004Cytotoxicita se stanoví s metabolickou aktivací i bez ní v hlavním experimentu, přičemž se použije vhodné indikace buněčné integrity a růstu buněk, jako je relativní klonovací účinnost (přežití) nebo relativní celkový růst. Je vhodné stanovit cytotoxicitu a rozpustnost v předběžných experimentech.

        účinné od 1. 8. 2004Použijí se minimálně čtyři analyzovatelné koncentrace. Dochází-li k cytotoxicitě, musí tyto koncentrace pokrývat rozsah od maximální do nízké nebo nulové toxicity. To obvykle znamená, že se jednotlivé koncentrace nebudou lišit více než násobkem, který leží mezi hodnotami 2 a √10. Vychází-li maximální koncentrace z cytotoxicity, měla by vést k relativnímu přežití (relativní klonovací účinnosti) nebo relativnímu celkovému růstu v 10–20 %, ne však méně než 10 %. U relativně netoxických látek by maximální expoziční dávka měla být nejnižší z hodnot 5 mg/ml, 5 μl/ml a 0,01 M.

        účinné od 1. 8. 2004U relativně nerozpustných látek, jež jsou netoxické v koncentracích nižších než je koncentrace při které se již látka nerozpouští, má být nejvyšší použitá koncentrace vyšší než je mez rozpustnosti ve finálním kultivačním médiu na konci kultivace s testovanou látkou. Může být účelné vyhodnotit rozpustnost na začátku a na konci působení, jelikož se rozpustnost může během expozice v důsledku přítomnosti buněk, S9, séra atd. měnit. Nerozpustnost se dá zjistit i prostým okem. Sraženina nesmí být na překážku při hodnocení buněk.

      1. účinné od 1. 8. 20041.5.2.3 Kontroly
        1. účinné od 1. 8. 2004V rámci každého experimentu se musejí provést i souběžné pozitivní a negativní (rozpouštědlo, vehikulum) kontroly, a to jak s metabolickou aktivací, tak bez ní. Pokud se aplikuje metabolická aktivace, musí být pozitivní kontrola látka vyžadující metabolickou aktivaci k vyvolání mutagenního účinku. Mezi látky pro pozitivní kontrolu patří například:
          účinné od 1. 8. 2004
          Metabolická aktivaceLokusLátkaCASEINECS
          NeHPRTethyl methansulfonát62-50-0200-536-7
          ethyl nitrosomočovina759-73-9212-072-2
          TK (malé a velké kolonie)methyl methansulfonát66-27-3200-625-0
          XPRTethyl methansulfonát62-50-0200-536-7
          ethyl nitrosomočovina759-73-9212-072-2
          AnoHPRT3-methylcholantren56-49-5200-276-4
          N-nitrosodimethylamin62-75-9200-549-8
          7,12-dimethylbenzantracen57-97-6200-359-5
          TK (malé a velké kolonie)Cyklofosfamid
          monohydrát cyklofosfamidu          		50-18-0
          6055-19-2          		200-015-4
          benzo[a]pyren50-32-8200-028-5
          3-methylcholantren56-49-5200-276-5
          XPRTN-nitrosodimethylamin (pro vysoké koncentrace S-9)62-75-9200-549-8
          benzo[a]pyren50-32-8200-028-5

        účinné od 1. 8. 2004Pro pozitivní kontrolu se mohou použít i jiné vhodné látky; jestliže má například laboratoř historické údaje o 5-brom-2'-deoxyuridinu (CAS 59-14-3, číslo EINECS 200-415-9), lze použít i tuto referenční látku. Tam, kde je to možné, je vhodné použít pro pozitivní kontrolu látku ze stejné chemické skupiny.

        účinné od 1. 8. 2004Pro každý časový interval sklízení kultur je třeba použít i negativní kontrolu, ve které se používá rozpouštědlo nebo vehikulum v kultivačním médiu, zpracované stejným způsobem jako experimentální kultury. Mimoto je rovněž třeba zařadit kontrolu bez jakéhokoliv ovlivnění, ledaže existují historické údaje prokazující, že zvolené rozpouštědlo/vehikulum nevykazuje žádné pro buňky nepříznivé či mutagenní účinky.

    1. účinné od 1. 8. 20041.5.3 Postup
      1. účinné od 1. 8. 20041.5.3.1 Expozice testovanou látkou

        účinné od 1. 8. 2004Na proliferující buňky se působí testovanou látkou jak s metabolickou aktivací, tak bez ní. Expozice probíhá po vhodnou dobu (obvykle je účinná doba 3–6 hodin). Doba expozice může přesáhnout jeden nebo více buněčných cyklů.

        účinné od 1. 8. 2004Pro každou koncentraci se používají kultury duplicitní nebo jenom jedna. Používá-li se jenom jedna kultura, je třeba zvýšit počet koncentrací tak, aby se zajistil adekvátní počet kultur k analýze (tj. minimálně osm analyzovatelných koncentrací). Kultury s negativní kontrolou (rozpouštědlem/vehikulem) se používají duplicitní.

        účinné od 1. 8. 2004V případě plynných nebo těkavých látek je třeba uplatnit v testu vhodné postupy, jako je použití neprodyšně uzavřených kultivačních nádob.5)

      1. účinné od 1. 8. 20041.5.3.2 Hodnocení přežívání, viability a mutační frekvence

        účinné od 1. 8. 2004Po skončení expozice se buňky promyjí a kultivují ke stanovení přežívání a fenotypické exprese. Po expozici se obvykle začíná s analýzou cytotoxicity stanovením klonovací účinnosti - cloning efficiency nebo relativního celkového růstu.

        účinné od 1. 8. 2004Každý lokus má určitou minimální časový interval pro téměř optimální expresi nově indukovaných mutantů (HPRT a XPRT vyžaduje minimálně 6 – 8 dní, TK minimálně 2 dny). Buňky se pěstují v médiu s a bez selekčního činidla pro stanovení počtu mutantů a klonovací účinnosti. Po skončení doby exprese se začne s analýzou životnosti (používané k výpočtu četnosti mutantů) inokulací buněk na neselekční médium.

        účinné od 1. 8. 2004Pokud je látka v testu L5178Y TK+/- pozitivní, je třeba minimálně na jedné z experimentálních kultur (nejvyšší pozitivní koncentrace) a na negativních a pozitivních kontrolách stanovit velikost kolonií. Pokud je látka v tomto testu negativní, změří se velikost kolonií u negativní a pozitivní kontroly. Měření se může provést i ve studiích s TK6TK+/-.

  1. účinné od 1. 8. 20042 ÚDAJE
    1. účinné od 1. 8. 20042.1 Zpracování výsledků

      účinné od 1. 8. 2004Jako data slouží výsledky stanovení cytotoxicity a životnosti, počty kolonií a mutační frekvence u experimentálních a kontrolních kultur. V případě pozitivní reakce v testu L5178TK+/- se kolonie hodnotí pomocí kritérií malých a velkých kolonií přinejmenším v jedné koncentraci testované látky (nejvyšší pozitivní koncentrace) a v negativní a pozitivní kontrole. Molekulární a cytogenetické vlastnosti velkých i malých kolonií byly podrobně prostudovány v publikacích.5) Při testu TK+/- se kolonie hodnotí podle kritéria kolonií normálního růstu (velké) a pomalého růstu (malé).5) Mutanty, které utrpěly nejrozsáhlejší genetické poškození, mají delší dobu zdvojení a proto tvoří malé kolonie. Rozmezí tohoto poškození obvykle sahá od ztráty celého genu po karyotypicky viditelné chromozómové aberace. Tvorba malých kolonií je asociována s expozicí látkám indukujících hrubé chromozómové aberace.5) Méně závažně postižené mutanty rostou podobnou rychlostí jako buňky rodičovské a vytvářejí velké kolonie.

      účinné od 1. 8. 2004Je třeba uvádět také přežití (relativní klonovací účinnost - relative cloning efficiency) nebo relativní celkový růst. Mutační frekvence se vyjadřuje jako počet mutovaných buněk dělený počtem přežívajících buněk.

      účinné od 1. 8. 2004Uvádějí se individuální údaje o kultivačních podmínkách; nakonec se všechna data shrnou v tabelární formě.

      účinné od 1. 8. 2004Verifikace zjevně pozitivní reakce se nepožaduje. Nejednoznačné výsledky se objasňují dalším testováním, nejlépe za modifikovaných experimentálních podmínek. Negativní výsledky se musí potvrdit případ od případu. V případech, kdy se potvrzení negativních výsledků nepovažuje za nutné, je třeba podat zdůvodnění. V případě nejednoznačných nebo negativních výsledků je třeba v následných experimentech zvážit modifikaci parametrů studie tak, aby se rozšířilo rozmezí podmínek. K parametrům, které se dají v experimentu modifikovat, patří rozdíly mezi jednotlivými koncentracemi a podmínky metabolické aktivace.

    1. účinné od 1. 8. 20042.2 Vyhodnocení a interpretace výsledků

      účinné od 1. 8. 2004Ke stanovení pozitivního výsledku existuje několik kritérií, například na koncentraci testované látky závislý nárůst nebo reprodukovatelný nárůst mutační frekvence. Nejprve je třeba uvážit biologickou významnost výsledků. Při vyhodnocování výsledků testu se mohou použít statistické metody. Statistická významnost by však neměla být jediným určujícím faktorem pozitivního výsledku.

      účinné od 1. 8. 2004Testovaná látka, při jejímž použití výsledky nesplňují výše uvedená kritéria, se v tomto systému považuje za nemutagenní. Většina experimentů sice poskytuje jednoznačně pozitivní nebo negativní výsledky, v ojedinělých případech však nelze ze získaného souboru dat vyvodit o aktivitě testované látky definitivní závěr. Výsledky mohou být stále nejednoznačné nebo problematické, i když se experiment několikrát opakuje.

      účinné od 1. 8. 2004Pozitivní výsledky testu na genové mutace v savčích buňkách in vitro ukazují, že testovaná látka vyvolává v kultuře savčích buněk genové mutace. Nejprůkaznější je reprodukovatelný pozitivní efekt dávka-účinek. Negativní výsledky ukazují, že za daných experimentálních podmínek testovaná látka v kultuře savčích buněk nevyvolává genové mutace.

  1. účinné od 1. 8. 20043 PROJEKT POKUSU, PROTOKOL POKUSU A ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA

    účinné od 1. 8. 2004V souladu se s příslušnými právními předpisy9) musí být zpracován projekt pokusu a o průběhu pokusu je nutno vést protokol.

    1. účinné od 1. 8. 2004Ve zprávě o průběhu pokusu je třeba uvést tyto informace:
      1. účinné od 1. 8. 2004Rozpouštědlo / vehikulum:
        1. účinné od 1. 8. 2004- zdůvodnění volby rozpouštědla/vehikula,
        2. účinné od 1. 8. 2004- rozpustnost a stabilita testované látky v rozpouštědle/vehikulu, pokud je známa.
      1. účinné od 1. 8. 2004Buňky:
        1. účinné od 1. 8. 2004- typ a zdroj buněk,
        2. účinné od 1. 8. 2004- počet buněčných kultur,
        3. účinné od 1. 8. 2004- případně počet pasáží,
        4. účinné od 1. 8. 2004- případně metody kultivace buněčné kultury,
        5. účinné od 1. 8. 2004- absence mykoplazmat.
      1. účinné od 1. 8. 2004Podmínky pokusu:
        1. účinné od 1. 8. 2004- zdůvodnění volby použitých koncentrací a počtu kultur, včetně např. údajů o cytotoxicitě a limitech v rozpustnosti, jsou-li k dispozici,
        2. účinné od 1. 8. 2004- složení média, koncentrace CO2,
        3. účinné od 1. 8. 2004- koncentrace testované látky,
        4. účinné od 1. 8. 2004- objem vehikula a přidané testované látky,
        5. účinné od 1. 8. 2004- inkubační teplota,
        6. účinné od 1. 8. 2004- doba inkubace,
        7. účinné od 1. 8. 2004- doba působení látky,
        8. účinné od 1. 8. 2004- případně hustota buněk během expozice,
        9. účinné od 1. 8. 2004- typ a složení systému metabolické aktivace, včetně kritérií akceptovatelnosti,
        10. účinné od 1. 8. 2004- pozitivní a negativní kontroly,
        11. účinné od 1. 8. 2004- délka expresní periody (případně včetně počtu inokulovaných buněk, subkultur)
        12. účinné od 1. 8. 2004- selekční činidla,
        13. účinné od 1. 8. 2004- kritéria, jimiž se studie hodnotí jako pozitivní, negativní nebo nejednoznačná,
        14. účinné od 1. 8. 2004- metody zjišťování počtu živých a mutovaných buněk,
        15. účinné od 1. 8. 2004- definice kolonií, u nichž se hodnotí velikost a typ (včetně případných kritérií pro rozlišování mezi „malými“ a „velkými“ koloniemi).
      1. účinné od 1. 8. 2004Výsledky:
        1. účinné od 1. 8. 2004- známky toxicity,
        2. účinné od 1. 8. 2004- známky srážení,
        3. účinné od 1. 8. 2004- údaje o pH a osmolalitě během působení testované látky, jsou-li stanoveny,
        4. účinné od 1. 8. 2004- velikost kolonií, je-li hodnocena, minimálně pro negativní a pozitivní kontrolu,
        5. účinné od 1. 8. 2004- případné možnosti laboratoře zjistit malé kolonie mutantů pomocí systému L5178Y TK+/-
        6. účinné od 1. 8. 2004- vztah dávka- účinek, je-li to možné,
        7. účinné od 1. 8. 2004- statistické analýzy, byly-li provedeny,
        8. účinné od 1. 8. 2004- souběžné údaje z negativních (rozpouštědlo/vehikulum) a pozitivních kontrol,
        9. účinné od 1. 8. 2004- historické údaje z negativních (rozpouštědlo/vehikulum) a pozitivních kontrol, včetně rozpětí, průměrů a směrodatných odchylek
        10. účinné od 1. 8. 2004- četnost mutantů.

    účinné od 1. 8. 2004Diskuse výsledků.

    účinné od 1. 8. 2004Závěry.

účinné od 1. 8. 2004B.18 POŠKOZENÍ DNA REPARACE - NEPLÁNOVANÁ SYNTÉZA DNA - SAVČÍ BUŇKY IN VITRO

  1. účinné od 1. 8. 20041 METODA je v souladu s právem Evropských společenství.1)
    1. účinné od 1. 8. 20041.1 Princip metody

      účinné od 1. 8. 2004Test neplánované syntézy DNA (UDS) umožňuje měřit reparační syntézu DNA po excizi a odstranění části DNA obsahující oblast poškození indukovaného chemickými, nebo fyzikálními faktory. Test je založen na inkorporaci značeného tymidínu (3H-TdR) do DNA savčích buněk, které nejsou v S fázi buněčného cyklu. Vzestup 3H-TdR je stanoven autoradiograficky, nebo kapalnou scintilační metodou (LSC) v exponovaných buňkách. Používají se savčí buněčné kultury pokud ne přímo primární buněčné kultury hepatocytů potkana, které jsou exponovány testovanou látkou jak v přítomnosti tak i v nepřítomnosti exogenního metabolického aktivačního systému. UDS může být také stanovena v systému in vivo.

    1. účinné od 1. 8. 20041.2 Popis metody
      1. účinné od 1. 8. 20041.2.1 Příprava

        účinné od 1. 8. 2004Testované látky a sloučeniny použité jako kontrolní, nebo referenční se rozpustí, nebo suspendují v kultivačním médiu, nebo ve vhodném rozpouštědle. Další ředění se provádí jenom kultivačním médiem. Konečná koncentrace rozpouštědla v kultuře nesmí nepříznivě ovlivňovat životnost buněk.

        účinné od 1. 8. 2004Používají se pouze primokultury potkaních hepatocytů, lidských lymfocytů, nebo stabilizovaných buněčných linií (lidské diploidní fibroblasty).

        účinné od 1. 8. 2004Buňky jsou exponovány testované látce v přítomnosti a nepřítomnosti vhodného metabolického aktivačního systému.

      1. účinné od 1. 8. 20041.2.2 Experimentální podmínky
        1. účinné od 1. 8. 20041.2.2.1 Počet kultur

          účinné od 1. 8. 2004Pro každý experimentální bod je potřeba nejméně dvou buněčných kultur pro autoradiografii a šesti kultur (nebo méně, je-li to vědecky zdůvodnitelné) pro LSC UDS.

        1. účinné od 1. 8. 20041.2.2.2 Negativní a pozitivní kontroly

          účinné od 1. 8. 2004V každém experimentu musí být současně zařazeny negativní a pozitivní kontroly v přítomnosti i v nepřítomnosti metabolického aktivačního systému.

          účinné od 1. 8. 2004Jako pozitivní kontrolu lze pro potkaní hepatocyty použít 7,12-dimethylbenzanthracen (7,12-DMBA), nebo 2-acetylaminofluoren (2-AAF). Jako positivní kontrolu pro stabilisované buněčné linie jak pro autoradiografii, tak i pro LSC bez metabolické aktivace lze použít 4-nitrochinolin-N-oxid (4-NQO). Jako pozitivní kontrolu při použití metabolického aktivačního systému lze použít N-dimethylnitrosamin.

        1. účinné od 1. 8. 20041.2.2.3 Koncentrace testované látky

          účinné od 1. 8. 2004Musí být použito několik koncentrací testované látky. Nejvyšší koncentrace musí vyvolávat cytotoxický efekt.

          účinné od 1. 8. 2004Látky ve vodě špatně rozpustné musí být testovány v koncentracích až na hranici rozpustnosti za použití vhodných postupů. Pro netoxické látky ve vodě dobře rozpustné se nejvyšší koncentrace testované látky určuje případ od případu.

        1. účinné od 1. 8. 20041.2.2.4 Buňky

          účinné od 1. 8. 2004Pro udržování kultur musí být použito vhodné růstové médium, koncentrace CO2, teplota a vlhkost. Stabilizované buněčné linie musí být pravidelně kontrolovány na přítomnost Mycoplasmat.

        1. účinné od 1. 8. 20041.2.2.5 Metabolická aktivace

          účinné od 1. 8. 2004Pro primokultury hepatocytů se metabolický aktivační systém nepoužívá. Stabilizované buněčné linie a lymfocyty jsou exponovány testované látce v přítomnosti i nepřítomnosti vhodného metabolického aktivačního systému.

      1. účinné od 1. 8. 20041.2.3 Vlastní experiment
        1. účinné od 1. 8. 20041.2.3.1 Příprava kultur

          účinné od 1. 8. 2004Stabilizovaná buněčná linie se připravuje ze zásobní kultury (trypsinací nebo setřepáním buněk z povrchu kultivační nádoby), inokuluje se do kultivačních nádob ve vhodné hustotě a inkubuje při 37 °C.

          účinné od 1. 8. 2004Krátkodobé kultury potkaních hepatocytů se připravují tak, že se umožní čerstvě isolovaným hepatocytům přichytit se ve vhodném médiu k povrchu kultivační nádoby.

          účinné od 1. 8. 2004Kultury lidských lymfocytů jsou založeny pomocí vhodné metody.

        1. účinné od 1. 8. 20041.2.3.2 Expozice kultur testované látce

          účinné od 1. 8. 2004Primární hepatocyty potkana. Čerstvě isolované hepatocyty potkana jsou exponovány testované látce v médiu obsahujícím 3H-TdR po vhodnou dobu. Po ukončené expozici je médium odstraněno, buňky promyty, fixovány a sušeny. Sklíčka jsou ponořena do autoradiografické emulse (alternativně může být použit stripping film), exponována, vyvolána, obarvena a vyhodnocena.

          účinné od 1. 8. 2004Stabilizované buněčné linie a lymfocyty

          účinné od 1. 8. 2004Autoradiografické techniky: Buněčné kultury jsou exponovány testované látce po vhodnou dobu a pak jsou vystaveny působení 3H-TdR. Doba působení je závislá na druhu testované látky, aktivitě metabolického systému a na typu buněk. K zachycení nejvyššího vrcholu UDS je třeba 3H-TdR přidat současně s testovanou látkou, nebo několik minut po expozici. Výběr mezi těmito postupy je ovlivněn možnou interakcí mezi testovanou látkou a 3H-TdR. K odlišení mezi UDS a semikonzervativní replikací DNA se užívá arginin deficientní médium, nízký obsah séra, nebo aplikace hydroxyurey do kultivačního média což způsobí inhibici semikonzervativní replikace DNA.

          účinné od 1. 8. 2004Stanovení UDS pomocí LSC: Před expozicí testované látce je třeba blokovat vstup buněk do S-fáze, jak bylo shora uvedeno. Buňky jsou pak exponovány testované látce jak bylo popsáno pro autoradiografii. Na konci kultivace je DNA extrahována z buněk a stanoven celkový obsah DNA a určen rozsah inkorporace 3H-TdR.

          účinné od 1. 8. 2004Jestliže jsou použity ve shora uvedených metodách lidské lymfocyty, je v nestimulovaných kulturách suprese semikonzervativní replikace DNA zbytečná.

      1. účinné od 1. 8. 20041.2.4 Analýza
        1. účinné od 1. 8. 20041.2.4.1 Vyhodnocení autoradiografie

          účinné od 1. 8. 2004Při vyhodnocování UDS v buněčné kultuře se jádra v S-fázi nehodnotí. Hodnotí se nejméně 50 buněk v každém experimentálním bodě. Preparáty je třeba zakódovat před vyhodnocováním. V každém preparátu se hodnotí několik náhodně vybraných polí. Množství inkorporovaného 3H-TdR v cytoplazmě se určí v zóně o velikosti tří jader v cytoplazmě každé hodnocené buňky.

        1. účinné od 1. 8. 20041.2.4.2 Vyhodnocení LSC

          účinné od 1. 8. 2004Pro stanovení LSC UDS se použije přiměřený počet kultur pro každou koncentraci testované látky a pro kontroly.

          účinné od 1. 8. 2004Výsledky musí být potvrzeny v nezávislých experimentech.

  1. účinné od 1. 8. 20042 ÚDAJE

    účinné od 1. 8. 2004Údaje musí být uvedeny v tabulkách.

    1. účinné od 1. 8. 20042.1 Vyhodnocení autoradiografie

      účinné od 1. 8. 2004Rozsah inkorporace 3H-TdR do cytoplazmy a počet zrn nalezených mimo buněčné jádro se zaznamenávají odděleně.

      účinné od 1. 8. 2004Rozsah inkorporace 3H-TdR do cytoplazmy a počet zrn v jádře je hodnocen pomocí průměru, mediánu a modu.

    1. účinné od 1. 8. 20042.2 Vyhodnocení LSC

      účinné od 1. 8. 2004Inkorporace 3H-TdR se zaznamenává jako dpm/μg DNA. Průměrná hodnota dpm/μg DNA spolu se směrodatnou odchylkou se používají k vyjádření distribuce inkorporace.

      účinné od 1. 8. 2004Údaje se vyhodnocují vhodnými statistickými metodami.

  1. účinné od 1. 8. 20043 PROJEKT POKUSU, PROTOKOL POKUSU A ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA

    účinné od 1. 8. 2004V souladu s příslušnými právními předpisy9) musí být zpracován projekt pokusu a o průběhu pokusu je nutno vést protokol.

    1. účinné od 1. 8. 2004Zpráva o průběhu pokusu obsahuje tyto informace o:
      1. účinné od 1. 8. 2004- použitých buňkách, jejich hustotě a číslu pasáže v době ovlivnění kultury, počtu buněčných kultur,
      2. účinné od 1. 8. 2004- metodách použitých k udržování kultury, médiu, teplotě, koncentraci CO2,
      3. účinné od 1. 8. 2004- testované látce, rozpouštědle, koncentracích a zdůvodnění jejich výběru v experimentu,
      4. účinné od 1. 8. 2004- metabolickém aktivačním systému,
      5. účinné od 1. 8. 2004- pokusném schématu,
      6. účinné od 1. 8. 2004- pozitivních a negativních kontrolách,
      7. účinné od 1. 8. 2004- použitých autoradiografických metodách,
      8. účinné od 1. 8. 2004- způsobech blokování vstupu buněk do S-fáze,
      9. účinné od 1. 8. 2004- postupech použitých k extrakci DNA, a k vyhodnocení celkového obsahu DNA při metodě LSC,
      10. účinné od 1. 8. 2004- vztahu dávka/účinek, je-li to možné,
      11. účinné od 1. 8. 2004- statistickém vyhodnocení.

    účinné od 1. 8. 2004Diskuse výsledků.

    účinné od 1. 8. 2004Závěry.

účinné od 1. 8. 2004B.19 SCE - VÝMĚNA SESTERSKÝCH CHROMATID IN VITRO

  1. účinné od 1. 8. 20041 METODA je v souladu s právem Evropských společenství.1)
    1. účinné od 1. 8. 20041.1 Princip metody

      účinné od 1. 8. 2004SCE je krátkodobý test pro detekci recipročních výměn DNA mezi dvěma sesterskými chromatidami chromozómu. SCE reprezentují výměny identických sekvencí DNA mezi replikačními produkty v identických (homologních) lokusech. SCE pravděpodobně vyžaduje zlom a opětovné spojení, ale je zatím málo znalostí o molekulárním základě tohoto procesu. Detekce SCE vyžaduje diferenční značení sesterských chromatid. Toho se dosahuje inkorporací bromodeoxyuridinu (BrdU) do chromozomální DNA po dobu dvou buněčných cyklů.

      účinné od 1. 8. 2004Savčí buňky in vitro jsou exponovány testované látce v přítomnosti i bez přítomnosti exogenního metabolického aktivačního systému, je-li to potřebné. Kultivují se po dobu dvou replikačních cyklů v médiu obsahujícím BrdU. Ke konci kultivace se buňky ovlivní inhibitorem dělícího vřeténka (např. kolchicin) k akumulaci buněk v c-metafázi mitózy. Po ukončení kultivace jsou buňky zpracovány a připraveny preparáty pro analýzu chromozómů.

    1. účinné od 1. 8. 20041.2 Popis metody
      1. účinné od 1. 8. 20041.2.1 Příprava

        účinné od 1. 8. 2004Používají se primokultury, (lidské lymfocyty) nebo stabilizované buněčné linie (ovariální buňky čínského křečka). Buněčné linie musí být kontrolovány z hlediska kontaminace Mycoplasmaty,

        účinné od 1. 8. 2004Používají se vhodná kultivační média a kultivační podmínky (teplota, kultivační nádoby, koncentrace CO2 a vlhkost),

        účinné od 1. 8. 2004Testovaná látka se rozpouští, nebo suspenduje v kultivačním médiu, nebo ve vhodném rozpouštědle. Výsledná koncentrace rozpouštědla nesmí významně ovlivnit životnost buněk, rychlost růstu nebo frekvenci SCE,

        účinné od 1. 8. 2004Buňky se exponují testované látce v přítomnosti i bez přítomnosti vhodného exogenního savčího metabolického aktivačního systému. Připouští se použití buněčných typů s vnitřní (vlastní) metabolickou aktivitou, jestliže úroveň a vlastnosti této aktivity jsou vhodné pro testovanou skupinu chemických látek.

      1. účinné od 1. 8. 20041.2.2 Experimentální podmínky
        1. účinné od 1. 8. 20041.2.2.1 Počet kultur

          účinné od 1. 8. 2004Pro každý experimentální bod se použijí nejméně dvě kultury.

        1. účinné od 1. 8. 20041.2.2.2 Negativní a pozitivní kontroly

          účinné od 1. 8. 2004V každém experimentu musí být zařazeny pozitivní kontroly s látkami s přímým mutagenním účinkem a látky vyžadující metabolickou aktivaci. Dále musí být použita negativní kontrola s použitým rozpouštědlem.

          1. účinné od 1. 8. 2004Jako pozitivní kontrolu lze použít:
            1. účinné od 1. 8. 2004- přímo působící mutageny: etylmetansulfonát
            2. účinné od 1. 8. 2004- nepřímo působící mutageny: cyklofosfamid

            účinné od 1. 8. 2004Je-li třeba, je možné zařadit další positivní kontrolu ze stejné chemické skupiny jako je testovaná látka.

        1. účinné od 1. 8. 20041.2.2.3 Koncentrace

          účinné od 1. 8. 2004Testují se nejméně tři dávky. Nejvyšší koncentrace testované látky musí mít signifikantní toxický účinek, ale zároveň musí umožnit adekvátní replikaci buněk. Ve vodě relativně nerozpustné látky je třeba testovat až na hranici jejich rozpustnosti za použití vhodných postupů. Nejvyšší použitá koncentrace ve vodě rozpustné netoxické látky se určuje individuálně.

      1. účinné od 1. 8. 20041.2.3 Popis postupu
        1. účinné od 1. 8. 20041.2.3.1 Příprava kultur

          účinné od 1. 8. 2004Stabilizovaná buněčná linie se připravuje se zásobní kultury (trypsinací, nebo setřepáním buněk z povrchu kultivační nádoby), inokuluje se do kultivačních nádob ve vhodné hustotě a inkubuje při 37 °C. Pro monovrstevné kultury se stanoví takový počet buněk v kultivační nádobě, aby na konci kultivace nevytvářely více než z 50 % konfluentní vrstvu. Lze také použít suspenzních kultur. Lidské lymfocytární kultury se připraví z heparinizované krve běžnými postupy a inkubují při 37 °C.

        1. účinné od 1. 8. 20041.2.3.2 Expozice kultur

          účinné od 1. 8. 2004Buňky jsou exponovány testované látce v exponenciální fázi růstu po vhodnou dobu. Ve většině případů stačí jedna až dvě hodiny, ale expozice může být prodloužena až na dva buněčné cykly, je-li to třeba. Buňky, které nemají dostatečnou vlastní metabolickou aktivitu, musí být exponovány testovanou látkou v přítomnosti i nepřítomnosti vhodného metabolického aktivačního systému. Na konci expozice je testovaná látka z média odstraněna, buňky vymyty a dále kultivovány v růstovém médiu s BrdU dva replikační cykly. Alternativně mohou být buňky exponovány současně s testovanou látkou a BrdU po dobu dvou buněčných cyklů.

          účinné od 1. 8. 2004Lidské lymfocytární kultury jsou exponovány testovanou látkou dokud jsou v semisynchronizovaných podmínkách.

          účinné od 1. 8. 2004Buňky jsou analyzovány v druhém mitotickém dělení po expozici testované látce, která proběhla v nejcitlivějším stádiu buněčného cyklu. Všechny kultury s BrdU je třeba udržovat v temnu, nebo ve světle zastíněné žárovky, aby se zabránilo fotolýze DNA ve které je inkorporovaný BrdU.

        1. účinné od 1. 8. 20041.2.3.3 Zpracování buněk

          účinné od 1. 8. 2004Jednu až čtyři hodiny před ukončením kultivace se do kultur přidá inhibitor dělícího vřeténka (např. kolchicin). Každá kultura se zpracovává samostatně.

        1. účinné od 1. 8. 20041.2.3.4 Příprava preparátů a barvení

          účinné od 1. 8. 2004Preparáty se připraví standardní cytogenetickou technikou. Barvení preparátů ke znázornění SCE může být provedeno několika technikami (např. fluorescenční plus Giemsa).

        1. účinné od 1. 8. 20041.2.3.5 Analýza

          účinné od 1. 8. 2004Počet analyzovaných buněk je závislý na spontánní frekvenci SCE v kontrole. Obvykle se hodnotí nejméně 25 dobře rozprostřených metafází na každou kulturu. Preparáty musí být zakódovány před analýzou. V lidských lymfocytech se analyzují pouze metafáze s 46 centromerami. U stabilizovaných linií pouze metafáze, které se liší o ± 2 centromery od modálního počtu centromer. Je třeba stanovit, zda se budou analyzovat SCE v oblasti centromery. Výsledky musí být ověřeny v nezávislých experimentech.

  1. účinné od 1. 8. 20042 ÚDAJE

    účinné od 1. 8. 2004Údaje se zapisují do tabulky. Zaznamenává se počet SCE v každé metafázi a počet SCE/chromozóm zvlášť pro každou metafázi v exponovaných i kontrolních skupinách.

    účinné od 1. 8. 2004Údaje se hodnotí vhodnými statistickými metodami.

  1. účinné od 1. 8. 20043 PROJEKT POKUSU, PROTOKOL POKUSU A ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA

    účinné od 1. 8. 2004V souladu s příslušnými právními předpisy9) musí být zpracován projekt pokusu a o průběhu pokusu je nutno vést protokol.

    1. účinné od 1. 8. 2004Zpráva o průběhu pokusu obsahuje tyto informace o:
      1. účinné od 1. 8. 2004- použitých buňkách, metodách použitých k udržování kultury,
      2. účinné od 1. 8. 2004- kultivačních podmínkách: složení média, teplotě, koncentraci CO2, koncentraci testované látky, rozpouštědle, kultivačních nádobách, délce expozice, inhibitoru mitózy a jeho koncentraci i jeho délce působení, metabolickém aktivačním systému, positivních a negativních kontrolách,
      3. účinné od 1. 8. 2004- počtu kultur pro každý experimentální bod,
      4. účinné od 1. 8. 2004- způsobu přípravy mikroskopických preparátů
      5. účinné od 1. 8. 2004- počtu analyzovaných metafází (odděleně pro každou kulturu)
      6. účinné od 1. 8. 2004- průměrném počtu SCE/buňku a SCE/chromozóm (odděleně pro každou kulturu
      7. účinné od 1. 8. 2004- kritériích hodnocení SCE
      8. účinné od 1. 8. 2004- zdůvodnění výběru koncentrací
      9. účinné od 1. 8. 2004- vztahu dávka/účinek, je-li to možné,
      10. účinné od 1. 8. 2004- statistickém vyhodnocení.

    účinné od 1. 8. 2004Diskuse výsledků.

    účinné od 1. 8. 2004Závěry.

účinné od 1. 8. 2004B.20 RECESIVNÍ LETÁLNÍ MUTACE VÁZANÉ NA POHLAVÍ U DROSOPHILA MELANOGASTER

  1. účinné od 1. 8. 20041 METODA je v souladu s právem Evropských společenství.1)
    1. účinné od 1. 8. 20041.1 Princip metody

      účinné od 1. 8. 2004Test na recesivní letální mutace vázané na pohlaví (SLRL) na Drosophila melanogaster umožňuje detekci mutací, jak genových, tak i malých delecí, v zárodečných buňkách hmyzu. Je to test na forward mutace vhodný pro skríning mutací v přibližně 800 lokusech chromozómu X. Tyto reprezentují asi 80 % všech lokusů X-chromozómu. X-chromozóm reprezentuje přibližně 1/5 celého haploidního genómu.

      účinné od 1. 8. 2004Mutace v X-chromozómu se fenotypicky projeví u samců nesoucích mutovaný gen. Když je mutace letální v hemizygotním stavu lze na její přítomnost usuzovat z absence jednoho ze dvou typů samčích potomků, kteří se normálně rodí heterozygotní samici. SRLS test je výhodný vzhledem k zvláštnímu vzhledu a uspořádání chromozómů.

    1. účinné od 1. 8. 20041.2 Popis metody
      1. účinné od 1. 8. 20041.2.1 Příprava
        1. účinné od 1. 8. 20041.2.1.1 Zdroje

          účinné od 1. 8. 2004Používají se samci dobře definované divoké linie a samice linie Muller-5. Mohou být použity i jiné vhodné dobře popsané linie samic s vícenásobnou inversí X-chromozómu.

        1. účinné od 1. 8. 20041.2.1.2 Testované látky

          účinné od 1. 8. 2004Testované látky se rozpouštějí ve vodě. Látky ve vodě nerozpustné se rozpouštějí, nebo suspendují ve vhodném rozpouštědle (např. směs etanolu a Tweenu-60, nebo 80), před aplikací se dále ředí vodou, nebo fyziologickým roztokem. Doporučuje se nepoužívat dimetylsulfoxid (DMSO) jako vehikulum.

        1. účinné od 1. 8. 20041.2.1.3 Počet zvířat

          účinné od 1. 8. 2004Test má předem určenou citlivost. Spontánní frekvence mutací v kontrolní skupině významně ovlivňuje nutný počet ovlivněných chromozómů, které je třeba analyzovat.

        1. účinné od 1. 8. 20041.2.1.4 Způsob aplikace

          účinné od 1. 8. 2004Expozice testované látce se uskutečňuje per os, injekčně, nebo expozicí plynům nebo parám. Zkrmování testované látky se provádí v cukerném roztoku. Je-li to nutné, testovaná látka se rozpustí v 0,7 % roztoku NaCl a injikuje se do hrudní nebo břišní dutiny.

        1. účinné od 1. 8. 20041.2.1.5 Negativní a pozitivní kontroly

          účinné od 1. 8. 2004V každém pokusu se zařazují negativní (s rozpouštědlem) a pozitivní kontroly. Jestliže má laboratoř k dispozici vhodné historické kontrolní údaje, není třeba zařazovat do experimentu souběžné kontroly.

        1. účinné od 1. 8. 20041.2.1.6 Dávkování

          účinné od 1. 8. 2004Používají se tři dávky testované látky. Pro předběžný orientační odhad se používá jedna dávka rovnající se maximální tolerované koncentraci, nebo vyvolávající známky toxicity. Netoxické látky se testují v nejvyšší dosažitelné dávce.

      1. účinné od 1. 8. 20041.2.2 Popis postupu

        účinné od 1. 8. 2004Samci divokého typu (ve stáří 3-5 dnů) jsou ovlivněni testovanou látkou a individuálně kříženi s virginními samicemi z linie Muller-5 nebo z jiné vhodné markerové linie (vícenásobná inverse X-chromozómu). Samice jsou vyměněny za čerstvé virginní samice každé dva až tři dny aby byl pokryt celý buněčný cyklus zárodečných buněk. U potomků těchto samic je sledován letální efekt korespondující s účinkem testované látky v době expozice na zralé spermie, na spermatidy ve středním, nebo pozdním stádiu, časné spermatidy, spermatocyty a spermatogonie.

        účinné od 1. 8. 2004Heterozygotní F1 samice narozené z tohoto křížení jsou dále kříženy individuálně (tj. jedna samice/zkumavku) se svými bratry. V F2 generaci je v každé kultuře zaznamenávána absence samců divokého typu. Jestliže v kultuře vznikají F1 samice nesoucí letální mutaci v rodičovském X-chromozómu ( nejsou nalezeni žádní samci s ovlivněným chromozómem), dcery těchto samic se stejným genotypem jsou dále testovány aby se zjistilo, zda letalita se opakuje v dalších generacích.

  1. účinné od 1. 8. 20042 ÚDAJE

    účinné od 1. 8. 2004Získané údaje se zpracují do tabulky. Uvádí se počet hodnocených X-chromozómů, počet afertilních samců a počet chromozómů s letální mutací pro každou koncentraci, pro každé období křížení a pro každého testovaného samce. Zaznamenává se počet clusterů různých velikostí pro každého samce. Výsledky se mají potvrdit v nezávislém experimentu.

    účinné od 1. 8. 2004Údaje se zhodnotí vhodnou statistickou metodou. Nahromadění recesivních letálních mutací vzniklých v jednom samci má být vzato v úvahu a zhodnoceno vhodným statistickým způsobem.

  1. účinné od 1. 8. 20043 PROJEKT POKUSU, PROTOKOL POKUSU A ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA

    účinné od 1. 8. 2004V souladu se s příslušnými právními předpisy9) musí být zpracován projekt pokusu a o průběhu pokusu je nutno vést protokol.

    1. účinné od 1. 8. 2004Zpráva o průběhu pokusu obsahuje tyto informace o:
      1. účinné od 1. 8. 2004- použitých liniích, nebo kmenech Drosophily, věku, počtu ovlivněných samců, počtu sterilních samců, počtu vzniklých F2 kultur, počtu F2 kultur bez potomků, počtu chromozómů nesoucích letální mutaci pro každé stádium zárodečných buněk,
      2. účinné od 1. 8. 2004- kritériích pro velikost ovlivněných skupin,
      3. účinné od 1. 8. 2004- podmínkách testu: detailní popis ovlivňování a schéma odběru vzorků, výše dávek, údaje o toxicitě, negativní (s rozpouštědlem) a positivní kontroly,
      4. účinné od 1. 8. 2004- kritériích počítání letálních mutací,
      5. účinné od 1. 8. 2004- vztahu expozice/účinek, je-li to možné,
      6. účinné od 1. 8. 2004- hodnocení údajů,

    účinné od 1. 8. 2004Diskuse výsledků.

    účinné od 1. 8. 2004Závěry.

účinné od 1. 8. 2004B.21 TEST TRANSFORMACE SAVČÍCH BUNĚK - IN VITRO

  1. účinné od 1. 8. 20041 METODA je v souladu s právem Evropských společenství.1)
    1. účinné od 1. 8. 20041.1 Princip metody

      účinné od 1. 8. 2004Savčí buňky lze použít pro detekci fenotypických změn in vitro indukovaných chemickými látkami spojených s maligní transformací in vivo. Nejčastěji se používají buňky C3H10T1/2, 3T3, SHE, Fischerových potkanů a test se opírá o změny buněčné morfologie, tvorbu ložisek, nebo změny v uchycení v semisolidním agaru. Méně se používají systémy detekující ostatní fyziologické či morfologické změny v buňkách po expozici karcinogenním látkám. Žádný výsledek in vitro testu není důkazem karcinogenity. Některé systémy jsou schopné detekce promotorů. Cytotoxicita může být zjištěna hodnocením účinku testované látky na schopnost vytvářet kolonie (cloning efficiency), nebo ovlivněním rychlosti růstu kultury. Při hodnocení cytotoxicity se vychází ze skutečnosti, že expozice testované látce byla toxikologicky relevantní, ale přesto ji nelze použít k určení frekvence transformace ve všech experimentech, protože u některých mohlo dojít k prodloužení inkubace, nebo k replatingu.

    1. účinné od 1. 8. 20041.2 Popis metody
      1. účinné od 1. 8. 20041.2.1 Příprava
        1. účinné od 1. 8. 20041.2.1.1 Buňky

          účinné od 1. 8. 2004Existuje řada buněčných linií a primokultur použitelných k testu transformace. Experimentátor musí zajistit, že buňky použité v testu transformace vykazují příslušné fenotypické změny po expozici známým karcinogenem a že test používaný laboratoří je ověřen a že je dokumentována jeho oprávněnost a spolehlivost.

        1. účinné od 1. 8. 20041.2.1.2 Médium

          účinné od 1. 8. 2004Použitá média a experimentální podmínky musí být vhodné pro použitý test transformace.

        1. účinné od 1. 8. 20041.2.1.3 Testované látky

          účinné od 1. 8. 2004Testované látky se rozpouštějí, nebo suspendují v kultivačním médiu, nebo ve vhodném rozpouštědle před ovlivněním buněk. Konečná koncentrace rozpouštědla v kultuře nesmí ovlivnit životnost buněk, růstovou rychlost nebo výskyt transformace.

        1. účinné od 1. 8. 20041.2.1.4 Metabolická aktivace

          účinné od 1. 8. 2004Buňky jsou exponovány testované látce v přítomnosti a bez přítomnosti vhodného metabolického aktivačního systému. Alternativně mohou být použity buňky s vlastní metabolickou aktivitou, jestliže její vlastnosti jsou vhodné pro testované látky.

      1. účinné od 1. 8. 20041.2.2 Experimentální podmínky
        1. účinné od 1. 8. 20041.2.2.1 Negativní a pozitivní kontroly

          účinné od 1. 8. 2004Do každého experimentu musí být zařazeny pozitivní kontroly s použitím látek přímo působících, i vyžadujících metabolickou aktivaci. Musí být zařazeny také negativní kontroly (s rozpouštědlem).

          1. účinné od 1. 8. 2004Příklady látek pro pozitivní kontroly:
            1. účinné od 1. 8. 2004- přímo působící látky: etylmetansulfonát, β-propiolakton,
            2. účinné od 1. 8. 2004- látky vyžadující metabolickou aktivaci: 2-acetylaminofluoren, 4-dimetylaminoazo-benzen, 7,12-dimetylbenzantracen.

          účinné od 1. 8. 2004Je možné zařadit další pozitivní kontrolu ze stejné chemické skupiny jako je testovaná látka.

        1. účinné od 1. 8. 20041.2.2.2 Koncentrace

          účinné od 1. 8. 2004Testují se nejméně 3 dávky. Tyto koncentrace musí vyvolávat toxický efekt závislý na koncentraci, nejvyšší koncentrace způsobují nízkou úroveň přežívání buněk, v nejnižší koncentraci je přežívání buněk přibližně stejné jako v negativní kontrole. Ve vodě relativně nerozpustné látky je třeba testovat až na hranici jejich rozpustnosti za použití vhodných postupů. Nejvyšší použitá koncentrace ve vodě rozpustné netoxické látky se určuje individuálně.

      1. účinné od 1. 8. 20041.2.3 Popis postupu

        účinné od 1. 8. 2004Buňky musí být exponovány dostatečnou dobu závislou na použitém testovacím systému. Ta může zahrnovat i opakovanou expozici testované látce spojenou s výměnou média (ev. výměnou čerstvé metabolické aktivační směsi) jestliže se jedná o prolongovanou expozici. Buňky bez dostatečné vlastní metabolické aktivity musí být exponovány testované látce v přítomnosti i nepřítomnosti vhodného metabolického aktivačního systému. Na konci expozice je z buněk propláchnutím odstraněna testovaná látka a kultivace probíhá dále za vhodných podmínek pro transformaci. Pak je zaznamenáván výskyt transformace. Všechny výsledky musí být ověřeny v nezávislých experimentech.

  1. účinné od 1. 8. 20042 ÚDAJE

    účinné od 1. 8. 2004Údaje musí být zapsány v tabulce. Je vhodné vyjadřovat přežívání buněk jako procento kontrolní úrovně a frekvenci transformací jako počet transformací na počet přežívajících buněk. Data je třeba zpracovat vhodnými statistickými metodami.

  1. účinné od 1. 8. 20043 PROJEKT POKUSU, PROTOKOL POKUSU A ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA

    účinné od 1. 8. 2004V souladu se s příslušnými právními předpisy9) musí být zpracován projekt pokusu a o průběhu pokusu je nutno vést protokol.

    1. účinné od 1. 8. 2004Zpráva o průběhu pokusu obsahuje tyto informace o:
      1. účinné od 1. 8. 2004- použitých buňkách, metodách použitých k udržování kultury, počtu kultur,
      2. účinné od 1. 8. 2004- kultivačních podmínkách: koncentraci testované látky, době inkubace, rozpouštědle, kultivačních nádobách, délce a frekvenci expozice, metabolickém aktivačním systému, positivních a negativních kontrolách, hustotě buněk během expozice, specifikaci sledovaného fenotypu, použití selektivního systému (je-li to vhodné), zdůvodnění výběru koncentrací,
      3. účinné od 1. 8. 2004- metodách vyčíslení živých a transformovaných buněk,
      4. účinné od 1. 8. 2004- statistickém vyhodnocení.

    účinné od 1. 8. 2004Diskuse výsledků.

    účinné od 1. 8. 2004Závěry.

účinné od 1. 8. 2004B.22 DOMINANTNÍ LETÁLNÍ TEST U HLODAVCŮ

  1. účinné od 1. 8. 20041 METODA je v souladu s právem Evropských společenství.1)
    1. účinné od 1. 8. 20041.1 Princip metody

      účinné od 1. 8. 2004Dominantní letalita způsobuje embryonální, nebo fetální smrt. Indukce dominantních letálních mutací po expozici chemické látce dokazuje, že tato látka poškozuje zárodečné tkáně exponovaného zvířecího druhu. Obecně se přijímá, že dominantní letální mutace jsou způsobeny poškozením chromozómů (strukturální a numerické abnormality). Smrt embrya exponované samice může být také výsledkem toxického účinku.

      účinné od 1. 8. 2004Samci jsou exponováni testované látce a pářeni s neovlivněnými, intaktními samicemi. Různá stádia zárodečných buněk mohou být testována odděleně použitím po sobě jdoucích intervalů páření. Vzestup mrtvých implantací na samičku v exponované skupině nad počet mrtvých implantací v kontrolní skupině vyjadřuje postimplantační ztráty. Preimplantační ztráty se hodnotí na základě počtu žlutých tělísek, nebo porovnáním všech implantací na samici v exponované a kontrolní skupině. Celková dominantní letalita je součet pre- a postimplantačních ztrát. Výpočet celkové dominantní letality je založen na srovnání živých implantací na samici v exponované skupině k živým implantacím na samici v kontrolní skupině. Snížení počtu implantací v některém intervalu může být způsobeno zánikem buněk (tj. spermatocytů a/nebo spermatogonií).

    1. účinné od 1. 8. 20041.2 Popis metody
      1. účinné od 1. 8. 20041.2.1 Příprava

        účinné od 1. 8. 2004Testovanou látku rozpustit, nebo suspendovat ve fyziologickém roztoku. Látky nerozpustné ve vodě se ředí, nebo suspendují ve vhodném rozpouštědle. Použité rozpouštědlo nesmí reagovat s testovanou látkou ani vyvolávat toxické účinky. Před aplikací je třeba připravovat čerstvě naředěnou testovanou látku.

      1. účinné od 1. 8. 20041.2.2 Experimentální podmínky
        1. účinné od 1. 8. 20041.2.2.1 Způsob aplikace

          účinné od 1. 8. 2004Testovaná látka se obvykle podává pouze jednou. Na základě toxikologických informací je možné podávat látku opakovaně. Obvyklý způsob aplikace je orální sondou nebo intraperitoneální injekce. Mohou být vhodné i jiné způsoby aplikace.

        1. účinné od 1. 8. 20041.2.2.2 Experimentální zvířata

          účinné od 1. 8. 2004Pokusná zvířata jsou vybrána s ohledem na druh, pohlaví, a stáří v souladu s ustanovením § 15 zvláštního právního předpisu10) a označena tak, aby byla možná identifikace jednotlivých zvířat. Dobu navykání stanoví § 10 zvláštního právního předpisu.10) Zdravá, pohlavně dospělá zvířata jsou náhodně rozdělena na exponované a kontrolní skupiny.

        1. účinné od 1. 8. 20041.2.2.3 Počet a pohlaví

          účinné od 1. 8. 2004Je třeba použít dostatečný počet exponovaných samců s ohledem na spontánní variabilitu hodnocené biologické charakteristiky. Počet se řídí předem zjištěnou detekční citlivostí a silou statistického testu. V typickém případě se na příklad volí takový počet samců, aby se dosáhlo 30 - 50 březích samic na připouštěcí interval.

        1. účinné od 1. 8. 20041.2.2.4 Negativní a pozitivní kontroly

          účinné od 1. 8. 2004Pozitivní a negativní (s rozpouštědlem) kontroly musí být zařazeny do každého experimentu. Jestliže však má laboratoř k dispozici přijatelné výsledky pozitivních kontrol z nedávných experimentů, mohou být použity. Látky pro positivní kontroly musí být použity ve vhodných, nízkých dávkách aby byla prokázána citlivost testu (např. MMS, intraperitoneálně, 10 mg.kg-1).

        1. účinné od 1. 8. 20041.2.2.5 Dávkování

          účinné od 1. 8. 2004Nejčastěji se používají 3 dávkové hladiny. Nejvyšší dávka má vyvolávat známky toxicity, nebo snížené fertility u exponovaných zvířat. V některých případech je postačující jedna vysoká dávka.

        1. účinné od 1. 8. 20041.2.2.6 Limitní test

          účinné od 1. 8. 2004Netoxické látky se podávají v jedné dávce 5 g.kg-1, nebo v dávce 1 g.kg-1.den-1 při opakované aplikaci.

      1. účinné od 1. 8. 20041.2.3 Popis postupu

        účinné od 1. 8. 2004Existuje několik postupů. Nejčastěji se používá jednorázová aplikace. Může však být použito jiné schéma.

        účinné od 1. 8. 2004Jeden samec je opakovaně křížen s jednou, nebo dvěmi neovlivněnými, intaktními samičkami ve vhodných intervalech po aplikaci látky. Samičky musí být u samců nejméně po dobu trvání jednoho cyklu říje, nebo pokud se neprokáží spermie ve vagíně, či vaginální zátka.

        účinné od 1. 8. 2004Počet páření po expozici je dán schématem expozice a musí zahrnovat všechna stádia zárodečných buněk sledovaných po expozici.

        účinné od 1. 8. 2004Samice jsou utraceny cervikální dislokací nebo za použití anestetik ve druhé polovině březosti a obsah dělohy je vyšetřen k určení počtu mrtvých a živých implantací. Vaječníky mohou být vyšetřeny k určení počtu žlutých tělísek.

  1. účinné od 1. 8. 20042 ÚDAJE

    účinné od 1. 8. 2004Údaje o počtu samců, počtu březích samic a počtu nezabřezlých samic jsou uváděny v tabulkách. Výsledky každého páření, včetně identifikace každého samce a samice jsou uváděny samostatně. Každá samice musí mít záznam o týdnu páření, o dávce podané samci, o počtu živých a mrtvých implantacích.

    účinné od 1. 8. 2004Zhodnocení celkového dominantního letálního efektu je založeno na srovnání počtu živých implantací na samici v exponované skupině s počtem živých implantací v kontrolní skupině. Poměr mrtvých ku živým implantacím v exponované skupině ke stejnému poměru v kontrolní skupině po analýze vypovídá o postimplantačních ztrátách.

    účinné od 1. 8. 2004V tabulce musí být jasně odlišeny časná a pozdní letalita. Odhadují-li se i preimplantační ztráty, uvedou se. Ty mohou být vypočítány jako rozdíl mezi počtem corpora lutea a počtem implantací, nebo jako snížení průměrného počtu implantací na dělohu ve srovnání s kontrolou.

    účinné od 1. 8. 2004Údaje jsou vyhodnoceny vhodnými statistickými metodami.

  1. účinné od 1. 8. 20043 PROJEKT POKUSU, PROTOKOL POKUSU A ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA

    účinné od 1. 8. 2004V souladu s příslušnými právními předpisy9) musí být zpracován projekt pokusu a o průběhu pokusu je nutno vést protokol.

    1. účinné od 1. 8. 2004Zpráva o průběhu pokusu obsahuje informace o:
      1. účinné od 1. 8. 2004- druhu, kmeni, věku a hmotnosti zvířat, počet zvířat od každého pohlaví v exponovaných a kontrolních skupinách,
      2. účinné od 1. 8. 2004- testované látce, rozpouštědlu, dávkových hladinách a důvodech jejich výběru, negativních a positivních kontrolách, údajích o toxicitě,
      3. účinné od 1. 8. 2004- způsobu podání a schématu expozice,
      4. účinné od 1. 8. 2004- schéma páření,
      5. účinné od 1. 8. 2004- metodách k průkazu páření,
      6. účinné od 1. 8. 2004- doba usmrcení,
      7. účinné od 1. 8. 2004- kriteria pro hodnocení dominantních letálních efektů,
      8. účinné od 1. 8. 2004- vztah dávka/odpověď,
      9. účinné od 1. 8. 2004- statistické hodnocení.

    účinné od 1. 8. 2004Diskuse výsledků.

    účinné od 1. 8. 2004Závěry.

účinné od 1. 8. 2004B.23 ANALÝZA CHROMOZÓMOVÝCH ABERACÍ V SAVČÍCH SPERMATOGONIÍCH

  1. účinné od 1. 8. 20041 METODA je v souladu s právem Evropských společenství.5)
    1. účinné od 1. 8. 20041.1 Úvod

      účinné od 1. 8. 2004Účelem testu je in vivo identifikovat látky způsobující strukturální chromozómové aberace v savčích spermatogoniích.5) Strukturální aberace jsou dvojího druhu: chromozómové a chromatidové. Aberace vyvolané chemickými mutageny jsou většinou chromatidové, ovšem k aberacím chromozómového typu dochází rovněž. Tato metoda není určena k analýze numerických aberací a běžně se k tomuto účelu nepoužívá. Chromozómové mutace a příbuzné jevy jsou u člověka příčinou řady genetických chorob.

      účinné od 1. 8. 2004Tímto testem se analyzují chromozómové aberace v spermatogoniích a proto se předpokládá, že dokáže predikovat indukci dědičných mutací v zárodečných buňkách.

      účinné od 1. 8. 2004K testu se obvykle používají hlodavci. Tímto cytogenetickým testem in vivo se zjišťují chromozómové aberace v mitózách spermatogonií.Tato metoda nepoužívá jiné cílové buňky.

      účinné od 1. 8. 2004Aby se ve spermatogoniích zjistily aberace chromatidového typu, je třeba analyzovat první mitózu po působení testované látky, dříve než se poškození ztratí v následujícím buněčném dělení. Další informace z ovlivněných spermatogonií lze získat analýzou meiotických chromozómů, kde se zjišťují aberace chromozómového typu v diakinéze I, když se ovlivněné buňky mění ve spermatocyty.

      účinné od 1. 8. 2004Tento test in vivo je určen ke zjišťování, zda jsou mutageny aktivní v somatických buňkách také aktivní v buňkách zárodečných. Mimoto má test význam také pro hodnocení rizika mutagenity tím, že umožňuje posuzovat faktory metabolismu in vivo, farmakokinetiky a reparačních procesů DNA.

      účinné od 1. 8. 2004V testech je přítomna řada generací spermatogonií se širokým spektrem citlivosti vůči chemickým látkám. Zjištěné aberace tedy představují souhrn reakcí ovlivněných populací spermatogonií, kde převládají diferencované spermatogonie. Podle jejich polohy ve varleti pak různé generace spermatogonií mohou, ale nemusejí být exponovány krevním oběhem kvůli anatomické a fyziologické bariéře Sertoliho buněk a hemato-testikulární bariéře.

      účinné od 1. 8. 2004Existují-li doklady toho, že se testovaná látka nebo její reaktivní metabolit do cílové tkáně nedostane, není tato látka pro test vhodná.

    1. účinné od 1. 8. 20041.2 Definice

      účinné od 1. 8. 2004Aberace chromatidového typu: strukturální poškození chromozómu, které se projevuje jako zlom jedné, případně obou chromatid, nebo zlom a opětovné spojení mezi chromatidami.

      účinné od 1. 8. 2004Aberace chromozómového typu: strukturální poškození chromozómu vyjádřená jako zlom respektive jako zlom a opětovné spojení obou chromatid na stejném místě (zahrnuty jsou aberace typu dicentrický chromozóm, prsténčitý chromozóm-ring)

      účinné od 1. 8. 2004Zlom chromatidy: . jako zlom lze hodnotit porušení kontinuity jedné nebo obou chromatid za předpokladu, že vzniklá mezera ve struktuře chromatidy je větší než je šířka poškozené chromatidy. Dále pak v případech, koncový (distální) fragment v místě zlomu je dislokovaný (nebo mimo osu chromatidy), případně jedna chromatida hodnoceného chromozómu je kratší v důsledku delece.

      účinné od 1. 8. 2004Gap: achromatická léze menší než šířka jedné chromatidy a s minimálním vybočením chromatid.

      účinné od 1. 8. 2004Numerická aberace: změna počtu chromozómů oproti normálnímu počtu charakteristickému pro použité buňky.

      účinné od 1. 8. 2004Polyploidie: násobek haploidního počtu chromozómů (n) jiný než diploidní počet (tedy 3n, 4n atd.).