Platné znění

Vyhláška, kterou se stanoví základní metody pro zkoušení toxicity chemických látek a chemických přípravků

účinné od 1. 8. 2004Toxikokinetické studie se provádějí na jednom či více vhodných živočišných druzích, užívaných nebo uvažovaných pro užití v jiných toxikologických studiích zabývajících se testovanou látkou. Jestliže jsou pro testování používáni hlodavci, neměla by být variabilita hmotnosti vyšší než ± 20 % průměrné hodnoty.

  1. účinné od 1. 8. 20041.3.1.2 Počet a pohlaví

    účinné od 1. 8. 2004Při studiu absorpce a vylučování se užije nejprve 4 zvířat pro každou jednotlivou dávku. Pro testování není dávána přednost určitému pohlaví, ale za určitých podmínek může vzniknout potřeba provádět studie na obou pohlavích. Jestliže jsou nalezeny rozdílné odpovědi u různých pohlaví, potom je třeba testovat 4 zvířata každého pohlaví. V případě ostatních druhů zvířat (jiných než hlodavců) je možné použít menší počet zvířat.

    účinné od 1. 8. 2004Je-li studována tkáňová distribuce, pak je při určení počáteční velikosti skupiny zvířat třeba brát v úvahu jak počet zvířat, která budou utracena v každém časovém bodu, tak počet časových bodů, v nichž bude testování prováděno.

    účinné od 1. 8. 2004Je-li studován metabolismus, pak je velikost skupiny zvířat úměrná potřebám studie.

    účinné od 1. 8. 2004Zahrnuje-li studie větší počet dávek a sledovaných časových intervalů, pak je potřeba, aby bylo ve skupině tolik zvířat, aby v každém časovém intervalu při plánovaném utrácení zvířat byla ve skupině minimálně 2 zvířata. Velikost skupiny musí být dostatečná, aby pro látku respektive její metabolity její metabolity poskytla přijatelné charakteristiky ve fázi retence, rovnovážného stavu a deplece.

  1. účinné od 1. 8. 20041.3.1.3 Dávky

    účinné od 1. 8. 2004V případě jednorázového podání se použijí nejméně 2 různé dávky testované látky, a to nízká dávka, po která nemá žádné toxické účinky a vysoká dávka, po které mohou být nalezeny změny v toxikokinetických parametrech nebo která vyvolává toxické účinky.

    účinné od 1. 8. 2004V případě opakovaného podávání je většinou dostatečné podání nízkých dávek látky. Za určitých podmínek může být nezbytné i podávání vysoké dávky.

  1. účinné od 1. 8. 20041.3.1.4 Způsob aplikace

    účinné od 1. 8. 2004Toxikokinetické studie se provádí stejným způsobem aplikace a je-li to vhodné i se stejným vehikulem tak, jak jsou používány v ostatních toxikologických studiích. Testovaná látka je buď podávána orálně sondou nebo v potravě, nebo se aplikuje na kůži, nebo inhalačně vždy po určenou dobu skupině experimentálních zvířat. Intravenosní podání testované látky může být užitečné pro stanovení relativního vstřebávání při jiných způsobech aplikace. Navíc, krátce po intravenosní aplikaci látky mohou být získány důležité informace o distribuci látky v organismu.

    účinné od 1. 8. 2004Vždy je nutno pamatovat na možnou interferenci vehikula s testovanou látkou. Pozornost je potřeba věnovat i rozdílům ve vstřebávání v případě, je-li testovaná látka podána sondou nebo v potravě, a přesnému stanovení dávky, zvláště je-li testovaná látka podávána v potravě.

  1. účinné od 1. 8. 20041.3.1.5 Doba sledování

    účinné od 1. 8. 2004Všechna zvířata se sledují denně a zaznamenávají se příznaky toxicity i další významné klinické údaje spolu s údaji o jejich počátku, velikosti a trvání.

  1. účinné od 1. 8. 20041.3.1.6 Popis postupu

    účinné od 1. 8. 2004Po zvážení pokusných zvířat je testovaná látka podána způsobem přiměřeným účelu. Ve zdůvodněných případech je možno nechat zvířata před podáním testované látky vyhladovět.

  1. účinné od 1. 8. 20041.3.1.7 Absorpce
    1. účinné od 1. 8. 2004Ke sledování rychlosti a rozsahu absorpce podávané látky mohou být použity různé metody s nebo bez referenční skupiny (referenční skupinou se rozumí ta skupina, ve které je testovaná látka podávána takovým způsobem, který zajišťuje úplnou biologickou dostupnost látky), a to např.:
      1. účinné od 1. 8. 2004- stanovení množství testované látky a ev. jejích metabolitů v exkretech např. v moči, žluči, stolici, vydechovaném vzduchu a také jejích zbytků v karkasu,
      2. účinné od 1. 8. 2004- porovnání biologické odpovědi (např. studie akutní toxicity) mezi testovanou a kontrolní a případně referenční skupinou,
      3. účinné od 1. 8. 2004- porovnání množství látky resp. jejích metabolitů vylučovaných ledvinami mezi testovanou a kontrolní a případně referenční skupinou,
      4. účinné od 1. 8. 2004- stanovení plochy pod křivkou závislosti koncentrací testované látky a ev. jejích metabolitů v plazmě na čase a porovnání s daty získanými v referenční skupině.
  1. účinné od 1. 8. 20041.3.2 Distribuce
    1. účinné od 1. 8. 2004V současné době jsou dostupné 2 přístupy, z nichž pro analýzu distribučního schématu mohou být použity jeden či oba:
      1. účinné od 1. 8. 2004- při použití celotělové autoradiografie lze získat užitečné kvalitativní informace;
      2. účinné od 1. 8. 2004- kvantitativní informace poskytuje stanovení koncentrací a množství testované látky a jejích případných metabolitů v tkáních a orgánech, získaných ze zvířat v různých časových intervalech po zahájení expozice.
  1. účinné od 1. 8. 20041.3.3 Vylučování

    účinné od 1. 8. 2004Při studiu vylučování se sbírá moč, stolice, vydechovaný vzduch a v určitých případech žluč. Množství testované látky a jejích případných metabolitů se v těchto exkretech stanovuje několikrát po podání látky, a to buď do vyloučení 95 % z podaného množství nebo nejvýše 7 dnů od počátku vylučování.

    účinné od 1. 8. 2004Ve specielních případech se sleduje vylučování testované látky v mléce v době laktace testovaných zvířat.

  1. účinné od 1. 8. 20041.3.4 Metabolismus

    účinné od 1. 8. 2004K určení rozsahu a schématu metabolismu látky se biologické vzorky analyzují vhodnými technikami. Měla by být objasněna struktura metabolitů a navrženo odpovídající metabolické schéma tam, kde je třeba odpovědět na otázky z předcházejících toxikologických studií. Pro získání informací o metabolismu může být prospěšné provedení in vitro studií.

    účinné od 1. 8. 2004Další informace o vztahu mezi metabolismem a toxicitou látky lze získat z biochemických studií např. studiem účinků látky na enzymy metabolického systému, sledováním poklesu endogenních neproteinových sloučenin obsahujících - SH skupiny a nebo vazby látky na makromolekuly.

  1. účinné od 1. 8. 20042 ÚDAJE

    účinné od 1. 8. 2004Získané údaje se podle typu prováděné studie sumarizují v tabulkách, pokud možno doplněných grafickým znázorněním.

    účinné od 1. 8. 2004Pro každou testovanou skupinu se uvedou průměry a charakteristiky variability ve vztahu k času, dávce, tkáni a orgánům (pokud je to důležité). Míra vstřebání i množství a rychlost vylučování se stanoví vhodnými metodami. V případě metabolických studií by měla být identifikována struktura metabolitů a navrženy metabolické cesty studované látky.

  1. účinné od 1. 8. 20043 PROJEKT POKUSU, PROTOKOL POKUSU A ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA

    účinné od 1. 8. 2004V souladu s příslušnými právními předpisy9) musí být zpracován projekt pokusu a o průběhu pokusu je nutno vést protokol.

    1. účinné od 1. 8. 2004Podle typu prováděné studie obsahuje zpráva o testu následující údaje:
      1. účinné od 1. 8. 2004- živočišný druh, kmen, zdroj, životní podmínky, výživa,
      2. účinné od 1. 8. 2004- charakteristika značeného materiálu, jestliže byl použit,
      3. účinné od 1. 8. 2004- velikost dávky a intervaly podání,
      4. účinné od 1. 8. 2004- způsob(y) podání a všechna použitá vehikula,
      5. účinné od 1. 8. 2004- toxické a i ostatní pozorované účinky,
      6. účinné od 1. 8. 2004- metody stanovení testované látky a ev. jejích metabolitů v biologickém materiálu včetně vydechovaného vzduchu,
      7. účinné od 1. 8. 2004- tabulky výsledků rozdělené podle pohlaví, dávky, režimu, času, tkání a orgánů,
      8. účinné od 1. 8. 2004- uvedení rozsahu vstřebávání a vylučování v závislosti na čase,
      9. účinné od 1. 8. 2004- metody užité pro charakterizaci a identifikaci metabolitů v biologickém materiálu,
      10. účinné od 1. 8. 2004- metody užité pro biochemická stanovení týkající se metabolismu,
      11. účinné od 1. 8. 2004- navrhované schéma pro metabolismus.

    účinné od 1. 8. 2004Diskuse výsledků.

    účinné od 1. 8. 2004Závěry.

účinné od 1. 8. 2004B.37 POZDNÍ NEUROTOXITA ORGANICKÝCH SLOUČENIN FOSFORU - AKUTNÍ EXPOZICE

  1. účinné od 1. 8. 20041 METODA je v souladu s právem Evropských společenství.4)
    1. účinné od 1. 8. 20041.1 Úvod

      účinné od 1. 8. 2004Při stanovení a vyhodnocení toxických účinků látek je důležité vzít v úvahu schopnost určité skupiny látek vyvolat specifický typ neurotoxicity, který nemůže být zjištěn v jiných studiích toxicity. U určitých organických sloučenin fosforu byly pozorovány zpožděné projevy neurotoxicity a mají být testovány touto metodou.

      účinné od 1. 8. 2004Vyšetřovací testy in vitro mohou být použity pro vyhledávání látek, které mohou vyvolat pozdní polyneuropatii. Negativní nález z in vitro studií však není možno považovat za důkaz, že látka nemá schopnost vyvolat pozdní neurotoxicitu.

    1. účinné od 1. 8. 20041.2 Definice

      účinné od 1. 8. 2004Do skupiny látek označených v názvu této metody jako „organické sloučeniny fosforu“ patří elektricky neutrální organické estery, thioestery nebo anhydridy kyseliny fosforečné, fosfonové nebo amidofosforečné nebo příslušných kyselin thiofosforečných, thiofosfonových nebo amidothiofosforečných, nebo jiné látky, které mohou způsobit pozdní neurotoxicitu, pozorovanou u některých látek této skupiny.

      účinné od 1. 8. 2004Pozdní neurotoxicita je syndrom projevující se ataxií, distální axonopatií, změnami v míše a periferním nervu s pozdním počátkem těchto příznaků, a dále inhibicí a stárnutím specifické esterázy - NTE (neuropathy target esterase) v nervové tkáni.

    1. účinné od 1. 8. 20041.3 Referenční látky

      účinné od 1. 8. 2004Referenční látka může být testována na pozitivní kontrolní skupině k průkazu, že v laboratorních podmínkách se reakce testovaných druhů podstatně nezměnila.

      účinné od 1. 8. 2004Příkladem široce používané referenční látky s pozdním neurotoxickým účinkem je tri-o-tolylfosfát (CAS 78-30-8, EINECS 201-103-5, chemický název:

      účinné od 1. 8. 2004tris(2-metylfenyl) ester kyseliny fosforečné, syn: tri-o-kresylfosfát (TOCP).

    1. účinné od 1. 8. 20041.4 Princip testovací metody

      účinné od 1. 8. 2004Testovaná látka se podává orálně v jediné dávce slepicím, chráněným před možnými akutními cholinergními účinky. Zvířata se pozorují po dobu 21 dnů, zaznamenává se jejich abnormální chování, ataxie a parézy. Biochemické vyšetření, zvláště inhibice NTE, se provádí u slepic náhodně vybraných z každé skupiny, obvykle 24 a 48 hodin po podání látky. 21 dnů po podání látky jsou zbývající slepice utraceny a je provedeno histopatologické vyšetření vybraných nervových tkání.

    1. účinné od 1. 8. 20041.5 Popis metody testování
      1. účinné od 1. 8. 20041.5.1 Příprava

        účinné od 1. 8. 2004Mladé zdravé dospělé slepice bez interferujících virových onemocnění a farmakologické léčby a s normální chůzí se náhodně přiřadí do experimentální a kontrolní skupiny. Pokusná zvířata jsou vybrána s ohledem na druh, pohlaví, a stáří v souladu s ustanovením § 15 zvláštního právního předpisu10) a označena tak, aby byla možná identifikace jednotlivých zvířat. Dobu navykání stanoví § 10 zvláštního právního předpisu.10) Používají se dostatečně velké klece nebo ohrady umožňující volný pohyb slepic a snadné pozorování chůze.

        účinné od 1. 8. 2004Testovaná látka se podává orálně sondou, želatinovými tobolkami nebo jinou srovnatelnou metodou. Tekutiny se podávají neředěné nebo rozpuštěné ve vhodném vehikulu, jako je například kukuřičný olej. Pevné látky je vhodné rozpustit, neboť velké dávky pevných látek v želatinových tobolkách by se nemusely dostatečně vstřebat. U nevodných nosičů musí být známy nebo určeny před testem jejich toxikologické vlastnosti.

      1. účinné od 1. 8. 20041.5.2 Experimentální podmínky
        1. účinné od 1. 8. 20041.5.2.1 Pokusná zvířata

          účinné od 1. 8. 2004Doporučují se mladé nosnice kura domácího (Gallus gallus domesticus) ve věku 8 až 12 měsíců. Používají se plemena o standardní velikosti a chovají se za podmínek, které dovolují volný pohyb.

        1. účinné od 1. 8. 20041.5.2.2 Počet a pohlaví

          účinné od 1. 8. 2004Kromě testovací skupiny se použije jak kontrolní skupina s vehikulem, tak pozitivní kontrolní skupina. S výjimkou aplikace testované látky se se zvířaty v kontrolní skupině zachází stejně jako s pokusnými.

          účinné od 1. 8. 2004V každé skupině má být dostatečný počet slepic, aby alespoň 6 z nich mohlo být utraceno pro biochemické vyšetření (3 první a 3 druhý den po podání) a aby 6 z nich přežilo pozorování trvající 21 dnů.

          účinné od 1. 8. 2004Pozitivní kontrolní skupina se může testovat souběžně nebo se může použít kontrolní skupina z nedávné historie. Má mít alespoň 6 slepic, kterým se podává látka vyvolávající pozdní neurotoxicitu, 3 slepice jsou určeny pro biochemii a 3 slepice pro histologii. Doporučuje se periodicky doplňovat historické údaje, když se v provádějící laboratoři změní některý ze základních prvků testu (např. plemeno, potrava, podmínky chovu).

        1. účinné od 1. 8. 20041.5.2.3 Volba dávek

          účinné od 1. 8. 2004Má být provedena předběžná studie s využitím příslušného počtu slepic a skupin v různých úrovních dávek, aby se dala stanovit úroveň, která bude použita v hlavní studii. Určitá úmrtnost je v této předběžné studii nezbytná pro stanovení přiměřené dávky v hlavní studii. Aby se zabránilo úmrtí pro akutní cholinergní účinky, používá se atropin nebo jiný ochranný přípravek, o kterém je známo, že neinterferuje s pozdními neurotoxickými účinky. K odhadu maximální neletální dávky testovaných látek může být použito různých typů testovacích metod (viz metoda B.1 bis). Historické údaje pro slepice nebo jiné toxikologické informace mohou být také nápomocné při výběru dávky.

          účinné od 1. 8. 2004Úroveň dávky testované látky v hlavní studii by měla být co nejvyšší s přihlédnutím k výsledkům předběžné studie výběru dávky a hornímu limitu dávky 2000 mg.kg-1 tělesné hmotnosti. Případné úhyny by neměly ovlivnit přežití dostatečného počtu zvířat, to je šesti pro biochemii a po 21 dnech šesti pro histologii. Atropin nebo jiný ochranný přípravek, o kterém je známo, že neinterferuje s pozdními neurotoxickými účinky, se má použit jako ochrana před akutními cholinergními účinky.

          účinné od 1. 8. 2004Jestliže test s dávkou nejméně 2000 mg.kg-1 tělesné hmotnosti, za použití postupů popsaných pro tuto studii, nevyvolá žádné pozorované toxické účinky a jestliže podle údajů u látek s příbuznou strukturou není důvod toxicitu očekávat, pak není třeba uvažovat o studii s podáním vyšší dávky. Limitní test se neprovádí, pokud expozice, vyskytující se u lidí, naznačuje potřebu použití ještě vyšší úrovně dávky.

          účinné od 1. 8. 2004Doba pozorování je 21 dnů.

      1. účinné od 1. 8. 20041.5.3 Popis postupu

        účinné od 1. 8. 2004Po aplikaci prostředku, ochraňujícího před úmrtím na následky akutního cholinergního účinku, je testovaná látka podána v jediné dávce.

        1. účinné od 1. 8. 20041.5.3.1 Všeobecné pozorování

          účinné od 1. 8. 2004Pozorování má začít okamžitě po podání látky. Všechny slepice se pečlivě pozorují několikrát v průběhu prvních 2 dnů a pak aspoň jednou denně po dobu 21 dní nebo dokud nebudou utraceny podle plánu. Veškeré příznaky toxicity se zaznamenávají, včetně nástupu, typu, stupně a trvání abnormálního chování. Ataxie se hodnotí podle nejméně čtyřstupňové stupnice a zaznamenává se paréza. Nejméně dvakrát týdně se slepice vykazující patologické změny vyjmou z klecí a vystaví nucené motorické aktivitě jako např. vystupování po žebříku, aby se usnadnilo posouzení minimálních toxických účinků. Umírající zvířata a zvířata se závažnými a přetrvávajícími příznaky utrpení a bolesti je třeba vyřadit, humánním způsobem utratit a pitvat.

        1. účinné od 1. 8. 20041.5.3.2 Tělesná hmotnost

          účinné od 1. 8. 2004Všechny slepice se zváží těsně před podáním testované látky a pak aspoň jednou týdně.

        1. účinné od 1. 8. 20041.5.3.3 Biochemie

          účinné od 1. 8. 20046 slepic náhodně vybraných z každé testované a kontrolní skupiny s vehikulem a 3 slepice z pozitivní kontrolní skupiny (je-li skupina použita) se usmrtí v prvních dnech po aplikaci látky. Pro analýzu inhibice NTE se vyjmou mozek a lumbální mícha. Je vhodné vypreparovat také nervus ischiadicus a analyzovat jeho tkáň na inhibici NTE. Běžně se usmrcují 3 slepice z kontrolní a každé testované skupiny po 24 hodinách a další tři po 48 hodinách, 3 slepice z pozitivní kontrolní skupiny se usmrcují pouze po 24 hodinách. Jestliže pozorování klinických příznaků naznačuje, že toxická látka se v organismu pohybuje velmi pomalu (hodnotí se nástup cholinergních příznaků), pak je výhodnější odebrat vzorky tkáně dvakrát ze 3 zvířat, a to mezi 24 až 72 hodinami po podání látky.

          účinné od 1. 8. 2004U těchto vzorků tkáně se případně provede také analýza acetylcholinesterázy (AChE). In vivo může však nastat spontánní reaktivace AChE, což může vést k podcenění látky jako inhibitoru AChE.

        1. účinné od 1. 8. 20041.5.3.4 Pitva

          účinné od 1. 8. 2004Pitva všech zvířat (plánovaně usmrcených i utracených pro špatný celkový stav) zahrnuje makroskopické posouzení stavu mozku a míchy.

        1. účinné od 1. 8. 20041.5.3.5 Histopatologické vyšetření

          účinné od 1. 8. 2004Nervová tkáň z přeživších zvířat (nepoužitých pro biochemické studie) se histologicky vyšetří. Tkáně se fixují in situ za použití perfuzních technik. Odebírá se: mozeček (střední podélný řez), prodloužená mícha, mícha - řezy míchy se provádějí v horní krční části, střední hrudní a lumbosakrální, z periferních nervů se odebírá distální část z n. tibialis (a jeho větve k m.gastrocnemius) a z n. ischiadicus. Řezy se barví specifickými barvivy na myelin a axony.

  1. účinné od 1. 8. 20042 SBĚR A ZÁZNAM ÚDAJŮ

    účinné od 1. 8. 2004Negativní výsledky o účincích sledovaných touto metodou (biochemie, histopatologie a změny chování) běžně nevyžadují další testování na pozdní neurotoxicitu. Neprůkazné nebo neurčité výsledky mohou vyžadovat další sledování.

    účinné od 1. 8. 2004Uvádějí se údaje pro jednotlivá zvířata. Údaje se dále sestaví do tabulky. Z ní musí být pro každou experimentální skupinu patrný počet zvířat na počátku pokusu a počet zvířat jevících poškození, změny chování nebo biochemické účinky, typy a stupeň těchto poškození nebo účinků a procento zvířat vykazujících každý typ a stupeň poškození nebo účinku.

    účinné od 1. 8. 2004Výsledky studie se vyhodnotí z hlediska výskytu, závažnosti a korelace mezi změnami chování, biochemickými a histopatologickými nálezy a dalšími pozorovanými jevy u testovaných a kontrolních skupin.

    účinné od 1. 8. 2004Číselné výsledky je třeba vyhodnotit vhodnou a obecně uznávanou statistickou metodou. Statistické metody se zvolí již v době plánování studie.

  1. účinné od 1. 8. 20043 PROJEKT POKUSU, PROTOKOL POKUSU A ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA

    účinné od 1. 8. 2004V souladu s příslušnými právními předpisy9) musí být zpracován projekt pokusu a o průběhu pokusu je nutno vést protokol.

    1. účinné od 1. 8. 2004Testovaná zvířata:
      1. účinné od 1. 8. 2004- použité plemeno;
      2. účinné od 1. 8. 2004- počet a stáří zvířat;
      3. účinné od 1. 8. 2004- zdroj, podmínky ustájení atd.;
      4. účinné od 1. 8. 2004- hmotnosti jednotlivých zvířat na začátku studie.
    1. účinné od 1. 8. 2004Podmínky testování:
      1. účinné od 1. 8. 2004- podrobné údaje o přípravě, stabilitě a homogenitě testované látky;
      2. účinné od 1. 8. 2004- zdůvodnění výběru vehikula;
      3. účinné od 1. 8. 2004- podrobné údaje o způsobu aplikace testované látky;
      4. účinné od 1. 8. 2004- podrobné údaje o potravě a kvalitě vody;
      5. účinné od 1. 8. 2004- zdůvodnění vybrané úrovně dávek;
      6. účinné od 1. 8. 2004- specifikace podávaných dávek, včetně podrobných údajů o vehikulu, objemu a fyzikální formě aplikované látky;
      7. účinné od 1. 8. 2004- podrobné údaje o podání ochranného přípravku.
    1. účinné od 1. 8. 2004Výsledky:
      1. účinné od 1. 8. 2004- údaje o tělesné hmotnosti;
      2. účinné od 1. 8. 2004- údaje o toxických odpovědích podle dávkových skupin, včetně úmrtnosti;
      3. účinné od 1. 8. 2004- charakter, stupeň a trvání klinických příznaků (ať vratných nebo nevratných);
      4. účinné od 1. 8. 2004- podrobný popis biochemických vyšetření a jejich výsledky;
      5. účinné od 1. 8. 2004- pitevní nálezy;
      6. účinné od 1. 8. 2004- podrobný popis všech histopatologických nálezů;
      7. účinné od 1. 8. 2004- statistické vyhodnocení výsledků, u kterých je to možné.

    účinné od 1. 8. 2004Diskuse.

    účinné od 1. 8. 2004Závěry.

účinné od 1. 8. 2004B.38 POZDNÍ NEUROTOXITA ORGANICKÝCH SLOUČENIN FOSFORU 28-DENNÍ OPAKOVANÁ EXPOZICE

  1. účinné od 1. 8. 20041 METODA je v souladu s právem Evropských společenství.4)
    1. účinné od 1. 8. 20041.1 Úvod

      účinné od 1. 8. 2004Při stanovení a vyhodnocení toxických účinků látek je důležité vzít v úvahu schopnost určité skupiny látek vyvolat specifický typ neurotoxicity, který nemůže být zjištěn v jiných studiích toxicity. U určitých organických sloučenin fosforu byly pozorovány zpožděné projevy neurotoxicity a mají být testovány touto metodou.

      účinné od 1. 8. 2004Vyšetřovací testy in vitro mohou být použity pro vyhledávání látek, které mohou vyvolat pozdní polyneuropatii. Negativní nález z in vitro studií však není možno považovat za důkaz, že látka nemá schopnost vyvolat pozdní neurotoxicitu.

      účinné od 1. 8. 2004Tento 28-denní test pozdní neurotoxicity poskytuje informace o možném zdravotním riziku vznikajícím z expozic opakovaných během určitého krátkého časového období. Poskytne informace o závislosti odpovědi na dávce a může poskytnout odhad rozpětí dávkových úrovní, ve kterém nejsou pozorovány žádné nepříznivé účinky. Tato úroveň se používá pro stanovení kritérií bezpečné expozice.

    1. účinné od 1. 8. 20041.2 Definice

      účinné od 1. 8. 2004Do skupiny látek označených v názvu této metody jako „organické sloučeniny fosforu“ patří elektricky neutrální organické estery, thioestery nebo anhydridy kyseliny fosforečné, fosfonové nebo amidofosforečné nebo příslušných kyselin thiofosforečných, thiofosfonových nebo amidothiofosforečných, nebo jiné látky, které mohou způsobit pozdní neurotoxicitu, pozorovanou u některých látek této skupiny.

      účinné od 1. 8. 2004Pozdní neurotoxicita je syndrom projevující se ataxií, distální axonopatií, změnami v míše a periferním nervu s pozdním počátkem těchto příznaků a dále inhibicí a stárnutím specifické esterázy - NTE (neuropathy target esterase) v nervové tkáni.

    1. účinné od 1. 8. 20041.3 Princip testovací metody

      účinné od 1. 8. 2004Testovaná látka se podává denně orálně slepicím po dobu 28 dnů. Zvířata jsou sledována nejméně jednou denně, zaznamenává se abnormální chování, ataxie a paréza ještě 14 dnů po poslední dávce. Biochemické vyšetření, zvláště inhibice NTE, se provádí u slepic náhodně vybraných z každé skupiny 24 a 48 hodin po posledním podání látky. 2 týdny po poslední dávce jsou zbývající slepice utraceny a je provedeno histopatologické vyšetření vybraných nervových tkání.

    1. účinné od 1. 8. 20041.4 Popis testovací metody
      1. účinné od 1. 8. 20041.4.1 Příprava

        účinné od 1. 8. 2004Pokusná zvířata jsou vybrána s ohledem na druh, pohlaví, a stáří v souladu s ustanovením § 15 zvláštního právního předpisu10) a označena tak, aby byla možná identifikace jednotlivých zvířat. Dobu navykání stanoví § 10 zvláštního právního předpisu.10)

        účinné od 1. 8. 2004Mladé zdravé dospělé slepice bez interferujících virových onemocnění a farmakologické léčby a s normální chůzí se náhodně přiřadí do experimentální a kontrolní skupiny. Nejméně 5 dní před zahájením studie jsou zvířata chována v podmínkách chovu a krmení, v jakých budou během experimentu.

        účinné od 1. 8. 2004Používají se dostatečně velké klece nebo ohrady umožňující volný pohyb slepic a snadné pozorování chůze.

        účinné od 1. 8. 2004Testovaná látka se podává orálně, denně 7 dní v týdnu, buď sondou, želatinovými tobolkami nebo jinou srovnatelnou metodou. Tekutiny se podávají neředěné nebo rozpuštěné ve vhodném vehikulu jako je například kukuřičný olej. Pevné látky je vhodné rozpustit, neboť velké dávky pevných látek v želatinových tobolkách by se nemusely dostatečně vstřebat. U nevodných nosičů musí být známy nebo určeny před testem jejich toxikologické vlastnosti.

      1. účinné od 1. 8. 20041.4.2 Experimentální podmínky
        1. účinné od 1. 8. 20041.4.2.1 Pokusná zvířata

          účinné od 1. 8. 2004Doporučují se mladé nosnice kura domácího (Gallus gallus domesticus) ve věku 8 až 12 měsíců. Používají se plemena o standardní velikosti a chovají se za podmínek, které dovolují volný pohyb.

        1. účinné od 1. 8. 20041.4.2.2 Počet a pohlaví

          účinné od 1. 8. 2004Je třeba použít nejméně 3 úrovně dávek a 1 kontrolní skupinu s vehikulem. S výjimkou aplikace testované látky se se zvířaty v kontrolní skupině zachází stejně jako s pokusnými.

          účinné od 1. 8. 2004V každé skupině má být dostatečný počet slepic, aby alespoň 6 z nich mohlo být utraceno pro biochemické vyšetření (3 v každém ze 2 časových bodů) a aby 6 z nich přežilo čtrnáctidenní pozorování po ukončení expozice.

        1. účinné od 1. 8. 20041.4.2.3 Volba dávek

          účinné od 1. 8. 2004Dávkové úrovně se zvolí s přihlédnutím ke 3 výsledkům z akutního testu na pozdní neurotoxicitu a k dalším údajům o toxicitě nebo kinetice testované látky. Nejvyšší úroveň dávky má vyvolat toxické účinky, nejlépe příznaky pozdní neurotoxicity, nezpůsobit žádné uhynutí ani zřejmé utrpení. Dále se zvolí řada klesajících dávek způsobem, který umožní sledovat závislost účinku na dávce. Nejnižší dávka by neměla vyvolat žádné příznaky toxicity.

        1. účinné od 1. 8. 20041.4.2.4 Limitní test

          účinné od 1. 8. 2004Jestliže test s dávkou nejméně 1000 mg.kg-1 tělesné hmotnosti a den, za použití postupů popsaných pro tuto studii, nevyvolá žádné pozorované toxické účinky a jestliže podle údajů u látek s příbuznou strukturou není důvod toxicitu očekávat, pak není třeba uvažovat o studii s podáním vyšší dávky. Limitní test se neprovádí, pokud expozice vyskytující se u lidí naznačuje potřebu použití ještě vyšší úrovně dávky.

        1. účinné od 1. 8. 20041.4.2.5 Doba pozorování

          účinné od 1. 8. 2004Všechna zvířata se pozorují nejméně jednou denně po dobu expozice a 14 dnů po ní, nebo do utracení a do pitvy podle plánu.

      1. účinné od 1. 8. 20041.4.3 Popis postupu

        účinné od 1. 8. 2004Testovaná látka se podává 7 dnů v týdnu po 28 dnů.

        1. účinné od 1. 8. 20041.4.3.1 Všeobecné pozorování

          účinné od 1. 8. 2004Pozorování má začít okamžitě po podání látky. Všechny slepice se pečlivě pozorují nejméně jednou denně po 28 dnů a dalších 14 dnů po ukončení aplikace, do utracení podle plánu. Veškeré příznaky toxicity se zaznamenávají, včetně nástupu, typu, stupně a trvání. Pozorování má zahrnovat abnormality chování, ale nemá se na ně omezovat. Ataxie se hodnotí podle nejméně čtyřstupňové pořadové stupnice, zaznamenává se paréza. Nejméně dvakrát týdně se slepice vyjmou z klecí a vystaví nucené motorické aktivitě, jako např. vystupování po žebříku, aby se usnadnilo posouzení minimálních toxických účinků. Umírající zvířata se závažnými a přetrvávajícími příznaky stresu a bolesti je třeba vyloučit, humánním způsobem utratit a pitvat.

        1. účinné od 1. 8. 20041.4.3.2 Tělesná hmotnost

          účinné od 1. 8. 2004Všechny slepice se zváží těsně před prvním podáním testované látky a pak alespoň jednou týdně.

        1. účinné od 1. 8. 20041.4.3.3 Biochemie

          účinné od 1. 8. 2004Šest slepic náhodně vybraných z každé testované a kontrolní skupiny s vehikulem se usmrtí v prvních dnech po aplikaci poslední dávky. Pro analýzu inhibice NTE se vyjmou mozek a lumbální mícha. Je vhodné vypreparovat také nervus ischiadicus a analyzovat jeho tkáň na inhibici NTE. Obvykle se usmrcují tři slepice z kontrolní a každé testované skupiny po 24 hodinách a další tři po 48 hodinách po posledním podání dávky. Jestliže údaje z akutní studie nebo jiných studií (např. toxikokinetických) naznačují, že je výhodnější jiná doba usmrcení po poslední aplikaci, pak se doporučuje použít tuto dobu a zdůvodnění uvést v dokumentaci.

          účinné od 1. 8. 2004U těchto vzorků tkáně se případně provede také analýza acetylcholinesterázy (AChE). In vivo může však nastat spontánní reaktivace AChE, což může vést k podcenění látky jako inhibitoru AChE.

        1. účinné od 1. 8. 20041.4.3.4 Pitva

          účinné od 1. 8. 2004Pitva všech zvířat (plánovaně usmrcených i utracených pro špatný celková stav) zahrnuje makroskopické posouzení stavu mozku a míchy.

        1. účinné od 1. 8. 20041.4.3.5 Histopatologické vyšetření

          účinné od 1. 8. 2004Nervová tkáň z přeživších zvířat (nepoužitých pro biochemické studie) se histologicky vyšetří. Tkáně se fixují in situ za použití perfuzních technik. Odebírá se: mozeček (střední podélný řez), prodloužená mícha, mícha (řezy míchy se provádí v horní krční části, střední hrudní a lumbosakrální), z periferních nervů se odebírá distální část z nervus tibialis (a jeho větve k nervus gastrocnemius) a z nervus ischiadicus. Řezy se barví specifickými barvivy na myelin a axony.

          účinné od 1. 8. 2004Nejprve se vyšetří fixované tkáně všech zvířat kontrolní skupiny a skupiny s nejvyšší dávkou. Pokud se najdou u zvířat skupiny s nejvyšší dávkou známky účinku, provede se histologické vyšetření i na slepicích ze skupin, které dostaly dávku střední a nízkou.

  1. účinné od 1. 8. 20042 SBĚR A ZÁZNAM ÚDAJŮ

    účinné od 1. 8. 2004Pokud jsou výsledky získané touto metodou (biochemie, histopatologie a změny chování) negativní, běžně se neprovádí další testování na pozdní neurotoxicitu. Neprůkazné nebo neurčité výsledky mohou vyžadovat další sledování.

    účinné od 1. 8. 2004Uvádějí se údaje pro jednotlivá zvířata. Údaje se dále sestaví do tabulky. Z ní musí být pro každou experimentální skupinu patrný počet zvířat na počátku pokusu a počet zvířat jevících poškození, změny chování nebo biochemické účinky, typy a stupeň těchto poškození nebo účinků a procento zvířat vykazujících každý typ a stupeň poškození nebo účinku.

    účinné od 1. 8. 2004Výsledky studie se vyhodnotí z hlediska výskytu, závažnosti a korelaci mezi změnami chování, biochemickými a histopatologickými nálezy a dalšími pozorovanými jevy u testovaných a kontrolních skupin.

    účinné od 1. 8. 2004Číselné výsledky je třeba vyhodnotit vhodnou a obecně uznávanou statistickou metodou. Statistické metody se zvolí již v době plánování studie.

  1. účinné od 1. 8. 20043 PROJEKT POKUSU, PROTOKOL POKUSU A ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA

    účinné od 1. 8. 2004V souladu s příslušnými právními předpisy9) musí být zpracován projekt pokusu a o průběhu pokusu je nutno vést protokol.

    1. účinné od 1. 8. 2004Zpráva o pokusu obsahuje tyto informace, pokud mohly být získány:
      1. účinné od 1. 8. 2004Testovaná zvířata:
        1. účinné od 1. 8. 2004- použité plemeno,
        2. účinné od 1. 8. 2004- počet a stáří zvířat,
        3. účinné od 1. 8. 2004- zdroj, podmínky ustájení atd.,
        4. účinné od 1. 8. 2004- hmotnosti jednotlivých zvířat na začátku studie.
      1. účinné od 1. 8. 2004Podmínky testování:
        1. účinné od 1. 8. 2004- podrobné údaje o přípravě, stabilitě a homogenitě testované látky,
        2. účinné od 1. 8. 2004- zdůvodnění výběru vehikula,
        3. účinné od 1. 8. 2004- podrobné údaje o způsobu aplikace testované látky,
        4. účinné od 1. 8. 2004- podrobné údaje o potravě a kvalitě vody,
        5. účinné od 1. 8. 2004- zdůvodnění vybrané úrovně dávek,
        6. účinné od 1. 8. 2004- specifikace podávaných dávek, včetně podrobných údajů o vehikulu, objemu a fyzikální formě aplikované látky,
        7. účinné od 1. 8. 2004- zdůvodnění doby pro odběr na biochemické vyšetření, je-li jiná než 24 a 48 hodin.
      1. účinné od 1. 8. 2004Výsledky:
        1. účinné od 1. 8. 2004- údaje o tělesné hmotnosti,
        2. účinné od 1. 8. 2004- údaje o toxických odpovědích podle dávkových skupin, včetně úmrtnosti,
        3. účinné od 1. 8. 2004- úroveň bez účinku (NOAEL),
        4. účinné od 1. 8. 2004- charakter, stupeň a trvání klinických příznaků (ať vratných nebo nevratných),
        5. účinné od 1. 8. 2004- podrobný popis biochemických vyšetření a jejich výsledky,
        6. účinné od 1. 8. 2004- pitevní nálezy,
        7. účinné od 1. 8. 2004- podrobný popis všech histopatologických nálezů,
        8. účinné od 1. 8. 2004- statistické vyhodnocení výsledků, u kterých je to možné.

    účinné od 1. 8. 2004Diskuse výsledků.

    účinné od 1. 8. 2004Závěry.

účinné od 1. 8. 2004B.39 TEST NEPLÁNOVANÉ SYNTÉZY DNA V SAVČÍCH JATERNÍCH BUŇKÁCH IN VIVO

  1. účinné od 1. 8. 20041 METODA je v souladu s právem Evropských společenství.5)
    1. účinné od 1. 8. 20041.1 Úvod

      účinné od 1. 8. 2004Účelem testu neplánované syntézy DNA (unscheduled DNA synthesis, UDS) v savčích jaterních buňkách in vivo je určit látky, vyvolávající reparaci DNA v jaterních buňkách pokusných zvířat.5)

      účinné od 1. 8. 2004Tento test in vivo představuje metodu pro zjišťování genotoxických účinků chemických látek v játrech. Výsledek testu indikuje poškození DNA v jaterních buňkách a její následnou reparaci. Játra jsou obvykle hlavním místem metabolismu absorbovaných sloučenin; jsou proto vhodným objektem pro detekci poškození DNA in vivo.

      účinné od 1. 8. 2004Existují-li doklady o tom, že se testovaná látka do cílové tkáně nedostane, není tento test vhodný.

      účinné od 1. 8. 2004Výsledek neplánované syntézy DNA (UDS) se hodnotí tak, že se stanoví absorpce značených nukleosidů v buňkách, které neprocházejí plánovanou (S-fáze) syntézou DNA. Nejběžnější je metoda, při které se autoradiograficky stanoví thymidin značený tritiem (3H-TdR). Pro testy UDS in vivo se nejčastěji používají potkaní játra. Jiné tkáně než játra se sice také mohou použít, nejsou však předmětem této metody.

      účinné od 1. 8. 2004Detekce odpovědi závisí na počtu bází DNA, jež jsou v místě poškození odstraněny a nahrazeny. Proto je metoda UDS zvláště vhodná k detekci látek indukujících „longpatch repair“ (20 – 30 bází), zatímco pro látky indukující „shortpatch repair“ (1 – 3 báze) je méně citlivá. Dále může docházet k mutacím v důsledku neopravení, chybného opravení nebo chybné replikace lézí DNA. Rozsah odpovědi UDS neříká nic o přesnosti procesu reparace. Mimoto je možné, že mutagen bude sice s DNA reagovat, ale poškození DNA není opraveno excizním reparačním procesem. To, že UDS test neposkytuje o mutagenní aktivitě specifické informace, je vyváženo jeho potenciální citlivostí, protože poskytuje výsledek v celém genomu.

    1. účinné od 1. 8. 20041.2 Definice

      účinné od 1. 8. 2004Buňky v reparaci: net nuclear grain (NNG) vyšší než určitá, předem stanovená hodnota, kterou zdůvodní laboratoř provádějící test.

      účinné od 1. 8. 2004Net nuclear grains (NNG): kvantitativní míra UDS aktivity buněk při autoradiografických testech UDS, vypočtená jako rozdíl mezi počtem zrn v jádře (NG) a průměrným počtem zrn v cytoplasmě (CG): NNG = NG – CG. Počty NNG se vypočítávají pro jednotlivé buňky a následně přepočítány na buňky v kultuře, v paralelních kulturách apod.

      účinné od 1. 8. 2004Neplánovaná syntéza DNA (unscheduled DNA synthesis, UDS): opravná syntéza DNA po excizi a odstranění úseku DNA obsahujícího oblast poškození vyvolaného chemickou látkou nebo fyzikálním činidlem.

    1. účinné od 1. 8. 20041.3 Princip metody

      účinné od 1. 8. 2004Test UDS v savčích jaterních buňkách in vivo indikuje reparační syntézu DNA po excizi a odstranění segmentu DNA obsahujícího oblast poškození vyvolaného chemickou látkou nebo fyzikálním působením. Test vychází obvykle z inkorporace 3H-TdR do DNA jaterních buněk, charakteristických nízkým počtem buněk v S-fázi buněčného cyklu. Inkorporace 3H-TdR se obvykle stanoví autoradiograficky, protože tato technika není tak náchylná k interferenci s buňkami v S-fázi, jako je např. scintilační metoda.

      1. účinné od 1. 8. 20041.3.1 Popis metody
      2. účinné od 1. 8. 20041.3.2 Příprava
        1. účinné od 1. 8. 20041.3.2.1 Výběr živočišného druhu

          účinné od 1. 8. 2004Běžně se používají potkani, lze ovšem použít jakýkoliv vhodný savčí druh. Používají se běžné laboratorní kmeny mladých zdravých dospělých jedinců. Hmotnostní rozdíly by při zahájení studie měly být minimální a u každého pohlaví nemají přesahovat ± 20 % průměrné hmotnosti.

      1. účinné od 1. 8. 20041.3.3 Podmínky chovu

        účinné od 1. 8. 2004Všeobecné podmínky chovu jsou uvedeny v kapitole Všeobecný úvod.

        účinné od 1. 8. 2004Vlhkost by měla být 50 – 60 %.

        1. účinné od 1. 8. 20041.3.3.1 Příprava zvířat

          účinné od 1. 8. 2004Pokusná zvířata jsou vybrána s ohledem na druh, pohlaví, a stáří v souladu s ustanovením § 15 zvláštního právního předpisu10) a označena tak, aby byla možná identifikace jednotlivých zvířat. Dobu navykání stanoví § 10 zvláštního právního předpisu.10) Zdraví mladí dospělí jedinci se náhodně rozdělí do kontrolní a experimentální skupiny. Jedinci se jednoznačně označí a klece je třeba uspořádat tak, aby se minimalizovaly případné vlivy toho, jak a kde jsou klece umístěny.

        1. účinné od 1. 8. 20041.3.3.2 Testovaná látka/příprava

          účinné od 1. 8. 2004Je-li testovaná látka v pevném stavu a je-li to možné, látka se před podáním zvířatům rozpustí nebo se připraví její suspenze ve vhodném rozpouštědle nebo vehikulu. Kapalné testované látky se mohou podávat přímo nebo se před podáváním ředí. Je třeba používat čerstvé preparáty, ledaže údaje o stálosti (stabilitě) prokazují, že skladování ji neovlivní.

      1. účinné od 1. 8. 20041.3.4 Podmínky testu
        1. účinné od 1. 8. 20041.3.4.1 Rozpouštědlo/vehikulum

          účinné od 1. 8. 2004Rozpouštědlo / vehikulum v používaných dávkách nesmí vyvolávat toxické účinky a nesmí s testovanou látkou chemicky reagovat. Používá-li se ne příliš známé rozpouštědlo, musí být jeho použití podpořeno údaji o kompatibilitě s testovanou látkou. Doporučuje se, aby kde je to možné, bylo na prvním místě použito vodné rozpouštědlo / vehikulum.

        1. účinné od 1. 8. 20041.3.4.2 Kontroly

          účinné od 1. 8. 2004Do každého testu je třeba pro každé pohlaví zařadit souběžné pozitivní a negativní (rozpouštědlo/vehikulum) kontroly. Je třeba zacházet se zvířaty ve všech skupinách stejně.

          1. účinné od 1. 8. 2004Pozitivní kontroly by měly indukovat UDS při dávkách kdy lze očekávat jejich detekovatelné zvýšení nad spontánní úroveň. Pozitivní kontroly vyžadující metabolickou aktivaci se používají v dávkách vedoucích ke středně vysoké odezvě. Dávky při pozitivní kontrole se volí tak, aby byly účinky patrné, ale přitom nenapovídaly hodnotiteli totožnost zakódovaného preparátu. Mezi látky pro pozitivní kontrolu patří například:
            účinné od 1. 8. 2004
            B.37 POZDNÍ NEUROTOXITA ORGANICKÝCH SLOUČENIN FOSFORU - AKUTNÍ EXPOZICE B.38 POZDNÍ NEUROTOXITA ORGANICKÝCH SLOUČENIN FOSFORU 28-DENNÍ OPAKOVANÁ EXPOZICE B.39 TEST NEPLÁNOVANÉ SYNTÉZY DNA V SAVČÍCH JATERNÍCH BUŇKÁCH IN VIVO
            Doba odběru vzorkuLátkaCASEINECS
            odběr v intervalu (2 - 4 hodiny)N-nitrosodimethylamin62-75-9200-249-8
            odběr v intervalu (12 - 16 hodin)N-2-fluorenylacetamid
            (2-AAF)            		53-96-3200-188-6

          účinné od 1. 8. 2004Je možno použít i jiné vhodné látky. Je možná aplikace pozitivní kontroly jinou cestou, než je podávána testovaná látka.

    1. účinné od 1. 8. 20041.4 Postup
      1. účinné od 1. 8. 20041.4.1 Počet a pohlaví zvířat

        účinné od 1. 8. 2004V každé skupině musí být minimálně 3 analyzovatelní jedinci. Pokud existuje historická databáze, pak pro souběžné skupiny negativní a pozitivní kontroly postačují 1 nebo 2 jedinci.

        účinné od 1. 8. 2004Pokud v době, kdy se studie provádí, existují údaje ze studií s týmž živočišným druhem využívajících týž expozičních cest, prokazující, že mezi oběma pohlavími nejsou v toxicitě podstatné rozdíly, je možné provést testování pouze na jednom pohlaví, nejlépe na samcích. Tam, kde humánní expozice testovaným látkám může být pohlavně specifická, jak je tomu například u některých farmaceutických přípravků, provádí se test na zvířatech odpovídajícího pohlaví.

      1. účinné od 1. 8. 20041.4.2 Dávkovací schéma

        účinné od 1. 8. 2004Testovaná látka se obvykle podává jednorázově.

      1. účinné od 1. 8. 20041.4.3 Dávkování

        účinné od 1. 8. 2004Obvykle se používají 2 různé dávky. Nejvyšší dávka je definována jako dávka vyvolávající takové známky toxicity, že při vyšší dávce ve stejném režimu by se očekával letální účinek. Nižší dávka představuje obecně 50–25 % dávky vyšší.

        účinné od 1. 8. 2004Látky, jež v nízkých netoxických dávkách vykazují specifickou biologickou aktivitu, jako jsou hormony nebo mitogeny, mohou představovat výjimky z těchto kritérií pro stanovení dávek a vyhodnocují se případ od případu. Provádí-li se studie ke zjištění rozpětí toxicity, protože potřebné údaje nejsou k dispozici, je třeba ji realizovat v téže laboratoři a za použití stejného živočišného druhu, kmene, pohlaví a pokusného režimu, jaké se pak použijí v hlavní studii.

        účinné od 1. 8. 2004Jako nejvyšší dávku lze také definovat dávku vyvolávající určité známky toxicity v játrech (např. pyknotická jádra).

      1. účinné od 1. 8. 20041.4.4 Limitní test

        účinné od 1. 8. 2004Jestliže test při dávce minimálně 2 000 mg/kg hmotnosti podané v 1 nebo 2 dávkách týž den nevyvolává žádné pozorovatelné toxické účinky a jestliže se na základě údajů o strukturně příbuzných látkách neočekává genotoxicita, nemusí se provést úplná studie. Podle očekávané humánní expozice může být použita v limitním testu vyšší dávka.

      1. účinné od 1. 8. 20041.4.5 Aplikace látky

        účinné od 1. 8. 2004Testovaná látka se obvykle vpravuje žaludeční sondou. V odůvodněných případech mohou být přijatelné i jiné expoziční cesty. Intraperitoneální aplikace se však nedoporučuje, protože by se tím mohla játra vystavit působení testované látky přímo, nikoli krevním oběhem. Maximální objem kapaliny, která se dá sondou nebo injekcí najednou vpravit, závisí na velikosti pokusného zvířete a nemá překročit 2 ml/100 g hmotnosti organismu; vyšší dávky musí být zdůvodněné. S výjimkou dráždivých nebo žíravých látek, jež normálně vykazují při vyšších koncentracích horší účinky, je třeba upravit koncentrace látky tak, aby objem byl ve všech dávkových úrovních stejný a minimalizovala se tak objemová variabilita.

      1. účinné od 1. 8. 20041.4.6 Příprava jaterních buněk

        účinné od 1. 8. 2004Jaterní buňky se z pokusných zvířat zpracovávají obvykle 12 – 16 hodin po podání testované látky. Obvykle je zapotřebí ještě další odběr (obvykle 2 – 4 hodiny po podání látky), ledaže je po 12 – 16 hodinách pozitivní reakce zjevná. Je ovšem možno použít i jiné časy odběru vzorků, je-li to odůvodněné na základě toxikokinetických údajů.

        účinné od 1. 8. 2004Krátkodobé kultury savčích jaterních buněk se obvykle zakládají perfuzí jater in situ kolagenázou. Je třeba zajistit, aby se čerstvě disociované jaterní buňky mohly přichytit ke vhodnému povrchu. Jaterní buňky ze zvířat z negativní kontroly mají mít minimálně 50 % životaschopnost.

      1. účinné od 1. 8. 20041.4.7 Stanovení UDS

        účinné od 1. 8. 2004Čerstvě izolované savčí jaterní buňky se po vhodnou dobu (např. 3 – 8 hodin) obvykle inkubují v médiu obsahujícím 3H-TdR. Po inkubaci se médium odstraní; buňky se potom mohou inkubovat v médiu obsahujícím nadbytek neznačeného thymidinu, aby se snížila neinkorporovaná radioaktivita (tzv. „cold chase“). Buňky se pak promyjí, fixují a vysuší. Při delších inkubačních intervalech nemusí se „cold chase“ provádět. Sklíčka s preparáty se ponoří do autoradiografické emulze a exponují se exponují ve tmě (např. po dobu jednoho nebo dvou týdnů v chladničce), vyvolají, obarví a počítají se exponovaná stříbrná zrna. Z každého jedince se připraví 2 nebo 3 preparáty.

      1. účinné od 1. 8. 20041.4.8 Analýza

        účinné od 1. 8. 2004Mikroskopické preparáty musí obsahovat dostatečný počet buněk s normální morfologií, aby bylo možno UDS vyhodnotit. Mikroskopicky se hodnotí zjevné známky cytotoxicity (např. pyknóza, snížená úroveň radioaktivního značení).

        účinné od 1. 8. 2004Preparáty se před počítáním zrn zakódují. Vždy na minimálně 2 preparátech z každého jedince se obvykle hodnotí 100 buněk; pokud je buněk méně než 100 na jedince, musí to být zdůvodněné. Při počítání zrn se nevyhodnocují jádra v S-fázi, ale podíl buněk v S-fázi se registruje.

        účinné od 1. 8. 2004Vhodnou metodou se stanoví stupeň inkorporace 3H-TdR do jader a cytoplazmy v morfologicky normálních buňkách, zjištěných podle depozice stříbrných zrnek.

        účinné od 1. 8. 2004Počet buněk se stanoví z počtu zrn odpovídajících buněčným jádrům (NG) a z průměrného počtu zrn v cytoplasmatických oblastech (CG) odpovídajících jádrům. Jako hodnota CG se použije buď počet buněk pro nejsilněji označenou oblast cytoplasmy, nebo průměrná hodnota dvou až tří náhodně vybraných oblastí v blízkosti dotyčných buněčných jader. Po odpovídajícím zdůvodnění mohou být použity i jiné postupy stanovení počtu buněk (např. počítání celých buněk).

  1. účinné od 1. 8. 20042 ÚDAJE
    1. účinné od 1. 8. 20042.1 Zpracování výsledků

      účinné od 1. 8. 2004Výsledky zahrnují údaje z jednotlivých preparátů a zvířat. Mimoto se všechna data shrnou v tabelární formě. Pro každou buňku, každého jedince a každou dávku a čas se stanoví čistý počet „nuclear grain“ (NNG) odečtením počtu CG od počtu NG. Počítají-li se „buňky v opravě“, musí být kritéria, kterými se tyto buňky určují, zdůvodněna a podložena daty z historických nebo souběžných negativních kontrol. Numerické výsledky se mohou vyhodnotit statistickými metodami; pokud se statistické testy použijí, je třeba je vybrat a zdůvodnit ještě před započetím studie.

    1. účinné od 1. 8. 20042.2 Vyhodnocení a interpretace výsledků
      1. účinné od 1. 8. 2004Kritéria pro pozitivní / negativní reakci zahrnují:
        účinné od 1. 8. 2004
        B.37 POZDNÍ NEUROTOXITA ORGANICKÝCH SLOUČENIN FOSFORU - AKUTNÍ EXPOZICE B.38 POZDNÍ NEUROTOXITA ORGANICKÝCH SLOUČENIN FOSFORU 28-DENNÍ OPAKOVANÁ EXPOZICE B.39 TEST NEPLÁNOVANÉ SYNTÉZY DNA V SAVČÍCH JATERNÍCH BUŇKÁCH IN VIVO
        Pozitivní (I) hodnoty NNG nad předem stanoveným prahem, zdůvodněným na základě historických dat dané laboratoře, nebo
        (II) hodnoty NNG významně vyšší než u souběžné kontroly.
        účinné od 1. 8. 2004
        B.37 POZDNÍ NEUROTOXITA ORGANICKÝCH SLOUČENIN FOSFORU - AKUTNÍ EXPOZICE B.38 POZDNÍ NEUROTOXITA ORGANICKÝCH SLOUČENIN FOSFORU 28-DENNÍ OPAKOVANÁ EXPOZICE B.39 TEST NEPLÁNOVANÉ SYNTÉZY DNA V SAVČÍCH JATERNÍCH BUŇKÁCH IN VIVO
        Negativní(I) hodnoty NNG na úrovni/pod úrovní historického prahu u kontrol, nebo
        (II) hodnoty NNG nejsou signifikantně vyšší než souběžná kontrola.

      účinné od 1. 8. 2004Je třeba uvážit biologickou významnost získaných dat, což znamená, že je třeba vzít v úvahu parametry, jako jsou variabilita mezi jednotlivými jedinci, vztah dávka-odpověď a cytotoxicita. Při vyhodnocování výsledků lze použít statistické metody; statistická významnost by však neměla být pro pozitivní reakci rozhodujícím faktorem.

      účinné od 1. 8. 2004Většina experimentů poskytuje jednoznačné pozitivní nebo negativní výsledky, v ojedinělých případech však nelze ze získaného souboru dat vyvodit o aktivitě testované látky definitivní závěr. Výsledky mohou být stále nejednoznačné nebo problematické, i když se experiment několikrát opakuje.

      účinné od 1. 8. 2004Pozitivní výsledek testu UDS se savčími jaterními buňkami in vivo ukazuje, že testovaná látka vyvolává v savčích jaterních buňkách in vivo poškození DNA, které lze opravit neplánovanou syntézou DNA in vitro. Negativní výsledek ukazuje, že za daných experimentálních podmínek testovaná látka nevyvolává takové poškození DNA, jež je tímto testem zjistitelná.

      účinné od 1. 8. 2004Je třeba vzít v úvahu, jaká je pravděpodobnost, že testovaná látka dosáhne širokého použití nebo je specifická pro určitou cílovou tkáň (např. systémová toxicita).

  1. účinné od 1. 8. 20043 PROJEKT POKUSU, PROTOKOL POKUSU A ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA

    účinné od 1. 8. 2004V souladu se s příslušnými právními předpisy9) musí být zpracován projekt pokusu a o průběhu pokusu je nutno vést protokol.

    1. účinné od 1. 8. 2004Ve zprávě o průběhu pokusu je třeba uvést tyto informace:
      1. účinné od 1. 8. 2004Rozpouštědlo / vehikulum:
        1. účinné od 1. 8. 2004- zdůvodnění volby vehikula,
        2. účinné od 1. 8. 2004- rozpustnost a stabilita testované látky v rozpouštědle/vehikulu, pokud je známa.
      1. účinné od 1. 8. 2004Pokusná zvířata:
        1. účinné od 1. 8. 2004- použitý živočišný druh/kmen,
        2. účinné od 1. 8. 2004- počet, věk a pohlaví jedinců,
        3. účinné od 1. 8. 2004- původ, chovné podmínky, strava apod.,
        4. účinné od 1. 8. 2004- hmotnost jednotlivých zvířat na počátku testu, včetně hmotnostního rozpětí, průměrů a směrodatných odchylek pro jednotlivé skupiny.
      1. účinné od 1. 8. 2004Podmínky pokusu:
        1. účinné od 1. 8. 2004- pozitivní a negativní (rozpouštědlo/vehikulum) kontroly,
        2. účinné od 1. 8. 2004- údaje ze studie pro určení rozpětí, byla-li provedena,
        3. účinné od 1. 8. 2004- zdůvodnění zvolených úrovní dávek,
        4. účinné od 1. 8. 2004- podrobnosti o přípravě testované látky,
        5. účinné od 1. 8. 2004- podrobnosti o podávání testované látky,
        6. účinné od 1. 8. 2004- zdůvodnění způsobu podávání,
        7. účinné od 1. 8. 2004- případné metody k ověření, že se látka dostala do krevního oběhu nebo do cílové tkáně,
        8. účinné od 1. 8. 2004- případný převod koncentrace látky v potravě/pitné vodě (ppm) na faktickou dávku (mg/kg hmotnosti /den ),
        9. účinné od 1. 8. 2004- podrobnosti o kvalitě potravy a vody,
        10. účinné od 1. 8. 2004- podrobné schéma podávání testované látky a odběru vzorků,
        11. účinné od 1. 8. 2004- metody zjišťování toxicity,
        12. účinné od 1. 8. 2004- metoda přípravy a kultivace jaterních buněk,
        13. účinné od 1. 8. 2004- použitá autoradiografická metoda,
        14. účinné od 1. 8. 2004- počet připravených preparátů a počet hodnocených buněk,
        15. účinné od 1. 8. 2004- kritéria analýzy,
        16. účinné od 1. 8. 2004- kritéria, jimiž se studie hodnotí jako pozitivní, negativní nebo nejednoznačná.
      1. účinné od 1. 8. 2004Výsledky:
        1. účinné od 1. 8. 2004- průměrné hodnoty počtů stříbrných zrn v jádrech, cytoplazmě a „net nuclear grains“ pro jednotlivé preparáty, zvířata a skupiny,
        2. účinné od 1. 8. 2004- vztah dávka-odpověď, pokud je k dispozici,
        3. účinné od 1. 8. 2004- statistické hodnocení, bylo-li provedeno,
        4. účinné od 1. 8. 2004- známky toxicity,
        5. účinné od 1. 8. 2004- údaje ze souběžných negativních (rozpouštědlo/vehikulum) a pozitivních kontrol,
        6. účinné od 1. 8. 2004- historické údaje z negativních (rozpouštědlo/vehikulum) a pozitivních kontrol včetně rozpětí, průměrů a směrodatných odchylek,
        7. účinné od 1. 8. 2004- počet „buněk v opravě“, byl-li stanoven,
        8. účinné od 1. 8. 2004- počet buněk v S-fázi, byl-li stanoven,
        9. účinné od 1. 8. 2004- životaschopnost buněk..

    účinné od 1. 8. 2004Diskuse výsledků.

    účinné od 1. 8. 2004Závěry.

účinné od 1. 8. 2004B.40 LEPTAVÉ ÚČINKY NA KŮŽI

  1. účinné od 1. 8. 20041 METODA je v souladu s právem Evropských společenství.6)
    1. účinné od 1. 8. 20041.1 Úvod

      účinné od 1. 8. 2004Evropské centrum pro validaci alternativních metod (European Centre for the Validation of Alternative Methods, ECVAM, Joint Research Centre, European Commission) schválilo jakožto vědecky validní dva testy in vitro na leptavé účinky na kůži: test na principu měření transkutánního elektrického odporu kůže potkana (transcutaneous electrical resistance, TER) a test využívající modelu lidské kůže.6) Validační studie ECVAM prokázala, že oba testy dokáží spolehlivě rozlišovat mezi známými látkami leptajícími a neleptajícími kůži. Mimoto test vycházející z modelu lidské kůže umožňuje správně rozlišovat jednotlivé stupně leptavých účinků (známé látky způsobující těžké poleptání kůže R35, a ostatní látky způsobující poleptání kůže, R34).6) Je uveden popis a postupy obou testů; výběr mezi oběma testy závisí na konkrétních požadavcích a na preferencích uživatele.

    1. účinné od 1. 8. 20041.2 Definice

      účinné od 1. 8. 2004Poleptání kůže: způsobení nevratného poškození tkáně kůže po aplikaci testované látky.

    1. účinné od 1. 8. 20041.3 Referenční látky

      účinné od 1. 8. 2004Žádná referenční látka není specifikována, viz však odst. 1.5.3.4 a 1.7.2.3.

    1. účinné od 1. 8. 20041.4 Princip metody - test TER na kůži potkana

      účinné od 1. 8. 2004Testovaný materiál se nanese na dobu až 24 hodin na epidermální povrch terčíků kůže odebrané z mladých potkanů utracených humánním způsobem. Látky, které mají leptavé účinky, jsou identifikovány podle své schopnosti porušit normální integritu a bariérové funkce stratum corneum. Tato schopnost se měří jakožto pokles inherentního transkutánního elektrického odporu (TER) pod určitou prahovou hodnotu (5 kΩ).6) Dráždivé a nedráždivé látky TER pod prahovou hodnotu nesnižují. V případě detergentů a neutrálních organických látek (jejichž definici viz v lit.6) je možno do zkušebního postupu zařadit test fixace barviva, aby se snížil počet falešných pozitivních výsledků, jež se u těchto typů chemických látek vyskytují.6)

    1. účinné od 1. 8. 20041.5 Popis metody - test TER na kůži potkana
      1. účinné od 1. 8. 20041.5.1 Pokusná zvířata

        účinné od 1. 8. 2004Pokusná zvířata jsou vybrána s ohledem na druh, pohlaví, a stáří v souladu s ustanovením § 15 zvláštního právního předpisu10) a označena tak, aby byla možná identifikace jednotlivých zvířat. Dobu navykání stanoví § 10 zvláštního právního předpisu.10)

        účinné od 1. 8. 2004Pro přípravu kožních terčíků jsou používáni mladí (20- až 23-denní) potkani, Wistar nebo srovnatelný kmen. Malými nůžkami na zvířata se pečlivě odstraní srst z dorzální a boční plochy. Zvířata se pak omyjí pečlivým otíráním a oblast se ponoří do roztoku antibiotika, například streptomycinu, penicilinu, chloramfenikolu nebo amfotericinu, v koncentracích inhibujících růst bakterií. Třetí nebo čtvrtý den po prvním omytí se zvířata omyjí antibiotiky znovu a během 3 dní se použijí. Pro přípravu kožních vzorků nesmějí být zvířata starší než 31 dní.

      1. účinné od 1. 8. 20041.5.2 Příprava terčíků kůže

        účinné od 1. 8. 2004Zvířata se humánním způsobem usmrtí, sejme se kůže z dorzální plochy a z té se opatrně sloupne přebytečný tuk. Kůže se přiloží přes konec polytetrafluorethylenové (PTFE) trubice, a to epidermální stranou k trubici. Přes konec trubice se přetáhne gumový O-kroužek, kterým se kůže připne, a přebytečná tkáň se odřízne. Rozměry trubice a O-kroužku ukazuje obr. 1. Gumový O-kroužek se pak zatěsní pečlivě ke konci PTFE trubice žlutou vazelínou. Trubice se ponoří do nádoby obsahující roztok síranu hořečnatého (154 mM), kde je přidržována pružinovou sponou (obr. 2).

      1. účinné od 1. 8. 20041.5.3 Popis postupu
        1. účinné od 1. 8. 20041.5.3.1 Nanesení testované látky

          účinné od 1. 8. 2004Je-li testovaná látka v tekutém stavu, nanese se na epidermální povrch uvnitř trubice (obr. 2). Je-li ve stavu pevném, nanese se na terčík v takovém množství, aby se pokryl celý povrch epidermis, na povrch látky se přidá 150 μl deionizované vody a trubicemi se jemně zatřepe. Testovaná látka musí mít s kůží maximální možný kontakt. U některých pevných látek toho lze dosáhnout zahřátím látky na 30°C, aby se roztavila, nebo rozetřením zrnitého materiálu na jemný prášek. Použijí se vždy 3 terčíky pro každou látku. Látka se nanáší na dobu 24 hodin (viz též 1.5.3.4) a odstraní se promýváním proudem vodovodní vody teplé maximálně 30°C tak dlouho, dokud se látka vyplavuje. Odstranění testované látky, která v trubici ztuhla, se dá napomoci vymýváním prudkým proudem vody teplé zhruba 30°C.

        1. účinné od 1. 8. 20041.5.3.2 Měření TER

          účinné od 1. 8. 2004Transkutánní elektrický odpor (TER) se měří pomocí nízkonapěťového impedančního můstku pro střídavý proud (např. AIM 401 nebo 6401 či ekvivalentního). Před měřením elektrického odporu se sníží povrchové napětí kůže přídavkem dostatečného objemu 70% ethanolu, kterým se pokryje epidermis. Po několika sekundách se ethanol odstraní tak, že se trubice otočí, a tkáň se hydratuje přídavkem 3 mililitrů 154 mM roztoku síranu hořečnatého. Elektrody můstku se přiloží na obě strany kůže a změří se odpor v kΩ/terčík (obr. 2). Rozměry elektrod a délku holé elektrody pod krokosvorkou ukazuje obr. 1. Svorka vnitřní (silné) elektrody se během měření uloží navrch PTFE trubice tak, aby byla do roztoku síranu hořečnatého ponořena vždy stejná délka elektrody. Vnější (tenká) elektroda se uloží do receptorové komůrky tak, aby ležela na dně. Je třeba dodržovat konstantní vzdálenost mezi spodní hranou pružinové svorky a spodkem PTFE trubice (obr. 1), tato vzdálenost má vliv na získanou hodnotu odporu.

          účinné od 1. 8. 2004Upozorňujeme, že je-li naměřený odpor vyšší než 20 kΩ, může to být důsledek toho, že testovaná látka překrývá epidermální povrch terčíku kůže. Je možno se pokusit tento povlak odstranit, například tak, že se PTFE trubice utěsní palcem v rukavici a zhruba 10 sekund se protřepává, roztok síranu hořečnatého se vylije a měření odporu se opakuje s čerstvým roztokem.

          účinné od 1. 8. 2004Průměrná naměřená hodnota TER je akceptována, pokud hodnoty ze souběžné pozitivní a negativní kontroly leží v rozmezích přijatelných pro tuto metodu. Navrhované kontrolní látky a příslušná akceptovatelná rozmezí odporu pro popisovanou metodu a aparaturu jsou tyto:

          účinné od 1. 8. 2004
          B.37 POZDNÍ NEUROTOXITA ORGANICKÝCH SLOUČENIN FOSFORU - AKUTNÍ EXPOZICE B.38 POZDNÍ NEUROTOXITA ORGANICKÝCH SLOUČENIN FOSFORU 28-DENNÍ OPAKOVANÁ EXPOZICE B.39 TEST NEPLÁNOVANÉ SYNTÉZY DNA V SAVČÍCH JATERNÍCH BUŇKÁCH IN VIVO B.40 LEPTAVÉ ÚČINKY NA KŮŽI
          KontrolaLátkaRozmezí odporu (kΩ)
          Pozitivní 10 M kyselina chlorovodíková (36%) 0,5 – 1,0
          Negativnídestilovaná voda10 – 25
        1. účinné od 1. 8. 20041.5.3.3 Modifikovaný postup pro povrchově aktivní látky a neutrální organické látky