Vyhláška, kterou se stanoví základní metody pro zkoušení toxicity chemických látek a chemických přípravků, 443/2004 Sb., účinné od 30. 7. 2004

Předchozí stránka

účinné od 1. 8. 2004Pokusná zvířata jsou vybrána s ohledem na druh, pohlaví, a stáří v souladu s ustanovením § 15 zvláštního právního předpisu¹⁰) a označena tak, aby byla možná identifikace jednotlivých zvířat. Dobu navykání stanoví § 10 zvláštního právního předpisu.¹⁰)

účinné od 1. 8. 2004Mladé, dospělé samice, které nikdy nebyly březí, stejného věku a velikosti jsou aklimatizovány při laboratorních podmínkách. Potom jsou připuštěni samci s ověřenou plodností. Oplozené samice jsou náhodně rozděleny do experimentálních skupin.

účinné od 1. 8. 2004Oplodnění může být zajištěno přirozenou cestou nebo umělou inseminací. Testovaná látka je podávána samicím denně. Aplikace začíná časně po implantaci a pokračuje během období organogeneze. Den před termínem jsou plody vyjmuty hysterektomií a podrobeny sledování abnormalit skeletu a vnitřních orgánů včetně sledování možnosti zpomaleného růstu, opožděné osifikace a krvácení do střeva.

účinné od 1. 8. 20041.2.2 Testovací podmínky
1. účinné od 1. 8. 20041.2.2.1 Experimentální zvířata
  účinné od 1. 8. 2004Běžně používanými druhy jsou potkan, myš, křeček a králík. Preferovanými druhy jsou potkan a králík. Je třeba používat všeobecně zavedené kmeny. Používaný kmen by neměl mít nízkou plodnost a měly by být u něj známy reakce na teratogeny. Zvířata jsou chována jednotlivě.
1. účinné od 1. 8. 20041.2.2.2 Počet a pohlaví
  účinné od 1. 8. 2004Pro každou dávku je třeba použít aspoň 20 březích potkanů, myší nebo křečků nebo 12 březích králíků. Ke sledování teratogenního potenciálu studované látky je třeba zajistit dostatečný počet vrhů a mláďat.
1. účinné od 1. 8. 20041.2.2.3 Dávky
  účinné od 1. 8. 2004Je třeba použít aspoň 3 dávky a 1 kontrolní skupinu. V případě, že je testovaná látka podána ve vehikulu, je třeba zahrnout do studie i skupinu, které bylo podáno samotné vehikulum. Je třeba také znát toxikologické vlastnosti vehikula: nesmí být teratogenní ani mít vliv na reprodukční schopnosti. Se zvířaty v kontrolní(ch) skupině(ách) se zachází stejným způsobem jako se zvířaty v testovací skupině s výjimkou aplikace testované látky. Pokud to fyzikálně chemické nebo biologické vlastnosti dovolují, pak nejvyšší dávka testované látky by v ideálním případě měla u matek vyvolat takové projevy toxicity, jako je mírné snížení váhy, ale už ne více jak 10 % úmrtí. Nízká úroveň dávek by neměla vyvolat viditelné účinky. Střední dávky by měly být voleny tak, aby byly geometricky rozloženy mezi nízkou a vysokou dávku.
1. účinné od 1. 8. 20041.2.2.4 Limitní test
  účinné od 1. 8. 2004V případě, že látka s nízkou toxicitou při dávce nejméně 1000 mg.kg^-1 prokazatelně nevyvolá projevy embryotoxicity ani teratogenicity, není třeba testovat na jiných úrovních dávek.
1. účinné od 1. 8. 20041.2.2.5 Doba expozice
  účinné od 1. 8. 2004Nultým dnem testu je den, kdy je pozorována vaginální zátka a/nebo spermie. Doba aplikace by měla zahrnovat období hlavní organogeneze. Za toto období je možno považovat šestý až patnáctý den u potkana a myši, šestý až čtrnáctý den u křečka a šestý až osmnáctý den u králíka. V případě, že je za nultý den považován den, kdy bylo pozorováno páření nebo byla provedena umělá inseminace, je třeba připočítat k předchozím údajům 1 den. Podle jiné alternativy končí aplikace 1 den před očekávaným porodem.
1. účinné od 1. 8. 20041.2.2.6 Období pozorování
  účinné od 1. 8. 2004Každý den je třeba provést pečlivé klinické vyšetření. Další sledování a opatření jsou prováděna za účelem minimalizace ztrát během studie.

účinné od 1. 8. 20041.2.3 Popis postupu
účinné od 1. 8. 2004Testovaná látka je aplikována orálně sondou, denně ve stejnou dobu.
účinné od 1. 8. 2004Testovaným samicím se testovaná látka podává denně během příslušného období testu. Dávka může být vztažena na hmotnost samic na počátku podávání látky nebo, vzhledem k rychlému nárůstu hmotnosti během březosti, zvířata mohou být periodicky vážena a dávka upravována podle posledního vážení. Všechny známky toxicity je třeba ihned zaznamenat včetně doby nástupu, stupně a trvání. Samice vykazující známky potratu nebo předčasného porodu je třeba utratit a řádně makroskopicky vyšetřit. V pozorování je třeba pokračovat i po ukončení podávání látky až do doby přibližně jeden den před porodem. Hlavním účelem je postihnout většinu období březosti, ale vyhnout se komplikacím při interpretaci výsledků po přirozeném porodu. Pozorování zvířat v kleci by mělo zahrnovat přinejmenším změny kůže a srsti, očí a sliznic, dále dýchacího, oběhového, autonomního a centrálního nervového systému, somatomotorické aktivity a chování. Každý týden je třeba měřit spotřebu potravy a vážit zvířata.
1. účinné od 1. 8. 20041.2.3.1 Pitva
  účinné od 1. 8. 2004Pokud dojde k uhynutí během nebo na konci studie je třeba u samic makroskopicky vyšetřit na morfologické abnormity nebo patologické změny, které mohly mít vliv na průběh březosti. Ihned po smrti je třeba odstranit dělohu a její obsah vyšetřit s ohledem na úmrtí embryí a zárodků a zjistit počet živých zárodků. Obvykle je možné určit dobu úmrtí zárodků v děloze. U potkanů a králíků je možné stanovit počet žlutých tělísek. Je třeba určit pohlaví zárodků a zaznamenat hmotnost jednotlivých zárodků a vypočítat průměr. Po vyjmutí je třeba jednotlivě zevně vyšetřit každý zárodek. U potkanů, myší a křečků je třeba vyšetřit kosterní abnormity u zhruba jedné třetiny až poloviny vrhu a u zbytku vhodnými metodami vyšetřit abnormity měkkých tkání. U králíků je třeba každý zárodek důkladně vyšetřit pitvou z hlediska abnormit vnitřností a skeletu.

účinné od 1. 8. 20042 ÚDAJE
účinné od 1. 8. 2004Údaje je třeba shrnout ve formě tabulky, udávající pro každou testovanou skupinu počet zvířat na začátku testu, počet zvířat, která zabřezla, počet a procento živých zárodků a zárodků s abnormalitami skeletu nebo měkkých tkání a vztah výskytu abnormalit k určitým vrhům. Výsledky se hodnotí vhodnou statistickou metodou. Je možno použít jakékoliv uznávané statistické metody.

účinné od 1. 8. 20043 PROJEKT POKUSU, PROTOKOL POKUSU A ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA
účinné od 1. 8. 2004V souladu s příslušnými právními předpisy⁹) musí být zpracován projekt pokusu a o průběhu pokusu je nutno vést protokol.
1. účinné od 1. 8. 2004Zpráva o testu by měla pokud možno obsahovat následující informace:
  1. účinné od 1. 8. 2004- druh, kmen, zdroj, podmínky ustájení, potrava,
  2. účinné od 1. 8. 2004- podmínky testu,
  3. účinné od 1. 8. 2004- dávky (včetně vehikula pokud bylo použito) a koncentrace,
  4. účinné od 1. 8. 2004- projevy toxicity pro každou dávku,
  5. účinné od 1. 8. 2004- dávka bez účinku (pokud ji bylo možno stanovit),
  6. účinné od 1. 8. 2004- dobu úmrtí během studie nebo zda zvířata přežila do konce testu,
  7. účinné od 1. 8. 2004- popis toxických nebo jiných účinků,
  8. účinné od 1. 8. 2004- doba, kdy byly pozorovány jednotlivé abnormální příznaky, a jejich další vývoj,
  9. účinné od 1. 8. 2004- údaje o tělesné hmotnosti a spotřebě potravy,
  10. účinné od 1. 8. 2004- délka březosti a údaje o vrhu (včetně historických údajů),
  11. účinné od 1. 8. 2004- údaje o zárodcích (živé/mrtvé, pohlaví, defekty skeletu a měkkých tkání),
  12. účinné od 1. 8. 2004- údaje o jednotlivých vrzích (živé/mrtvé plody, pohlaví, defekty skeletu a měkkých tkání),
  13. účinné od 1. 8. 2004- statistické vyhodnocení výsledků.
účinné od 1. 8. 2004Diskuse výsledků.
účinné od 1. 8. 2004Závěry.

účinné od 1. 8. 2004B.32 TEST KARCINOGENITY

účinné od 1. 8. 20041 METODA je v souladu s právem Evropských společenství.¹)
1. účinné od 1. 8. 20041.1 Princip metody
  účinné od 1. 8. 2004Testovaná látka je podávána obvykle 7 dnů v týdnu, vhodnou cestou, několika skupinám pokusných zvířat, 1 dávka na skupinu, po větší část života zvířat. Během a po expozici testované látce jsou zvířata denně pozorována za účelem sledování projevů toxicity, zvláště vývinu tumorů.
1. účinné od 1. 8. 20041.2 Popis metody
  účinné od 1. 8. 2004Pokusná zvířata jsou vybrána s ohledem na druh, pohlaví, a stáří v souladu s ustanovením § 15 zvláštního právního předpisu¹⁰) a označena tak, aby byla možná identifikace jednotlivých zvířat. Dobu navykání stanoví § 10 zvláštního právního předpisu.¹⁰) Před testem se mladá zdravá zvířata náhodně rozdělí do kontrolních a exponovaných skupin.
1. účinné od 1. 8. 20041.3 Experimentální zvířata
  účinné od 1. 8. 2004Preferovaným druhem je potkan. Na základě předchozích studií je možno použít i další druhy (hlodavce i nehlodavce). Používají se zdravá mladá zvířata z běžně chovaných kmenů laboratorních zvířat. Expozice by měla být započata co nejdříve po odstavení mláďat. Na začátku studie by neměl rozdíl v hmotnosti zvířat činit více než ± 20% od průměru. V případě, že vlastní studii předchází test subchronické orální toxicity, je třeba použít stejný druh a kmen v obou studiích.
1. účinné od 1. 8. 20041.4 Počet a pohlaví
  účinné od 1. 8. 2004Pro hlodavce se užije nejméně 100 zvířat (50 samic a 50 samců) pro každou úroveň dávky a souběžná kontrolní skupina. Samice by měly být nullipary a negravidní. Je-li plánováno průběžné utrácení zvířat, počty je třeba zvýšit o počet zvířat, která budou takto utracena před koncem studie.
  1. účinné od 1. 8. 20041.4.1 Dávkové úrovně a frekvence expozic
    účinné od 1. 8. 2004Zvolí se při nejmenším tři dávkové úrovně kromě souběžné kontrolní skupiny. Nejvyšší dávková úroveň by měla vyvolat příznaky minimální toxicity, jako je mírný pokles váhových přírůstků (méně než 10 %), bez podstatnějších změn normální doby dožití daných jinými účinky než tumory.
    účinné od 1. 8. 2004Nejnižší dávková úroveň by neměla interferovat s normálním růstem, vývojem a délkou života zvířete nebo vyvolat jakékoli známky toxicity. Obecně by neměla být nižší než 10% vysoké dávky. Střední dávku/dávky je třeba stanovit ve středním pásmu mezi vysokou a nízkou dávkou.
    účinné od 1. 8. 2004Volba dávkových úrovní by měla vzít v úvahu předchozí testy a studie toxicity.
    účinné od 1. 8. 2004Expozice se provádí obvykle denně. Je-li látka podávána v pitné vodě nebo přimíšena do potravy, měla by být stále k disposici.
  1. účinné od 1. 8. 20041.4.2 Kontroly
    účinné od 1. 8. 2004Souběžná kontrolní skupina je identická v každém ohledu s exponovanou skupinou, vyjma expozice testované látce.
    účinné od 1. 8. 2004Ve zvláštních případech, jako jsou inhalační studie s aerosoly nebo použije-li se pro orální aplikaci emulgátoru, jehož biologická aktivita není charakterizována, zařadí se další negativní kontrolní skupina, která není exponována ani vehikulu.
  1. účinné od 1. 8. 20041.4.3 Způsob aplikace
    účinné od 1. 8. 20043 hlavní cesty aplikace jsou orální, dermální a inhalační. Volba způsobu podání závisí na fyzikálních a chemických charakteristikách testované látky a pravděpodobném způsobu expozice u člověka.
    1. účinné od 1. 8. 20041.4.3.1 Orální studie
      účinné od 1. 8. 2004Tam, kde se testovaná látka vstřebává z gastrointestinálního traktu a je-li požití jedna z cest, jimiž může být exponován člověk, dává se přednost orální aplikaci, pokud nejsou proti tomu nějaké důvody. Zvířata mohou dostat testovanou látku v potravě, rozpuštěnu v pitné vodě nebo podanou v tobolce.
      účinné od 1. 8. 2004Ideálně by se měla látka podávat 7 dnů v týdnu, protože dávkování 5 dnů v týdnu může vést k vymizení toxicity nebo naopak vyvolat „abstinenční“ příznaky v období bez aplikace, a tudíž ovlivnit výsledky a následné hodnocení. Nicméně, především s ohledem na praktické aspekty, dávkování pětkrát týdně je považováno za přijatelné.
    1. účinné od 1. 8. 20041.4.3.2 Dermální studie
      účinné od 1. 8. 2004Aplikace přímo na kůži může být zvolena jako simulace hlavní cesty vstupu u člověka a jako modelový způsob vyvolání kožního poškození.
    1. účinné od 1. 8. 20041.4.3.3 Inhalační studie
      účinné od 1. 8. 2004Protože inhalační studie jsou technicky komplikovanější než jiné způsoby aplikace, jsou zde uvedeny podrobněji informace o této cestě podání. Intratracheální instilace může být platnou alternativou v specifických situacích.
      účinné od 1. 8. 2004Dlouhodobé expozice obvykle napodobují předpokládané lidské expozice, takže zvíře je obvykle exponováno po ustálení koncentrace 6 hodin denně po 5 dnů v týdnu (přerušovaná expozice), nebo v návaznosti na možnou expozici v prostředí, 22-24 hodin denně po 7 dní v týdnu (kontinuální expozice), s přibližně 1 hodinou pro krmení zvířat denně ve stejnou dobu dne, použitou i pro čištění expozičního boxu. V obou případech jsou zvířata obvykle exponována fixním koncentracím testované látky. Hlavní rozdíl mezi přerušovanou a stálou expozicí je v tom, že v první má zvíře 17-18 hodin na ústup účinků denní expozice s ještě delším obdobím během víkendu.
      účinné od 1. 8. 2004Volba přerušované nebo kontinuální expozice závisí na cílech studie a na lidské expozici, která má být simulována. Nicméně, je třeba vzít v úvahu určité technické obtíže. Na příklad, výhody kontinuální expozice pro simulaci podmínek zevního prostředí mohou být narušeny nutností pití a krmení během expozice a potřebou komplikovanější (a spolehlivé) generace aerosolu nebo určité koncentrace par a technik monitorování.
      účinné od 1. 8. 2004Expoziční komory
      účinné od 1. 8. 2004Zvířata se exponují v inhalačních komorách, jejichž konstrukce zaručuje dynamický proud pro nejméně 12 výměn vzduchu za hodinu, aby byl zajištěn dostatečný přísun kyslíku a rovnoměrná distribuce expoziční atmosféry. Kontrolní a expoziční komory by měly mít identickou konstrukci, tak aby byly expoziční podmínky srovnatelné ve všech aspektech vyjma expozice testované látce. Uvnitř komory se obvykle udržuje mírný podtlak a tím se brání úniku testované látky do okolního prostředí. Komory by měly minimalizovat stísněnost testovaných zvířat. Obecně by v zájmu udržení stabilní atmosféry v komoře objem zvířat neměl přesáhnout 5 % objemu komory.
      1. účinné od 1. 8. 2004Měření nebo monitorování zahrnuje:
        účinné od 1. 8. 2004(a) Průtok vzduchu: rychlost průtoku vzduchu komorou by měla být nejlépe kontrolována kontinuálně.
        účinné od 1. 8. 2004(b) Koncentrace: během denní expozice by koncentrace testované látky neměla kolísat více než ±15% střední hodnoty.
        účinné od 1. 8. 2004(c) Teplota a vlhkost: pro hlodavce, teplota by měla být udržována v rozmezí 22 ± 2 °C a vlhkost v komorách 30 - 70 % vyjma případů, kdy je voda používána k rozptýlení testované látky v atmosféře komory. Oba parametry by měly být kontrolovány průběžně.
        účinné od 1. 8. 2004(d) Měření velikosti částic: stanoví se distribuce velikosti částic v atmosféře komor u tekutých nebo pevných aerosolů. Aerosolové částice mají být v respirabilní velikosti pro použité testovací zvíře. Vzorky atmosféry komor se odebírají z dýchací zóny zvířat. Vzorek vzduchu má být reprezentativní pro distribuci částic, kterým je zvíře exponováno, a gravimetricky má odpovídat celému suspendovanému aerosolu, i když značná část aerosolu není respirabilní. Analýza velikosti částic se provádí často během vývoje generujícího systému, aby se zajistila stabilita aerosolu, a poté během expozic tak často, aby bylo možno posoudit stabilitu distribuce částic, kterým jsou zvířata exponována.
  1. účinné od 1. 8. 20041.4.4 Trvání studie
    účinné od 1. 8. 2004Trvání testu karcinogenity zahrnuje větší část normální doby života zvířete použitého pro test. Test by měl být ukončen v 18 měsících u myší a křečků a 24 měsících u potkanů. Nicméně, pro některé kmeny zvířat s delší dobou života, respektive s nízkým spontánním výskytem tumorů, by doba ukončení studie měla být za 24 měsíců pro myši a křečky a za 30 měsíců pro potkany. Alternativně, ukončení takové prodloužené studie je přijatelné, když počet přežívajících u nejnižší dávky nebo v kontrolní skupině klesne na 25 %. Při ukončení testu, ve kterém je zřetelný sexuální rozdíl odpovědi, se každé pohlaví posuzuje zvlášť. Tam, kde uhyne předčasně jen skupina s vysokou dávkou ze zjevných toxických příčin, nemusí to nutně vést k ukončení celého testu, pokud ostatní skupiny nevykazují toxické projevy, které by činily problémy. Aby bylo možno uznat negativní výsledek testu, nesmí být ztráty použitelných údajů (autolýzou, kanibalismem nebo v důsledku chyb obsluhy) v žádné skupině větší než 10% a přežití ve všech skupinách nesmí být nižší než 50% v 18 měsících u myší a křečků a v 24 měsících u potkanů.
1. účinné od 1. 8. 20041.5 Popis postupu
  1. účinné od 1. 8. 20041.5.1 Pozorování
    účinné od 1. 8. 2004Denní pozorování zvířat v klecích zahrnuje změny kůže a srsti, očí a sliznic, jakož i dýchacího, oběhového, autonomního a centrálního nervového systému, somatomotorické aktivity a chování.
    účinné od 1. 8. 2004Pravidelná kontrola zvířat je nutná, aby se zabránilo ztrátám zvířat ze studie v důsledku kanibalismu, autolýzy tkání nebo chyb v obsluze. Zvířata v agónii jsou utracena a pitvána.
    účinné od 1. 8. 2004Klinické příznaky a mortalita by měly být zaznamenány u všech zvířat. Zvláštní pozornost je třeba věnovat vývoji tumorů: doba objevení, lokalizace, rozměry, vzhled a progrese každého viditelného či hmatného tumoru se zaznamenává.
    účinné od 1. 8. 2004Je třeba provádět měření spotřeby potravy (a vody tam, kde je testovaná látka podávána v pitné vodě) týdně během prvních 13 týdnů a pak přibližně ve tříměsíčních intervalech, ledaže by zdravotní stav nebo změny tělesné hmotnosti ukázaly nutnost jiné frekvence sledování.
    účinné od 1. 8. 2004Tělesné hmotnosti se zaznamenávají individuálně u všech zvířat jednou týdně během prvních 13 týdnů období testu a aspoň jednou za čtyři týdny po tomto období.
  1. účinné od 1. 8. 20041.5.2 Klinická vyšetření
    1. účinné od 1. 8. 20041.5.2.1 Hematologie
      účinné od 1. 8. 2004Pokud pozorování zvířat v klecích svědčí o zhoršeném zdravotním stavu zvířat během studia, je třeba vyšetřit diferenciální obraz bílých krvinek.
      účinné od 1. 8. 2004Za 12 měsíců, za 18 měsíců a před utracením zvířat se provede krevní nátěr ze všech zvířat. Diferenciál bílých krvinek se provede ve vzorcích ze zvířat ve skupině s nejvyšší dávkou a u kontrol. Pokud tato data, zvláště údaje získané před utracením, nebo údaje z vyšetření patologických změn naznačí nutnost, diferenciál se vyšetří i u skupiny s dávkou nejblíže nižší, než je vysoká dávka.
    1. účinné od 1. 8. 20041.5.2.2 Pitva
      účinné od 1. 8. 2004Kompletní pitva by měla být provedena u všech zvířat, včetně těch, která zemřela během pokusu nebo byla utracena, protože byla nemocná. Všechny viditelné tumory nebo léze, nebo léze které by mohly být tumory, je třeba uchovat.
      účinné od 1. 8. 2004Následující orgány a tkáně by měly být uchovány ve vhodných médiích pro možné budoucí histopatologické vyšetření: mozek (včetně řezů prodloužené míchy/mostu, mozečkové kory, kory mozkové), podvěsek mozkový, štítná žláza a příštítná tělíska, tkáň thymu, trachea a plíce, srdce, aorta, slinné žlázy, játra, slezina, ledviny, nadledviny, pankreas, gonády, děloha, akcesorní pohlavní orgány, kůže, jícen, žaludek, dvanácterník, jejunum, ileum, slepé střevo, tračník, konečník, močový měchýř, representativní lymfatická uzlina, samičí mléčná žláza, svalovina stehna, periferní nerv, sternum s kostní dření, stehenní kost včetně kloubu, mícha na třech úrovních (krční, střední hrudní a bederní) a oči.
      účinné od 1. 8. 2004Naplnění plic a močového měchýře fixativem je optimální způsob uchování těchto tkání. Naplnění plic v inhalačních studiích je zásadní pro odpovídající histopatologické vyšetření. V inhalačních studiích by měl být uchován celý respirační trakt včetně nosní dutiny, hltanu a hrtanu.
    1. účinné od 1. 8. 20041.5.2.3 Histopatologické vyšetření
      účinné od 1. 8. 2004(a) Úplná histopatologie se provede v orgánech a tkáních všech zvířat, která uhynula nebo byla utracena během testu a u všech zvířat skupiny kontrolní a s nejvyšší dávkou.
      účinné od 1. 8. 2004(b) Všechny tumory viditelné okem a léze, které jsou podezřelé jako tumory, se vyšetří mikroskopicky u všech skupin.
      účinné od 1. 8. 2004(c) Je-li významný rozdíl v incidenci neoplastických lézí mezi skupinou s vysokou dávkou a kontrolní skupinou, histopatologické vyšetření se provede v daném orgánu či tkáni i v dalších skupinách.
      účinné od 1. 8. 2004(d) Je-li přežití ve skupině s vysokou dávkou podstatně nižší než u kontrol, měla by být kompletně zkoumána i skupina s nejbližší nižší dávkou.
      účinné od 1. 8. 2004(e) Je-li ve skupině s vysokou dávkou doklad o vyvolání toxických nebo jiných účinků, které by mohly ovlivnit neoplastickou odpověď, je třeba kompletně vyšetřit nejblíže nižší dávkovou úroveň.

účinné od 1. 8. 20042 ÚDAJE
účinné od 1. 8. 2004Údaje se sumarizují ve formě tabulek, ukazujících pro každou testovanou skupinu počet zvířat na začátku testu, počet zvířat vykazujících tumory zjištěné během testu, doba jejich stanovení a počet zvířat s tumory při utracení. Výsledky se hodnotí odpovídající statistickou metodou. Mohou být použity jakékoliv uznávané statistické metody.

účinné od 1. 8. 20043 PROJEKT POKUSU, PROTOKOL POKUSU A ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA
účinné od 1. 8. 2004V souladu s příslušnými právními předpisy⁹) musí být zpracován projekt pokusu a o průběhu pokusu je nutno vést protokol.
1. účinné od 1. 8. 2004Zpráva o testu bude obsahovat následující informace:
  1. účinné od 1. 8. 2004- živočišný druh, kmen, zdroj, podmínky ustájení, dieta,
  2. účinné od 1. 8. 2004- podmínky testu:
    1. účinné od 1. 8. 2004Popis expozičního zařízení:
      1. účinné od 1. 8. 2004včetně konstrukce, typu, rozměrů, zdroje vzduchu, systému pro vytváření částic a aerosolů, metody klimatizace, zneškodňování vzduchu vycházejícího z aparatury a způsobu umístění zvířat v expozičním boxu, pokud se používá. Dále je třeba popsat zařízení pro měření teploty, vlhkosti, a tam, kde je to žádoucí, stability koncentrace nebo velikosti částic aerosolu. Údaje o expozici: ve formě tabulky včetně průměrných hodnot a variability (např. směrodatná odchylka) a měly by zahrnovat:
        účinné od 1. 8. 2004(a) rychlost průtoku vzduchu v inhalačním zařízení,
        účinné od 1. 8. 2004(b) teplotu a vlhkost vzduchu,
        účinné od 1. 8. 2004(c) nominální koncentraci (celkové množství testované látky vstupující do inhalační aparatury děleno objemem vzduchu),
        účinné od 1. 8. 2004(d) povahu vehikula, je-li použito,
        účinné od 1. 8. 2004(e) skutečné koncentrace v dýchací zóně,
        účinné od 1. 8. 2004(f) medián velikosti částic (tam kde je relevantní),
  1. účinné od 1. 8. 2004- dávkové úrovně (včetně vehikula, je-li užito) a koncentrace,
  2. účinné od 1. 8. 2004- incidence tumorů podle pohlaví, dávky a typu tumoru,
  3. účinné od 1. 8. 2004- doba úmrtí během studie nebo zda zvířata přežila až do konce,
  4. účinné od 1. 8. 2004- výskyt toxických účinků podle pohlaví a dávky,
  5. účinné od 1. 8. 2004- popis toxických a jiných účinků,
  6. účinné od 1. 8. 2004- doba, kdy byl pozorován jakýkoliv abnormální příznak a jeho další vývoj,
  7. účinné od 1. 8. 2004- data o spotřebě potravy a tělesné hmotnosti,
  8. účinné od 1. 8. 2004- použité hematologické testy a výsledky,
  9. účinné od 1. 8. 2004- nálezy patologicko-anatomické,
  10. účinné od 1. 8. 2004- detailní popis všech histopatologických nálezů,
  11. účinné od 1. 8. 2004- statistické zpracování výsledků s popisem použitých metod.
účinné od 1. 8. 2004Diskuse výsledků.
účinné od 1. 8. 2004Závěry.

účinné od 1. 8. 2004B.33 KOMBINOVANÝ TEST CHRONICKÉ TOXICITY/KARCINOGENITY

účinné od 1. 8. 20041 METODA je v souladu s právem Evropských společenství.¹)
1. účinné od 1. 8. 20041.1 Princip testu
  účinné od 1. 8. 2004Cílem kombinovaného testu chronické toxicity/karcinogenity je určit chronické a karcinogenní účinky látky u některého druhu savců po dlouhodobé expozici.
  účinné od 1. 8. 2004Pro tento účel je test karcinogenity doplněn alespoň jednou exponovanou satelitní skupinou a kontrolní satelitní skupinou. Dávka použitá pro tuto satelitní skupinu může být vyšší než nejvyšší dávka použitá při testu karcinogenity. Zvířata v testu karcinogenity jsou zkoumána jak na obecnou toxicitu, tak na karcinogenní odpověď. Zvířata v exponované satelitní skupině jsou testována na obecnou toxicitu.
  účinné od 1. 8. 2004Testovaná látka se podává obvykle 7 dnů v týdnu, vhodnou cestou, několika skupinám pokusných zvířat, 1 dávka na skupinu, po větší část života zvířat. Během a po expozici testované látce jsou zvířata denně pozorována za účelem sledování projevů toxicity a vývoje tumorů.
1. účinné od 1. 8. 20041.2 Popis metody
  účinné od 1. 8. 2004Pokusná zvířata jsou vybrána s ohledem na druh, pohlaví, a stáří v souladu s ustanovením § 15 zvláštního právního předpisu¹⁰) a označena tak, aby byla možná identifikace jednotlivých zvířat. Dobu navykání stanoví § 10 zvláštního právního předpisu.¹⁰) Před testem se mladá zdravá zvířata náhodně rozdělí do kontrolních a exponovaných skupin.
  1. účinné od 1. 8. 20041.2.1 Experimentální zvířata
    účinné od 1. 8. 2004Preferovaným druhem je potkan. Na základě předchozích studií je možno použít i jiné druhy (hlodavce i nehlodavce). Používají se zdravá mladá zvířata z běžně chovaných kmenů laboratorních zvířat. Expozice by měla být započata co nejdříve po odstavení mláďat. Na začátku studie by neměl rozdíl v hmotnosti zvířat činit více než ± 20% od průměru. V případě, že vlastní studii předchází test subchronické orální toxicity, je třeba použít stejný druh a kmen v obou studiích.
  1. účinné od 1. 8. 20041.2.2 Počet a pohlaví
    účinné od 1. 8. 2004Pro hlodavce se použije nejméně 100 zvířat (50 samic a 50 samců) na každou úroveň dávky a souběžná kontrolní skupina. Samice by měly být nullipary a negravidní. Je-li plánováno průběžné utrácení zvířat, počty se zvýší o počet zvířat, která budou takto utracena před koncem studie.
    účinné od 1. 8. 2004Exponovaná satelitní skupina (skupiny) pro hodnocení patologie jiné než jsou tumory by každá měla obsahovat 20 zvířat pro každé pohlaví, zatímco satelitní skupina kontrol by měla obsahovat 10 zvířat každého pohlaví.
  1. účinné od 1. 8. 20041.2.3 Dávkové úrovně a frekvence expozic
    účinné od 1. 8. 2004Pro test karcinogenity se zvolí přinejmenším 3 dávkové úrovně kromě souběžné kontrolní skupiny. Nejvyšší dávková úroveň by měla vyvolat příznaky minimální toxicity, jako je mírný pokles váhových přírůstků (méně než 10%), bez podstatnějších změn normální doby dožití daných jinými účinky než tumory. Nejnižší dávková úroveň by neměla interferovat s normálním růstem, vývojem a délkou života zvířete nebo vyvolat jakékoli známky toxicity. Obecně by neměla být nižší než 10% vysoké dávky. Střední dávku/dávky je třeba stanovit ve středním pásmu mezi vysokou a nízkou dávkou.
    účinné od 1. 8. 2004Při volbě dávkových úrovní by se měly vzít v úvahu předchozí testy a studie toxicity.
    účinné od 1. 8. 2004Pro účely testování chronické toxicity jsou v testu zahrnuty satelitní exponované skupiny a souběžná kontrolní satelitní skupina. Vysoká dávka pro exponovaná satelitní zvířata by měla vyvolat zřetelné příznaky toxicity.
    účinné od 1. 8. 2004Expozice se provádí obvykle denně. Je-li látka podávána v pitné vodě nebo přimíšena do potravy, měla by být stále k disposici.
  1. účinné od 1. 8. 20041.2.4 Kontroly
    účinné od 1. 8. 2004Souběžná kontrolní skupina je identická v každém ohledu s exponovanou skupinou, vyjma expozice testované látce.
    účinné od 1. 8. 2004Ve zvláštních případech, jako jsou inhalační studie s aerosoly nebo použije-li se pro orální aplikaci emulgátoru, jehož biologická aktivita není charakterizována, zařadí se další negativní kontrolní skupina, která není exponována ani vehikulu.
  1. účinné od 1. 8. 20041.2.5 Způsob aplikace
    účinné od 1. 8. 2004Tři hlavní cesty aplikace jsou orální, dermální a inhalační. Volba způsobu podání závisí na fyzikálních a chemických charakteristikách testované látky a pravděpodobnému způsobu expozice u člověka.
    1. účinné od 1. 8. 20041.2.5.1 Orální studie
      účinné od 1. 8. 2004Tam, kde se testovaná látka vstřebává z gastrointestinálního traktu a je-li požití jedna z cest, jimiž může být exponován člověk, dává se přednost orální aplikaci, pokud nejsou proti tomu nějaké důvody. Zvířata mohou dostat testovanou látku v potravě, rozpuštěnu v pitné vodě nebo podanou v tobolce.
      účinné od 1. 8. 2004Ideálně by se měla látka podávat 7 dnů v týdnu, protože dávkování 5 dnů v týdnu může vést k vymizení toxicity nebo naopak vyvolat „abstinenční“ příznaky v období bez aplikace, a tudíž ovlivnit výsledky a následné hodnocení. Nicméně, především s ohledem na praktické aspekty, dávkování pětkrát týdně je považováno za přijatelné.
    1. účinné od 1. 8. 20041.2.5.2 Dermální studie
      účinné od 1. 8. 2004Aplikace přímo na kůži může být zvolena jako simulace hlavní cesty vstupu u člověka a jako modelový způsob vyvolání kožního poškození.
    1. účinné od 1. 8. 20041.2.5.3 Inhalační studie
      účinné od 1. 8. 2004Protože inhalační studie jsou technicky komplikovanější než jiné způsoby aplikace, jsou zde uvedeny podrobněji informace o této cestě podání. Intratracheální instilace může být platnou alternativou v specifických situacích.
      účinné od 1. 8. 2004Dlouhodobé expozice obvykle napodobují předpokládané lidské expozice, takže zvíře je obvykle exponováno po ustálení koncentrace 6 hodin denně po 5 dnů v týdnu (přerušovaná expozice), nebo v návaznosti na možnou expozici v prostředí, 22-24 hodin denně po 7 dnů v týdnu (kontinuální expozice), s přibližně jednou hodinou pro krmení zvířat denně ve stejnou dobu dne, použitou i pro čištění expozičního boxu. V obou případech jsou zvířata obvykle exponována fixním koncentracím testované látky. Hlavní rozdíl mezi přerušovanou a stálou expozicí je v tom, že v první má zvíře 17-18 hodin na ústup účinků denní expozice s ještě delším obdobím během víkendu.
      účinné od 1. 8. 2004Volba přerušované nebo kontinuální expozice závisí na cílech studie a na lidské expozici, která má být simulována. Nicméně, je třeba vzít v úvahu určité technické obtíže. Na příklad, výhody kontinuální expozice pro simulaci podmínek zevního prostředí mohou být narušeny nutností pití a krmení během expozice a potřebou komplikovanější (a spolehlivé) generace aerosolu nebo určité koncentrace par a technik monitorování.
      účinné od 1. 8. 2004Expoziční komory
      účinné od 1. 8. 2004Zvířata se exponují v inhalačních komorách, jejichž konstrukce zaručuje dynamický proud pro nejméně 12 výměn vzduchu za hodinu, aby byl zajištěn dostatečný přísunu kyslíku a rovnoměrná distribuce expoziční atmosféry. Kontrolní a expoziční komory by měly mít identickou konstrukci, tak aby byly expoziční podmínky srovnatelné ve všech aspektech vyjma expozice testované látce. Uvnitř komory se obvykle udržuje mírný podtlak a tím se brání úniku testované látky do okolního prostředí. Komory by měly minimalizovat shlukování testovaných zvířat. Obecně by v zájmu udržení stabilní atmosféry v komoře objem zvířat neměl přesáhnou 5 % objemu komory.
      1. účinné od 1. 8. 2004Měření nebo monitorování zahrnuje:
        účinné od 1. 8. 2004(a) průtok vzduchu: rychlost průtoku vzduchu komorou by měla být nejlépe kontrolována kontinuálně,
        účinné od 1. 8. 2004(b) koncentrace: během denní expozice by koncentrace testované látky neměla kolísat více než ±15% střední hodnoty,
        účinné od 1. 8. 2004(c) teplota a vlhkost: pro hlodavce, teplota by měla být udržována v rozmezí 22 ± 2 °C a vlhkost v komorách 30 - 70 % vyjma případů, kdy je voda používána k rozptýlení testované látky v atmosféře komory. Oba parametry by měly být kontrolovány průběžně,
        účinné od 1. 8. 2004(d) měření velikosti částic: měla by být stanovena distribuce velikosti částic v atmosféře komor u tekutých nebo pevných aerosolů. Aerosolové částice by měly být v respirabilní velikosti pro použité testovací zvíře. Vzorky atmosféry komor se odebírají z dýchací zóny zvířat. Vzorek vzduchu by měl být representativní pro distribuci částic, kterým je zvíře exponováno, a měl by gravimetricky odpovídat celému suspendovanému aerosolu, i když značná část aerosolu není respirabilní. Analýza velikosti částic by měla být prováděna často během vývoje generujícího systému, aby zajistila stabilitu aerosolu, a poté během expozic tak často, aby bylo možno posoudit stabilitu distribuce částic, kterým jsou zvířata exponována.
  1. účinné od 1. 8. 20041.2.6 Trvání studie
    účinné od 1. 8. 2004Trvání testu karcinogenity zahrnuje větší část normální doby života zvířete použitého pro test. Test by měl být ukončen v 18 měsících u myší a křečků a 24 měsících u potkanů. Nicméně, pro některé kmeny zvířat s delší dobou života, respektive s nízkým spontánním výskytem tumorů, by doba ukončení experimentu měla být za 24 měsíců pro myši a křečky a za 30 měsíců pro potkany. Alternativně, ukončení takové prodloužené studie je přijatelné, když počet přežívajících u nejnižší dávky nebo v kontrolní skupině klesne na 25 %. Při ukončení testu, ve kterém je zřetelný sexuální rozdíl odpovědi, každé pohlaví se posuzuje zvlášť. Tam, kde uhyne předčasně jen skupina s vysokou dávkou ze zjevných toxických příčin, nemusí to nutně vést k ukončení celého testu, pokud ostatní skupiny nevykazují toxické projevy, které by činily problémy. Aby bylo možno uznat negativní výsledek testu, nesmí být ztráty použitelných údajů (autolýzou, kanibalismem nebo v důsledku chyb obsluhy) v žádné skupině větší než 10% a přežití ve všech skupinách nesmí být nižší než 50% v 18 měsících u myší a křečků a v 24 měsících u potkanů.
    účinné od 1. 8. 2004Satelitní skupiny 20 dávkovaných zvířat pro každé pohlaví a 10 připojených kontrolních zvířat každého pohlaví použitých pro testování chronické toxicity by měly být v pokusu aspoň 12 měsíců. U těchto zvířat by mělo být plánováno utracení tak, aby umožnilo odlišení patologie, která má vztah k testované látce, od komplikujících projevů stárnutí.
1. účinné od 1. 8. 20041.3 Popis postupu
  1. účinné od 1. 8. 20041.3.1 Pozorování
    účinné od 1. 8. 2004Denní pozorování zvířat v klecích zahrnuje změny kůže a srsti, očí a sliznic, jakož i dýchacího, oběhového, autonomního a centrálního nervového systému, somatomotorické aktivity a chování.
    účinné od 1. 8. 2004U zvířat exponované satelitní skupiny (skupin) se provádí v přiměřených intervalech klinické vyšetření.
    účinné od 1. 8. 2004Pravidelná kontrola zvířat je nutná, aby se zabránilo ztrátám zvířat ze studie např. v důsledku kanibalismu, autolýzy tkání nebo chyb v obsluze. Zvířata v agónii by měla být utracena a pitvána.
    účinné od 1. 8. 2004Klinické příznaky včetně neurologických a očních nálezů a mortalita se zaznamenávají u všech zvířat. Zvláštní pozornost je třeba věnovat vývoji tumorů: doba objevení, lokalizace, rozměry, vzhled a progrese každého viditelného či hmatného tumoru se zaznamenává.
    účinné od 1. 8. 2004Je třeba provádět měření spotřeby potravy (a vody tam, kde je testovaná látka podávána v pitné vodě) týdně během prvních 13 týdnů a pak přibližně ve tříměsíčních intervalech, ledaže by zdravotní stav nebo změny tělesné hmotnosti ukázaly nutnost jiné frekvence sledování.
    účinné od 1. 8. 2004Tělesné hmotnosti se zaznamenávají individuálně u všech zvířat jednou týdně během prvních 13 týdnů období testu a aspoň jednou za čtyři týdny po tomto období.
  1. účinné od 1. 8. 20041.3.2 Klinická vyšetření
    1. účinné od 1. 8. 20041.3.2.1 Hematologie
      účinné od 1. 8. 2004Hematologická vyšetření (např.obsah hemoglobinu, hematokrit, celkový počet erytrocytů, celkový počet bílých krvinek, krevních destiček, nebo další měření srážlivosti) by měla být prováděna za 3 měsíce, 6 měsíců a poté v přibližně šestiměsíčních intervalech, a na konci na vzorcích krve od 10 potkanů na pohlaví z každé skupiny. Tam kde je to možné, vzorky ve všech intervalech by měly být od týchž potkanů.
      účinné od 1. 8. 2004Pokud pozorování zvířat v klecích svědčí o zhoršeném zdravotním stavu zvířat během studia, je třeba vyšetřit diferenciální obraz bílých krvinek.
      účinné od 1. 8. 2004Diferenciální obraz bílých krvinek se provede ve vzorcích ze zvířat ve skupině s nejvyšší dávkou a u kontrol. Pokud tato data, nebo údaje z vyšetření patologických změn naznačí nutnost, diferenciál se vyšetří i u skupiny s dávkou nejblíže nižší, než je vysoká dávka.
    1. účinné od 1. 8. 20041.3.2.2 Analýza moči
      1. účinné od 1. 8. 2004Vzorky moči od 10 potkanů od každého pohlaví se sbírají pro analýzu od stejných zvířat a ve stejných intervalech jako hematologické zkoušky. Následující stanovení jsou provedena buď na vzorcích jednotlivých zvířat nebo na směsném vzorku pro skupiny podle dávek a pohlaví:
        účinné od 1. 8. 2004- vzhled moči, objem a hustota u jednotlivých zvířat,
        účinné od 1. 8. 2004- proteiny, glukosa, ketolátky, okultní krvácení (semi-kvantitativně),
        účinné od 1. 8. 2004- mikroskopické vyšetření sedimentu (semi-kvantitativně).
    1. účinné od 1. 8. 20041.3.2.3 Biochemické vyšetření
      1. účinné od 1. 8. 2004V přibližně šestiměsíčních intervalech a na závěr jsou odebrány krevní vzorky pro biochemická měření od všech nehlodavců a 10 potkanů obojího pohlaví, pokud možno pro tytéž potkany ve všech intervalech. Od nehlodavců se vedle toho odeberou vzorky před testem. Z těchto vzorků je připravena plasma a jsou provedeny následující zkoušky:
        účinné od 1. 8. 2004- celková koncentrace proteinů,
        účinné od 1. 8. 2004- koncentrace albuminu,
        účinné od 1. 8. 2004- testy na funkci jater (např. aktivita bazické fosfatázy, aktivita glutamát pyruvát transaminázy (nyní známá jako sérová alanin aminotransferáza), glutamát acetát transaminázy (nyní známá jako sérová aspartát aminotransferáza), gama glutamyl transpeptidázy, ornithin dekarboxylázy,
        účinné od 1. 8. 2004- metabolismus cukrů, např. krevní glukosa nalačno,
        účinné od 1. 8. 2004- test na funkci ledvin, např. dusík močoviny v krvi.
    1. účinné od 1. 8. 20041.3.2.4 Makroskopické patologické vyšetření
      účinné od 1. 8. 2004Kompletní pitva se provede u všech zvířat, včetně těch, která zemřela během pokusu nebo byla utracena v agónii. Před utracením se odeberou vzorky krve všech zvířat pro diferenciální obraz bílých krvinek. Všechny viditelné léze, tumory nebo léze, nebo léze které by mohly být tumory, je třeba uchovat. Mělo by být provedeno porovnání anatomicko-patologických změn s mikroskopickými nálezy.
      účinné od 1. 8. 2004Orgány a tkáně se uchovávají pro histopatologické vyšetření. Obvykle se jedná o následující orgány a tkáně: mozek (prodloužené míchy/mostu, mozečkové kory, kory mozkové), podvěsek mozkový, štítnou žlázu a příštítná tělíska, thymus, trachea a plíce, srdce, aortu, slinnou žlázu, jatra, slezinu, ledviny, nadledviny, jícen, žaludek, dvanácterník, jejunum, ileum, slepé střevo, tračník, konečník, močový měchýř, lymfatické uzliny, slinivku, gonády, akcesorní pohlavních orgány, samičí mléčné žlázy, kůži, svalovinu, periferní nervy, míchu (krční, hrudní a bederní), sternum s kostní dření, stehenní kost včetně kloubů, a oči. Naplnění plic a močového měchýře fixativem je optimální cestou ke konzervaci těchto tkání; naplnění plic v inhalačních studiích je zásadní pro odpovídající histopatologické zkoumání. Ve speciálních studiích, jako jsou inhalační studie, má být studován celý respirační trakt včetně nosu, hltanu a hrtanu.
    2. účinné od 1. 8. 2004Poznámka: štítná žláza s příštitnými tělísky ze všech nehlodavců musí být zvážena stejně jako mozek, játra, ledviny, nadledviny a gonády z 10 zvířat na pohlaví a na skupinu u hlodavců a ze všech nehlodavců.
    1. účinné od 1. 8. 20041.3.2.5 Histopatologie
      1. účinné od 1. 8. 2004Pro testování chronické toxicity:
        účinné od 1. 8. 2004Podrobné vyšetření se provede ve všech uchovaných orgánech všech zvířat satelitní skupiny s vysokou dávkou a satelitní kontrolní skupiny. Pokud se v satelitní skupině exponované nejvyšší dávce najdou patologické změny způsobené látkou, vyšetří se histologicky cílové orgány všech ostatních zvířat z ostatních exponovaných satelitních skupin i ze všech exponovaných skupin části studie věnované karcinogenitě při jejím ukončení.
      1. účinné od 1. 8. 2004Pro testování karcinogenity:
        účinné od 1. 8. 2004(a) úplná histopatologie se provede v orgánech a tkáních všech zvířat, která uhynula nebo byla utracena během testu a u všech zvířat skupiny kontrolní a s nejvyšší dávkou;
        účinné od 1. 8. 2004(b) všechny tumory viditelné okem a léze, které jsou podezřelé jako tumory, se vyšetří mikroskopicky u všech skupin;
        účinné od 1. 8. 2004(c) je-li významný rozdíl v incidenci neoplastických lézí mezi skupinou s vysokou dávkou a kontrolní skupinou, histopatologické vyšetření se provede v daném orgánu či tkáni i v dalších skupinách;
        účinné od 1. 8. 2004(d) je-li přežití ve skupině s vysokou dávkou podstatně nižší než u kontrol, měla by být kompletně zkoumána i skupina s nejbližší nižší dávkou;
        účinné od 1. 8. 2004(e) je-li ve skupině s vysokou dávkou doklad o vyvolání toxických nebo jiných účinků, které by mohly ovlivnit neoplastickou odpověď, je třeba kompletně vyšetřit nejblíže nižší dávkovou úroveň.

účinné od 1. 8. 20042 ÚDAJE
účinné od 1. 8. 2004Údaje se sumarizují ve formě tabulek, ukazujících pro každou testovanou skupinu počet zvířat na začátku testu, počet zvířat ukazujících tumory zjištěné během testu, dobu jejich stanovení a počet zvířat s tumory při utracení. Výsledky se hodnotí odpovídající statistickou metodou. Mohou být použity jakékoliv uznávané statistické metody.

účinné od 1. 8. 20043 PROJEKT POKUSU, PROTOKOL POKUSU A ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA
účinné od 1. 8. 2004V souladu se s příslušnými právními předpisy⁹) musí být zpracován projekt pokusu a o průběhu pokusu je nutno vést protokol.
1. účinné od 1. 8. 2004Zpráva o testu musí obsahovat následující informace:
  1. účinné od 1. 8. 2004- živočišný druh, kmen, zdroj, podmínky ustájení, dieta,
  2. účinné od 1. 8. 2004- podmínky testu:
    1. účinné od 1. 8. 2004popis expozičního zařízení:
      1. účinné od 1. 8. 2004včetně konstrukce, typu, rozměrů, zdroje vzduchu, systému pro vytváření částic a aerosolů, metody klimatizace, zneškodňování vzduchu vycházejícího z aparatury a způsobu umístění zvířat v expozičním boxu pokud se používá. Dále je třeba popsat zařízení pro měření teploty, vlhkosti, a tam, kde je to žádoucí, stability koncentrace nebo velikosti částic aerosolu.
    1. účinné od 1. 8. 2004Údaje o expozici: ve formě tabulky včetně průměrných hodnot a variability (např. směrodatná odchylka) by měly zahrnovat:
      účinné od 1. 8. 2004(a) rychlost proudu vzduchu v inhalačním zařízení,
      účinné od 1. 8. 2004(b) teplotu a vlhkost vzduchu,
      účinné od 1. 8. 2004(c) nominální koncentraci (celkové množství testované látky vstupující do inhalační aparatury děleno objemem vzduchu),
      účinné od 1. 8. 2004(e) povahu vehikula, je-li použito,
      účinné od 1. 8. 2004(f) skutečné koncentrace v dýchací zóně,
      účinné od 1. 8. 2004(g) medián velikosti částic (tam kde relevantní),
    1. účinné od 1. 8. 2004- dávkové úrovně (včetně vehikula, je-li užito) a koncentrace,
    2. účinné od 1. 8. 2004- data incidence tumorů podle pohlaví, dávky a typu tumoru,
    3. účinné od 1. 8. 2004- doba úmrtí během studie nebo zda zvířata přežila až do konce, včetně satelitních skupin,
    4. účinné od 1. 8. 2004- výskyt toxických účinků podle pohlaví a dávky
    5. účinné od 1. 8. 2004- popis toxických a jiných účinků,
    6. účinné od 1. 8. 2004- doba, kdy byl pozorován jakýkoliv abnormální příznak a jeho další vývoj,
    7. účinné od 1. 8. 2004- data o spotřebě potravy a tělesné hmotnosti,
    8. účinné od 1. 8. 2004- oftalmologické nálezy,
    9. účinné od 1. 8. 2004- použité hematologické testy a výsledky,
    10. účinné od 1. 8. 2004- testy klinické biochemie a všechny výsledky (včetně výsledků analýzy moči),
    11. účinné od 1. 8. 2004- nálezy patologicko-anatomické,
    12. účinné od 1. 8. 2004- detailní popis všech histopatologických nálezů,
    13. účinné od 1. 8. 2004- statistické zpracování výsledků s popisem použitých metod.
účinné od 1. 8. 2004Diskuse výsledků.
účinné od 1. 8. 2004Závěry.

účinné od 1. 8. 2004B.34 REPRODUKČNÍ TOXICITA - JEDNOGENERAČNÍ TEST

účinné od 1. 8. 20041 METODA je v souladu s právem Evropských společenství.¹)
1. účinné od 1. 8. 20041.1 Princip testovací metody
  účinné od 1. 8. 2004Testovaná látka se podává několika skupinám samic a samců v odstupňovaných dávkách.
  účinné od 1. 8. 2004Samci dostávají testovanou látku v době růstu a alespoň v průběhu jednoho úplného spermatogenního cyklu (přibližně 56 dnů u myší a 70 dnů u potkanů), aby byl zachycen jakýkoliv nepříznivý účinek testované látky na spermatogenezu.
  účinné od 1. 8. 2004Samice rodičovské generace (P) dostávají látku po dobu alespoň 2 estrálních cyklů, aby byl zachycen jakýkoliv nepříznivý účinek testované látky na estrus. Zvířata jsou poté připuštěna. V době připouštění se testovaná látka podává zvířatům obou pohlaví, v době gravidity a kojení pouze samicím.
  účinné od 1. 8. 2004Pro inhalační aplikaci je třeba metodu modifikovat.
1. účinné od 1. 8. 20041.2 Popis testovací metody
  1. účinné od 1. 8. 20041.2.1 Příprava
    účinné od 1. 8. 2004Pokusná zvířata jsou vybrána s ohledem na druh, pohlaví, a stáří v souladu s ustanovením § 15 zvláštního právního předpisu¹⁰) a označena tak, aby byla možná identifikace jednotlivých zvířat. Dobu navykání stanoví § 10 zvláštního právního předpisu.¹⁰) Před zahájením testu se zdravá mladá dospělá zvířata náhodně rozdělí do kontrolní a exponovaných skupin.
    účinné od 1. 8. 2004Doporučuje se testovanou látku podávat v potravě nebo v pitné vodě. Jiné způsoby podání jsou také přijatelné. Všechna zvířata látku dostávají stejným způsobem v průběhu celého testu. Pokud se používá k usnadnění aplikace vehikulum nebo jiné aditivum, musí být o nich známo, že nemají toxické účinky. Látka se aplikuje 7 dnů v týdnu.
  1. účinné od 1. 8. 20041.2.2 Pokusná zvířata
    1. účinné od 1. 8. 20041.2.2.1 Výběr druhu
      účinné od 1. 8. 2004Dává se přednost potkanům nebo myším. Používají se zdravá zvířata, do té doby nepoužitá pro jiné experimenty. Nepoužívá se kmenů s nízkou plodností. Musí být plně charakterizována co do druhu, kmene, pohlaví a hmotnosti a/nebo věku. Plodnost musí být ověřena vhodným způsobem u obou pohlaví. Zvířata v obou skupinách, exponované a kontrolní, musí být odstavena před zahájením aplikace.
    1. účinné od 1. 8. 20041.2.2.2 Počet a pohlaví
      účinné od 1. 8. 2004Každá exponovaná i kontrolní skupina musí mít dostatečný počet zvířat, aby bylo zaručeno cca 20 březích samic s přibližně stejným termínem porodu. Cílem je získat dostatečný počet těhotenství a potomstva, a tím zajistit spolehlivé hodnocení vlivu látky na plodnost, průběh gravidity a mateřské chování v P generaci, kojení, růst a vývoj potomstva generace F₁ od početí do odstavu.
  1. účinné od 1. 8. 20041.2.3 Podmínky testu
    účinné od 1. 8. 2004Vodu a potravu dostávají zvířata ad libitum. Před porodem se těhotné samice přemístí do zvláštních porodních nebo mateřských klecí a je jim poskytnut materiál pro vytvoření hnízda.
  1. účinné od 1. 8. 20041.2.4 Dávkování
    účinné od 1. 8. 2004Použijí se alespoň 3 exponované skupiny a 1 kontrolní. Pokud se používá pro aplikaci testované látky vehikulum, pak zvířata kontrolní skupiny dostávají vehikulum v nejvyšším použitém objemu. Pokud testovaná látka snižuje příjem a využití potravy, je třeba uvážit použití další kontrolní skupiny, spárované co do výživy.
    účinné od 1. 8. 2004Testovaná látka v nejvyšší koncentraci má v ideálním případě - pokud to není omezeno jejími fyzikálně-chemickými vlastnostmi nebo povahou biologického účinku - vyvolávat toxicitu, ale žádná uhynutí v rodičovské populaci. Střední dávka(y) by měla(y) vyvolat minimální toxické účinky, které by se daly připsat testované látce, a nejnižší dávka by neměla vyvolávat žádné pozorovatelné nepříznivé účinky, ani u rodičů ani u potomstva.
    účinné od 1. 8. 2004Při podání sondou nebo v tobolkách se dávka stanoví individuálně na základě hmotnosti zvířete a přizpůsobuje se každý týden podle změny váhy. V případě těhotných samic dávky mohou být případně určeny na základě tělesné hmotnosti v nultém nebo šestém dnu od začátku těhotenství.
  1. účinné od 1. 8. 20041.2.5 Limitní test
    účinné od 1. 8. 2004V případě látek s nízkou toxicitou, pokud se ani dávka 1000 mg.kg^-1 neprojevuje žádným toxickým účinkem na reprodukci, nemusí se provádět studie na jiných dávkových úrovních. Pokud předběžná studie ukáže, že vysoká dávka, vyvolávající u matek jasné příznaky toxicity, nemá nepříznivé účinky na plodnost, není nutné provádět studie na jiných dávkových úrovních.
1. účinné od 1. 8. 20041.3 Popis postupu
  1. účinné od 1. 8. 20041.3.1 Plán pokusu
    účinné od 1. 8. 2004Denní aplikace samcům rodičovské generace (P) začne ve věku 5 až 9 týdnů, po nejméně pětidenní aklimatizaci po odstavení. U potkanů aplikace pokračuje 10 týdnů před obdobím připouštění (8 týdnů pro myši). Samci se buď utratí a vyšetří na konci období připouštění, nebo se pokračuje v aplikaci a mohou být použiti pro produkci dalších vrhů a jsou pak utraceni a vyšetřeni někdy před koncem pokusu.
    účinné od 1. 8. 2004Denní aplikace samicím rodičovské generace (P) začne po pětidenní aklimatizaci a pokračuje aspoň 2 týdny před obdobím připouštění. Denní aplikace pokračuje pak po celé 3 týdny období připouštění, v době gravidity až do odstavení F₁ generace. Je přípustná změna dávkovacího plánu podle znalostí o vlastnostech studované látky, např. o indukci metabolismu a/nebo bioakumulaci.
  1. účinné od 1. 8. 20041.3.2 Postup při připouštění
    účinné od 1. 8. 2004Je možno použít párování 1:1 (jedna samice a jeden samec) anebo 1:2 (jeden samec ke dvěma samicím).
    účinné od 1. 8. 2004V případě 1:1 párovaní, samice se ponechá s týmž samcem ve společné kleci do otěhotnění anebo po dobu 3 týdnů. Každé ráno jsou samice vyšetřeny na přítomnost spermatu nebo vaginální zátky. Den 0 těhotenství je definován jako den nálezu vaginální zátky nebo spermatu.
    účinné od 1. 8. 2004Dvojice, u kterých nedojde k oplodnění, je třeba vyšetřit s cílem zjistit důvod neplodnosti páru. To je možné buď poskytnutím další příležitosti k oplodnění s osvědčenými jedinci obou pohlaví nebo mikroskopickým vyšetřením reprodukčních orgánů nebo vyšetřením estrálního cyklu a spermatogenezy.
  1. účinné od 1. 8. 20041.3.3 Velikost vrhů
    účinné od 1. 8. 2004Zvířatům použitým pro vyšetření plodnosti je ponechána možnost porodit normálně a pečovat o své potomstvo do okamžiku odstavení bez standardizace velikosti vrhů. Pokud se velikost vrhů standardizuje, je třeba dodržet následující postup: mezi 1. a 4. dnem po porodu se velikost všech vrhů upraví vyřazením nadbytečných jedinců tak, aby se dosáhlo počtu 4 samců a 4 samic na vrh; pokud to není proveditelné, je možno standardizovat na jiné počty, například 5 samců a 3 samice. Vrhy menší než 8 nelze standardizovat.
  1. účinné od 1. 8. 20041.3.4 Pozorování
    účinné od 1. 8. 2004Každé zvíře musí být pozorováno alespoň jednou za den. Významné změny chování, příznaky ztíženého nebo prodlouženého porodu, a všechny příznaky toxicity, včetně mortality, se zaznamenávají. Příjem potravy se měří denně jak před tak během doby připouštění. Během gravidity je vhodné kontrolovat příjem potravy denně. Po porodu a v průběhu laktace se měří příjem potravy (a vody, pokud se látka podává v pitné vodě) ve stejný den, kdy je potomstvo váženo. Rodičovská P zvířata se váží první den aplikace a pak týdně. Všechna pozorování se zaznamenávají individuálně pro každé dospělé zvíře.
    účinné od 1. 8. 2004Doba gestace se počítá od dne 0 těhotenství. Každý vrh se co nejdříve po porodu vyšetří a stanoví se počty a pohlaví mláďat, počet mrtvých a živých porodů a přítomnost hrubých anomálií.
    účinné od 1. 8. 2004Mrtvá mláďata a mláďata utracená ve čtvrtém dnu se uchovají pro vyšetření na možné defekty. Živá mláďata se spočítají a celé vrhy se zváží ráno po porodu, ve čtvrtém a sedmém dnu a potom každý týden do ukončení studie, kdy jsou zvířata zvážena individuálně. Pozorují se a zaznamenávají všechny abnormality v chování a fyzickém stavu matek a potomstva.
  1. účinné od 1. 8. 20041.3.5 Patologie
    1. účinné od 1. 8. 20041.3.5.1 Pitva
      účinné od 1. 8. 2004Po utracení nebo úmrtí se všechna zvířata generace P makroskopicky vyšetří na strukturní abnormality anebo patologické změny, se zvláštní pozorností k orgánům reprodukčního systému. Mláďata zemřelá nebo umírající se vyšetří na defekty.
    1. účinné od 1. 8. 20041.3.5.2 Histopatologická vyšetření
      účinné od 1. 8. 2004Vaječníky, děloha, děložní hrdlo, vagína, varlata, epididymis, semenné váčky, koagulační žláza, prostata, hypofysa a cílové orgány všech zvířat generace P se uchovají pro mikroskopické vyšetření. V případě, že tyto orgány nebyly doposud vyšetřeny v jiných mnohadávkových studiích, provede se mikroskopické vyšetření u všech zvířat kontrolní skupiny a skupiny dostávající nejvyšší dávku a dále u zvířat, která zemřela v průběhu pokusu.
      účinné od 1. 8. 2004Orgány, které jevily abnormality u těchto skupin zvířat, se vyšetří i u P zvířat ostatních dávkových skupin. V těchto případech se mikroskopicky vyšetřují všechny tkáně makroskopicky postižené. Jak již bylo uvedeno, reprodukční orgány zvířat podezřelých z neplodností se mají též podrobit mikroskopické analýze.

účinné od 1. 8. 20042 ÚDAJE
účinné od 1. 8. 2004Data se sumarizují v tabulkách, kde je uveden pro každou dávkovou skupinu počet zvířat na začátku pokusu, počet plodných samců, počet těhotných samic, typ změn a procento zvířat nesoucích tyto změny.
účinné od 1. 8. 2004Numerické výsledky se být statisticky zpracovávají příslušnou statistickou metodou. Může se použít kterákoliv obecně přijímaná statistická metoda.

účinné od 1. 8. 20043 PROJEKT POKUSU, PROTOKOL POKUSU A ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA
účinné od 1. 8. 2004V souladu s příslušnými právními předpisy⁹) musí být zpracován projekt pokusu a o průběhu pokusu je nutno vést protokol.
1. účinné od 1. 8. 2004Zpráva o experimentu by měla pokud možno obsahovat následující údaje:
  1. účinné od 1. 8. 2004- druh /kmen použitých zvířat,
  2. účinné od 1. 8. 2004- údaje o toxické odezvě v závislosti na dávce a pohlaví, včetně ukazatelů plodností, gestace a životaschopnosti,
  3. účinné od 1. 8. 2004- dobu uhynutí v průběhu studie nebo zda zvířata přežila do ukončení pokusu,
  4. účinné od 1. 8. 2004- tabulka uvádějící hmotnost každého vrhu, průměrnou hmotnost jednotlivých mláďat a konečnou individuální hmotnost potomků,
  5. účinné od 1. 8. 2004- toxické a další účinky na reprodukci, potomstvo a postnatální růst,
  6. účinné od 1. 8. 2004- den, kdy byly pozorovány jednotlivé abnormální příznaky a jejich další vývoj,
  7. účinné od 1. 8. 2004- tělesná hmotnost zvířat P generace,
  8. účinné od 1. 8. 2004- pitevní nálezy,
  9. účinné od 1. 8. 2004- detailní popis všech mikroskopických nálezů,
  10. účinné od 1. 8. 2004- statistické zpracování všech údajů, pokud je možné.
účinné od 1. 8. 2004Diskuse výsledků.
účinné od 1. 8. 2004Závěry.

účinné od 1. 8. 2004B.35 REPRODUKČNÍ TOXICITA - DVOUGENERAČNÍ TEST

účinné od 1. 8. 20041 METODA je v souladu s právem Evropských společenství.¹)
1. účinné od 1. 8. 20041.1 Princip testovací metody.
  účinné od 1. 8. 2004Testovaná látka se podává několika skupinám samic a samců v odstupňovaných dávkách.
  účinné od 1. 8. 2004Samci rodičovské (P) generace dostávají testovanou látku v době růstu a alespoň v průběhu jednoho spermatogenního cyklu (přibližně 56 dnů u myší a 70 dnů u potkanů), aby byl zachycen jakýkoliv nepříznivý účinek testované látky na spermatogenezu.
  účinné od 1. 8. 2004Samice rodičovské generace (P) dostávají látku po dobu alespoň dvou estrálních cyklů, aby byl zachycen jakýkoliv nepříznivý účinek testované látky na estrus.
  účinné od 1. 8. 2004Zvířata jsou poté připuštěna. V době připouštění se testovaná látka podává zvířatům obou pohlaví a potom, v době gravidity a kojení, pouze samicím. Po odstavení je látka podávána zvířatům filiální generace F₁ v průběhu růstu do dospělosti, v době páření a až do doby odstavení F₂ generace.
  účinné od 1. 8. 2004Pro inhalační aplikaci je třeba metodu modifikovat.
1. účinné od 1. 8. 20041.2 Popis testovací metody
  1. účinné od 1. 8. 20041.2.1 Příprava
    účinné od 1. 8. 2004Pokusná zvířata jsou vybrána s ohledem na druh, pohlaví, a stáří v souladu s ustanovením § 15 zvláštního právního předpisu¹⁰) a označena tak, aby byla možná identifikace jednotlivých zvířat. Dobu navykání stanoví § 10 zvláštního právního předpisu.¹⁰)
    účinné od 1. 8. 2004Před zahájením testu jsou zdravá zvířata náhodně rozdělena do kontrolní a exponovaných skupin. Rodičovská zvířata (P) jsou chována nejméně 5 dnů před zahájením pokusu v těch podmínkách ustájení a krmení, v jakých budou během experimentu. Doporučuje se testovanou látku podávat v potravě nebo v pitné vodě. Jiné způsoby podání jsou také možné. Všechna zvířata látku dostávají stejným způsobem v průběhu celého testu. Pokud se používá k usnadnění aplikace vehikulum nebo jiné aditivum, musí být o nich známo, že nemají toxické účinky. Látka se aplikuje 7 dní v týdnu.
  1. účinné od 1. 8. 20041.2.2 Pokusná zvířata
    účinné od 1. 8. 2004V pokuse se přednostně používají potkani nebo myši. Používají se zdravá P zvířata, do té doby nepoužitá pro jiné experimenty. Nepoužívá se kmenů s nízkou plodností. Zvířata musí být plně charakterizována co do druhu, kmene, pohlaví a hmotnosti nebo věku. Plodnost musí být ověřena u obou pohlaví. Zvířata v obou skupinách, exponované a kontrolní, musí být odstavena před zahájením aplikace.
  1. účinné od 1. 8. 20041.2.3 Počet a pohlaví
    účinné od 1. 8. 2004Každá exponovaná i kontrolní skupina musí mít dostatečný počet zvířat, aby bylo zaručeno cca 20 březích samic s přibližně stejným termínem porodu. Cílem je získat dostatečný počet těhotenství a potomstva a tak zajistit spolehlivé hodnocení vlivu látky na plodnost, průběh gravidity a mateřské chování, kojení, růst a vývoj potomstva generace F₁ od početí do dospělosti a vývoj jejich potomstva generace F₂ až do odstavení.
  1. účinné od 1. 8. 20041.2.4 Podmínky testu
    účinné od 1. 8. 2004Vodu a potravu dostávají zvířata ad libitum. Před porodem se těhotné samice přemístí do zvláštních porodních nebo mateřských klecí a je jim poskytnut materiál pro vytvoření hnízda.
  1. účinné od 1. 8. 20041.2.5 Dávkování
    účinné od 1. 8. 2004Použijí se alespoň 3 exponované a 1 kontrolní skupina zvířat. Pokud se používá pro aplikaci testované látky vehikulum, pak zvířata kontrolní skupiny dostávají vehikulum v největším použitém objemu. Pokud testovaná látka snižuje příjem a utilizaci potravy, je třeba uvážit použití další kontrolní skupiny, spárované co do výživy.
    účinné od 1. 8. 2004Testovaná látka v nejvyšší koncentraci má v ideálním případě, pokud to dovolí fyzikálně-chemické vlastnosti látky a její biologické účinky, vyvolávat toxicitu a nikoli mortalitu v rodičovské populaci. Střední dávka(y) by měla(y) vyvolat minimální toxické účinky, které by se daly připsat testované látce, a nejnižší dávka by neměla vyvolávat žádné pozorovatelné nepříznivé účinky ani u rodičů ani u potomstva.
    účinné od 1. 8. 2004Při podání sondou nebo v tobolkách se dávka stanoví na základě individuální hmotnosti zvířete a přizpůsobuje se každý týden podle změny hmotnosti. V případě těhotných samic, dávky mohou být případně určeny na základě tělesné hmotnosti v 0. nebo 6.dni od začátku těhotenství.
  1. účinné od 1. 8. 20041.2.6 Limitní test
    účinné od 1. 8. 2004V případě látek s nízkou toxicitou, pokud se ani dávka 1000 mg.kg^-1 neprojevuje žádným toxickým účinkem na reprodukci, nemusí se provádět studie na jiných dávkových úrovních. Pokud předběžná studie ukáže, že vysoká dávka, vyvolávající jasnou mateřskou toxicitu, nemá nepříznivé účinky na plodnost, není nutné provádět studie na jiných dávkových úrovních.
1. účinné od 1. 8. 20041.3 Popis postupu
  1. účinné od 1. 8. 20041.3.1 Plán pokusu
    účinné od 1. 8. 2004Denní aplikace samcům rodičovské generace P začne ve věku pěti až devíti týdnů, aspoň po pětidenní aklimatizaci po odstavení. U potkanů aplikace pokračuje deset týdnů před obdobím připouštění (8 týdnů pro myši). Samci se buď utratí a vyšetří na konci období připouštění nebo se pokračuje v aplikaci a jsou použiti pro případnou produkci dalších vrhů a jsou utraceni a vyšetřeni před koncem pokusu.
    účinné od 1. 8. 2004Denní aplikace samicím rodičovské generace P začne po pětidenní aklimatizaci a pokračuje aspoň dva týdny před obdobím připouštění. Denní aplikace pokračuje pak po celé tři týdny období připouštění, v době gravidity až do odstavení F₁ potomstva.
    účinné od 1. 8. 2004Změna dávkovacího plánu je na základě znalostí o vlastnostech studované látky, například o indukci metabolismu respektive o bioakumulaci, přípustná.
    účinné od 1. 8. 2004Aplikace zvířatům generace F₁ začíná po odstavu a končí jejich utracením.
  1. účinné od 1. 8. 20041.3.2 Postup při připouštění
    účinné od 1. 8. 2004Je možno použít párování 1:1 (jedna samice a jeden samec) anebo 1:2 (jeden samec ke dvěma samicím).
    účinné od 1. 8. 2004V případě 1:1 párovaní, samice se ponechá s týmž samcem ve společné kleci do otěhotnění anebo po dobu 3 týdnů. Každé ráno jsou samice vyšetřeny na přítomnost spermatu nebo vaginální zátky. Den 0 těhotenství je definován jako den nálezu vaginální zátky nebo spermatu.
    účinné od 1. 8. 2004Vzhledem k vývoji spermiogenese, se zvířata generace F₁ nepoužívají pro připouštění do věku 11 týdnů u myší a 13 týdnů u potkanů. Pro připouštění zvířat generace F₁ se náhodně vyberou páry z různých vrhů téže dávkové skupiny. Nepoužitá zvířata se utratí po odstavu.
    účinné od 1. 8. 2004Dvojice, u kterých nedojde k oplodnění, je třeba vyšetřit s cílem zjistit důvod neplodnosti páru. To je možné buď poskytnutím další příležitosti k oplodnění s osvědčenými jedinci obou pohlaví nebo mikroskopickým vyšetřením reprodukčních orgánů nebo vyšetřením estrálního cyklu a spermatogenezy.
  1. účinné od 1. 8. 20041.3.3 Velikost vrhů
    účinné od 1. 8. 2004Zvířatům použitým pro vyšetření plodnosti je ponechána možnost porodit normálně a pečovat o své potomstvo do okamžiku odstavení bez standardizace velikosti vrhů. Pokud se velikost vrhů standardizuje, je třeba dodržet následující postup: mezi 1. a 4. dnem po porodu se velikost všech vrhů upraví vyřazením nadbytečných jedinců tak, aby se dosáhlo počtu 4 samců a 4 samic na vrh; pokud to není proveditelné, je možno standardizovat na jiné počty, např. 5 samců a 3 samice. Vrhy menší než 8 nelze standardizovat. Standardizace vrhů generace F₂ se provede obdobně.
  1. účinné od 1. 8. 20041.3.4 Pozorování
    účinné od 1. 8. 2004Každé zvíře musí být pozorováno alespoň jednou za den. Významné změny chování, příznaky ztíženého nebo prodlouženého porodu a všechny příznaky toxicity, včetně mortality, se zaznamenávají. Příjem potravy se měří týdně jak před, tak během doby připouštění. Během gravidity je vhodné kontrolovat příjem potravy denně. Po porodu a v průběhu laktace se měří příjem potravy ve stejný den, kdy je potomstvo váženo. Rodičovská P a F₁ zvířata se váží první den aplikace a pak týdně. Všechna pozorování se zaznamenávají individuálně pro každé dospělé zvíře.
    účinné od 1. 8. 2004Doba gestace se počítá od nultého dne těhotenství. Každý vrh se co nejdříve po porodu vyšetří a stanoví se počty a pohlaví mláďat, počet mrtvých a živých porodů a přítomnost hrubých anomálií.
    účinné od 1. 8. 2004Mrtvá mláďata a mláďata utracená ve čtvrtém dnu se uchovají pro vyšetření možných defektů. Živá mláďata se spočítají a celé vrhy se zváží ráno po porodu, ve čtvrtém a sedmém dnu a potom každý týden do ukončení studie, kdy jsou zvířata zvážena individuálně. Pozorují se a zaznamenávají všechny abnormality v chování a fyzickém stavu matek a potomstva.
  1. účinné od 1. 8. 20041.3.5 Patologie
    1. účinné od 1. 8. 20041.3.5.1 Pitva
      účinné od 1. 8. 2004Všechna dospělá zvířata generací P a F₁ se utrácejí, jakmile není nutné je déle uchovávat pro posouzení účinků látky na reprodukci. Zvířata generace F₁ nevybraná pro připouštění a všechna zvířata generace F₂ se utratí po odstavení.
      účinné od 1. 8. 2004Po utracení nebo úmrtí se u všech rodičovských zvířat P a F₁ makroskopicky vyšetří na strukturní abnormality a patologické změny se zvláštní pozorností k orgánům reprodukčního systému. Mláďata uhynulá nebo v agónii se vyšetří na defekty.
    1. účinné od 1. 8. 20041.3.5.2 Histopatologické vyšetření
      účinné od 1. 8. 2004Vaječníky, děloha, děložní hrdlo, vagína, varlata, epididymis, semenné kanálky, koagulační žlázka, prostata, hypofysa a další cílové orgány všech zvířat generací P a F₁ se uchovají pro mikroskopické vyšetření. V případě, že tyto orgány nebyly doposud vyšetřeny v jiných mnohadávkových studiích, provede se mikroskopické vyšetření u všech P a F₁ zvířat kontrolní skupiny a skupiny dostávající nejvyšší dávku, která byla vybrána pro připouštění, a dále u zvířat, která zemřela v průběhu pokusu. Orgány, které jevily abnormality u těchto skupin zvířat, se vyšetří i u zvířat ostatních dávkových skupin. V těchto případech se mikroskopicky vyšetřují všechny tkáně makroskopicky postižené. Jak již bylo uvedeno, reprodukční orgány zvířat podezřelých z neplodností se mají též podrobit mikroskopické analýze.

účinné od 1. 8. 20042 ÚDAJE
účinné od 1. 8. 2004Údaje se zapisují do tabulek, kde je uveden pro každou dávkovou skupinu počet zvířat na začátku pokusu, počet těhotných samic, typ změn a procento zvířat nesoucích tyto změny.
účinné od 1. 8. 2004Numerické výsledky se zpracovávají vhodnou statistickou metodou. Může se použít kterákoliv obecně přijímaná statistická metoda.

účinné od 1. 8. 20043 PROJEKT POKUSU, PROTOKOL POKUSU A ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA
účinné od 1. 8. 2004V souladu s příslušnými právními předpisy⁹) musí být zpracován projekt pokusu a o průběhu pokusu je nutno vést protokol.
účinné od 1. 8. 2004Zpráva o experimentu obsahuje následující údaje:
1. účinné od 1. 8. 2004- druh /kmen použitých zvířat,
2. účinné od 1. 8. 2004- údaje o toxické odezvě v závislosti na dávce a pohlaví, včetně ukazatelů plodností, gestace a životaschopnosti,
3. účinné od 1. 8. 2004- dobu uhynutí v průběhu studie nebo zda zvířata přežila do ukončení pokusu,
4. účinné od 1. 8. 2004- tabulka uvádějící hmotnost u každého vrhu, průměrnou hmotnost jednotlivých mláďat a individuální hmotnost potomků před utracením,
5. účinné od 1. 8. 2004- toxické a další účinky na reprodukci, potomstvo a postnatální růst,
6. účinné od 1. 8. 2004- den, kdy byly pozorovány jednotlivé abnormální příznaky a jejich další vývoj,
7. účinné od 1. 8. 2004- tělesná hmotnost zvířat P a F₁ generace, vybraných pro připouštění,
8. účinné od 1. 8. 2004- pitevní nálezy,
9. účinné od 1. 8. 2004- detailní popis všech mikroskopických nálezů, statistické zpracování všech údajů, pokud je možné.
účinné od 1. 8. 2004Diskuse výsledků.
účinné od 1. 8. 2004Závěry.

účinné od 1. 8. 2004B.36 TOXIKOKINETIKA

účinné od 1. 8. 20041 METODA je v souladu s právem Evropských společenství.¹)
1. účinné od 1. 8. 20041.1 Princip testovací metody
  účinné od 1. 8. 2004Testovaná látka se podává vhodnou cestou. V závislosti na zaměření studie může být látka podávána jednorázově nebo opakovaně v průběhu stanovené doby jedné nebo několika skupinám experimentálních zvířat. Látka, respektive její metabolity, jsou pak podle účelu studie stanovovány v tělních tekutinách, tkáních anebo v exkretech.
  účinné od 1. 8. 2004Studie mohou být prováděny s „neznačenou“ či „značenou“ formou testované látky. Jestliže je použito značení, umístí se tak, aby poskytlo co nejvíce informací o osudu testované látky v organismu.
1. účinné od 1. 8. 20041.2 Popis testovací metody
2. účinné od 1. 8. 20041.3 Přípravy
  účinné od 1. 8. 2004Pokusná zvířata jsou vybrána s ohledem na druh, pohlaví, a stáří v souladu s ustanovením § 15 zvláštního právního předpisu¹⁰) a označena tak, aby byla možná identifikace jednotlivých zvířat. Dobu navykání stanoví § 10 zvláštního právního předpisu.¹⁰) Před zahájením testování jsou zvířata náhodně rozdělena do skupin. Pro řešení specielních otázek se může použít velmi mladých, březích či premedikovaných zvířat.
  1. účinné od 1. 8. 20041.3.1 Experimentální podmínky
    1. účinné od 1. 8. 20041.3.1.1 Pokusná zvířata

Následující stránka