| Dávka | Výsledky | Interpretace |
|---|---|---|
| 5 mg.kg-1 tělesné hmotnosti | Méně než 100% přežití 100% přežití, ale zřejmá toxicita 100% přežití; není zřejmá toxicita | Látky, které jsou vysoce toxické Látky, které jsou toxické Viz výsledky při 50 mg.kg-1 |
| 50 mg.kg-1 tělesné hmotnosti | Méně než 100% přežití 100% přežití, ale zřejmá toxicita 100% přežití; není zřejmá toxicita | Látky, které mohou být toxické nebo vysoce toxické. Viz výsledky při 5 mg.kg-1 Látky, které jsou zdraví škodlivé Viz výsledky u 500 mg.kg-1 |
| 500 mg.kg-1 tělesné hmotnosti | Méně než 100% přežití 100% přežití, ale zřejmá toxicita 100% přežití; není zřejmá toxicita | Látky, které mohou být toxické nebo zdraví škodlivé. Viz výsledky u 50 mg.kg-1 Látky, které lze považovat za látky bez významné akutní toxicity Viz výsledky u 2000 mg.kg-1 |
| 2000 mg.kg-1 tělesné hmotnosti | Méně než 100% přežití 100% přežití s nebo bez zřejmé toxicity | Viz výsledky u 500 mg.kg-1 Látky, které nemají významnou akutní toxicitu |
- 1 METODA je v souladu s právem Evropských společenství.2)
- 1.1 Princip testovací metody
Test akutní orální toxicity poskytuje informace o nepříznivých účincích, které mohou následovat během krátké doby po orálním podání 1 dávky testované látky.
Metoda s fixní dávkou se provádí ve dvou etapách.
V předběžné orientační studii se sekvenčním způsobem sledují účinky několika dávek při orální aplikaci sondou u zvířat téhož pohlaví, vždy 1 zvíře na dávku. Orientační studie poskytuje informaci o vztahu dávky a toxicity, včetně odhadu minimální letální dávky. Normálně se v této první etapě nepoužije víc než 5 zvířat.
V hlavní studii se látka podává orálně sondou skupinám vždy s o 5 samci a 5 samicemi v 1 z těchto fixních dávek: 5, 50, 500 nebo 2000 mg.kg-1 tělesné hmotnosti. Použitá dávka se odvodí z předběžné orientační studie, a to jako dávka, která pravděpodobně vyvolá „zřejmou toxicitu“ (viz část B - Všeobecný úvod bod 1.2), ale ne uhynutí.
Po podání se pozorují účinky. Jestliže vybraná výchozí úroveň dávky vyvolá zřejmou toxicitu, ale žádnou mortalitu, není třeba žádné další testování. Když na zvolené úrovni dávky není pozorována zřejmá toxicita, látka se znova otestuje na nejbližší vyšší úrovni dávky. Pokud zvířata uhynou nebo když závažná toxická reakce vyžaduje humánní utracení, látka se znova otestuje na nejbližší nižší úrovni dávky.
Tento postup umožňuje zjistit „diskriminační dávku“ (viz. Všeobecný úvod bod 1.4), tj. nejvyšší z předem stanovených úrovní dávky, kterou je možno podat aniž by došlo k úhynu (včetně případů humánního utracení).
Zvířata se závažnými a přetrvávajícími příznaky utrpení a bolesti je třeba humánním způsobem utratit. Testované látky se nesmějí podávat v takových dávkách a takovým způsobem, o kterých je známo, že vyvolávají značnou bolest a utrpení následkem svých leptavých nebo dráždivých vlastností.
- 1.2 Popis metody
- 1.2.1 Příprava
- 1.2.1.1 Pokusná zvířata
Přednostně se jako pokusná zvířata používají potkani, nejsou-li závažné důvody proti.
Používají se běžně užívané kmeny pokusných zvířat. Na začátku testu by u obou pohlaví nemělo variační rozpětí hmotnosti zvířat (pro každé pohlaví zvlášť) překročit ± 20 % střední hodnoty.
Nejméně 5 dnů před testem jsou zvířata chována v podmínkách ustájení a krmení, v jakých budou během experimentu. Před testem se zdravá mladá dospělá zvířata náhodně přiřadí do jednotlivých experimentálních skupin orientační studie a hlavní studie. Běžně stačí pro hlavní studii jedna skupina každého z obou pohlaví.
- 1.2.1.2 Příprava a podávání dávky
Pokud je třeba, připraví se roztok nebo suspenze testované látky ve vhodném vehikulu. Doporučuje se jako první uvážit použití vodného roztoku, další volbou je roztok v rostlinném oleji, teprve potom jako další možnost roztok v jiných vhodných vehikulech nebo suspenze. U nevodných vehikul musí být známy nebo určeny před testem nebo během něho jejich relevantní toxikologické vlastnosti.
U hlodavců by objem neměl normálně překročit 10 ml.kg-1 tělesné hmotnosti; výjimkou jsou vodné roztoky, jichž je možno podávat až 20 ml.kg-1. Variabilita objemů látky podávané v testech by se měla minimalizovat takovou úpravou koncentrací, aby se zajistil konstantní objem na všech hladinách dávek.
Před podáním testované látky mají být zvířata hladová. Potkanům se potrava odebere večer před testem; přístup k pitné vodě není omezen. V den pokusu se zvířata zváží a testovaná látka se podá sondou orálně v jediné dávce. Není-li možno podat dávku najednou, lze podat aplikovanou dávku po menších množstvích během nejvýše 24 hodin. Po podání dávky je třeba zamezit přístup k potravě ještě 3 - 4 hodiny. Podává-li se látka po částech během určitého období, může být žádoucí - podle délky této doby - potravu a vodu zvířatům poskytnout.
- 1.2.1.1 Pokusná zvířata
- 1.2.2 Popis postupu
- 1.2.2.1 Orientační studie
Vyšetřují se účinky různých dávek na jednotlivá zvířata. Normálně se používají samice, pokud nejsou k dispozici údaje, že jsou samci citlivějším pohlavím. Dávky se podávají postupně, čeká se alespoň 24 hodin před podáním dávky dalšímu zvířeti. Všechna zvířata se pečlivě pozorují s cílem zjistit projevy otravy nejméně po sedm dní; pokud přetrvávají projevy mírné otravy sedmý den, zvíře se musí pozorovat ještě po dalších sedm dní. Posuzují se následující výchozí hladiny dávek: 5, 50, 500 a 2000 mg.kg-1. Jestliže zvolená výchozí dávka nevyvolá těžkou otravu a přitom nejbližší vyšší vyvolá uhynutí, potom je nutné podat podle potřeby jednu nebo více úrovní dávek mezi výchozími hladinami dávek. Tento způsob poskytuje informace o úrovni(ích) dávek, která(é) vyvolává(jí) příznaky otravy a o nejmenší dávce, která vyvolává mortalitu.
Je třeba pokusit se vybrat výchozí dávku podle údajů o příbuzných chemických látkách. Pokud nejsou takové informace k dispozici, doporučuje se použít jako první dávku 500 mg.kg-1. Jestliže se po výchozí dávce nepozorují příznaky otravy, vyšetřuje se další vyšší úroveň dávky. Jestliže nedojde k uhynutí při 2000 mg.kg-1, je orientační studie skončena a hlavní studii je třeba provést na této úrovni dávky. Jestliže jsou při použití výchozí dávky (např. 500 mg.kg-1) zjištěny těžké účinky, vyžadující humánní utracení, je podána dalšímu zvířeti nejbližší nižší dávka (např. 50 mg.kg-1). Jestliže toto zvíře přežívá, mohou být použity pro další zvířata vhodné dávky mezi určenými fixními dávkami. Za normálních podmínek se neočekává, že je při tomto postupu zapotřebí více než 5 zvířat.
- 1.2.2.2 Hlavní studie
Pro každou vyšetřovanou dávkovou hladinu by se použije nejméně 10 zvířat (5 samic a 5 samců). Samice by měly být nullipary a nesmí být březí.
Principem metody fixní dávky je použití pouze mírně toxických dávek pro hlavní studii. Je třeba se vyhnout podávání letálních dávek testované látky.
Dávka, která bude užita v testu, má být zvolena z jedné ze 4 fixních úrovní dávek, jmenovitě 5, 50, 500 nebo 2000 mg.kg-1 tělesné hmotnosti. Zvolená výchozí úroveň dávky by měla být ta, která pravděpodobně vyvolá zřejmou toxicitu, avšak nikoliv mortalitu (včetně utracení z humánních důvodů); náhodná uhynutí nejsou zahrnuta, ale mají být zaznamenána. Jestliže tato dávka vyvolá zřejmou toxicitu, ale nevyvolá mortalitu, není další testování nutné.
Když podání zvolené dávky nevyvolá zřejmou toxicitu, je nutné látku znovu testovat na další vyšší úrovni dávek. Zvířata by však měla být dále pozorována tak, aby pozorovací období bylo kompletní. Jestliže těžká toxická odpověď vyžaduje humánní utracení zvířat nebo když se projeví mortalita vlivem látky, měla by být látka znovu testována na další nižší úrovni dávek. Zvířata, která není nutné utratit, se pozorují po celou dobu testování.
Po podání látky se pozorování provádějí a zaznamenávají systematicky. Pro každé zvíře se vedou samostatné záznamy. Je nezbytné sledovat a zaznamenat místní účinek aplikované látky a bezprostřední reakci zvířat na aplikaci.
Doba pozorování by měla být nejméně 14 dní. Nelze ji však stanovit pevně. Stanovuje se podle obrazu otravy, rychlosti vývoje otravy a trvání fáze zotavení. Dobu pozorování je možno podle potřeby prodloužit. Důležitá je doba, od projevení příznaků otravy až do jejich vymizení nebo do úhynu zvířat, zvláště tam, kde je patrná tendence k pozdnímu vzniku toxických příznaků.
Pečlivá klinická vyšetření je třeba provádět nejméně dvakrát první den po podání látky a nejméně jedenkrát za den další dny. Zvířata vykazující patrné známky bolesti nebo výrazné příznaky utrpení je třeba humánně utratit. Častější pozorování jsou prováděna během několika prvních dní po podání látky, jestliže zvířata dále vykazují příznaky toxicity. Test může být ukončen v případě, když je zřejmé, že byla zvolena příliš vysoká dávka.
Pozorování se zaměřuje na změny kůže, srsti, očí, sliznic, dýchání a krevního oběhu, změny funkce autonomní a centrální nervové soustavy, somatomotorické aktivity a chování. Zvláštní pozornost je třeba věnovat tremoru, křečovým jevům, slinění, průjmu, letargii, spánku a komatu.
Stanovení hmotnosti jednotlivých zvířat se provede bezprostředně před podáním testované látky, denně po další 3 dny a potom jednou týdně. Zvířata, která uhynou během testu, i ta, která přežívají do konce testu, se zváží a pitvají. Všechny makroskopické patologické změny se zaznamenávají. Je-li to indikováno, odeberou se tkáně pro histopatologické vyšetření.
V závislosti na účincích předcházející úrovně dávky může být zapotřebí vyšetření druhé nebo výjimečné třetí hladiny dávky.
V případě, že látka způsobí úmrtí při dávce 5 mg.kg-1 (nebo jestliže orientační studie naznačuje mortalitu při této dávce), je třeba dále vyšetřovat akutní toxicitu testované látky.
- 1.2.2.1 Orientační studie
- 1.2.1 Příprava
- 1.1 Princip testovací metody
- 2 ÚDAJE
Údaje z orientační i hlavní studie se sestavují do tabulky jednotlivě pro každou testovanou úroveň dávky. Z ní musí být patrný počet zvířat na počátku pokusu; počet zvířat s příznaky toxicity; počet zvířat uhynulých během testu nebo utracených z humánních důvodů; popis toxických účinků; pro hlavní studii, zda byl pozorován zřejmý toxický účinek, který lze připsat testované látce; časový průběh všech toxických účinků; výsledky pitvy. V případě, že zvířata přežívají déle než den, je třeba vypočítat a zaznamenat změny hmotnosti.
Zvířata, která jsou humánně utracena vzhledem k utrpení nebo bolestem vyvolaným testovanou látkou, jsou zaznamenána jako uhynutí vyvolaná testovanou látkou.
- 3 PROJEKT POKUSU, PROTOKOL POKUSU A ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA
V souladu se s příslušnými právními předpisy9) musí být zpracován projekt pokusu a o průběhu pokusu je nutno vést protokol.
- Zpráva o průběhu pokusu obsahuje tyto informace pro orientační i hlavní studii
- - živočišný druh, kmen, původ, podmínky ustájení, potrava, atd.,
- - experimentální podmínky,
- - úrovně dávek (včetně vehikula, pokud se použije) a koncentrace,
- - kompletní výsledky všech vyšetřovaných úrovní dávek,
- - ve formě tabulky údaje o odpovědích podle pohlaví a podle úrovní dávek (počet použitých zvířat; změny tělesné hmotnosti; případně počet uhynulých zvířat nebo zvířat utracených během testu; počet zvířat s příznaky toxicity; povaha, stupeň a trvání účinků),
- - časový průběh nástupu toxických příznaků a zda byly reversibilní,
- - pokud zvířata uhynula nebo byla utracena, doba úhynu po podání látky, důvody a kriteria použitá pro indikaci humánního utracení zvířat,
- - pitevní nálezy,
- - všechny histopatologické nálezy.
Diskuse výsledků.
Závěry s interpretací výsledků, včetně příznaků zřejmé toxicity a diskriminující dávkové hladiny zjištěné v testu podle tabulky č. 1.
Tabulka č. 1
Hodnocení a interpretace výsledků testu.
- Zpráva o průběhu pokusu obsahuje tyto informace pro orientační i hlavní studii
B.1 tris AKUTNÍ TOXICITA ORÁLNÍ (PER OS)
METODA STANOVENÍ TŘÍDY AKUTNÍ TOXICITY
- 1 METODA je v souladu s právem Evropských společenství.4)
- 1.1 Úvod
Metoda stanovení třídy akutní toxicity poskytuje informace jak pro posuzování rizika, tak pro účely klasifikace rizika.
Metoda používá 3 pevně stanovených dávek v přiměřených odstupech, tak aby bylo možno testovanou látku na základě výsledků zařadit. Kromě toho postup popsaný pro tuto testovací metodu umožňuje výběr 3 doplňkových pevně stanovených dávek, které lze použít buď jako alternativní dávky pro určité body rozhodovacího procesu, nebo pro další testování. Použití některé z těchto doplňkových dávek je možno uvážit, pokud je žádoucí nebo nezbytné další zpřesnění.
Metoda používá pevně stanovené počáteční dávky a není určena pro výpočet přesné hodnoty LD50 Umožňuje stanovení rozsahu expozic, ve kterém se očekává úmrtnost, protože uhynutí části zvířat je i u této metody hlavním kritériem účinku. Výsledky testu mají umožnit klasifikaci látky. Vzhledem k sekvenčnímu postupu by trvání testu mohlo být delší než postup popsaný v metodě B.1.2) Hlavní výhodou této metody je menší spotřeba zvířat než u alternativní metody fixní dávky (B.1 bis).2)
- 1.2 Princip testovací metody
Látka se podává orálně skupině pokusných zvířat v 1 ze stanovených dávek. Testování se provádí postupně, v každém kroku se používají 3 zvířata stejného pohlaví. Není nutné provádět předběžnou orientační studii. Přítomnost nebo nepřítomnost úhynu zvířat ve vztahu k podávané látce rozhodne o dalším kroku, tj.
- - není zapotřebí další testování;
- - další krok bude proveden se stejnou dávkou, ale se zvířaty druhého pohlaví;
- - další krok bude proveden s vyšší nebo nižší úrovní dávky.
- 1.3 Popis metody
- 1.3.1 Příprava
Pokusná zvířata jsou vybrána s ohledem na druh, pohlaví, a stáří v souladu s ustanovením § 15 zvláštního právního předpisu10) a označena tak, aby byla možná identifikace jednotlivých zvířat. Dobu navykání stanoví § 10 zvláštního právního předpisu.10) Zvířata mohou být v klecích ve skupinách podle pohlaví a dávky, ale počet zvířat v jedné kleci musí umožnit jasné pozorování každého zvířete.
Testovaná látka je aplikována zvířatům v jediné dávce žaludeční sondou nebo vhodnou kanylou.
Pokud je to třeba, testovaná látka se rozpustí nebo suspenduje ve vhodném vehikulu. Doporučuje se nejprve zvážit použití vodného roztoku/suspenze, pak použití roztoku/emulze v jedlém rostlinném oleji (např. kukuřičném) a pak roztoku v jiných vehikulech. Pro nevodná vehikula musí být známa jejich toxická charakteristika; pokud není známa, musí být stanovena ještě před testem.
Zvířata jsou před aplikováním látky po určitou dobu bez potravy (např. potkani přes noc a myši 3 - 4 hodiny); přístup k vodě se neomezuje.
- 1.3.2 Experimentální podmínky
- 1.3.2.1 Pokusná zvířata
V pokusech se upřednostňují potkani, nejsou-li známy důvody proti jejich použití. Samice musí být nullipary a nesmí být březí.
Na začátku studie by nemělo variační rozpětí hmotnosti zvířat (pro každé pohlaví zvlášť) překročit ± 20 % střední hodnoty.
- 1.3.2.2 Počet a pohlaví
Pro každý krok se používají tři zvířata jednoho pohlaví. V úvodním kroku může být použito kterékoli pohlaví.
- 1.3.2.3 Úrovně dávek
Výchozí dávková úroveň je vybrána ze tří pevných úrovní, tj. 25, 200 a 2000 mg.kg-1 tělesné hmotnosti. Výchozí úroveň dávky by měla být taková, aby s největší pravděpodobností způsobila uhynutí alespoň některých zvířat, jimž byla látka podána. V závislosti na výchozí dávce se použije příslušného diagramu postupu popsaného v odstavci 1.3.3.
Pro výběr pohlaví a výchozí dávky je třeba využít veškeré dostupné informace, včetně informací o vztahu struktury a účinku. Pokud tyto informace naznačují, že úmrtnost je nepravděpodobná i při nejvyšší úrovni dávky (2000 mg.kg-1 tělesné hmotnosti), pak se provede limitní test. Nejsou-li informace o testované látce, doporučuje se - s ohledem na pokusná zvířata - použít výchozí dávku 200 mg.kg-1 tělesné hmotnosti.
V některých případech je třeba dále zpřesnit získanou informaci, než jak to dovoluje test s třemi pevnými dávkovými úrovněmi ve výši 25, 200 a 2000 mg.kg-1 tělesné hmotnosti. V těchto případech se může uvažovat o dalším testování při doplňkových pevných dávkách ve výši 5, 50 nebo 500 mg.kg-1 tělesné hmotnosti.
Nemají se aplikovat dávky, o kterých je známo, že způsobují svými leptavými nebo těžce dráždícími účinky značnou bolest a utrpení.
Časový interval mezi aplikačními skupinami je závislý na rychlosti nástupu, na trvání a závažnosti toxických příznaků. Testování na zvířatech druhého pohlaví nebo aplikaci další dávky je třeba odložit, dokud není jisté, že zvířata předchozí dávku přežila.
- 1.3.2.4 Limitní test
Limitní test s jedinou úrovní dávky ve výši 2000 mg.kg-1 tělesné hmotnosti se provádí na 3 zvířatech každého pohlaví. Pokud dojde k uhynutí souvisejícím s podáním látky, lze další testování provést při dávkách 200 mg.kg-1 (nebo 500 mg.kg-1) tělesné hmotnosti.
- 1.3.2.5 Doba pozorování
Přežívající zvířata je třeba pozorovat obvykle po dobu 14 dnů, kromě případů, kdy musí být zvířata vyloučena z dalšího pozorování a humánně utracena z důvodů ochrany zvířat. Trvání pozorování by však nemělo být stanoveno předem pevně; může být prodlouženo podle toxických reakcí, doby jejich nástupu a délky zotavovacího období. Je důležité zaznamenávat dobu, kdy se objeví a mizí příznaky toxicity, zvláště jde-li o zpožděné toxické příznaky. Veškerá pozorování jsou systematicky zaznamenávána: záznamy jsou vedeny pro každé jednotlivé zvíře.
- 1.3.2.1 Pokusná zvířata
- 1.3.3 Popis postupu
Po období hladovění jsou zvířata před podáním zkušební látky zvážena. Po aplikaci látky jsou zvířata bez potravy po dobu dalších 3 - 4 hodin. Kde je dávka podávána po částech během určité doby, může být - v závislosti na délce této doby - nezbytné poskytnout zvířatům potravu i vodu.
Maximální objem tekutiny, který může být podán najednou, závisí na velikosti zvířete. U hlodavců by objem neměl normálně přesáhnout 1 ml na 100 g tělesné hmotnosti, v případě vodných roztoků lze podat i 2 ml na 100 g tělesné hmotnosti. Rozdíly v podávaném objemu je třeba minimalizovat upravením koncentrace tak, aby byl podáván týž objem na všech úrovních dávky. Jestliže není možné podat dávku celou najednou, je možné ji aplikovat po částech po dobu nepřekračující 24 hodin.
Podrobnosti postupu testování jsou uvedeny níže.
- a) Jak bylo uvedeno v bodu 1.3.2.3, výchozí dávka by měla být ta ze tří pevně stanovených dávkových úrovní, která pravděpodobně způsobí uhynutí aspoň u některých zvířat. Pro výběr výchozí dávky lze použít následující informace:
- - údaje o fyzikálně-chemických vlastnostech,
- - vztah struktury a účinku,
- - všechny údaje z jiných testů toxicity a
- - předpokládané použití testované látky.
- b) Příslušné vývojové diagramy stanovují postup pro každou výchozí dávku. V závislosti na počtu humánně utracených nebo uhynulých zvířat postupuje testování tak, jak naznačují šipky.
- c) Pokud po aplikaci výchozí dávky 25 nebo 200 mg.kg-1 tělesné hmotnosti uhyne pouze jedno zvíře druhého pohlaví, obvykle se již dále netestuje. Pokud však přitom nejsou u ostatních 5 zvířat žádné toxické příznaky, je třeba pitvou ověřit možnost, že uhynutí nesouviselo s podanou látkou. Jestliže se tato možnost potvrdí, je třeba pokračovat v testování na vyšší úrovni dávky.
- d) Pokud po dávce 2000 mg.kg-1 tělesné hmotnosti uhyne jedno zvíře každého pohlaví, dá se předpokládat, že hodnota LD50 překročí dávku 2000 mg.kg-1 tělesné hmotnosti. Protože je to však jen hraniční výsledek, je třeba pečlivě posoudit reakce zbývajících dvou zvířat každého pohlaví: zřetelné, výrazné toxické příznaky u těchto zvířat mohou být důvodem pro klasifikaci odpovídající hodnotě LD50 ve výši 2000 mg.kg-1 tělesné hmotnosti nebo menší, nebo mohou být podnětem pro další testování na stejné úrovni dávky.
- e) Postup umožňuje testování s 3 doplňkovými pevně stanovenými dávkami (varianta 2). Této varianty je možno použít buď k výběru alternativní dávky v daném bodu rozhodovacím procesu, nebo pro další testování po dokončení testování podle varianty 1.
- f) Diagram testování s výchozí dávkou 25 mg.kg-1 tělesné hmotnosti je uveden v tabulce č. 2.
- g) Diagram testování s výchozí dávkou 200 mg.kg-1 tělesné hmotnosti je uveden v tabulce č. 3.
- h) Diagram testování s výchozí dávkou 2000 mg.kg-1 tělesné hmotnosti je uveden v tabulce č. 4.
- 1.3.3.1 Všeobecné pozorování
Pečlivé klinické pozorování se provádí dvakrát za první den (den aplikace) nebo častěji, pokud to vyžaduje reakce zvířat na podání látky, a dále nejméně jednou denně. Zvířata, která jsou nalezena v agonálním stavu, nebo zvířata vykazující příznaky silné bolesti a přetrvávajícího velkého utrpení, je třeba humánně utratit: tato zvířata jsou hodnocena stejně jako zvířata uhynulá.
Ať už byla zvířata utracena z humánních důvodů nebo byla nalezena mrtvá, dobu smrti je třeba zaznamenat co nejpřesněji. Další pozorování se provádí, dokud zvířata vykazují příznaky toxicity. Pozorování zahrnuje změny kůže, srsti, očí, sliznic, dýchání a krevního oběhu, vegetativního a centrálního nervového systému, motorické aktivity a chování. Pozornost je třeba věnovat výskytu třesu, křečových jevům, slinění, průjmu, letargii, spánku a kómatu.
Veškerá pozorování jsou systematicky zaznamenávána: záznamy jsou vedeny pro každé jednotlivé zvíře.
- 1.3.3.2 Tělesná hmotnost
Všechna zvířata jsou zvážena krátce před podáním testované látky a pak nejméně jednou týdně. Měří se a zaznamenávají změny hmotnosti. Na konci testu jsou přežívající zvířata zvážena před tím, než budou humánně utracena.
- 1.3.3.3 Pitva
U všech zvířat použitých ve studii, včetně uhynulých a utracených během testu, se provede pitva. Všechny makroskopické patologické změny jsou zaznamenány pro každé zvíře zvlášť. Pro získání dalších užitečných informací je možno uvážit mikroskopické vyšetření orgánů vykazujících známky makroskopické patologie u zvířat přežívajících 24 a více hodin.
- a) Jak bylo uvedeno v bodu 1.3.2.3, výchozí dávka by měla být ta ze tří pevně stanovených dávkových úrovní, která pravděpodobně způsobí uhynutí aspoň u některých zvířat. Pro výběr výchozí dávky lze použít následující informace:
- 1.3.1 Příprava
- 1.1 Úvod
- 2 SBĚR A ZÁZNAM ÚDAJŮ
K dispozici musí být údaje o každém jednotlivém zvířeti. Navíc jsou všechny údaje shrnuty do tabulkové formy, uvádějící u každé testované skupiny počet použitých zvířat, počet zvířat vykazujících příznaky toxicity, počet zvířat uhynulých v průběhu testu nebo utracených z humánních důvodů, dobu úhynu jednotlivých zvířat, popis, časový průběh a vratnost toxických účinků, a pitevní nálezy.
Interpretace výsledků je znázorněna v tabulce č. 5.
- 3 PROJEKT POKUSU, PROTOKOL POKUSU A ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA
V souladu se s příslušnými právními předpisy9) musí být zpracován projekt pokusu a o průběhu pokusu je nutno vést protokol.
- Zpráva o pokusu obsahuje tyto informace, pokud mohly být získány:
- Pokusná zvířata:
- - živočišný druh/kmen;
- - mikrobiologický stav zvířat, je-li znám;
- - počet, stáří a pohlaví zvířat;
- - zdroj, podmínky chovu, potrava atd.;
- - hmotnost jednotlivých zvířat na začátku testu, dále v týdenních intervalech a na konci testu.
- Podmínky testování:
- - zdůvodnění výběru vehikula, pokud je jiné než voda;
- - podrobné údaje o způsobu aplikace testované látky včetně podávaných objemů a doby aplikace;
- - podrobné údaje o potravě a kvalitě vody (včetně druhu a zdroje);
- - zdůvodnění výběru počáteční dávky.
- Výsledky:
- - sestavení údajů o reakcích každého zvířete do tabulek podle pohlaví a dávkové úrovně (tzn. zvířata vykazující příznaky toxicity včetně úhynu, charakter, závažnost a trvání účinků);
- - nástup a časový průběh příznaků toxicity a jejich reverzibilita u každého zvířete;
- - pitevní nálezy a histopatologické nálezy u každého zvířete, jsou-li dispozici.
Diskuse výsledků.
Hodnocení a interpretace.
- Pokusná zvířata:
Tabulka č. 2
Postup testování s výchozí dávkou 25 mg.kg-1 tělesné hmotnosti
V rámečcích je udána dávka, počet zvířat a pohlaví (1 - pohlaví zvolené jako první, 2 - pohlaví zvolené jako druhé).
Pod rámečky je počet uhynulých nebo utracených zvířat (0, 1, 2, 3). Podle počtu uhynulých zvířat se v testování pokračuje ve směru šipek až do dosažení šedého rámečku.
Varianta 1 - Ukončení testu: Klasifikace se provede na základě konečných hodnot uvedených v příslušném šedém rámečku nebo podle způsobu vyhodnocení uvedeného v Dodatku 2.
Varianta 2 - Pokračování testu s příslušnou doplňkovou dávkou.
Ukončení testu: Klasifikace se provede na základě konečných hodnot uvedených v příslušném šedém rámečku.
Tabulka č. 3
Postup testování s výchozí dávkou 200 mg.kg-1 tělesné hmotnosti
V rámečcích je udána dávka, počet zvířat a pohlaví (1 - pohlaví zvolené jako první, 2 - pohlaví zvolené jako druhé).
Pod rámečky je počet uhynulých nebo utracených zvířat (0, 1, 2, 3). Podle počtu uhynulých zvířat se v testování pokračuje ve směru šipek až do dosažení šedého rámečku.
Varianta 1 - Ukončení testu: Klasifikace se provede na základě konečných hodnot uvedených v příslušném šedém rámečku nebo podle způsobu vyhodnocení uvedeného v Dodatku 2.
Varianta 2 - Pokračování testu s příslušnou doplňkovou dávkou.
Ukončení testu: Klasifikace se provede na základě konečných hodnot uvedených v příslušném šedém rámečku.
Tabulka č. 4
Postup testování s výchozí dávkou 2000 mg.kg-1 tělesné hmotnosti
V rámečcích je udána dávka, počet zvířat a pohlaví (1 - pohlaví zvolené jako první, 2 - pohlaví zvolené jako druhé).
Pod rámečky je počet uhynulých nebo utracených zvířat (0, 1, 2, 3). Podle počtu uhynulých zvířat se v testování pokračuje ve směru šipek až do dosažení šedého rámečku.
Varianta 1 - Ukončení testu: Klasifikace se provede na základě konečných hodnot uvedených v příslušném šedém rámečku nebo podle způsobu vyhodnocení uvedeného v Dodatku 2.
Varianta 2 - Pokračování testu s příslušnou doplňkovou dávkou.
Ukončení testu: Klasifikace se provede na základě konečných hodnot uvedených v příslušném šedém rámečku.
Tabulka č. 5
Interpretace výsledků založených na testovací variantě 1
V rámečcích je udána dávka, počet zvířat a pohlaví (1 - pohlaví zvolené jako první, 2 - pohlaví zvolené jako druhé).
Pod rámečky je počet uhynulých nebo utracených zvířat (0, 1, 2, 3).
Šedé rámečky pod rámečkem „ŽÁDNÉ DALŠÍ TESTOVÁNÍ“ v diagramech tohoto dodatku obsahují konečné hodnoty pro klasifikaci. Po testování podle varianty 1 se příslušná šipka sleduje dokud se nedosáhne příslušného rámečku. (Hodnoty v rámečcích vyznačují horní hranice pro příslušný způsob klasifikace. Ležatá osmička znamená, že LD50 je větší než hodnota v nejbližším rámečku vlevo.)
Výchozí dávka 25 mg/kg tělesné hmotnosti
Pokračování tabulky č. 5
Výchozí dávka 200 mg/kg tělesné hmotnosti
Pokračování tabulky č. 5
Výchozí dávka 2000 mg/kg tělesné hmotnosti
- Zpráva o pokusu obsahuje tyto informace, pokud mohly být získány:
B.2 AKUTNÍ TOXICITA INHALAČNÍ
- 1 METODA je v souladu s právem Evropských společenství.2),3)
- 1.1 Úvod
Je užitečné před pokusem získat údaje o rozdělení velikosti částic, tenzi par, bodu tání, bodu varu, bodu vzplanutí a výbušnosti (jsou-li stanovitelné) testované látky.
- 1.2 Princip metody
Několik skupin pokusných zvířat je exponováno studované látce po určenou dobu v odstupňovaných koncentracích, a to jedné koncentraci v každé skupině. Potom se zvířata pozorují a zjišťují se účinky a případy uhynutí. Zvířata, která během pokusu uhynou, i ta, která přežijí do konce pokusu, se pitvají.
Zvířata se závažnými a přetrvávajícími příznaky utrpení a bolesti je třeba humánním způsobem utratit. Testované látky se nemají podávat v takových koncentracích a takovým způsobem, o kterých je známo, že vyvolávají značnou bolest a utrpení následkem svých leptavých nebo dráždivých vlastností.
- 1.3 Popis metody
- 1.3.1 Příprava
Pokusná zvířata jsou vybrána s ohledem na druh, pohlaví, a stáří v souladu s ustanovením § 15 zvláštního právního předpisu10) a označena tak, aby byla možná identifikace jednotlivých zvířat. Dobu navykání stanoví § 10 zvláštního právního předpisu.10) Pokud to nevyžaduje typ používaného expozičního zařízení, není třeba podrobit zvířata simulované expozici.
Pevné testované látky je třeba rozmělnit na částice příslušné velikosti. Pokud je třeba, přidá se k testované látce vhodné vehikulum tak, aby v ovzduší vznikla příslušná koncentrace testované látky; v tom případě se zařadí také kontrolní skupina s vehikulem. Pokud se užije pro usnadnění aplikace vehikulum nebo jiná aditiva, musí být o nich známo, že nemají toxický účinek. Existují-li vhodná historická data, je možno je využít.
- 1.3.2 Experimentální podmínky
- 1.3.2.1 Pokusná zvířata
V pokusech se upřednostňují potkani, nejsou-li známy důvody proti jejich použití. Používá se běžně užívaných pokusných kmenů. Na začátku studie nemá variační rozpětí hmotnosti zvířat překročit ± 20 % střední hodnoty (pro každé pohlaví zvlášť).
- 1.3.2.2 Počet a pohlaví
Pro každou dávkovou hladinu je třeba použít nejméně 10 hlodavců (5 samic a 5 samců). Samice musí být nullipary a nesmí být březí.
- Poznámka: Používají-li se v akutních testech toxicity zvířata vyšších druhů, než jsou hlodavci, mělo by se zvážit použití menšího počtu zvířat. Dávky je třeba pečlivě volit a je třeba zaručit, aby nebyly překročeny mírně toxické dávky. V těchto testech je třeba vyhnout se podávání letálních dávek testované látky.
- 1.3.2.1 Pokusná zvířata
- 1.3.2.3 Expoziční koncentrace
Má být dostatečný počet úrovní dávek, nejméně 3, a mají být vhodně odstupňovány tak, aby byl u testovacích skupin viditelný rozsah toxických účinků a mortality. Získané údaje musí stačit na znázornění vztahu mezi dávkou a mortalitou a, pokud je to možné, musí umožnit stanovení LC50 s přijatelnou spolehlivostí.
- 1.3.2.4 Limitní test
Nedojde-li po 4 hodinové expozici 5 samců a 5 samic plynu v koncentraci 20 mg.l-1 nebo parám či aerosolu tekuté nebo pevné látky v koncentraci 5 mg.l-1 (nebo - v případech, kdy tuto koncentraci není možné použít v důsledku fyzikálních nebo chemických vlastností sledované látky včetně rizika výbuchu - při expozici maximální dosažitelné koncentraci) během 14 dnů k žádné mortalitě vyvolané sledovanou látkou, považují se další pokusy za zbytečné.
- 1.3.2.5 Doba expozice
Nejkratší doba expozice má být 4 hodiny.
- 1.3.2.6 Vybavení
Pro pokusy se zvířaty je třeba použít inhalační zařízení, které umožňuje dynamické proudění vzduchu s výměnou vzduchu nejméně dvanáctkrát za hodinu, aby byl zaručen přiměřený obsah kyslíku a rovnoměrné rozdělení látky v expoziční atmosféře. Použije-li se expoziční box, je třeba ho konstruovat tak, aby se co nejvíce omezovalo shlukování zvířat a aby inhalační expozice testované látce byla maximální. Pro zajištění stability atmosféry v inhalačním boxu by neměl v zásadě celkový objem pokusných zvířat přesáhnout 5 % objemu boxu. Je také možné použít inhalační expozice orálně-nasální, samotné hlavy nebo individuální celotělové expozice; první dva způsoby expozice minimalizují příjem látky jinými cestami.
- 1.3.2.7 Doba pozorování
Doba pozorování by měla trvat nejméně 14 dní. Nelze ji však stanovit rigorózně. Může záviset na toxických reakcích, na rychlosti jejich vzniku a na trvání fáze zotavení. Dobu pozorování je možno podle potřeby prodloužit. Rozhodující je doba, kdy se objeví a opět odezní projevy otravy, stejně jako doba do uhynutí, zvláště tam, kde je patrná tendence ke zpožděné mortalitě.
- 1.3.1 Příprava
- 1.3.3 Popis postupu
Zvířata se bezprostředně před expozicí zváží. Exponují se po dobu 4 hodin od ustavení rovnováhy koncentrace studované látky. Nastavení rovnováhy by mělo být rychlé. Teplota během pokusu má být 22 °C ± 3 °C. Relativní vlhkost má být ideálně mezi 30 % a 70 %, s výjimkou případů, kde to není možné (např. experimenty s aerosoly). Udržování mírného podtlaku uvnitř komory (≤ 5 mm vodního sloupce) zabrání unikání testované látky do okolí. Během expozice se nepodává potrava ani voda.
Používají se vhodné systémy pro vytvoření a monitorování testovací atmosféry. Systém musí zaručovat, že stabilních podmínek expozice bude dosaženo co nejrychleji. Konstrukce a provoz boxu má zajišťovat homogenní distribuci testované atmosféry v komoře.
- Je třeba zajistit měření nebo monitorování podmínek expozice:
(a) průtok vzduchu (kontinuálně),
(b) skutečná koncentrace studované látky se měří v dýchací zóně alespoň třikrát během expozice (některá ovzduší, např. aerosoly ve vysoké koncentraci, mohou vyžadovat častější monitorování). Během jedné expozice se nemá koncentrace odchylovat od střední hodnoty o více než ± 15 %. U některých aerosolů, kde této úrovně regulace není možné dosáhnout, se připouští větší rozsah kolísání. Po celou dobu trvání experimentu mají být koncentrace tak stabilní, jak je to prakticky možné. Pokud se týká částic a aerosolů, měří se distribuce velikosti částic tak často, jak to pokus vyžaduje (ale nejméně jednou pro každou testovanou skupinu),
(c) teplota a vlhkost vzduchu se měří kontinuálně.
Během expozice i po jejím skončení se pozorování provádějí a zaznamenávají systematicky. Každé zvíře má svůj individuální protokol. Během prvního dne je třeba provádět pozorování často. Minimálně jednou každý pracovní den je třeba provést pečlivé klinické vyšetření. Další každodenní pozorování a odpovídající opatření mají sloužit maximálnímu snížení ztrát zvířat ve studii, např. pitvou nebo zmrazením uhynulých zvířat nebo izolací či utracením slabých nebo umírajících zvířat.
Pozorování zahrnuje změny kůže, srsti, očí, sliznic, dýchání a krevního oběhu, změny funkce autonomní a centrální nervové soustavy, somatomotorické aktivity a chování. Zvláštní pozornost je třeba věnovat vnějšímu dýchání, tremoru, křečovým jevům, slinění, průjmu, letargii, spánku a komatu. Okamžik uhynutí je třeba zachytit co nejpřesněji. Hmotnost jednotlivých zvířat se stanovuje po expozici týdně a v okamžiku uhynutí.
Zvířata, která během pokusu uhynou i ta, která přežijí do konce pokusu, se pitvají se zvláštním zřetelem ke všem změnám horní i dolní části dýchacího traktu. Všechny makroskopické patologické změny se zaznamenávají a odeberou se příslušné tkáně pro histopatologické vyšetření.
- Je třeba zajistit měření nebo monitorování podmínek expozice:
- 1.1 Úvod
- 2 ÚDAJE
Údaje se sestaví do tabulky. Z ní musí být pro každou experimentální skupinu patrný počet zvířat na počátku pokusu, doba uhynutí jednotlivých zvířat, počet zvířat vykazujících další příznaky toxicity, popis toxických účinků a pitevní nálezy. Změny hmotnosti je třeba vypočítat a zaznamenat pokud zvířata přežijí déle než 1 den. Zvířata, která jsou humánně utracena s ohledem na utrpení nebo k bolestem vyvolaným testovanou látkou, jsou zaznamenána jako uhynutí vyvolaná testovanou látkou. LC50 se vypočte uznávanou metodou. Dále se hodnotí vztah - pokud existuje - mezi expozicí zvířete testované látce a výskytem a stupněm všech abnormalit, včetně změn chování, klinických symptomů, makroskopických poškození, změn tělesné hmotnosti, mortality a všech dalších toxických účinků.
- 3 PROJEKT POKUSU, PROTOKOL POKUSU A ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA
V souladu se s příslušnými právními předpisy9) musí být zpracován projekt pokusu a o průběhu pokusu je nutno vést protokol.
- Zpráva o průběhu pokusu obsahuje následující informace:
- - živočišný druh, kmen, původ, podmínky ustájení, potrava, atd.
- - podmínky pokusu: popis expozičního zařízení včetně konstrukce, typu, rozměrů, zdroje vzduchu, systému přípravy aerosolů, klimatizačního systému a způsobu umístění zvířat v expozičním boxu, pokud je používán. Je třeba popsat přístroje pro měření teploty, vlhkosti vzduchu, koncentrace a distribuce velikosti částic aerosolu.
- - údaje o expozici se sestaví do tabulky a uvedou spolu s průměrnými hodnotami a charakteristikou variability (např. směrodatnou odchylkou). Mají pokud možno obsahovat tyto údaje:
- a) rychlost průtoku vzduchu v inhalačním zařízení;
- b) teplota a vlhkost vzduchu;
- c) nominální koncentrace (celkové množství testované látky přiváděné do inhalačního zařízení, dělené objemem vzduchu);
- Poznámka: při expozici aerosolům látek v roztoku (např. ve vodě) je třeba uvádět nejen výslednou koncentraci látky ve vzduchu, nýbrž také, pokud je to možné, koncentraci účinné látky ve vehikulu.
- d) povaha vehikula, pokud bylo užito;
- e) skutečná koncentrace v dýchací zóně;
- f) hmotnostní medián aerodynamického průměru (MMAD) a geometrická směrodatná odchylka (GSD);
- g) doba do ustavení rovnováhy;
- h) doba expozice;
- - tabulky toxických reakcích podle pohlaví a úrovně expozice (tj. počet zvířat, která v pokuse uhynula nebo byla humánně utracena; počet zvířat s příznaky toxicity; počet exponovaných zvířat);
- - doba uhynutí během expozice nebo po jejím skončení, důvody a kritéria pro humánní utracení zvířat;
- - všechna pozorování;
- - hodnota LC50 pro každé pohlaví stanovená po skončení doby pozorování (s uvedením metody výpočtu);
- - 95%-ní interval spolehlivosti pro LC50 (pokud je možno jej stanovit);
- - křivka závislosti mortality na dávce (koncentraci) a její směrnice (pokud to dovoluje metoda stanovení);
- - pitevní nálezy;
- - všechny histopatologické nálezy.
- Zpráva o průběhu pokusu obsahuje následující informace:
Diskuse výsledků (se zvláštním zřetelem k vlivu případného utracení zvířat z humánních důvodů během testu na vypočtenou hodnotu LC50).
Závěry.
B.3 AKUTNÍ TOXICITA DERMÁLNÍ
- 1 METODA je v souladu s právem Evropských společenství.2)
- 1.1 Princip metody
Testovaná látka se nanáší na kůži v odstupňovaných dávkách několika skupinám pokusných zvířat, a to každé skupině jedna úroveň dávky. Pozorují a zaznamenávají se účinky a případy uhynutí. Zvířata, která uhynou během pokusu, i zvířata, která přežijí konec pokusu, se pitvají.
Zvířata se závažnými a přetrvávajícími příznaky utrpení a bolesti je třeba humánním způsobem utratit. Testované látky se nemají podávat v takových dávkách a takovým způsobem, o kterých je známo, že vyvolávají značnou bolest a utrpení následkem svých leptavých nebo dráždivých vlastností.
- 1.2 Popis metody
- 1.2.1 Příprava
Nejméně 5 dnů před testem jsou zvířata chována v pokusných nádobách v podmínkách ustájení a krmení, v jakých budou během experimentu. Před testem se zdravá mladá dospělá zvířata náhodně přiřadí do jednotlivých experimentálních skupin. Asi 24 hodin před zahájením testu se srst zvířat na zádech ostříhá nebo oholí. Při stříhání nebo holení srsti je třeba dbát na to, aby se nepoškodila (např. abrazí) kůže, což by mohlo změnit její propustnost. Pro aplikaci testované látky se připraví nejméně 10 % povrchu těla. Při pokusech s pevnými látkami, případně připravenými v práškové formě, je třeba látku dostatečně navlhčit vodou nebo vhodným vehikulem, aby byl dobrý kontakt s kůží. Při použití vehikula je nutné brát v úvahu vliv vehikula na průnik testované látky kůží. Výběr vehikula by se měl řídit tím, v jaké formě se může daná látka dostat do styku s lidskou kůží, a ze všech relevantních způsobů vybrat ten, který nejvíce usnadňuje průnik kůží. Testované kapaliny se zpravidla aplikují neředěné.
- 1.2.2 Experimentální podmínky
- 1.2.2.1 Pokusná zvířata
Pokusná zvířata jsou vybrána s ohledem na druh, pohlaví, a stáří v souladu s ustanovením § 15 zvláštního právního předpisu10) a označena tak, aby byla možná identifikace jednotlivých zvířat. Dobu navykání stanoví § 10 zvláštního právního předpisu.10)
Používá se dospělých potkanů nebo králíků. Lze použít i jiné živočišné druhy, pokud jsou pro to důvody. Je třeba volit známé kmeny pokusných zvířat. Na začátku testu by nemělo variační rozpětí hmotnosti zvířat (pro každé pohlaví zvlášť) překročit ± 20 % střední hodnoty.
- 1.2.2.2 Počet a pohlaví
Pro každou úroveň dávek použít nejméně 5 zvířat stejného pohlaví. Používá-li se samic, musí být nullipary a nesmí být březí. Pokud je k dispozici informace, že jedno z obou pohlaví je výrazně citlivější, je třeba používat zvířata tohoto pohlaví.
- Poznámka: Používají-li se v akutních testech toxicity zvířata vyšších druhů, než jsou hlodavci, mělo by se zvážit použití menšího počtu zvířat. Dávky je třeba pečlivě zvolit a je třeba zajistit, aby se nepřekročily mírně toxické dávky. V těchto testech je třeba vyhnout se podávání letálních dávek testované látky.
- 1.2.2.1 Pokusná zvířata
- 1.2.2.3 Dávkování
Má být dostatečný počet dávkových úrovní, nejméně tři, a mají být vhodně odstupňovány tak, aby vznikly testovací skupiny se zřetelným rozsahem toxických účinků a mortality. Při rozhodování o úrovních dávek je třeba vzít v úvahu dráždivé nebo leptavé účinky testované látky. Získané údaje musí stačit na znázornění vztahu mezi dávkou a účinkem, a umožnit stanovení LD50 s přijatelnou spolehlivostí.
- 1.2.2.4 Limitní test
Lze provést limitní test jednou dávkou nejméně 2000 mg.kg-1 tělesné hmotnosti na skupinách 5 samců a 5 samic s použitím výše popsaných postupů. Pokud látka způsobí uhynutí, je třeba provést úplnou studii.
- 1.2.2.5 Doba pozorování
Doba pozorování má být nejméně 14 dní. Nelze ji však stanovit rigorózně. Měla by být určena podle obrazu otravy, rychlosti vývoje otravy a trvání fáze zotavení. Dobu pozorování je možno podle potřeby prodloužit. Rozhodující je doba, kdy se příznak otravy projeví a vymizí a doba do uhynutí, zvláště tam, kde je patrná tendence k výskytu pozdních uhynutí.
- 1.2.1 Příprava
- 1.2.3 Popis postupu
Zvířata se chovají jednotlivě v klecích. Testovaná látka se nanese rovnoměrně na plochu, která činí asi 10 % celkového povrchu těla. Pro vysoce toxické látky může být tato plocha menší; mělo by se však aplikovat stejnoměrně na co největší část této plochy.
Testovaná látka je po expoziční dobu 24 hodin udržována v kontaktu s kůží pomocí porézního mulového obvazu a nedráždivé náplasti. Testovanou plochu je dále třeba vhodným způsobem překrýt, aby se mulový obvaz a testovaná látka fixovaly a aby se zabránilo orálnímu příjmu. K zamezení požití látky je možno použít i prostředků pro omezení volnosti pohybu, úplnou imobilizaci však nelze doporučit.
Po uplynutí doby expozice se odstraní zbytky testované látky, pokud možno vodou nebo jiným vhodným způsobem se provede očištění pokožky.
Pozorování je třeba ihned systematicky zaznamenávat. Pro každé zvíře je třeba vést samostatné záznamy. První den se zvířata pozorují často. Nejméně jednou každý pracovní den je třeba provést pečlivé klinické vyšetření. Další každodenní pozorování a odpovídající opatření mají sloužit maximálnímu snížení ztrát zvířat pro studii, např. pitvou nebo zmrazením uhynulých zvířat nebo izolací a utracením slabých či umírajících zvířat.
Pozorování zahrnuje změny srsti, kůže, na kterou byla provedena aplikace, očí a sliznic, a také dýchání a krevního oběhu, změny funkce autonomní a centrální nervové soustavy, somatomotorické aktivity a chování. Zvláštní pozornost je třeba věnovat tremoru, křečovým jevům, slinění, průjmu, letargii, spánku a komatu.
Okamžik uhynutí je třeba zachytit co nejpřesněji. Zvířata, která během pokusu uhynou, i která přežijí až do konce pokusu, se pitvají. Všechny makroskopické patologické změny se zaznamenávají a poškozené tkáně se odeberou pro histopatologické vyšetření.
- 1.2.3.1 Hodnocení toxicity u druhého pohlaví
Po dokončení studie na jednom pohlaví se podá látka nejméně jedné skupině o pěti zvířatech druhého pohlaví, aby se zjistilo, zda zvířata druhého pohlaví nejsou výrazně citlivější na testovanou látku. V konkrétních případech může být odůvodněno použití menšího počtu zvířat. Pokud je k dispozici spolehlivá informace, že zvířata testovaného pohlaví jsou výrazně citlivější, testování na zvířatech druhého pohlaví je možno vynechat.
- 1.2.3.1 Hodnocení toxicity u druhého pohlaví
- 1.1 Princip metody
- 2 ÚDAJE
Údaje se sestaví do tabulky. Z ní musí být pro každou experimentální skupinu patrný počet zvířat na počátku pokusu, doba uhynutí jednotlivých zvířat, počet zvířat s jinými projevy otravy, popis toxických účinků a pitevních nálezů. Stanovení hmotnosti jednotlivých zvířat se provede bezprostředně před podáním testované látky, pak v týdenních intervalech a před utracením. Změny hmotnosti je třeba stanovit a zaznamenat, přežijí-li zvířata déle než jeden den. Zvířata, která byla humánním způsobem utracena s ohledem na stres a bolesti vyvolané podanou látkou, se zaznamenávají jako uhynutí vyvolané touto látkou. LD50 se vypočte uznávanou metodou. Dále se hodnotí vztah, pokud existuje, mezi expozicí zvířat testované látce a výskytem a stupněm všech abnormalit včetně změn chování, klinických symptomů, makroskopických lézí, změn tělesné hmotnosti, mortality a všech ostatních toxických účinků.
- 3 PROJEKT POKUSU, PROTOKOL POKUSU A ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA
V souladu se s příslušnými právními předpisy9) musí být zpracován projekt pokusu a o průběhu pokusu je nutno vést protokol.
- Zpráva o průběhu pokusu obsahuje tato informace:
- - živočišný druh, kmen, původ, podmínky chovu, potrava atd.,
- - podmínky pokusu (včetně způsobu očištění kůže a typu obvazu: okluzívní nebo neokluzívní),
- - úrovně dávek (včetně vehikula, pokud je užito) a koncentrace,
- - pohlaví pokusných zvířat,
- - tabulky toxických reakcí podle pohlaví a podle dávek (počet zvířat uhynulých nebo humánně utracených během testu; počet zvířat s příznaky toxicity; počet exponovaných zvířat),
- - doba uhynutí po podání testované látky, důvody a kritéria pro humánní utracení zvířat,
- - všechna pozorování,
- - hodnota LD50 pro to pohlaví, u kterého byl proveden úplná studie, a to pro 14-tidenní pozorování (s uvedením metody vypočtu),
- - 95%-ní interval spolehlivosti pro LD50 (pokud jej lze stanovit),
- - křivka závislosti mortality na dávce a její směrnice (pokud je stanovení danou metodou možné),
- - pitevní nálezy,
- - všechny histopatologické nálezy,
- - výsledky všech testů na druhém pohlaví,
Diskuse s rozborem výsledků (zvláštní pozornost věnovat možnému ovlivnění vypočtené hodnoty LD50 v souvislosti s utracením zvířat z humánních důvodů během testu).
Závěry.
- Zpráva o průběhu pokusu obsahuje tato informace:
B.4 KOŽNÍ DRÁŽDIVOST
- 1 METODA je v souladu s právem Evropských společenství společenství.2)
- 1.1 Princip metody
Výchozí úvahy
Je třeba pečlivě zvážit všechny dostupné informace o dané látce s cílem snížit na minimum testování látky za podmínek, které mohou vyvolat výrazné těžké reakce. Následující informace může být užitečná pro posouzení, zda je vhodný úplný test, studie na jediném zvířeti nebo zda není zapotřebí další testování.
- a) Fyzikálně-chemické vlastnosti a chemická reaktivita. Silně kyselé nebo zásadité látky (např. pH rovné či menší 2 nebo pH rovné či větší 11,5) není třeba testovat na primární kožní dráždivost, jestliže mohou být očekávány leptavé účinky. Je třeba vzít v úvahu také alkalickou nebo kyselou rezervu.
- b) Jestliže jsou dostupné přesvědčivé doklady závažných účinků látky ze spolehlivě validizovaných in vitro testů, není vyžadován úplný test.
- c) Výsledky ze studií akutní toxicity. Jestliže byla látka v testu akutní toxicity po dermální aplikaci studována při limitní úrovni dávky (2000 mg.kg-1 tělesné hmotnosti) a nebylo pozorováno podráždění kůže, není třeba dále testovat kožní dráždivost. Rovněž není třeba testovat látky vysoce toxické při dermální cestě vstupu.
Studovaná látka se nanese v jednorázové dávce na kůži několika pokusných zvířat, přičemž každé zvíře slouží jako svoje vlastní kontrola. Po stanovené době se odečte, vyhodnotí a následně popíše stupeň podráždění, aby bylo možno provést úplné posouzení účinků. Doba pozorování musí být tak dlouhá, aby bylo možné plně zhodnotit také reverzibilitu pozorovaných účinků.
Zvířata se závažnými a přetrvávajícími příznaky utrpení a bolesti je třeba humánním způsobem utratit.
- 1.2 Popis metody
- 1.2.1 Příprava
Asi 24 hodin před zahájením testu se srst zvířat na zádech ostříhá nebo oholí. Při střihání nebo holení srsti je třeba dbát na to, aby se nepoškodila kůže (např. abrazí). Je možno použít pouze zvířata se zdravou, neporaněnou kůží.
Některé kmeny králíka mají ostrůvky husté srsti, které jsou výraznější v některých obdobích roku. Testované látky se nesmí nanášet na tyto zóny růstu husté srsti.
Při pokusech s pevnými látkami, případně připravenými v práškové formě, je třeba testovanou látku dostatečně navlhčit vodou, případně jiným vhodným vehikulem, aby byl dobrý kontakt s kůží. Při použití vehikula je nutné brát v úvahu vliv vehikula na podráždění kůže testovanou látkou. Testované kapaliny se zpravidla aplikují nezředěné.
- 1.2.2 Experimentální podmínky
- 1.2.2.1 Pokusná zvířata
Je možné použít různé druhy savců, je však třeba dát přednost albinotickému králíkovi.
- 1.2.2.2 Počet zvířat
Jestliže je na základě výsledků z in vitro screeningových testů nebo z jiných důvodů podezření, že látka může vyvolávat nekrózu (např. je leptavá) je třeba uvážit provedení testu na jednom zvířeti. Jestliže výsledky tohoto testu nenaznačují leptavé účinky, je třeba doplnit testování na dvou dalších zvířatech.
Pro úplný test jsou nutná nejméně tři zdravá dospělá zvířata. Není třeba zvláštních zvířat pro neošetřenou kontrolní skupinu, pro vyjasnění případů nejednoznačných reakcí mohou být použita další zvířata.
- 1.2.2.3 Dávkování
Pokud nejsou žádné zvláštní důvody pro jiný postup, nanese se na testovací místo kůže 0,5 ml kapaliny nebo 0,5 g tuhé nebo polotuhé látky. Přilehlé oblasti neošetřené kůže zvířete slouží v testu jako vlastní kontrola.
- 1.2.2.4 Doba pozorování
Dobu pozorování není možno stanovit rigorózně. Musí být dostatečně dlouhá, aby bylo možno úplně vyhodnotit vratnost nebo nevratnost účinků. Normálně není třeba překračovat dobu 14 dnů po aplikaci.
- 1.2.2.1 Pokusná zvířata
- 1.2.3 Popis postupu
Zvířata se chovají jednotlivě v klecích. Testovaná látka se nanese na malou plochu (asi 6 cm2) kůže a pokryje se plátkem mulu přidržovaným nedráždivou náplastí. U kapalin a některých past může být vhodné nanést nejprve testovanou látku na mul, a pak jej připevnit na kůži. Po dobu trvání expozice je třeba přidržovat plátek volně na kůži vhodným okluzívním nebo částečně okluzívním obvazem. Je třeba zabránit tomu, aby se zvíře dostalo k mulu a mohlo přijmout testovanou látku orálně nebo ji vdechnout.
Na konci doby expozice je třeba odstranit zbylou testovanou látku vodou, pokud je to možné, nebo vhodným rozpouštědlem, ale tak, aby nebyla ovlivněna případná reakce kůže nebo celistvost pokožky.
Doba expozice je obvykle 4 hodiny.
Pokud existuje podezření, že látka může vyvolat nekrózu (např.tím, že působí poleptání, je třeba zkrátit délku expozice (např. na 1 hodinu nebo 3 minuty). Při takovém testování je možné použít nejprve jediné zvíře a aplikovat 3 plátky mulu současně, pokud to akutní dermální toxicita testované látky nevylučuje. První plátek se odstraní po 3 minutách. Pokud není pozorována závažná kožní reakce, odstraní se druhý plátek po 1 hodině. Pokud pozorování v této fázi naznačují, že je nezbytná 4-hodinová expozice a že neodporuje principu humánního zacházení, odstraní se třetí plátek po 4 hodinách a klasifikují se stupně odpovědi kůže. V případě, že byla možná 4 hodinová expozice, je třeba doplnit test s použitím nejméně dvou dalších zvířat; pokud to není kontraindikováno z humánních důvodů (např. jestliže po 4 hodinách expozice je pozorována nekróza kůže).
Jestliže je závažná kožní reakce (např. nekróza) pozorována po 3 minutách nebo po 1 hodině, je test okamžitě ukončen.
Za určitých podmínek je možné navrhnout delší expozice, například pokud to odpovídá očekávanému způsobu použití a expozici u člověka.
- 1.2.3.1 Pozorování a vyhodnocení
Zvířata je třeba pozorovat na příznaky erytému a kožního edému a stupeň reakce kůže po 60 minutách a dále 24, 48 a 72 hodin po odstranění plátku s testovanou látkou. Stupeň podráždění kůže se klasifikuje a zaznamenává podle systému uvedeného v tabulce č. 6. Jestliže nebylo během 72 hodin dosaženo úplného odeznění reakce, provádí se pozorování dále. Vedle podráždění kůže je třeba podrobně popsat všechny závažné léze jako je poleptání (nevratná destrukce kožní tkáně) a jiné toxické účinky. K objasnění pochybných reakcí nebo odpovědí, maskovaných zabarvením kůže testovanou látkou, je třeba použít technik histopatologického vyšetření nebo měření tloušťky kožní řasy.
- 1.2.3.1 Pozorování a vyhodnocení
- 1.2.1 Příprava
- 1.1 Princip metody
- 2 ÚDAJE
Údaje se sestaví do tabulky. Z ní musí být pro každé pokusné zvíře patrný stupeň podráždění posouzením erytému a edému po celou dobu pozorování. Je třeba rovněž uvést všechny závažné léze, popis stupně a povahy podráždění kůže, reversibilitu nebo poleptání a všechny další pozorované toxické účinky.
- 3 PROJEKT POKUSU, PROTOKOL POKUSU A ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA
V souladu se s příslušnými právními předpisy9) musí být zpracován projekt pokusu a o průběhu pokusu je nutno vést protokol.
- Zpráva o průběhu pokusu obsahuje tyto informace:
- - živočišný druh, kmen, původ, podmínky chovu, potrava atd.,
- - experimentální podmínky (včetně relevantních fyzikálně chemických vlastností testované látky, technik přípravy a čištění kůže, typ obvazu: okluzívní, semiokluzívní),
- - ve formě tabulky údaje o kožní reakci pro každé jednotlivé zvíře při každém pozorování (za 1, 24, 48 a 72 hodin atd. po odstranění mulu),
- - popis zjištěných vážných poškození včetně poleptání,
- - popis intenzity a povahy zjištěného podráždění a případně histopatologických nálezů,
- - popis všech dalších toxických účinků vedle podráždění kůže.
Diskuse výsledků.
Závěry.
Tabulka č. 6
Stupnice reakce kůže
Tabulka č. 1 Hodnocení a interpretace výsledků testu. B.1 tris AKUTNÍ TOXICITA ORÁLNÍ (PER OS) METODA STANOVENÍ TŘÍDY AKUTNÍ TOXICITY Tabulka č. 2 Postup testování s výchozí dávkou 25 mg.kg-1 tělesné hmotnosti Tabulka č. 3 Postup testování s výchozí dávkou 200 mg.kg-1 tělesné hmotnosti Tabulka č. 4 Postup testování s výchozí dávkou 2000 mg.kg-1 tělesné hmotnosti Tabulka č. 5 Interpretace výsledků založených na testovací variantě 1 Výchozí dávka 25 mg/kg tělesné hmotnosti Výchozí dávka 200 mg/kg tělesné hmotnosti Výchozí dávka 2000 mg/kg tělesné hmotnosti B.2 AKUTNÍ TOXICITA INHALAČNÍ B.3 AKUTNÍ TOXICITA DERMÁLNÍ B.4 KOŽNÍ DRÁŽDIVOST Tabulka č. 6 Stupnice reakce kůže Hodnocení erytému a příškvaru Hodnota Žádný erytém 0 Velmi slabý erytém (stěží viditelný) 1 Zřetelně viditelný erytém 2 Mírný až výrazný erytém 3 Těžký erytém (silné zrudnutí) nebo tvorba příškvaru (hloubkové poškození - nekróza) znemožňující posouzení erytému 4 Hodnocení edému Žádný edém 0 Velmi lehký edém (stěží viditelný) 1 Lehký edém (okraje jsou zřetelné, plocha je ohraničena zřetelným vyvýšením) 2 Mírný edém (okraje vyvýšeny asi o 1 mm) 3 Výrazný edém (zduření více než 1 mm a otok přesahující hranice exponované plochy) 4 - Zpráva o průběhu pokusu obsahuje tyto informace:
B.5 OČNÍ DRÁŽDIVOST
- 1 METODA je v souladu s právem Evropských společenství.2)
- 1.1 Princip metody
- 1.1.1 Výchozí úvahy
Je třeba pečlivé zvážit všechny dostupné informace o dané látce s cílem snížit na minimum testování látky. Přihlíží se k následujícím informacím.
- a) Fyzikálně-chemické vlastnosti a chemická reaktivita. Např. silně kyselé nebo zásadité látky, které - jak je možno očekávat - vyvolají v oku pH rovné či menší 2 nebo pH rovné či větší 11,5, není třeba testovat, pokud lze očekávat závažná poškození. Je třeba vzít v úvahu také alkalickou nebo kyselou rezervu.
- b) Výsledky spolehlivě validizovaných alternativních studií; látky s prokázanými potenciálně leptavými nebo silně dráždivými vlastnostmi nemají být dále testovány na dráždivost pro oko, protože lze předpokládat, že tyto látky budou mít závažné účinky na oko při testování touto metodou.
- c) Výsledky ze studií kožní dráždivosti. Látky, které vykazovaly zřejmé leptavé nebo výrazně dráždivé účinky na kůži ve studii kožní dráždivosti, není třeba dále testovat na dráždivost pro oko, protože lze předpokládat že budou mít na oči závažné účinky.
Testovaná látka se v jednorázové dávce aplikuje do jednoho oka několika pokusným zvířatům, přitom neexponované oko slouží jako kontrola. Ve stanovených intervalech se odečte a vyhodnotí stupeň podráždění a reakce se dále popíše, aby bylo možno provést úplné posouzení účinku. Doba pozorování musí být dostatečně dlouhá, aby bylo možné jednoznačně zhodnotit také vratnost nebo nevratnost pozorovaných účinků.
Zvířata se závažnými a přetrvávajícími příznaky utrpení a bolesti je třeba humánním způsobem utratit.
- 1.1.1 Výchozí úvahy
- 1.2 Popis metody
- 1.2.1 Příprava
24 hodin před testem se u každého z předběžně vybraných pokusných zvířat provede vyšetření obou očí. Zvířata, u kterých se zjistí podráždění očí, oční defekt nebo poškození rohovky se z experimentu vyloučí.
- 1.2.2 Experimentální podmínky
- 1.2.2.1 Pokusná zvířata
- 1.2.1 Příprava
- 1.1 Princip metody