Vyhláška, kterou se stanoví základní metody pro zkoušení toxicity chemických látek a chemických přípravků

1. — v případech, kdy odborný posudek potvrdí spolehlivé informace, které naznačují potenciál pro významné akutní účinky vyplývající z jiných studií na pokusných zvířatech.

ZKOUŠENÍ V DÁVKÁCH PŘESAHUJÍCÍCH 2 000 mg/kg

Ve výjimečných případech, a pouze je-li to odůvodněno specifickými regulačními potřebami, lze zvážit použití další nejvyšší úrovně fixní dávky 5 000 mg/kg. S ohledem na potřebu ochrany dobrého zacházení s pokusnými zvířaty se zkoušení v dávkách 5 000 mg/kg nedoporučuje a mělo by se zvažovat pouze v případě, že existuje velká pravděpodobnost, že výsledky takové zkoušky by měly přímý význam pro ochranu pokusných zvířat nebo lidského zdraví^7a).

Orientační studie

Pravidla pro rozhodování, jimiž se řídí metoda postupného podávání dávek uvedená v tabulce 1, se rozšíří tak, aby zahrnovala úroveň dávky 5 000 mg/kg. Pokud se v orientační studii použije výchozí dávka 5 000 mg/kg, výsledek A (úhyn) povede k nutnosti zkoušet na druhém pokusném zvířeti dávku 2 000 mg/kg. Výsledky B a C (zřejmá toxicita nebo žádná toxicita) umožní zvolit dávku 5 000 mg/kg za výchozí dávku hlavní studie. Podobně pokud se použije výchozí dávka jiná než 5 000 mg/kg, zkoušení pokračuje na úroveň 5 000 mg/kg v případě, že se při 2 000 mg/kg zjistí výsledky B nebo C. Následný výsledek A při 5 000 mg/kg bude vyžadovat výchozí dávku hlavní studie 2 000 mg/kg a výsledky B a C budou vyžadovat výchozí dávku v hlavní studii 5 000 mg/kg.

Hlavní studie

Pravidla pro rozhodování, jimiž se řídí metoda postupného podávání dávek uvedená v tabulce 2, se rozšíří tak, aby zahrnovala úroveň dávky 5 000 mg/kg. Pokud se tedy v hlavní studii použije výchozí dávka 5 000 mg/kg, bude výsledek A (≥ 2 úhyny) vyžadovat zkoušení dávky 2 000 mg/kg na druhé skupině. Výsledek B (zřejmá toxicita nebo ≤1 úhyn) nebo C (žádná toxicita) povedou k tomu, že látka nebude podle GHS klasifikována. Podobně pokud se použije výchozí dávka jiná než 5 000 mg/kg, zkoušení pokračuje na úroveň 5 000 mg/kg v případě, že se při 2 000 mg/kg zjistí výsledek C. Následný výsledek A při 5 000 mg/kg povede k tomu, že se látka přiřadí do kategorie 5 GHS a na základě výsledku B nebo C látka nebude klasifikována.

Tabulka 4: ZKUŠEBNÍ METODA

B.1 bis – Pokyny ke klasifikaci podle systému EU pro přechodné období do plného zavedení globálně harmonizovaného systému klasifikace (GHS) (převzato z literatury^7a))

B.1 tris AKUTNÍ TOXICITA ORÁLNÍ – METODA STANOVENÍ TŘÍDY AKUTNÍ TOXICITY

1. 1 METODA je v souladu s právem Evropských společenství.^7a)
   1. 1.1 ÚVOD

      Metoda stanovení třídy akutní toxicity^7a) stanovená v této zkoušce je metodou po krocích, přičemž u každého kroku se používají 3 pokusná zvířata stejného pohlaví. V závislosti na mortalitě nebo stavu agónie pokusných zvířat lze o akutní toxicitě zkoušené látky rozhodnout průměrně na základě 2 až 4 kroků. Tato metoda je reprodukovatelná, vyžaduje méně pokusných zvířat a dokáže látky zařadit podobně jako jiné metody zkoušení akutní toxicity. Metoda stanovení třídy akutní toxicity je založena na biometrickém hodnocení^7a) s fixními dávkami, přiměřeně oddělenými tak, aby umožnila zařazení látky pro účely klasifikace a posouzení nebezpečnosti. Na metodu přijatou v roce 1996 byly provedeny rozsáhlé národní^7a) i mezinárodní^7a) validační studie in vivo pro srovnání s hodnotami LD₅₀ získanými z literatury.

      Není nutné podávat zkoušené látky v dávkách, o nichž je známo, že v důsledku leptavých nebo výrazně dráždivých účinků vyvolávají značnou bolest a utrpení. Umírající pokusná zvířata nebo pokusná zvířata, která zjevně projevují příznaky bolesti nebo značného a přetrvávajícího utrpení, se humánně utratí a při interpretaci výsledků jsou hodnocena jako pokusná zvířata uhynulá při zkoušce. Kritéria rozhodování o utracení umírajících nebo značně trpících pokusných zvířat a poučení týkající se rozpoznání předvídatelného nebo blížícího se uhynutí lze nalézt v literatuře^7a).

      Metoda využívá předem stanovených dávek a její výsledky umožňují látku zařadit a klasifikovat podle globálně harmonizovaného systému klasifikace chemických látek, které způsobují akutní toxicitu^7a).

      V zásadě tato metoda neslouží k vypočtení přesné hodnoty LD₅₀, ale umožňuje určit definované rozpětí expozice, při které se předpokládá letalita, neboť hlavním koncovým vyhodnocením této zkoušky zůstává uhynutí části pokusných zvířat. Metoda umožňuje stanovit hodnotu LD₅₀, pouze pokud alespoň dvě dávky vedou k mortalitě vyšší než 0 % a nižší než 100 %. Použití výběru předem stanovených dávek bez ohledu na zkoušenou látku, u něhož se klasifikace explicitně váže k počtu pokusných zvířat pozorovaných v různých stavech, zvyšuje možnost konzistentního a opakovaného předávání zpráv mezi laboratořemi.

      Zkušební laboratoř by před provedením studie měla vzít v úvahu veškeré dostupné informace o zkoušené látce. Součástí těchto informací je totožnost a chemická struktura látky, její fyzikálně-chemické vlastnosti, výsledek jiných zkoušek toxicity dané látky in vivo nebo in vitro, toxikologické údaje o strukturně příbuzných látkách a očekávané použití látky. Tyto informace jsou nezbytné k tomu, aby byli všichni zainteresovaní přesvědčeni, že zkouška má význam pro ochranu lidského zdraví a pomůže při výběru nejvhodnější výchozí dávky.

   1. 1.2 DEFINICE

      Akutní orální toxicita: vztahuje se na nepříznivé účinky, které se projeví po orálním podání jedné dávky nebo více dávek látky během 24 h.

   1. 1.3 PODSTATA ZKOUŠKY
      1. Podstatou zkoušky je to, že se pomocí metody po krocích využívající minimálního počtu pokusných zvířat u každého kroku získají informace o akutní toxicitě zkoušené látky, které umožní její klasifikaci. Látka se skupině pokusných zvířat podává orálně v jedné ze stanovených dávek. Látka se zkouší metodou po krocích, přičemž u každého kroku se používají tři pokusná zvířata stejného pohlaví (obvykle samice). Přítomnost nebo nepřítomnost mortality vyvolané látkou u pokusných zvířat, jimž byla látka podána v jednom kroku, rozhodne o dalším kroku, tj.:
         1. — není třeba žádné další zkoušení,
         2. — podá se stejná dávka dalším třem pokusným zvířatům,
         3. — látka se podá dalším třem pokusným zvířatům v nejbližší vyšší nebo nejbližší nižší úrovni dávky.

         Podrobnosti postupu zkoušení jsou uvedeny v tabulce 5. Metoda umožní rozhodnout s ohledem na zařazení zkoušené látky do jedné z řady tříd toxicity definovaných fixními hraničními hodnotami LD₅₀.

   1. 1.4 POPIS METODY
      1. 1.4.1 Výběr druhu pokusných zvířat

         Upřednostňovaným druhem hlodavce je potkan, avšak lze použít i jiné druhy hlodavců. Obvykle se používají samice^7a). Je to proto, že přehled literatury o konvenčních zkouškách LD₅₀ ukazuje, že ačkoliv je mezi pohlavími obvykle malý rozdíl, pokud jde o citlivost, jsou samice v případech, ve kterých jsou rozdíly pozorovány, obecně nepatrně citlivější^7a). Pokud však poznatky o toxikologických nebo toxikokinetických vlastnostech strukturně příbuzných chemických látek naznačují, že citlivější jsou pravděpodobně samci, použije se toto pohlaví. Jestliže se zkouška provádí na samcích, je nutné podat náležité odůvodnění. Použijí se mladá zdravá dospělá pokusná zvířata běžně užívaných laboratorních kmenů. Samice musí být nullipary a nesmí být březí. Každé pokusné zvíře musí být na začátku podávání látky 8 až 12 týdnů staré a jeho hmotnost by se měla pohybovat v intervalu ± 20 % střední hmotnosti pokusných zvířat, kterým byla podána předchozí dávka.

      1. 1.4.2 Podmínky chovu a krmení

         Teplota v místnosti pro pokusná zvířata by měla být (22 ± 3) °C. Ačkoliv by relativní vlhkost měla být minimálně 30 % a pokud možno nepřesáhnout 70 % kromě doby úklidu místnosti, cílem by měla být hodnota 50 - 60 %. Osvětlení by mělo být umělé, mělo by se střídat 12 h světla a 12 h tmy, není-li v chovné místnosti denní světlo. Ke krmení lze použít obvyklé krmivo určené pro pokusná zvířata od registrovaného výrobce s neomezenou dodávkou pitné vody. Pokusná zvířata mohou být chována v klecích ve skupinách podle dávky v souladu s příslušným právním předpisem¹⁰), pokud není stanoveno projektem pokusů jinak, ale počet pokusných zvířat v kleci nesmí bránit nerušenému pozorování každého pokusného zvířete.

      1. 1.4.3 Příprava pokusných zvířat

         Pokusná zvířata jsou vybrána s ohledem na druh, pohlaví a stáří v souladu s ustanovením § 15 zvláštního právního předpisu¹⁰) a označena tak, aby byla možná identifikace jednotlivých pokusných zvířat. Dobu navykání stanoví § 10 zvláštního právního předpisu¹⁰).

      1. 1.4.4 Příprava dávek

         Zkoušená látka by obecně měla být při všech úrovních zkoušených dávek podávána v konstantním objemu pomocí úpravy koncentrace dávkovaného přípravku. V případech, kdy má být zkoušen kapalný konečný produkt nebo směs, může však mít použití nezředěné zkoušené látky, tj. s konstantní koncentrací, větší závažnost pro hodnocení následného rizika této látky. Ani v jednom případě nesmí být překročen maximální objem dávky. Maximální objem kapaliny, kterou lze jednorázově podat, závisí na velikosti pokusného zvířete. U hlodavců by objem obvykle neměl přesáhnout 1 ml/100 g tělesné hmotnosti: avšak u vodných roztoků připadá v úvahu i dávka 2 ml/100 g tělesné hmotnosti. S ohledem na složení dávkovaného přípravku se ve všech případech, kde je to možné, doporučuje použití vodného roztoku/suspenze/emulze, potom v pořadí podle preference použití roztoku/suspenze/emulze v oleji (např. v kukuřičném oleji) a nakonec případně roztoku v jiných vehikulech. U vehikul jiných než voda musí být známy jejich toxikologické charakteristiky. Dávky musí být připraveny krátce před podáním, pokud není stálost přípravku během doby, kdy bude používán, známa a neukáže se jako přijatelná.

   1. 1.5 POSTUP
      1. 1.5.1 Podávání dávek

         Zkoušená látka se podává sondou v jedné dávce pomocí žaludeční sondy nebo vhodné intubační rourky. Pokud výjimečně není možné podat dávku najednou, lze dávku podat po menších množstvích během nejvýše 24 h.

         Před podáním zkoušené látky nemají pokusná zvířata dostávat krmivo (např. potkanům by se nemělo podávat přes noc, myším 3 – 4 h), voda se však ponechává. Po uplynutí doby hladovění se pokusná zvířata zváží a podá se jim zkoušená látka. Po podání látky se zamezí přístupu ke krmivu na další 3 – 4 h u potkanů nebo 1 – 2 h u myší. Podává-li se látka po částech v průběhu určité doby, může být podle délky období nezbytné poskytnout pokusným zvířatům krmivo a vodu.

      1. 1.5.2 Počet pokusných zvířat a úrovně dávek

         V každém kroku se používají tři pokusná zvířata. Dávka, která bude použita jako výchozí, se zvolí z jedné ze čtyř fixních úrovní: 5, 50, 300 a 2 000 mg/kg tělesné hmotnosti. Výchozí dávka by měla být taková, která nejpravděpodobněji vyvolá uhynutí některých pokusných zvířat, jimž byla podána. Postup, který je nutno u každé výchozí dávky dodržet, je popsán ve vývojových diagramech v tabulce 5. Navíc je v tabulce 7 uvedeno poučení týkající se klasifikace v rámci systému EU, dokud nebude zaveden nový globálně harmonizovaný systém (GHS).

         Pokud dostupné informace naznačují, že mortalita nebude pravděpodobně při nejvyšší výchozí úrovni dávky (2 000 mg/kg tělesné hmotnosti) vyvolána, je nutné provést limitní zkoušku. Pokud nejsou o látce, která má být testována, k dispozici žádné informace, doporučuje se kvůli dodržování pravidla dobrého zacházení s pokusnými zvířaty použít výchozí dávku 300 mg/kg tělesné hmotnosti.

         Časový interval mezi experimentálními skupinami závisí na době nástupu, trvání a závažnosti příznaků toxicity. Expozice pokusných zvířat další dávce by měla být odložena, dokud nebude jisté, že pokusná zvířata, jimž byla podána předchozí dávka, přežila.

         Ve výjimečných případech a pouze je-li to odůvodněno specifickými regulačními potřebami, lze zvážit použití další nejvyšší úrovně dávky 5 000 mg/kg tělesné hmotnosti (viz tabulka 6). S ohledem na dobré zacházení s pokusnými zvířaty se pokusy na pokusných zvířatech v rámci kategorie 5 GHS (2 000 - 5 000 mg/kg) nedoporučují a měly by se zvažovat pouze tehdy, pokud existuje velká pravděpodobnost, že výsledky takové zkoušky budou mít přímý význam pro ochranu lidského zdraví, zdraví pokusných zvířat nebo životního prostředí.

      1. 1.5.3 Limitní zkouška

         Limitní zkouška se používá především tehdy, má-li osoba provádějící zkoušku informace svědčící o tom, že zkoušený materiál je pravděpodobně netoxický, tj. je toxický pouze nad rámec regulačních limitních dávek. Informace o toxicitě zkoušeného materiálu lze získat ze znalostí o podobných zkoušených sloučeninách, směsích nebo prostředcích s ohledem na totožnost a procento složek, o nichž se ví, že jsou toxikologicky významné. V situacích, kdy existuje jen málo informací nebo vůbec žádné informace o toxicitě nebo kdy se očekává, že zkoušený materiál bude toxický, by měla být provedena hlavní zkouška.

         Limitní zkoušku s jednou úrovní dávky 2 000 mg/kg tělesné hmotnosti lze provést na šesti pokusných zvířatech (tři pokusná zvířata na jeden krok). Výjimečně lze na třech pokusných zvířatech provést limitní zkoušku s jednou úrovní dávky 5 000 mg/kg (viz tabulka 6). Projeví-li se mortalita vyvolaná zkoušenou látkou, může být nutné provést další zkoušky s nejbližší nižší úrovní dávky.

   1. 1.6 POZOROVÁNÍ

      Po podání dávky se pokusná zvířata pozorují individuálně minimálně jednou během prvních 30 minut, pravidelně během prvních 24 h, přičemž zvláštní pozornost se věnuje prvním 4 h, a poté denně po dobu 14 dnů kromě případů, kdy je nutné pokusná zvířata ze studie vyjmout a humánně utratit kvůli dodržování pravidla dobrého zacházení s pokusnými zvířaty, nebo je zjištěn jejich úhyn. Doba pozorování by však neměla být stanovena pevně. Měla by být stanovena podle toxických reakcí, doby jejich nástupu a délky fáze zotavení, a může tedy být podle potřeby prodloužena. Doba, kdy se příznaky toxicity objeví a vymizí, je důležitá zejména v případě tendence ke zpožděným příznakům toxicity^7a). Veškerá pozorování se systematicky zaznamenávají, přičemž záznamy se vedou pro každé pokusné zvíře jednotlivě.

      Další pozorování bude nutné, jestliže pokusná zvířata dále vykazují příznaky toxicity. Pozorování zahrnují změny na kůži, na srsti, na očích, na sliznicích, a rovněž změny dýchání, krevního oběhu, změny funkce autonomní a centrální nervové soustavy, somatomotorické aktivity a chování. Pozornost je třeba věnovat třesu, křečím, slinění, průjmu, letargii, spánku a kómatu^7a). Pokusná zvířata ve stavu agónie a pokusná zvířata se známkami prudkých bolestí nebo přetrvávajícími příznaky značného utrpení se humánně utratí. Pokud jsou pokusná zvířata z humánních důvodů utracena nebo je zjištěn jejich úhyn, je nutné dobu uhynutí zaznamenat co nejpřesněji.

      1. 1.6.1 Tělesná hmotnost

         Hmotnosti jednotlivých pokusných zvířat se stanoví krátce před podáním zkoušené látky a nejméně jednou týdně poté. Vypočítají se změny hmotnosti a zaznamenají se. Na konci zkoušky se pokusná zvířata, která přežila, zváží a humánně utratí.

      1. 1.6.2 Patologie

         Všechna pokusná zvířata (včetně těch, která v průběhu zkoušky uhynula nebo byla utracena kvůli dodržování pravidla dobrého zacházení s pokusnými zvířaty) se pitvají. U každého pokusného zvířete se zaznamenají všechny makroskopické patologické nálezy. Lze také zvážit mikroskopické vyšetření orgánů, u nichž jsou patrné makroskopické patologie, u pokusných zvířat, která přežila 24 nebo více hodin, protože mohou poskytnout užitečné informace.

1. 2 DATA

   Měly by být uvedeny údaje pro každé jednotlivé pokusné zvíře. Navíc by měly být všechny údaje shrnuty do tabulky, přičemž se u každé zkušební skupiny uvede počet použitých pokusných zvířat, počet pokusných zvířat vykazujících příznaky toxicity, počet pokusných zvířat uhynulých v průběhu zkoušky nebo utracených z humánních důvodů, doba uhynutí jednotlivých pokusných zvířat, popis a časový průběh a vratnost toxických účinků a pitevní nálezy.

1. 3 PROJEKT POKUSU, PROTOKOL POKUSU A ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA

   V souladu s příslušnými právními předpisy⁹)^,10) musí být zpracován projekt pokusu a o průběhu pokusu je nutno vést protokol.

   1. 3.1 Zpráva o průběhu pokusu obsahuje tyto informace:
      1. Zkoušená látka:
         1. — fyzikální povaha, čistota a tam, kde je to podstatné, fyzikálně-chemické vlastnosti (včetně izomerizace),
         2. — identifikační údaje, včetně čísla CAS.
      1. Vehikulum (v případě potřeby):
         1. — zdůvodnění výběru vehikula, pokud není použita voda.
      1. Pokusná zvířata:
         1. — použitý druh/kmen,
         2. — mikrobiologický stav pokusných zvířat, je-li znám,
         3. — počet, stáří a pohlaví pokusných zvířat (případně včetně zdůvodnění použití samců místo samic),
         4. — původ, podmínky chovu, krmivo atd.
      1. Zkušební podmínky:
         1. — podrobné údaje o složení zkoušené látky, včetně podrobností o fyzikální formě podávaného materiálu,
         2. — podrobné údaje o způsobu podání zkoušené látky, včetně podávaných objemů a době podávání,
         3. — podrobné údaje o krmivu a kvalitě vody (včetně druhu/zdroje krmiva, zdroje vody),
         4. — zdůvodnění výběru výchozí dávky.
      1. Výsledky:
         1. — tabulky údajů o reakcích každého pokusného zvířete a o úrovni jeho dávky (tj. počet pokusných zvířat vykazujících příznaky toxicity, včetně uhynutí, povahy, závažnosti a trvání účinků),
         2. — tabulky údajů o tělesné hmotnosti a jejích změnách,
         3. — individuální hmotnosti pokusných zvířat v den podání dávky, poté v týdenních intervalech a v čase úhynu nebo utracení,
         4. — datum a doba úhynu, pokud předchází plánovanému usmrcení,
         5. — časový průběh nástupu příznaků toxicity u každého pokusného zvířete a zda byly vratné,
         6. — pitevní a histopatologické nálezy pro každé pokusné zvíře, pokud jsou k dispozici.

      Diskuse a interpretace výsledků.

      Závěry.

   Tabulka 5

   POSTUP, KTERÝ MÁ BÝT U KAŽDÉ Z VÝCHOZÍCH DÁVEK DODRŽEN

   OBECNÉ POZNÁMKY

   1. Systém zkoušení u každé výchozí dávky obsažený v této tabulce nastiňuje postup, podle kterého je třeba postupovat.
      1. — Tabulka 5 a: výchozí dávka je 5 mg /kg tělesné hmotnosti
      2. — Tabulka 5 b: výchozí dávka je 50 mg /kg tělesné hmotnosti
      3. — Tabulka 5 c: výchozí dávka je 300 mg/kg tělesné hmotnosti
      4. — Tabulka 5 d: výchozí dávka je 2 000 mg/kg tělesné hmotnosti

   Postup zkoušení se řídí naznačenými šipkami v závislosti na počtu humánně utracených nebo uhynulých pokusných zvířat.

   Tabulka 5a POSTUP ZKOUŠENÍ S VÝCHOZÍ DÁVKOU 5 mg/kg TĚLESNÉ HMOTNOSTI

   

   Tabulka 5b POSTUP ZKOUŠENÍ S VÝCHOZÍ DÁVKOU 50 mg/kg TĚLESNÉ HMOTNOSTI

   

   TABULKA 5c POSTUP ZKOUŠENÍ S VÝCHOZÍ DÁVKOU 300 mg/kg TĚLESNÉ HMOTNOSTI

   

   TABULKA 5d POSTUP ZKOUŠENÍ S VÝCHOZÍ DÁVKOU 2000 mg/kg TĚLESNÉ HMOTNOSTI

   

   Tabulka 6

   KRITÉRIA KLASIFIKACE ZKOUŠENÝCH LÁTEK S OČEKÁVANÝMI HODNOTAMI LD₅₀ PŘESAHUJÍCÍMI 2 000 mg/kg BEZ NUTNOSTI ZKOUŠENÍ

   1. Kritéria pro kategorii nebezpečnosti 5 mají umožnit identifikaci zkoušených látek, u nichž je nebezpečí akutní toxicity relativně nízké, avšak které mohou za určitých okolností pro citlivé jedince představovat nebezpečí. U těchto látek se předpokládá, že se jejich orální nebo dermální LD₅₀ nebo LD₅₀ ekvivalentních dávek podávaných jinými cestami pohybuje v rozmezí od 2 000 do 5 000 mg/kg. Zkoušenou látku lze klasifikovat v kategorii nebezpečnosti definované jako 2 000 mg/kg < LD₅₀ < 5 000 mg/kg (v GHS kategorie 5) v těchto případech:
      1. a) pokud je do této kategorie zařazena podle některého ze systémů zkoušení uvedeného v tabulce 5a – 5d, v závislosti na výskytech uhynutí,
      2. b) pokud jsou již k dispozici spolehlivé důkazy naznačující, že LD₅₀ se pohybuje v rozmezí hodnot kategorie 5, nebo pokud z jiných studií na pokusných zvířatech nebo toxických účinků na člověka vyplývají akutní obavy o lidské zdraví,
      3. c) pokud extrapolací, odhadem nebo měřením údajů není přiřazení do vyšší třídy nebezpečnosti odůvodněno a
         1. — pokud jsou k dispozici spolehlivé informace naznačující významné toxické účinky na člověka, nebo
         2. — pokud je během zkoušení orální cestou do hodnot kategorie 4 pozorováno uhynutí, nebo
         3. — v případech, kdy odborný posudek potvrdí závažné klinické příznaky toxicity při testování do hodnot kategorie 4 s výjimkou průjmu, piloerekce nebo rozcuchané srsti, nebo
         4. — v případech, kdy odborný posudek potvrdí spolehlivé informace, které naznačují potenciál pro významné akutní účinky vyplývající z jiných studií na pokusných zvířatech.

   ZKOUŠENÍ V DÁVKÁCH PŘESAHUJÍCÍCH 2 000 mg/kg

   S ohledem na potřebu ochrany dobrého zacházení s pokusnými zvířaty se zkoušení na pokusných zvířatech v kategorii 5 (5 000 mg/kg) nedoporučuje a mělo by se zvažovat pouze v případě, že existuje velká pravděpodobnost, že výsledky takové zkoušky mají přímý význam pro ochranu lidského zdraví nebo zdraví pokusných zvířat^7a). S vyššími úrovněmi dávek se žádné další zkoušky neprovedou.

   Pokud je vyžadováno zkoušení s dávkou 5 000 mg/kg, vyžaduje se pouze jeden krok (tj. tři pokusná zvířata). Pokud pokusné zvíře, jemuž byla podána dávka jako prvnímu, uhyne, pokračuje podávání s úrovní 2 000 mg/kg podle vývojového diagramu v tabulce 5. Pokud první pokusné zvíře přežije, podá se dávka dalším dvěma pokusným zvířatům. Pokud uhyne pouze jedno pokusné zvíře ze tří pokusných zvířat, očekává se, že hodnota LD₅₀ přesáhne 5 000 mg/kg. Pokud uhynou obě pokusná zvířata, pokračuje se podáním dávky 2 000 mg/kg.

   Tabulka 7
   METODA ZKOUŠENÍ B.1 tris: Pokyny ke klasifikaci podle systému EU pro přechodné období do plného zavedení globálně harmonizovaného systému klasifikace (GHS) (převzato z literatury^7a))

   
   
   
   
   

B.2 AKUTNÍ TOXICITA INHALAČNÍ

1. 1 METODA je v souladu s právem Evropských společenství.²),³)
   1. 1.1 Úvod

      Je užitečné před pokusem získat údaje o rozdělení velikosti částic, tenzi par, bodu tání, bodu varu, bodu vzplanutí a výbušnosti (jsou-li stanovitelné) testované látky.

   1. 1.2 Princip metody

      Několik skupin pokusných zvířat je exponováno studované látce po určenou dobu v odstupňovaných koncentracích, a to jedné koncentraci v každé skupině. Potom se zvířata pozorují a zjišťují se účinky a případy uhynutí. Zvířata, která během pokusu uhynou, i ta, která přežijí do konce pokusu, se pitvají.

      Zvířata se závažnými a přetrvávajícími příznaky utrpení a bolesti je třeba humánním způsobem utratit. Testované látky se nemají podávat v takových koncentracích a takovým způsobem, o kterých je známo, že vyvolávají značnou bolest a utrpení následkem svých leptavých nebo dráždivých vlastností.

   1. 1.3 Popis metody
      1. 1.3.1 Příprava

         Pokusná zvířata jsou vybrána s ohledem na druh, pohlaví, a stáří v souladu s ustanovením § 15 zvláštního právního předpisu¹⁰) a označena tak, aby byla možná identifikace jednotlivých zvířat. Dobu navykání stanoví § 10 zvláštního právního předpisu.¹⁰) Pokud to nevyžaduje typ používaného expozičního zařízení, není třeba podrobit zvířata simulované expozici.

         Pevné testované látky je třeba rozmělnit na částice příslušné velikosti. Pokud je třeba, přidá se k testované látce vhodné vehikulum tak, aby v ovzduší vznikla příslušná koncentrace testované látky; v tom případě se zařadí také kontrolní skupina s vehikulem. Pokud se užije pro usnadnění aplikace vehikulum nebo jiná aditiva, musí být o nich známo, že nemají toxický účinek. Existují-li vhodná historická data, je možno je využít.

      1. 1.3.2 Experimentální podmínky
         1. 1.3.2.1 Pokusná zvířata

            V pokusech se upřednostňují potkani, nejsou-li známy důvody proti jejich použití. Používá se běžně užívaných pokusných kmenů. Na začátku studie nemá variační rozpětí hmotnosti zvířat překročit ± 20 % střední hodnoty (pro každé pohlaví zvlášť).

         1. 1.3.2.2 Počet a pohlaví

            Pro každou dávkovou hladinu je třeba použít nejméně 10 hlodavců (5 samic a 5 samců). Samice musí být nullipary a nesmí být březí.

         2. Poznámka: Používají-li se v akutních testech toxicity zvířata vyšších druhů, než jsou hlodavci, mělo by se zvážit použití menšího počtu zvířat. Dávky je třeba pečlivě volit a je třeba zaručit, aby nebyly překročeny mírně toxické dávky. V těchto testech je třeba vyhnout se podávání letálních dávek testované látky.
         1. 1.3.2.3 Expoziční koncentrace

            Má být dostatečný počet úrovní dávek, nejméně 3, a mají být vhodně odstupňovány tak, aby byl u testovacích skupin viditelný rozsah toxických účinků a mortality. Získané údaje musí stačit na znázornění vztahu mezi dávkou a mortalitou a, pokud je to možné, musí umožnit stanovení LC₅₀ s přijatelnou spolehlivostí.

         1. 1.3.2.4 Limitní test

            Nedojde-li po 4 hodinové expozici 5 samců a 5 samic plynu v koncentraci 20 mg.l^-1 nebo parám či aerosolu tekuté nebo pevné látky v koncentraci 5 mg.l^-1 (nebo - v případech, kdy tuto koncentraci není možné použít v důsledku fyzikálních nebo chemických vlastností sledované látky včetně rizika výbuchu - při expozici maximální dosažitelné koncentraci) během 14 dnů k žádné mortalitě vyvolané sledovanou látkou, považují se další pokusy za zbytečné.

         1. 1.3.2.5 Doba expozice

            Nejkratší doba expozice má být 4 hodiny.

         1. 1.3.2.6 Vybavení

            Pro pokusy se zvířaty je třeba použít inhalační zařízení, které umožňuje dynamické proudění vzduchu s výměnou vzduchu nejméně dvanáctkrát za hodinu, aby byl zaručen přiměřený obsah kyslíku a rovnoměrné rozdělení látky v expoziční atmosféře. Použije-li se expoziční box, je třeba ho konstruovat tak, aby se co nejvíce omezovalo shlukování zvířat a aby inhalační expozice testované látce byla maximální. Pro zajištění stability atmosféry v inhalačním boxu by neměl v zásadě celkový objem pokusných zvířat přesáhnout 5 % objemu boxu. Je také možné použít inhalační expozice orálně-nasální, samotné hlavy nebo individuální celotělové expozice; první dva způsoby expozice minimalizují příjem látky jinými cestami.

         1. 1.3.2.7 Doba pozorování

            Doba pozorování by měla trvat nejméně 14 dní. Nelze ji však stanovit rigorózně. Může záviset na toxických reakcích, na rychlosti jejich vzniku a na trvání fáze zotavení. Dobu pozorování je možno podle potřeby prodloužit. Rozhodující je doba, kdy se objeví a opět odezní projevy otravy, stejně jako doba do uhynutí, zvláště tam, kde je patrná tendence ke zpožděné mortalitě.

      1. 1.3.3 Popis postupu

         Zvířata se bezprostředně před expozicí zváží. Exponují se po dobu 4 hodin od ustavení rovnováhy koncentrace studované látky. Nastavení rovnováhy by mělo být rychlé. Teplota během pokusu má být 22 °C ± 3 °C. Relativní vlhkost má být ideálně mezi 30 % a 70 %, s výjimkou případů, kde to není možné (např. experimenty s aerosoly). Udržování mírného podtlaku uvnitř komory (≤ 5 mm vodního sloupce) zabrání unikání testované látky do okolí. Během expozice se nepodává potrava ani voda.

         Používají se vhodné systémy pro vytvoření a monitorování testovací atmosféry. Systém musí zaručovat, že stabilních podmínek expozice bude dosaženo co nejrychleji. Konstrukce a provoz boxu má zajišťovat homogenní distribuci testované atmosféry v komoře.

         1. Je třeba zajistit měření nebo monitorování podmínek expozice:

            (a) průtok vzduchu (kontinuálně),

            (b) skutečná koncentrace studované látky se měří v dýchací zóně alespoň třikrát během expozice (některá ovzduší, např. aerosoly ve vysoké koncentraci, mohou vyžadovat častější monitorování). Během jedné expozice se nemá koncentrace odchylovat od střední hodnoty o více než ± 15 %. U některých aerosolů, kde této úrovně regulace není možné dosáhnout, se připouští větší rozsah kolísání. Po celou dobu trvání experimentu mají být koncentrace tak stabilní, jak je to prakticky možné. Pokud se týká částic a aerosolů, měří se distribuce velikosti částic tak často, jak to pokus vyžaduje (ale nejméně jednou pro každou testovanou skupinu),

            (c) teplota a vlhkost vzduchu se měří kontinuálně.

         Během expozice i po jejím skončení se pozorování provádějí a zaznamenávají systematicky. Každé zvíře má svůj individuální protokol. Během prvního dne je třeba provádět pozorování často. Minimálně jednou každý pracovní den je třeba provést pečlivé klinické vyšetření. Další každodenní pozorování a odpovídající opatření mají sloužit maximálnímu snížení ztrát zvířat ve studii, např. pitvou nebo zmrazením uhynulých zvířat nebo izolací či utracením slabých nebo umírajících zvířat.

         Pozorování zahrnuje změny kůže, srsti, očí, sliznic, dýchání a krevního oběhu, změny funkce autonomní a centrální nervové soustavy, somatomotorické aktivity a chování. Zvláštní pozornost je třeba věnovat vnějšímu dýchání, tremoru, křečovým jevům, slinění, průjmu, letargii, spánku a komatu. Okamžik uhynutí je třeba zachytit co nejpřesněji. Hmotnost jednotlivých zvířat se stanovuje po expozici týdně a v okamžiku uhynutí.

         Zvířata, která během pokusu uhynou i ta, která přežijí do konce pokusu, se pitvají se zvláštním zřetelem ke všem změnám horní i dolní části dýchacího traktu. Všechny makroskopické patologické změny se zaznamenávají a odeberou se příslušné tkáně pro histopatologické vyšetření.

1. 2 ÚDAJE

   Údaje se sestaví do tabulky. Z ní musí být pro každou experimentální skupinu patrný počet zvířat na počátku pokusu, doba uhynutí jednotlivých zvířat, počet zvířat vykazujících další příznaky toxicity, popis toxických účinků a pitevní nálezy. Změny hmotnosti je třeba vypočítat a zaznamenat pokud zvířata přežijí déle než 1 den. Zvířata, která jsou humánně utracena s ohledem na utrpení nebo k bolestem vyvolaným testovanou látkou, jsou zaznamenána jako uhynutí vyvolaná testovanou látkou. LC₅₀ se vypočte uznávanou metodou. Dále se hodnotí vztah - pokud existuje - mezi expozicí zvířete testované látce a výskytem a stupněm všech abnormalit, včetně změn chování, klinických symptomů, makroskopických poškození, změn tělesné hmotnosti, mortality a všech dalších toxických účinků.

1. 3 PROJEKT POKUSU, PROTOKOL POKUSU A ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA

   V souladu se s příslušnými právními předpisy⁹) musí být zpracován projekt pokusu a o průběhu pokusu je nutno vést protokol.

   1. Zpráva o průběhu pokusu obsahuje následující informace:
      1. - živočišný druh, kmen, původ, podmínky ustájení, potrava, atd.
      2. - podmínky pokusu: popis expozičního zařízení včetně konstrukce, typu, rozměrů, zdroje vzduchu, systému přípravy aerosolů, klimatizačního systému a způsobu umístění zvířat v expozičním boxu, pokud je používán. Je třeba popsat přístroje pro měření teploty, vlhkosti vzduchu, koncentrace a distribuce velikosti částic aerosolu.
      3. - údaje o expozici se sestaví do tabulky a uvedou spolu s průměrnými hodnotami a charakteristikou variability (např. směrodatnou odchylkou). Mají pokud možno obsahovat tyto údaje:
         1. a) rychlost průtoku vzduchu v inhalačním zařízení;
         2. b) teplota a vlhkost vzduchu;
         3. c) nominální koncentrace (celkové množství testované látky přiváděné do inhalačního zařízení, dělené objemem vzduchu);
         4. Poznámka: při expozici aerosolům látek v roztoku (např. ve vodě) je třeba uvádět nejen výslednou koncentraci látky ve vzduchu, nýbrž také, pokud je to možné, koncentraci účinné látky ve vehikulu.
         1. d) povaha vehikula, pokud bylo užito;
         2. e) skutečná koncentrace v dýchací zóně;
         3. f) hmotnostní medián aerodynamického průměru (MMAD) a geometrická směrodatná odchylka (GSD);
         4. g) doba do ustavení rovnováhy;
         5. h) doba expozice;
      1. - tabulky toxických reakcích podle pohlaví a úrovně expozice (tj. počet zvířat, která v pokuse uhynula nebo byla humánně utracena; počet zvířat s příznaky toxicity; počet exponovaných zvířat);
      2. - doba uhynutí během expozice nebo po jejím skončení, důvody a kritéria pro humánní utracení zvířat;
      3. - všechna pozorování;
      4. - hodnota LC₅₀ pro každé pohlaví stanovená po skončení doby pozorování (s uvedením metody výpočtu);
      5. - 95%-ní interval spolehlivosti pro LC₅₀ (pokud je možno jej stanovit);
      6. - křivka závislosti mortality na dávce (koncentraci) a její směrnice (pokud to dovoluje metoda stanovení);
      7. - pitevní nálezy;
      8. - všechny histopatologické nálezy.

   Diskuse výsledků (se zvláštním zřetelem k vlivu případného utracení zvířat z humánních důvodů během testu na vypočtenou hodnotu LC₅₀).

   Závěry.

B.3 AKUTNÍ TOXICITA DERMÁLNÍ

1. 1 METODA je v souladu s právem Evropských společenství.²)
   1. 1.1 Princip metody

      Testovaná látka se nanáší na kůži v odstupňovaných dávkách několika skupinám pokusných zvířat, a to každé skupině jedna úroveň dávky. Pozorují a zaznamenávají se účinky a případy uhynutí. Zvířata, která uhynou během pokusu, i zvířata, která přežijí konec pokusu, se pitvají.

      Zvířata se závažnými a přetrvávajícími příznaky utrpení a bolesti je třeba humánním způsobem utratit. Testované látky se nemají podávat v takových dávkách a takovým způsobem, o kterých je známo, že vyvolávají značnou bolest a utrpení následkem svých leptavých nebo dráždivých vlastností.

   1. 1.2 Popis metody
      1. 1.2.1 Příprava

         Nejméně 5 dnů před testem jsou zvířata chována v pokusných nádobách v podmínkách ustájení a krmení, v jakých budou během experimentu. Před testem se zdravá mladá dospělá zvířata náhodně přiřadí do jednotlivých experimentálních skupin. Asi 24 hodin před zahájením testu se srst zvířat na zádech ostříhá nebo oholí. Při stříhání nebo holení srsti je třeba dbát na to, aby se nepoškodila (např. abrazí) kůže, což by mohlo změnit její propustnost. Pro aplikaci testované látky se připraví nejméně 10 % povrchu těla. Při pokusech s pevnými látkami, případně připravenými v práškové formě, je třeba látku dostatečně navlhčit vodou nebo vhodným vehikulem, aby byl dobrý kontakt s kůží. Při použití vehikula je nutné brát v úvahu vliv vehikula na průnik testované látky kůží. Výběr vehikula by se měl řídit tím, v jaké formě se může daná látka dostat do styku s lidskou kůží, a ze všech relevantních způsobů vybrat ten, který nejvíce usnadňuje průnik kůží. Testované kapaliny se zpravidla aplikují neředěné.

      1. 1.2.2 Experimentální podmínky
         1. 1.2.2.1 Pokusná zvířata

            Pokusná zvířata jsou vybrána s ohledem na druh, pohlaví, a stáří v souladu s ustanovením § 15 zvláštního právního předpisu¹⁰) a označena tak, aby byla možná identifikace jednotlivých zvířat. Dobu navykání stanoví § 10 zvláštního právního předpisu.¹⁰)

            Používá se dospělých potkanů nebo králíků. Lze použít i jiné živočišné druhy, pokud jsou pro to důvody. Je třeba volit známé kmeny pokusných zvířat. Na začátku testu by nemělo variační rozpětí hmotnosti zvířat (pro každé pohlaví zvlášť) překročit ± 20 % střední hodnoty.

         1. 1.2.2.2 Počet a pohlaví

            Pro každou úroveň dávek použít nejméně 5 zvířat stejného pohlaví. Používá-li se samic, musí být nullipary a nesmí být březí. Pokud je k dispozici informace, že jedno z obou pohlaví je výrazně citlivější, je třeba používat zvířata tohoto pohlaví.

         2. Poznámka: Používají-li se v akutních testech toxicity zvířata vyšších druhů, než jsou hlodavci, mělo by se zvážit použití menšího počtu zvířat. Dávky je třeba pečlivě zvolit a je třeba zajistit, aby se nepřekročily mírně toxické dávky. V těchto testech je třeba vyhnout se podávání letálních dávek testované látky.
         1. 1.2.2.3 Dávkování

            Má být dostatečný počet dávkových úrovní, nejméně tři, a mají být vhodně odstupňovány tak, aby vznikly testovací skupiny se zřetelným rozsahem toxických účinků a mortality. Při rozhodování o úrovních dávek je třeba vzít v úvahu dráždivé nebo leptavé účinky testované látky. Získané údaje musí stačit na znázornění vztahu mezi dávkou a účinkem, a umožnit stanovení LD₅₀ s přijatelnou spolehlivostí.

         1. 1.2.2.4 Limitní test

            Lze provést limitní test jednou dávkou nejméně 2000 mg.kg^-1 tělesné hmotnosti na skupinách 5 samců a 5 samic s použitím výše popsaných postupů. Pokud látka způsobí uhynutí, je třeba provést úplnou studii.

         1. 1.2.2.5 Doba pozorování

            Doba pozorování má být nejméně 14 dní. Nelze ji však stanovit rigorózně. Měla by být určena podle obrazu otravy, rychlosti vývoje otravy a trvání fáze zotavení. Dobu pozorování je možno podle potřeby prodloužit. Rozhodující je doba, kdy se příznak otravy projeví a vymizí a doba do uhynutí, zvláště tam, kde je patrná tendence k výskytu pozdních uhynutí.

      1. 1.2.3 Popis postupu

         Zvířata se chovají jednotlivě v klecích. Testovaná látka se nanese rovnoměrně na plochu, která činí asi 10 % celkového povrchu těla. Pro vysoce toxické látky může být tato plocha menší; mělo by se však aplikovat stejnoměrně na co největší část této plochy.

         Testovaná látka je po expoziční dobu 24 hodin udržována v kontaktu s kůží pomocí porézního mulového obvazu a nedráždivé náplasti. Testovanou plochu je dále třeba vhodným způsobem překrýt, aby se mulový obvaz a testovaná látka fixovaly a aby se zabránilo orálnímu příjmu. K zamezení požití látky je možno použít i prostředků pro omezení volnosti pohybu, úplnou imobilizaci však nelze doporučit.

         Po uplynutí doby expozice se odstraní zbytky testované látky, pokud možno vodou nebo jiným vhodným způsobem se provede očištění pokožky.

         Pozorování je třeba ihned systematicky zaznamenávat. Pro každé zvíře je třeba vést samostatné záznamy. První den se zvířata pozorují často. Nejméně jednou každý pracovní den je třeba provést pečlivé klinické vyšetření. Další každodenní pozorování a odpovídající opatření mají sloužit maximálnímu snížení ztrát zvířat pro studii, např. pitvou nebo zmrazením uhynulých zvířat nebo izolací a utracením slabých či umírajících zvířat.

         Pozorování zahrnuje změny srsti, kůže, na kterou byla provedena aplikace, očí a sliznic, a také dýchání a krevního oběhu, změny funkce autonomní a centrální nervové soustavy, somatomotorické aktivity a chování. Zvláštní pozornost je třeba věnovat tremoru, křečovým jevům, slinění, průjmu, letargii, spánku a komatu.

         Okamžik uhynutí je třeba zachytit co nejpřesněji. Zvířata, která během pokusu uhynou, i která přežijí až do konce pokusu, se pitvají. Všechny makroskopické patologické změny se zaznamenávají a poškozené tkáně se odeberou pro histopatologické vyšetření.

         1. 1.2.3.1 Hodnocení toxicity u druhého pohlaví

            Po dokončení studie na jednom pohlaví se podá látka nejméně jedné skupině o pěti zvířatech druhého pohlaví, aby se zjistilo, zda zvířata druhého pohlaví nejsou výrazně citlivější na testovanou látku. V konkrétních případech může být odůvodněno použití menšího počtu zvířat. Pokud je k dispozici spolehlivá informace, že zvířata testovaného pohlaví jsou výrazně citlivější, testování na zvířatech druhého pohlaví je možno vynechat.

1. 2 ÚDAJE

   Údaje se sestaví do tabulky. Z ní musí být pro každou experimentální skupinu patrný počet zvířat na počátku pokusu, doba uhynutí jednotlivých zvířat, počet zvířat s jinými projevy otravy, popis toxických účinků a pitevních nálezů. Stanovení hmotnosti jednotlivých zvířat se provede bezprostředně před podáním testované látky, pak v týdenních intervalech a před utracením. Změny hmotnosti je třeba stanovit a zaznamenat, přežijí-li zvířata déle než jeden den. Zvířata, která byla humánním způsobem utracena s ohledem na stres a bolesti vyvolané podanou látkou, se zaznamenávají jako uhynutí vyvolané touto látkou. LD₅₀ se vypočte uznávanou metodou. Dále se hodnotí vztah, pokud existuje, mezi expozicí zvířat testované látce a výskytem a stupněm všech abnormalit včetně změn chování, klinických symptomů, makroskopických lézí, změn tělesné hmotnosti, mortality a všech ostatních toxických účinků.

1. 3 PROJEKT POKUSU, PROTOKOL POKUSU A ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA

   V souladu se s příslušnými právními předpisy⁹) musí být zpracován projekt pokusu a o průběhu pokusu je nutno vést protokol.

   1. Zpráva o průběhu pokusu obsahuje tato informace:
      1. - živočišný druh, kmen, původ, podmínky chovu, potrava atd.,
      2. - podmínky pokusu (včetně způsobu očištění kůže a typu obvazu: okluzívní nebo neokluzívní),
      3. - úrovně dávek (včetně vehikula, pokud je užito) a koncentrace,
      4. - pohlaví pokusných zvířat,
      5. - tabulky toxických reakcí podle pohlaví a podle dávek (počet zvířat uhynulých nebo humánně utracených během testu; počet zvířat s příznaky toxicity; počet exponovaných zvířat),
      6. - doba uhynutí po podání testované látky, důvody a kritéria pro humánní utracení zvířat,
      7. - všechna pozorování,
      8. - hodnota LD₅₀ pro to pohlaví, u kterého byl proveden úplná studie, a to pro 14-tidenní pozorování (s uvedením metody vypočtu),
      9. - 95%-ní interval spolehlivosti pro LD₅₀ (pokud jej lze stanovit),
      10. - křivka závislosti mortality na dávce a její směrnice (pokud je stanovení danou metodou možné),
      11. - pitevní nálezy,
      12. - všechny histopatologické nálezy,
      13. - výsledky všech testů na druhém pohlaví,

      Diskuse s rozborem výsledků (zvláštní pozornost věnovat možnému ovlivnění vypočtené hodnoty LD₅₀ v souvislosti s utracením zvířat z humánních důvodů během testu).

      Závěry.

B.4 AKUTNÍ TOXICITA: DRÁŽDIVÉ A LEPTAVÉ ÚČINKY NA KŮŽI

1. 1 METODA je v souladu s právem Evropských společenství^7a).
   1. 1.1 ÚVOD

      Při přípravě této aktualizované metody byla zvláštní pozornost věnována možným zlepšením v oblasti dobrého zacházení s pokusnými zvířaty a hodnocení veškerých existujících informací o zkoušené látce s cílem vyhnout se nadbytečným zkouškám na pokusných zvířatech. Součástí této metody je doporučení, aby před provedením popsané zkoušky dráždivých a leptavých účinků látky na kůži in vivo byla vypracována analýza průkaznosti stávajících relevantních údajů. Pokud jsou k dispozici nedostatečné údaje, lze je rozpracovat využitím metody postupného zkoušení.^7a) Strategie zkoušení zahrnuje provedení validovaných a uznaných zkoušek in vitro a je popsána v tabulce 8 k této metodě. Navíc se v případě potřeby v počáteční zkoušce in vivo doporučuje namísto současného aplikování postupná aplikace tří testovacích náplastí.

      V zájmu spolehlivého vědeckého přístupu a dobrého zacházení s pokusnými zvířaty by se zkoušky in vivo neměly provádět, dokud nebyly všechny dostupné údaje významné pro potenciální leptavé nebo dráždivé účinky látky vyhodnoceny na základě analýzy průkaznosti výsledků. Takové údaje budou zahrnovat důkazy ze stávajících studií na lidech nebo pokusných zvířatech, důkazy leptavých nebo dráždivých účinků jedné nebo více strukturně příbuzných látek nebo směsí takových látek, údaje dokládající silnou kyselost nebo zásaditost látky^7a) a výsledky validovaných a uznaných zkoušek in vitro nebo ex vivo^7a). Tato analýza by měla snížit potřebu zkoušek leptavých nebo dráždivých účinků na kůži metodou in vivo u látek, u nichž již existují důkazy z jiných studiích, pokud jde o tyto dva ukazatele.

      V tabulce 8 k této metodě je uvedena upřednostňovaná strategie postupného zkoušení, jejíž součástí je provedení validovaných a uznaných zkoušek leptavých/dráždivých účinků in vitro nebo ex vivo. Tato strategie byla vypracována na semináři OECD^7a), jeho účastníky jednohlasně doporučena a přijata jako doporučená strategie zkoušení v globálně harmonizovaném systému klasifikace chemických látek (GHS)^7a). Doporučuje se, aby se podle této strategie zkoušení postupovalo před provádění zkoušek in vivo. U nových látek se doporučuje metoda zkoušení po krocích, díky níž lze dosáhnout vědecky spolehlivých údajů o leptavých/dráždivých účincích látky. U existujících látek, o jejichž leptavých/dráždivých účincích na kůži není k dispozici dostatek údajů, by se měla tato strategie využít pro doplnění chybějících informací. Použití jiné strategie nebo postupu zkoušení nebo rozhodnutí nepoužít metodu po krocích musí být odůvodněno.

      Pokud pomocí analýzy průkaznosti výsledků nelze o leptavých nebo dráždivých účincích rozhodnout, měla by se v souladu se strategií postupného zkoušení uvážit zkouška in vivo (viz tabulka 8).