Vyhláška, kterou se stanoví základní metody pro zkoušení toxicity chemických látek a chemických přípravků

1. c) Dominantní letální test na hlodavcích (metoda B.22).¹)
2. d) Test na dědičnou translokaci u myší (metoda B.25).¹)

Genotoxické účinky – účinky na DNA

Genotoxicita je obecný pojem pro potenciálně škodlivé účinky na genetický materiál, které nejsou nezbytně spojeny s mutagenitou. Indikátorem genotoxicity může být vyvolané poškození DNA bez přímého důkazu mutace.

1. Následující metody využívající eukaryotické mikroorganismy nebo savčí buňky jsou vhodné pro takové studie:
   1. a) Mitotická rekombinace u Saccharomyces cerevisiae (metoda B.16).¹)
   2. b) Poškození DNA reparace – neplánovaná syntéza DNA v savčích buňkách – in vitro (metoda B.18).¹)
   3. c) Výměna sesterských chromatid v savčích buňkách – in vitro (metoda B.19).¹)

Alternativní metody vyšetřování karcinogenního potenciálu

K dispozici jsou testy transformace buněk savců, které určují schopnost látky vyvolat takové morfologické změny a změny chování buněčných kultur, u kterých se předpokládá souvislost s maligní transformací - in vivo (metoda B.21).¹) Používá se několika různých buněčných typů a kritérií pro transformaci.

Posuzování rizika dědičných účinků u savců

K dispozici jsou metody na detekci dědičných účinků v celém savčím organizmu, ať už vyvolaných genovými (bodovými) mutacemi, např. specifický locus test u myší detekující mutace zárodečné buňky v první generaci (nezahrnuto v této příloze), nebo chromozómovými aberacemi, např. test na přenosné translokace u myší (metoda B.25).¹) Těchto metod lze použít při odhadování možného genetického rizika látky pro člověka. Vzhledem ke složitosti těchto testů a velkému počtu potřebných zvířat, zvláště pro specifický locus test, je třeba se rozhodovat pro takovou studii jen na základě závažných důvodů.

Při stanovení genotoxicity se postupuje podle standardního metodického protokolu vypracovaného pro danou metodiku po projednání s Národní referenční laboratoří genetické toxikologie.

1. 4 KARCINOGENITA

   Chemické látky mohou být charakterizovány jako genotoxické nebo negenotoxické karcinogeny, v závislosti na předpokládaném mechanismu působení.

   Předběžné informace o genotoxickém karcinogenním potenciálu látky se čerpají ze studií mutagenity/genotoxicity. Další informace poskytují testy toxicity při opakované aplikaci a testy subchronické nebo chronické toxicity. Test toxicity při opakované aplikaci, metoda B.7,⁴) a dlouhodobější studie s opakovaným podáváním zahrnují posouzení takových histopatologických změn, např. hyperplazie v určitých tkáních, které by mohly být také významné. Tyto studie a toxikokinetické informace mohou pomoci identifikovat chemické látky s karcinogenním potenciálem, které vyžadují další, podrobnější zkoumání tohoto aspektu pomocí testu karcinogenity (metoda B.32)¹) nebo často v kombinované studii chronické toxicity/karcinogenity (metoda B.33).¹)

   K dispozici jsou rovněž testy transformace buněk savců, které určují schopnost látky vyvolat takové morfologické změny a změny chování buněčných kultur, u kterých se předpokládá souvislost s maligní transformací - in vivo (metoda B.21).¹) Používá se několika různých buněčných typů a kritérií pro transformaci.

1. 5 REPRODUKČNÍ TOXICITA

   Reprodukční toxicita se zjišťuje různými způsoby, např. podle zhoršení reprodukčních funkcí nebo schopností samců a samic (vliv na plodnost) nebo podle nedědičných škodlivých účinků na potomstvo (vývojová toxicita) zahrnující také teratogenitu a účinky v průběhu laktace.

   Testovací metoda (metoda B.31)¹) pro studie zaměřené na teratogenitu jako součást vývojové toxicity počítá hlavně s orálním podáváním. Alternativně mohou být použity jiné způsoby aplikace v závislosti na fyzikálních vlastnostech testované látky nebo podle pravděpodobného způsobu expozice člověka. V takových případech je třeba testovací metodu vhodně upravit s ohledem na příslušné body 28-denní testovací metody.

   Pokud je vyžadován třígenerační reprodukční test je možno popisovanou metodu pro dvougenerační reprodukční test (metoda B.35)¹) rozšířit tak, aby pokryl třetí generaci.

1. 6 NEUROTOXICITA

   Neurotoxicita se zjišťuje různými způsoby, např. podle funkčních změn nebo strukturních a biochemických změn v centrálním nebo periferním nervovém systému. Předběžné upozornění na neurotoxicitu může vzejít z testů akutní toxicity. Test toxicity při opakované aplikaci (metoda B.7)⁴) zahrnuje také posouzení neurotoxického účinku: u této metody se zdůrazňuje nutnost pečlivého klinického pozorování zvířat tak, aby se získalo co nejvíce informací. Metoda napomáhá odhalit chemické látky s neurotoxickým potenciálem, které vyžadují další, hloubkové zkoumání tohoto aspektu. Navíc je důležité vzít v úvahu specifické neurotoxické účinky, které nemohou být odhaleny v jiných studiích toxicity. Bylo například zjištěno, že jisté organické sloučeniny fosforu způsobují pozdní neurotoxicitu, která je posuzována metodami B.37⁴) a B.38⁴) po jednorázovém nebo opakovaném podání látky.

1. 7 IMUNOTOXICITA

   Imunotoxicita se zjišťuje různými způsoby, například podle imunosuprese anebo podle zvětšení odpovědi imunitního systému, které má za následek buď hypersenzitivitu nebo navozenou autoimunitu. Test toxicity při opakované aplikaci (metoda B.7),⁴) zahrnuje stanovení imunotoxických účinků. Metoda napomáhá odhalit chemické látky s imunotoxickým potenciálem, vyžadující další, hloubkové zkoumání tohoto aspektu.

1. 8 TOXIKOKINETIKA

   Toxikokinetické studie pomáhají při interpretaci a vyhodnocení údajů o toxicitě, objasňují specifické aspekty toxicity testované chemické látky a výsledky mohou pomoci při návrhu dalších studií toxicity. Nepředpokládá se, že bude v každém případě zapotřebí stanovit všechny parametry. Pouze v ojedinělých případech bude nezbytná celá posloupnost toxikokinetických studií (studie absorpce, distribuce, metabolismu a exkrece). U některých sloučenin mohou být vhodné změny v této sekvenci nebo se může ukázat jako dostatečná studie s jednorázovým podáním (metoda B.36).¹)

   Informace o chemické struktuře a fyzikálně-chemických vlastnostech mohou také poskytnout údaje, umožňující odhad charakteristik absorpce při plánovaném způsobu aplikace, metabolismu a distribuce do tkání. Přispět mohou také informace o toxikokinetických parametrech z předcházejících toxikologických a toxikokinetických studií.

1. 10 CHARAKTERISTIKY TESTOVANÉ LÁTKY

   Složení testované látky, včetně významných nečistot, a její relevantní fyzikálně-chemické vlastnosti včetně stability je třeba znát před zahájením jakékoli toxikologické studie.

   Fyzikálně-chemické vlastnosti testované látky poskytují informace důležité pro výběr způsobu podávání, pro návrh konkrétní studie a pro manipulaci s látkou a její skladování.

   Vypracování analytické metody pro kvalitativní a kvantitativní stanovení testované látky (a také pokud možno významných nečistot) v dávkovacím médiu a biologickém materiálu předchází zahájení studie.

   Všechny informace týkající se identifikace, fyzikálně-chemických vlastností, čistoty a chování testované látky se zahrnují v závěrečné zprávě o testu.

1. 11 PÉČE O ZVÍŘATA

   Pro toxikologické testy je přísná kontrola podmínek prostředí, ve kterém jsou pokusná zvířata chována, a správná péče o zvířata podstatnou podmínkou. Podmínky ochrany, chovu, využití včetně krmení zvířat jsou stanoveny zvláštními právními předpisy, které upravují ochranu zvířat.⁹)

   1. 11.1 Podmínky chovu

      Životní podmínky v prostorech pro pokusná zvířata je třeba přizpůsobit jednotlivým druhům. Pro potkany, myši a morčata je vhodná teplota místnosti 22°C ± 3°C při relativní vlhkosti vzduchu 30 - 70 %; pro králíky má být teplota 20°C ± 3°C při relativní vlhkosti vzduchu 30 - 70 %.

      Některé experimentální techniky výzkumu jsou zvláště citlivé na teplotu. Pro tyto případy jsou podrobnosti o příslušných podmínkách uvedeny v popisu testované metody. Při všech studiích toxických účinků je třeba zaznamenávat teplotu a vlhkost vzduchu a uvést je v závěrečné zprávě o průběhu pokusu.

      Osvětlení má být umělé se střídáním světla a tmy po dvanácti hodinách. Podrobnosti týkající se osvětlení je třeba zaznamenat a uvést ve zprávě o průběhu pokusu.

      Pokud metoda nevyžaduje jiný způsob, mohou být zvířata chována jednotlivě nebo v malých skupinách jedinců stejného pohlaví, ne více než 5 zvířat v jedné kleci.

      Podstatnou součástí zprávy o pokusech na zvířatech jsou údaje o způsobu chovu v klecích a počtu zvířat chovaných v jedné kleci jak během expozice sledované látce, tak během následující doby pozorování.

   1. 11.2 Podmínky krmení

      Krmení musí vyhovovat všem požadavkům výživy pro příslušný použitý živočišný druh. Podávají-li se zvířatům studované látky v potravě, může se výživová hodnota snížit vzájemným působením studované látky a některé složky potravy. Možnost takové reakce je nutno vzít v úvahu při interpretaci výsledků. Používají se konvenční laboratorní diety s neomezeným přístupem k pitné vodě. Pokud je testovaná látka podávána v potravě, je třeba tomu přizpůsobit výběr diety.

      Příměsi v potravě, které mají prokazatelně vliv na toxicitu, nesmí být přítomny v koncentracích, ve kterých by se tento vliv projevil.

1. 12 OCHRANA ZVÍŘAT

   Při vypracování testovacích metod musí být věnována potřebná pozornost ochraně zvířat v souladu s právními předpisy upravujícími ochranu zvířat.⁹) Níže jsou stručně uvedeny některé příklady, tento seznam není vyčerpávající. Pro stanovení akutní orální toxicity je třeba vzít v úvahu alternativní metody: postup s fixní dávkou a metoda stanovení třídy akutní toxicity. Postup s fixní dávkou nevyužívá uhynutí jako specifického kritéria a vyžaduje menší počet zvířat. Metoda stanovení třídy akutní toxicity vyžaduje v průměru o 70 % zvířat méně než metoda B.1²) pro akutní orální toxicitu. Tyto a alternativní metody mají za následek méně bolesti a stresu než klasická metodologie.

1. 13 ALTERNATIVNÍ TESTY

   Je nutno neustále vyvíjet a ověřovat alternativní metody, které mohou poskytovat stejnou úroveň informací jako současné testy na zvířatech a budou přitom využívat menšího počtu zvířat, způsobí méně utrpení nebo se úplně obejdou bez používání zvířat.

   V souladu s příslušnými právními předpisy, které upravují ochranu zvířat⁹), je nutno ověřovat v registrech mezinárodně ověřených a uznaných alternativních metod, zda k plánovanému pokusu existuje alternativní metoda, při které nemusí být použito zvíře.

   Pokud budou takové metody k dispozici, musí být jejich použití pro charakterizaci rizika, následnou klasifikaci a označování látky podle nebezpečnosti bráno v úvahu všude tam, kde je to možné.

1. 14 HODNOCENÍ A INTERPRETACE

   Při hodnocení a interpretaci pokusů na zvířatech a testů in vitro je nutno mít na zřeteli, že přímá extrapolace na člověka je možná jen v omezené míře; doklady o nepříznivých účincích u lidí, pokud jsou k dispozici, mohou sloužit k ověření výsledků testování.

   Výsledky testování mohou být použity pro klasifikaci a označování nových i existujících látek podle účinků na zdraví člověka na základě vlastností zjištěných a kvantifikovaných těmito metodami. Tyto výsledky mohou být také použity pro studie, zaměřené na posuzování rizika nových i existujících látek.

B.1 bis AKUTNÍ TOXICITA ORÁLNÍ – METODA FIXNÍ DÁVKY

1. 1 METODA je v souladu s právem Evropských společenství.^7a)
   1. 1.1 ÚVOD

      Podstatou metody je použití pouze středně toxických dávek v hlavní studii a dávky, u nichž se očekává, že budou letální, by neměly být podávány. Také není nutné podávat dávky, o nichž je známo, že v důsledku leptavých nebo výrazně dráždivých účinků vyvolávají značnou bolest a utrpení. Umírající pokusná zvířata nebo pokusná zvířata, která zjevně projevují příznaky bolesti nebo značného a přetrvávajícího utrpení, se humánně utratí a při interpretaci výsledků jsou hodnocena jako pokusná zvířata uhynulá při zkoušce^7a).

      Metoda poskytuje informace o nebezpečných vlastnostech a umožňuje zařazení a klasifikaci látky podle globálně harmonizovaného systému (GHS) klasifikace chemických látek, které způsobují akutní toxicitu^7a).

      Zkušební laboratoř by před provedením studie měla vzít v úvahu veškeré dostupné informace o zkoušené látce. Součástí těchto informací je totožnost a chemická struktura látky, její fyzikálně-chemické vlastnosti, výsledky jiných zkoušek toxicity dané látky in vitro nebo in vivo, toxikologické údaje o strukturně příbuzných látkách a očekávané použití látky. Tyto informace jsou nezbytné k tomu, aby byli všichni zainteresovaní přesvědčeni, že zkouška má význam pro ochranu lidského zdraví a pomůže při výběru vhodné výchozí dávky.

   1. 1.2 DEFINICE

      Akutní orální toxicita: vztahuje se na nepříznivé účinky, které se projeví po orálním podání jedné dávky nebo více dávek látky během 24 h.

   1. 1.3 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY

      Skupině pokusných zvířat stejného pohlaví se postupně podá fixní dávka 5, 50, 300 a 2 000 mg/kg (výjimečně lze uvažovat o další fixní dávce 5 000 mg/kg, viz část 1.6.2). Výchozí úroveň dávky se zvolí na základě orientační studie jako dávka, u níž se očekává, že vyvolá některé příznaky toxicity, aniž způsobí závažné toxické účinky nebo úhyn.^7a) Dalším skupinám pokusných zvířat může být podána vyšší nebo nižší dávka podle přítomnosti nebo nepřítomnosti příznaků toxicity nebo uhynutí. Podle tohoto postupu se pokračuje, dokud dávka nevyvolá zřejmou toxicitu nebo není pozorováno více než jedno uhynutí, anebo pokud nejsou při nejvyšší dávce zjištěny žádné účinky nebo pokud dochází k úhynům při nejnižší dávce.

   1. 1.4 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY
      1. 1.4.1 Výběr druhu pokusných zvířat

         Upřednostňovaným druhem hlodavce je potkan, avšak lze použít i jiné druhy hlodavců. Obvykle se používají samice^7a). Je to proto, že přehled literatury o konvenčních zkouškách LD₅₀ ukazuje, že mezi pohlavími je obvykle malý rozdíl, pokud jde o citlivost, ale v případech, v nichž jsou rozdíly pozorovány, jsou samice obecně nepatrně citlivější^7a). Pokud však poznatky o toxikologických nebo toxikokinetických vlastnostech strukturně příbuzných chemických látek naznačují, že citlivější jsou pravděpodobně samci, použije se toto pohlaví. Jestliže se zkouška provádí na samcích, je nutné podat náležité odůvodnění.

         Použijí se mladá zdravá dospělá pokusná zvířata běžně užívaných laboratorních kmenů. Samice musí být nullipary a nesmí být březí. Každé pokusné zvíře musí být na začátku podávání látky 8 až 12 týdnů staré a jeho hmotnost by se měla pohybovat v intervalu ± 20 % střední hmotnosti pokusných zvířat, kterým byla podána předchozí dávka.

      1. 1.4.2 Podmínky chovu a krmení

         Teplota v místnosti pro pokusná zvířata by měla být (22 ± 3) °C. Ačkoliv by relativní vlhkost měla být minimálně 30 % a pokud možno nepřesáhnout 70 % kromě doby úklidu místnosti, cílem by měla být hodnota 50 – 60 %. Osvětlení by mělo být umělé, mělo by se střídat 12 h světla a 12 h tmy, není-li v chovné místnosti denní světlo. Ke krmení lze použít obvyklé krmivo určené pro pokusná zvířata od registrovaného výrobce s neomezenou dodávkou pitné vody. Pokusná zvířata mohou být chována v klecích ve skupinách podle dávky v souladu s příslušným právním předpisem¹⁰), pokud není stanoveno projektem pokusů jinak, ale počet pokusných zvířat v kleci nesmí bránit nerušenému pozorování každého pokusného zvířete.

      1. 1.4.3 Příprava pokusných zvířat

         Pokusná zvířata jsou vybrána s ohledem na druh, pohlaví a stáří v souladu s ustanovením § 15 zvláštního právního předpisu¹⁰) a označena tak, aby byla možná identifikace jednotlivých pokusných zvířat. Dobu navykání stanoví § 10 zvláštního právního předpisu¹⁰).

      1. 1.4.4 Příprava dávek

         Zkoušená látka by obecně měla být při všech úrovních zkoušených dávek podávána v konstantním objemu pomocí úpravy koncentrace dávkovaného přípravku. V případech, kdy má být zkoušen kapalný konečný produkt nebo směs, může však mít použití nezředěné zkoušené látky, tj. s konstantní koncentrací, větší závažnost pro hodnocení následného rizika této látky. Ani v jednom případě nesmí být překročen maximální objem dávky. Maximální objem kapaliny, kterou lze jednorázově podat, závisí na velikosti pokusného zvířete. U hlodavců by objem obvykle neměl přesáhnout 1 ml/100 g tělesné hmotnosti: avšak u vodných roztoků připadá v úvahu dávka 2 ml/100 g tělesné hmotnosti. S ohledem na složení dávkovaného přípravku se ve všech případech, kde je to možné, doporučuje použití vodného roztoku/suspenze/emulze, potom v pořadí podle preference použití roztoku/suspenze/emulze v oleji (např. v kukuřičném oleji) a nakonec případně roztoku v jiných vehikulech. U vehikul jiných než voda musí být známy jejich toxikologické charakteristiky. Dávky musí být připraveny krátce před podáním, pokud není stálost přípravku během doby, kdy bude používán, známa a neukáže se jako přijatelná.

   1. 1.5 POSTUP
      1. 1.5.1 Podávání dávek

         Zkoušená látka se podává sondou v jedné dávce pomocí žaludeční sondy nebo vhodné intubační rourky. Pokud výjimečně není možné podat dávku najednou, lze dávku podat po menších množstvích během nejvýše 24 h.

         Před podáním zkoušené látky nemají pokusná zvířata dostávat krmivo (např. potkanům by se nemělo podávat přes noc, myším 3 – 4 h), voda se však ponechává. Po uplynutí doby hladovění se pokusná zvířata zváží a podá se jim zkoušená látka. Po podání látky se zamezí přístupu ke krmivu na další 3 – 4 h u potkanů nebo 1 – 2 h u myší. Podává-li se látka po částech v průběhu určité doby, může být podle délky období nezbytné poskytnout pokusným zvířatům krmivo a vodu.

      1. 1.5.2 Orientační studie

         Cílem orientační studie je umožnit výběr vhodné výchozí dávky pro hlavní studii. Zkoušená látka se podává jednotlivým zvířatům postupně podle vývojového diagramu v tabulce 1. Orientační studie je ukončena, jakmile lze stanovit výchozí dávku pro hlavní studii (nebo pokud je při nejnižší fixní dávce pozorován úhyn).

         Výchozí dávka orientační studie se zvolí z fixních úrovní dávek 5, 50, 300 a 2 000 mg/kg jako dávka, u níž se očekává, že vyvolá zřejmou toxicitu, přičemž toto očekávání je pokud možno založeno na důkazech z údajů získaných in vivo a in vitro ze stejné chemické látky a ze strukturně příbuzných látek. Pokud takové informace neexistují, výchozí dávka činí 300 mg/kg.

         Před podáním dávky každému dalšímu pokusnému zvířeti se ponechá doba minimálně 24 h. Všechna pokusná zvířata se pozorují minimálně 14 dnů.

         Ve výjimečných případech a pouze je-li to odůvodněno specifickými regulačními potřebami, lze zvážit použití další nejvyšší úrovně dávky 5 000 mg/kg (viz tabulka 3). S ohledem na dobré zacházení s pokusnými zvířaty se pokusy na pokusných zvířatech v rámci kategorie 5 GHS (2 000 – 5 000 mg/kg) nedoporučují a měly by se zvažovat pouze tehdy, pokud existuje velká pravděpodobnost, že výsledky takového pokusu mají přímý význam pro ochranu lidského zdraví, zdraví pokusných zvířat nebo životního prostředí.

         V případech, kdy pokusné zvíře, u něhož je látka zkoušena v nejnižší fixní úrovni dávky (5 mg/kg), v orientační studii uhyne, obvykle se studie ukončí a látka přiřadí do kategorie 1 GHS (jak je uvedeno v tabulce 1). Pokud je však vyžadováno další potvrzení klasifikace, může být proveden tento volitelný doplňkový postup: druhému pokusnému zvířeti se podá dávka 5 mg/kg. Pokud toto druhé pokusné zvíře uhyne, bude kategorie 1 GHS potvrzena a studie okamžitě ukončena. Pokud druhé pokusné zvíře přežije, dávka 5 mg/kg se podá maximálně třem dalším pokusným zvířatům. Jelikož riziko úhynu bude vysoké, měla by být látka pokusným zvířatům podávána postupně, aby bylo zajištěno dobré zacházení s pokusnými zvířaty. Časový interval mezi dávkami podanými jednotlivým pokusným zvířatům by měl být dostatečný na to, aby bylo možné stanovit, zda pokusné zvíře, jemuž byla látka podána dříve, pravděpodobně přežije. Pokud dojde k úhynu druhého pokusného zvířete, posloupnost podávání se okamžitě ukončí a látka nebude podána žádnému dalšímu pokusnému zvířeti. Vzhledem k tomu, že výskyt druhého úhynu (bez ohledu na počet pokusných zvířat, na nichž byla látka v době ukončení zkoušena) spadá do výsledku A (2 anebo více úhynů), postupuje se podle pravidla klasifikace v tabulce 2 s fixní dávkou 5 mg/kg (kategorie 1, pokud se vyskytnou dva a více úhynů nebo kategorie 2, pokud se nevyskytne více než 1 úhyn). Navíc je v tabulce 4 uvedeno poučení týkající se klasifikace v rámci systému EU, dokud nebude zaveden nový globálně harmonizovaný systém (GHS).

      1. 1.5.3 Hlavní studie
         1. 1.5.3.1 Počet pokusných zvířat a úrovně dávek

            Kroky, podle kterých se má postupovat po provedení zkoušek s výchozí úrovní dávky, jsou uvedeny ve vývojovém diagramu v tabulce 2. Bude nutné zvolit jeden ze tří postupů: buď zkoušení ukončit a stanovit odpovídající klasifikační třídu nebezpečnosti, provést zkoušky s vyšší fixní dávkou nebo zkoušky s nižší fixní dávkou. Avšak s ohledem na ochranu pokusných zvířat se v hlavní studii znovu nepoužije úroveň dávky, která v orientační studii vedla k uhynutí (viz tabulka 2). Zkušenosti ukázaly, že nejpravděpodobnějším výsledkem u výchozí úrovně dávky bude, že látku lze klasifikovat bez nutnosti dalších zkoušek.

            Obvykle se pro každou vyšetřovanou úroveň dávky použije celkem pět pokusných zvířat stejného pohlaví. Mezi těmito pěti pokusnými zvířaty bude jedno pokusné zvíře z orientační studie, jemuž byla podána zvolená úroveň dávky, a další čtyři pokusná zvířata (kromě výjimečných případů, kdy úroveň dávky použité v hlavní studii nebyla součástí orientační studie).

            Časový interval mezi podáváním každé úrovně dávky závisí na době nástupu, trvání a závažnosti příznaků toxicity. Expozice pokusných zvířat další dávce by měla být odložena, dokud nebude jisté, že pokusná zvířata, jimž byla podána předchozí dávka, přežila. Mezi jednotlivými úrovněmi dávky se v případě potřeby doporučuje ponechat dobu 3 nebo 4 dnů, aby bylo umožněno pozorování zpožděné toxicity. Časový interval lze podle potřeby upravit, např. v případě neprůkazné reakce.

            Při zvažování použití nejvyšší fixní dávky 5 000 mg/kg se postupuje podle metody popsané v tabulce 3 (viz také část 1.6.2).

         1. 1.5.3.2 Limitní zkouška

            Limitní zkouška se používá především tehdy, má-li osoba provádějící zkoušku informace svědčící o tom, že zkoušený materiál je pravděpodobně netoxický, tj. je toxický pouze nad rámec regulačních limitních dávek. Informace o toxicitě zkoušeného materiálu lze získat ze znalostí o podobných zkoušených sloučeninách, směsích nebo prostředcích s ohledem na totožnost a procento složek, o nichž se ví, že jsou toxikologicky významné. V situacích, kdy existuje jen málo informací nebo vůbec žádné informace o toxicitě nebo kdy se očekává, že zkoušený materiál bude toxický, by měla být provedena hlavní zkouška.

            Podle obvyklého postupu slouží jako limitní zkouška pro tyto pokyny výchozí dávka orientační studie 2 000 mg/kg (nebo výjimečně 5 000 mg/kg), po níž následuje podání této úrovně dávky dalším čtyřem pokusným zvířatům.

   1. 1.6 POZOROVÁNÍ

      Po podání dávky se pokusná zvířata pozorují individuálně minimálně jednou během prvních 30 minut, pravidelně během prvních 24 h, přičemž zvláštní pozornost se věnuje prvním 4 h, a poté denně po dobu 14 dnů kromě případů, kdy je nutné pokusná zvířata ze studie vyjmout a humánně utratit kvůli dodržování pravidla dobrého zacházení s pokusnými zvířaty, nebo je zjištěn jejich úhyn. Doba pozorování by však neměla být stanovena pevně. Měla by být stanovena podle toxických reakcí, doby jejich nástupu a délky fáze zotavení, a může tedy být podle potřeby prodloužena. Doba, kdy se příznaky toxicity objeví a vymizí, je důležitá zejména v případě tendence ke zpožděným příznakům toxicity^7a). Veškerá pozorování se systematicky zaznamenávají, přičemž záznamy se vedou pro každé pokusné zvíře jednotlivě.

      Další pozorování budou nutná, jestliže pokusná zvířata dále vykazují příznaky toxicity. Pozorování zahrnují změny na kůži, na srsti, na očích, na sliznicích, a rovněž změny dýchání, krevního oběhu, změny funkce autonomní a centrální nervové soustavy, somatomotorické aktivity a chování. Pozornost je třeba věnovat třesu, křečím, slinění, průjmu, letargii, spánku a kómatu.^7a) Pokusná zvířata ve stavu agónie a pokusná zvířata se známkami prudkých bolestí nebo s přetrvávajícími příznaky značného utrpení se humánně utratí. Pokud jsou pokusná zvířata z humánních důvodů utracena nebo je zjištěn jejich úhyn, je nutné dobu uhynutí zaznamenat co nejpřesněji.

      1. 1.6.1 Tělesná hmotnost

         Hmotnosti jednotlivých pokusných zvířat se stanoví krátce před podáním zkoušené látky a nejméně jednou týdně poté. Vypočítají se změny hmotnosti. Na konci zkoušky se pokusná zvířata, která přežila, zváží a poté humánně utratí.

      1. 1.6.2 Patologie

         Všechna pokusná zvířata se pitvají. U každého pokusného zvířete se zaznamenají všechny makroskopické patologické nálezy. Lze také zvážit mikroskopické vyšetření orgánů, u nichž jsou patrné makroskopické změny.

1. 2 DATA

   Měly by být uvedeny údaje pro každé jednotlivé pokusné zvíře. Navíc by měly být všechny údaje shrnuty do tabulky, přičemž se u každé zkušební skupiny uvede počet použitých pokusných zvířat, počet pokusných zvířat vykazujících příznaky toxicity, počet pokusných zvířat uhynulých v průběhu zkoušky nebo utracených z humánních důvodů, doba uhynutí jednotlivých pokusných zvířat, popis a časový průběh a vratnost toxických účinků a pitevní nálezy.

1. 3 PROJEKT POKUSU, PROTOKOL POKUSU A ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA

   V souladu s příslušnými právními předpisy⁹),¹⁰) musí být zpracován projekt pokusu a o průběhu pokusu je nutno vést protokol.

   1. 3.1 Zpráva o průběhu pokusu obsahuje tyto informace:
      1. Zkoušená látka:
         1. — fyzikální povaha, čistota a tam, kde je to podstatné, fyzikálně-chemické vlastnosti (včetně izomerizace),
         2. — identifikační údaje, včetně čísla CAS.
      1. Vehikulum (v případě potřeby):
         1. — zdůvodnění výběru vehikula, pokud není použita voda.
      1. Pokusná zvířata:
         1. — použitý druh/kmen,
         2. — mikrobiologický stav pokusných zvířat, je-li znám,
         3. — počet, stáří a pohlaví pokusných zvířat (případně včetně zdůvodnění použití samců místo samic),
         4. — původ, podmínky chovu, krmivo atd.
      1. Zkušební podmínky:
         1. — podrobné údaje o složení zkoušené látky, včetně podrobností o fyzikální formě podávaného materiálu,
         2. — podrobné údaje o způsobu podání zkoušené látky, včetně podávaných objemů a době podávání,
         3. — podrobné údaje o krmivu a kvalitě vody (včetně druhu/zdroje krmiva, zdroje vody),
         4. — zdůvodnění výběru výchozí dávky.
      1. Výsledky:
         1. — tabulky údajů o reakcích každého pokusného zvířete a o jeho úrovni dávky (tj. počet pokusných zvířat vykazujících příznaky toxicity, včetně uhynutí, povahy, závažnosti a trvání účinků),
         2. — tabulky údajů o tělesné hmotnosti a jejích změnách,
         3. — individuální hmotnosti pokusných zvířat v den podání dávky, poté v týdenních intervalech a v čase úhynu nebo utracení,
         4. — datum a doba úhynu, pokud předchází plánovanému usmrcení,
         5. — časový průběh nástupu příznaků toxicity u každého pokusného zvířete a zda byly vratné,
         6. — pitevní a histopatologické nálezy pro každé pokusné zvíře, pokud jsou k dispozici.

   Diskuse a interpretace výsledků.

   Závěry.

   Tabulka 1: VÝVOJOVÝ DIAGRAM PRO ORIENTAČNÍ STUDII

   
   
   

   Tabulka 2: VÝVOJOVÝ DIAGRAM PRO HLAVNÍ STUDII

   
   
   

   Tabulka 3

   KRITÉRIA KLASIFIKACE ZKOUŠENÝCH LÁTEK S OČEKÁVANÝMI HODNOTAMI LD₅₀ PŘESAHUJÍCÍMI 2 000 mg/kg BEZ NUTNOSTI ZKOUŠENÍ

   1. Kritéria pro kategorii nebezpečnosti 5 mají umožnit identifikaci zkoušených látek, u nichž je nebezpečí akutní toxicity nízké, avšak které mohou za určitých okolností pro citlivé jedince představovat nebezpečí. U těchto látek se předpokládá, že se jejich orální nebo dermální LD₅₀ nebo LD₅₀ ekvivalentních dávek podávaných jinými cestami pohybuje v rozmezí od 2 000 do 5 000 mg/kg. Zkoušené látky lze klasifikovat v kategorii nebezpečnosti definované jako 2 000 mg/kg < LD₅₀ < 5 000 mg/kg (v GHS kategorie 5) v těchto případech:
      1. a) pokud je do této kategorie zařazena podle některého ze systémů zkoušení uvedeného v tabulce 2, v závislosti na výskytech uhynutí,
      2. b) pokud jsou již k dispozici spolehlivé důkazy naznačující, že LD₅₀ se pohybuje v rozmezí hodnot kategorie 5, nebo pokud z jiných studií na pokusných zvířatech nebo z toxických účinků na člověka vyplývají akutní obavy o lidské zdraví,
      3. c) pokud extrapolací, odhadem nebo měřením údajů není přiřazení do vyšší třídy nebezpečnosti odůvodněno, a
         1. — pokud jsou k dispozici spolehlivé informace naznačující významné toxické účinky na člověka, nebo
         2. — pokud je během zkoušení orální cestou do hodnot kategorie 4 pozorováno uhynutí, nebo
         3. — v případech, kdy odborný posudek potvrdí závažné klinické příznaky toxicity při testování do hodnot kategorie 4 s výjimkou průjmu, piloerekce nebo rozcuchané srsti, nebo