Platné znění

Vyhláška Ministerstva zemědělství, kterou se provádí zákon č. 91/1996 Sb., o krmivech, ve znění zákona č. 244/2000 Sb.

  1. 2.5. Zvířata se ustájují v jednom ustájovacím prostoru. Umísťují se buď v bilančních klecích nebo v bilančních stáních tak, aby bylo umožněno přesné dávkování krmiv, zjišťování jejich zbytků a bezeztrátový sběr výkalů a moče. Mikroklimatické podmínky odpovídají fyziologickým nárokům zvířat.
  2. 2.6. Zkouší-li se krmivo určené jako krmná surovina do krmných směsí a stanovuje-li se jeho vliv na stravitelnost živin krmné směsi, použije se jako kontrolní krmivo rovněž krmná směs. Krmné dávky pro bilanční zkoušku zajišťují záchovnou potřebu živin, minerálních látek a vitamínů, hladina jejich obsahu nesmí překročit 1,5 násobek záchovné potřeby.
  3. 2.7. Krmná dávka se pro bilanční zkoušku stanoví tak, aby při zkrmování byly zbytky krmiva minimální. Krmí se 2 x denně, minimální interval mezi krmením je 7 hodin.
  4. 2.8. Veškerá krmiva včetně všech použitých krmných surovin, doplňkových látek a premixů, se předem ověřují analyticky.
  5. 2.9. Minimální doba trvání bilanční zkoušky je 5 dní u monogastrických zvířat a minimálně 7 dní u přežvýkavců. Bezprostředně po umístění zvířat do bilančních klecí nebo na bilanční stání musí proběhnout návykové období v délce podle druhu zvířat 7 - 14 dní a poté přípravné období minimálně 6 dní. Tato období se nezapočítávají do vyhodnocení bilanční zkoušky.
  6. 2.10. V průběhu bilanční zkoušky se u jednotlivých zvířat přesně podchycuje příjem a zbytky krmiv, množství výkalů a moče, u skopců pouze výkalů. Odebraná moč se konzervuje vhodnou konzervační přísadou nebo se zchlazuje,výkaly se buď konzervují nebo zmrazují. Sušení výkalů se provádí lyofilizací. Pokud není k dispozici lyofilizátor, výkaly se před stanovením dusíku nesuší.
  7. 2.11. Kontrola živé hmotnosti zvířat se provádí na počátku a na konci bilanční zkoušky,vždy ve stejnou dobu, a to před podáním krmiva.
  8. 2.12. Evidence se vede u každé bilanční zkoušky samostatně.
  9. 2.13. Výsledky bilančních zkoušek se zpracovávají do souhrnné dokumentace biologického zkoušení. Rozdíly stanovených koeficientů stravitelnosti, mezi kontrolním a zkoušeným krmivem, se ověřují statisticky. Metody statistického ověření se uvedou do dokumentace.
  10. 2.14. Z bilančních zkoušek se vyřazují zvířata, u kterých byly zjištěny klinicky zjevné poruchy zdraví a zvířata, u nichž činily zbytky krmiva více než 5% sušiny, nebo u nichž koeficient stravitelnosti jednotlivých živin přesahuje hodnotu dvojnásobku směrodatné odchylky od průměru ostatních zjištěných hodnot koeficientů stravitelnosti krmiva.
  1. 3. Krmná zkouška
    1. 3.1. Krmné zkoušky se provádějí na druhu a kategorii zvířat, pro které je zkoušené krmivo určeno, minimálně ve třech dílčích skupinových srovnávacích pokusech.
    2. 3.2. Krmné zkoušky se provádějí vždy ve dvou skupinách zvířat, kontrolní a pokusné. Zajištění krmiv je shodné s bodem 1.2. této přílohy.
    3. 3.3. Minimální počet zvířat ve skupině jednoho skupinového srovnávacího pokusu je u krmné zkoušky:
      1. - u kuřat, housat, kachňat, krůťat - 25 ks,
      2. - u dospělé drůbeže, králíků, selat, prasat, ovcí, koz - 10 ks,
      3. - u telat, ostatního skotu, koní - 3 ks.

      Počty zvířat jiných druhů se stanovují analogicky.

    1. 3.4. Do skupinového srovnávacího pokusu pro krmnou zkoušku se vybírají zvířata podle kritérií uvedených v bodech 1.3.2. až 1.3.7., ustájují se a krmí podle zásad uvedených v bodě 1.4. a 1.5. této přílohy.
    2. 3.5. Doba trvání skupinového srovnávacího pokusu krmné zkoušky je minimálně:
      1. - při zkoušce chutnosti 2 týdny, včetně přípravného období,
      2. - při zkoušce příjmu 3 týdny,
      3. - při zkoušce dietetických vlastností krmiva 4 týdny,
      4. - při jiných krmných zkouškách (např. při reklamaci,prošlé době použitelnosti apod.) se postupuje podle krmného návodu krmiva nebo podle krmného návodu pro krmiva podobného složení, účinku a charakteristiky.
    1. 3.6. Při zkoušce chutnosti krmiva se hodnotí především rychlost příjmu krmiv za určitý časový úsek. Dále se sleduje živá hmotnost zvířat na počátku a na konci zkoušky a reakce zvířat na podávaná krmiva.

      Při zkoušce příjmu krmiva se hodnotí dynamika příjmu kontrolního a zkoušeného krmiva ve vztahu k přijaté sušině.

    1. 3.7.Při zkouškách dietetických vlastností krmiva se hodnotí:
      1. - hmotnost zvířat na počátku a na konci sledovaného období,
      2. - přírůstek živé hmotnosti za sledované období,
      3. - příjem a celková spotřeba krmiv, reakce zvířat na zkoušené krmivo,
      4. - zdravotní stav zvířat sledovaný adspekcí,
      5. - veterinární vyšetření nutně odporažených a uhynulých zvířat,
      6. - chemické případně mikrobiologické vyšetření výkalů zvířat.
    1. 3.8. Pro hodnocení ostatních krmných zkoušek platí pravidla stanovená pro hodnocení biologické testace v bodě 1.6. této přílohy.
    2. 3.9.Evidence se vede u každého skupinového srovnávacího pokusu krmné zkoušky samostatně.Výsledky se zpracovávají do souhrnné dokumentace biologického zkoušení.

Příloha č. 21

k vyhlášce č. 451/2000 Sb.

ZKOUŠENÍ KONZERVAČNÍ ÚČINNOSTI

  1. 1. Zkoušení konzervační účinnosti
    1. 1.1. Kontrolní a pokusná zkouška konzervační účinnosti se zakládají současně.
    2. 1.2. Při zahájení konzervačních zkoušek se krmiva, na kterých se zkouška provádí a konzervační látky, ověřují analyticky.
    3. 1.3. Pro kontrolní a pokusnou zkoušku konzervační účinnosti u statkových objemných krmiv se používá stejné krmivo, tj. shodný druh, shodné vegetační stádium, shodná mechanická úprava (délka řezanky, uložení, dusání, zatížení, uzavření atd.).
    4. 1.4. Aplikace zkoušené konzervační látky se provádí podle návodu, uvedeného žadatelem o registraci. Dávkuje se rovnoměrně.
    5. 1.5. Krmivo, použité ke konzervační zkoušce, se váží.
    6. 1.6. Doba zakládání kontrolní a pokusné konzervační zkoušky u statkových objemných krmiv trvá nejvýše 24 hodin.
    7. 1.7. Konzervační zkoušky, s výjimkou konzervačních zkoušek u statkových objemných krmiv, se zakládají na dobu, která je stanovena jako maximální doba účinnosti zkoušené konzervační látky.
    8. 1.8. V průběhu kontrolní a pokusné konzervační zkoušky a v poslední den zkoušky se krmiva ověřují analyticky.
    9. 1.9. V průběhu konzervační zkoušky se sleduje a zaznamenává teplota, podle povahy zkoušené konzervační látky i vlhkost vnějšího prostředí. V průběhu konzervační zkoušky objemných krmiv se sleduje a zaznamenává pH.
    10. 1.10. V průběhu konzervační zkoušky u objemných statkových krmiv se zjišťují ztráty vzniklé odtokem silážních šťáv.
    11. 1.11. Po skončení konzervační zkoušky u objemných statkových krmiv se stanoví analyticky obsah živin, pH a obsah kyselin, vzniklých fermentačním procesem. Krmivo se hodnotí senzoricky.
    12. 1.12. O průběhu konzervačních zkoušek se vede evidence. Veškeré dílčí výsledky se zpracovávají do souhrnné dokumentace o zkoušení konzervační účinnosti.

Příloha č. 22

k vyhlášce č. 451/2000 Sb.

ZKOUŠENÍ JAKOSTI ŽIVOČIŠNÝCH PRODUKTŮ

  1. 1. Zkoušení jakosti masa
    1. 1.1. Senzorické hodnocení jakosti masa

      Podstata senzorického hodnocení spočívá v subjektivním posouzení vzhledu, vůně, chuti, šťavnatosti, křehkosti, jemnosti eventuálně dalších vlastností zkoušených vzorků masa, získaných od zvířat kontrolních a pokusných skupin.

      1. 1.1.1. Odborné znalecké posouzení provádí nejméně 5 posuzovatelů, z toho 3 stálí, otestovaní jako způsobilí, a dva další. Za optimální se považuje hodnocení 5 vzorků. Vzorky jsou anonymní.
      2. 1.1.2. Vzorky se doporučuje odebírat z míst, odkud se odebírá i vzorek k fyzikálně-chemickému zkoušení, a to v čisté svalovině a v množství:
        1. - u skotu mezi 9. a 12.žebrem - roštěnka (500-700 g)
        2. - u prasat od posledního žebra kaudálním směrem - pečeně (400-600 g)
        3. - u ovcí hřbetní partie (400-600 g)
        4. - u telat mezi 9. a 12.žebrem - pečeně (400-600 g)
        5. - u drůbeže prsní a stehenní svalovina (celý kus)
        6. - u ryb celé kusy (nejméně 500 g).

        Při senzorickém hodnocení lze dle potřeby použít i jiné svaly,tukovou tkáň, další části jatečného zvířete nebo jeho orgány, např. játra a jiné.

      1. 1.1.3. K balení vzorků se používají obaly, které zajistí původní vlastnosti vzorků.
      2. 1.1.4. Vzorky se skladují při teplotě masa v rozmezí 1 - 3°C; pokud není dodržena doporučená doba pro senzorické hodnocení od poražení zvířete, uvedená v bodě 1.1.5., vzorky se zamrazují a uchovávají při teplotě nižší než -18°C nejdéle do 2 měsíců.
      3. 1.1.5. Doporučená doba pro senzorické hodnocení od poražení zvířete:
        1. - u hovězího masa 6. - 8.den,
        2. - u vepřového masa 3. - 6.den,
        3. - u telecího 4. - 6.den,
        4. - u skopového 3. - 7.den,
        5. - u drůbežího 3. - 7.den.
      1. 1.1.6.Senzorické hodnocení syrového masa

        Provádí se posuzování:

        1. - barvy a vzhledu,
        2. - zastoupení mezisvalového tuku - mramorování,
        3. - vláknitosti,
        4. - textury - konzistence,
        5. - schopnosti masa vázat vlastní šťávu,
        6. - pachu.

        Výsledek se vyjadřuje buď slovně nebo bodovým hodnocením. Obvykle se boduje celková jakost. Doporučuje se užití 5 bodového systému.

      1. 1.1.7. Senzorické hodnocení masa tepelně upraveného

        Hodnotí se základní kriteria:

        1. - vůně,
        2. - chuť,
        3. - šťavnatost,
        4. - křehkost a jemnost.

        Posuzuje se bodovým systémem a slovně.

        1. 1.1.7.1. Tepelná úprava masa dušením v uzavřeném obalu

          Zkoušené vzorky masa se dusí v uzavřených masových sklenicích v prostředí páry po stanovenou dobu. Bodové hodnocení pak slouží ke vzájemnému porovnání vzorků a ke statistickému zpracování. Celkové vyhodnocení stanoví, zda se jedná o maso bez závad nebo o maso s odchylkami. Nedílnou součástí hodnocení je protokol, který se přikládá k celkovému hodnocení posuzovaných vzorků.

        1. 1.1.7.2. Hodnocení uvolněné šťávy (vývaru)

          U vývaru se posuzuje barva a čirost, vůně, chuť, eventuálně podíl tuku ve vývaru.

        1. 1.1.7.3. Tepelná úprava masa vařením

          Zkoušené vzorky se vaří ve vodě bez přísad po stanovenou dobu.

        1. 1.1.7.4. Tepelná úprava masa pečením

          Vzorky zkoušené svaloviny se pečou ve skleněných nádobách z varného skla v elektrické troubě při stanovené teplotě a době.

        1. 1.1.7.5. Úprava masa grilováním

          Vzorky masa se grilují na grilovacím automatu při stanovené teplotě a době.

        1. 1.1.7.6. Zkouška škvařením

          Vzorek tukové tkáně se rozkrájí na kousky o hraně 2 cm a škvaří se při stanovené teplotě až do uvolnění tuku.

        1. 1.1.7.7. Stanovení ztrát masa vařením

          Rozdíl mezi hmotností syrového a vařeného masa slouží k výpočtu ztrát vařením. Vyjadřuje se v procentech.

        1. 1.1.7.8.Stanovení ztrát masa grilováním

          Rozdíl mezi hmotností syrového a grilovaného masa slouží k výpočtu ztrát grilováním. Vyjadřuje se v procentech.

    1. 1.2.Chemické hodnocení jakosti masa

      Odběr vzorků je stejný jako v bodě 1.1.2. této přílohy.

      1. 1.2.1. Stanovení obsahu vody

        Vzorek se suší s pískem při 100 - 105°C do konstantní hmotnosti, obsah vody se vyjadřuje v procentech. Rozdíl mezi souběžnými stanoveními nepřesahuje 0,3%.

      1. 1.2.2. Stanovení celkového dusíku metodou podle Kjeldahla

        Dusík bílkovin se převede mineralizací na amoniak, který se stanoví destilací titračně. Obsah dusíkatých látek se vypočte násobením koeficientem 6,25.

      1. 1.2.3. Stanovení tuku přímou extrakcí

        Tuk po odstranění obsahu vody sušením se extrahuje rozpouštědlem, které se odpaří a tuk se zváží.

      1. 1.2.4. Stanovení obsahu popela - minerálií

        Spalováním zhomogenizovaného vzorku při teplotě max. 600°C do bílé až bílo-šedé barvy popele.

      1. 1.2.5. Stanovení hydroxyprolinu

        Stanoví se po hydrolýze bílkovin na základě barevné reakce jeho oxidačního produktu p-dimethylaminobenzaldehydem.

      1. 1.2.6. Stanovení tryptofanu

        Spočívá v alkalické hydrolýze vzorku hydroxidem barnatým a v kolorimetrickém stanovení.

      1. 1.2.7. Stanovení obsahu vazivových bílkovin výpočtem (x)

        x = a.f [g/100 g]

        1. a = obsah hydroxyprolinu v g/100 g
        2. f = 8,877 - přepočítávací faktor

        svalové bílkoviny = bílkoviny celkem - vazivové bílkoviny.

      1. 1.2.8. Stanovení nutriční hodnoty masa - výpočtem

        NP (%) = nutriční hodnota masa je procentuální podíl energie čistých, plně hodnotných bílkovin z hodnoty celkové energie masa.

        1. x = log hodnoty obsahu hydroxyprolinu/g ve 100g celkových bílkovin masa (g na 16 g N)
        2. B = obsah bílkovin v mase (%)
        3. T = obsahu tuku v mase (%).
      1. 1.2.9. Stanovení obsahu cholesterolu

        Stanoví se spektrofotometricky po reakci s kyselinou sulfosalicylovou a anhydridem kyseliny octové v prostředí kyseliny sírové.

    1. 1.3. Technologické hodnocení masa
      1. 1.3.1. Stanovení schopnosti masa vázat přidanou vodou. Zjišťuje se schopnost zhomogenizovaného masa udržet si v přítomnosti soli přidanou vodu i po tepelném zpracování.
      2. 1.3.2.Stanovení pH masa

        Obvykle se stanovuje u hovězího a vepřového masa jeho pH1hod 1 hodinu po porážce a pH24hod 24 hodin po porážce.

        Na základě posouzení těchto dvou hodnot se definuje výskyt specifických vad masa.

    1. 1.4. Stanovení inbibičních látek v mase

      Provádí se mikrobiologické stanovení reziduí inhibičních látek.

    1. 1.5. Jatečné hodnocení cílových zvířat

      Provádí se minimálně u 6 ks z kontrolní i pokusné skupiny (poměr pohlaví 1 : 1), u kterých se živá hmotnost nejvíce přibližuje průměru skupiny (± 5 %).

      U ryb se hodnotí 10 ks ryb z každé skupiny.

      Posuzuje se stupeň zmasilosti a protučnění, popř. stupeň nežádoucího přetučnění. Posuzuje se zrakem (hmatem).

      Dále se zjišťuje:

      1. - hmotnost při odběru, tj. celková hmotnost zvířete zjištěná vážením,
      2. - čistá hmotnost, tj. hmotnost při odběru snížená o srážku na nakrmenost nebo zvýšená o přirážku na lačnost,
      3. - hmotnost jatečně opracovaného těla, tj. hmotnost zjištěná vážením v tepelném stavu po ukončení porážky nejpozději do 30 min.,
      4. - výtěžnost, tj. % podíl hmotnosti jatečně opracovaného těla k čisté hmotnosti.
      1. 1.5.1. Jatečné hodnocení skotu a ovcí

        Do jatečně opracovaného těla se počítá hmotnost 2 půlek nebo 4 čtvrtí bez kůže, bez hlavy oddělené od trupu před 1. krčním obratlem, bez noh oddělených v dolním kloubu zápěstním nebo zánártním, bez orgánů dutiny hrudní, břišní a pánevní, vyňatých s přirostlým tukem, bez pohlavních orgánů, bez ledvin, ledvinového a pánevního loje.

      1. 1.5.2. Jatečné hodnocení prasat

        Do jatečně opracovaného těla se počítá hmotnost 2 půlek s hlavou bez mozku a míchy, včetně kruponu a kruponového sádla, s ledvinovým sádlem (plstním), bez ledvin a ostatních orgánů dutiny hrudní, břišní a pánevní, vyňatých s přirostlým tukem.

      1. 1.5.3. Jatečné hodnocení drůbeže

        Při jatečném rozboru se sleduje a vyhodnocuje:

        1. - živá hmotnost zvířat po 12 hodinovém lačnění,
        2. - hmotnost vykuchané drůbeže (čistý trup bez drůbků, ale s kůží krku),
        3. - hmotnost prsní svaloviny,
        4. - hmotnost stehenní svaloviny,
        5. - hmotnost jater,
        6. - hmotnost hodnotných částí,
        7. - hmotnost prázdného žaludku, jater a srdce.

        Výtěžnost je % podíl hmotnosti vykuchané drůbeže včetně hmotnosti hodnotných částí z hmotnosti před zabitím.

      1. 1.5.4.Jatečné hodnocení králíků

        Při bourání se oddělí hlava a za posledním žebrem přední část, která obsahuje krk, žebra s břišními svaly a přední nohy.

        Hmotnost zadní části je součet hmotností hřbetu a stehen.

        Jatečná výtěžnost se vypočte jako podíl součtu hmotností jatečného trupu s hlavou, srdce, jater, ledvin s ledvinovým tukem k živé hmotnosti.

      1. 1.5.5. Stanovení stolní hodnoty ryb

        Stolní hodnota je soubor smyslově posuzovaných vlastností a výtěžnosti.

        Hmotnost ryby je hmotnost mokré ryby po okapání přebytečné vody.

        Hmotnost masa je hmotnost ryby bez částí těla, které se nezapočítávají do výtěžnosti a představuje u kapra celé tělo bez hlavy, vnitřních orgánů, ploutví a šupin, včetně jiker nebo mlíčí,u pstruhů celé tělo bez vnitřních orgánů.

        Výtěžnost se stanoví jako % podíl hmotnosti masa z hmotnosti ryby.

  1. 2. Zkoušení mléka
    1. 2.1. Odběr vzorků mléka pro potřeby zkoušení

      Dojnice zařazené do srovnávacího biologického zkoušení se dojí individuálně. Vzorky se odebírají ihned po provedeném nádoji od každé dojnice samostatně.

      Po promíchání se zajistí odběr určitého reprezentativního množství mléka, které má veškeré vlastnosti celku.

      Vzorky určené k chemickému rozboru se uloží tak, aby byla uchována jejich nezměněná jakost až do doby potřebné k provedení rozboru.

    1. 2.2. Smyslové vlastnosti mléka

      Stanovují se senzorickým hodnocením, a to:

      1. - barva,
      2. - konzistence a vzhled,
      3. - chuť a vůně.
    1. 2.3. Fyzikální a chemické jakostní znaky mléka
      1. - stanovení obsahu tuku acidobutyrometrickou metodou,
      2. - stanovení sušiny mléka jako podíl po vysušení při teplotě 105°C ± 2°C,
      3. - stanovení tukuprosté sušiny výpočtem z obsahu sušiny mléka a obsahu tuku v mléce,
      4. - stanovení specifické hmotnosti mléka mléčným hustoměrem,
      5. - stanovení titrační kyselosti dle Soxhlet-Henckela,
      6. - stanovení obsahu celkového dusíku dle Kjeldahla,
      7. - stanovení bílkovin na základě celkového dusíku dle Kjeldahla vynásobením konvenčním faktorem pro mléčné bílkoviny 6,38,
      8. - stanovení mléčného cukru (laktózy) polarimetricky,
      9. - stanovení čísla kyselosti mléčného tuku neutralizací KOH volných mastných kyselin,
      10. - stanovení jodového čísla jako procentového množství jódu, vázaného zkoušenou látkou. Slouží pro zjištění nenasycených mastných kyselin a jakosti mléčného tuku,
      11. - stanovení kysací schopnosti mléka s použitím jogurtové kultury,
      12. - stanovení počtu somatických buněk v 1 ml mléka,
      13. - stanovení celkového počtu mikroorganismů (CPH) v 1 ml mléka v tisících,
      14. - stanovení inhibičních látek.
    1. 2.4. Doplňkové jakostní znaky mléka
      1. - mikrobiologické jakostní znaky,
      2. - obsah volných mastných kyselin u mléčného tuku,
      3. - obsah nutričně významných složek,
      4. - mechanické nečistoty.
  1. 3. Zkoušení vajec

    Odběr vzorků se provádí namátkovým výběrem reprezentativního počtu kusů vajec z každé skupiny.

    Jakost konzumních vajec se zjišťuje smyslově, fyzikálně, chemicky a mikrobiologicky. Veškeré kvantitativní vlastnosti se statisticky vyhodnocují.

    1. 3.1. Zjišťování smyslových vlastností vajec

      Zjišťuje se čistota, neporušenost a tvar skořápky, povrchový pach a vůně, velikost a nepohyblivost vzduchové bubliny, průhlednost a tuhost bílku, viditelnost a nepohyblivost žloutku, vývoj zárodku, vzhled bílku, vzhled žloutku, vůně a chuť obsahu po rozbití, zjištění chuti vaječného obsahu po uvaření.

    1. 3.2. Zjišťování fyzikálních vlastností vajec
      1. 3.2.1. Hmotnost vajec se zjišťuje vážením jednotlivých kusů
      2. 3.2.2. Index tvaru vajec je dán rozměry ve směru os
      3. 3.2.3. Pevnost skořápky se zjišťuje působením zesilujícího tlaku na celé vejce nebo upravenou skořápku.
      4. 3.2.4. Tloušťka skořápky se měří za konstantních podmínek na přesně zvolených místech, ostrém a tupém konci vejce.
      5. 3.2.5. Barva žloutku je intenzita zbarvení žloutku a posuzuje se podle 15 stupňového barevného vějíře.
      6. 3.2.6. Index tuhého bílku je dán poměrem plochy, kterou zaujímá bílek po vytlučení na podložku k jeho výšce. Plocha je charakterizována průměrem délky a šířky.
      7. 3.2.7. Haughovy jednotky vyjadřují jakost vejce na základě vztahu mezi výškou tuhého bílku a hmotností vejce. Vypočtou se dle vzorce:

        1. kde V je výška bílku v mm a H hmotnost vejce v g.
      1. 3.2.8. Index žloutku a zploštění je dán poměrem plochy, kterou zaujímá žloutek po vytlučení na podložku k jeho výšce. Plocha je charakterizovaná průměrem délky a šířky.

Příloha č. 23

část I k vyhlášce č. 451/2000 Sb.

BIOLOGICKÉ ZKOUŠENÍ DOPLŇKOVÝCH LÁTEK A URČITÝCH PROTEINOVÝCH KRMIV

BIOLOGICKÉ ZKOUŠENÍ DOPLŇKOVÝCH LÁTEK

Biologické zkoušení doplňkových látek se řídí postupy uvedenými v části I.. Mohou být požadovány všechny dále uváděné zkoušky a testy a je-li nutno, i další informace.

Základním požadavkem je provedení zkoušek identity, podmínek pro použití, fyzikálně-chemických vlastností, účinnosti doplňkové látky a její stanovitelnosti. Dále je nutno ověřit metabolismus a biologické a toxikologické vlivy doplňkové látky na cílová zvířata1). Je-li doplňková látka určena pro kategorii zvířat, patřících do definované skupiny zvířat, zkoušky musí být provedeny na tomto cílovém druhu zvířat. Testy požadované pro zhodnocení rizika pro lidské zdraví nebo životní prostředí závisí na povaze doplňkové látky a způsobech jejího užití. V tomto směru nejsou stanoveny striktní postupy.

U doplňkových látek, pro které je uvažováno použití výhradně do krmiv pro domácí zvířata, není vždy nutné provádět úplné vyčerpávající zkoušení chronické toxicity, mutagenity a karcinogenity, které je naopak nezbytné u doplňkových látek určených do krmiv pro hospodářská zvířata. Od zkoušek mutagenity a karcinogenity může být upuštěno, jestliže chemické složení, získané výsledky nebo jiné podklady neindikující možnost změn.

Důležitá je znalost metabolizmu doplňkových látek a jejich reziduí u hospodářských zvířat, kterou umožní rozsah toxikologických zkoušek provedených na laboratorních zvířatech tak, aby bylo riziko, pokud se vyskytne, stanoveno až ke spotřebiteli. Toto hodnocení nelze omezit jen na údaje získané určením přímých účinků doplňkové látky na pokusná zvířata. Tato neposkytují specifické informace o skutečných účincích reziduí přecházejících z metabolizmu druhu zvířat, pro které je doplňková látky určena.

Žádost o povolení nové doplňkové látky nebo jejího nového užití se doloží dokumentací a monografií. Vypuštění některých zkoušek a testů uvedených v této části přílohy nebo v příloze č. 25 se zdůvodní. Výsledky analyticky zjištěných údajů se dokládají přiložením protokolů laboratoří, které je provedly. Je požadováno dodržování správné laboratorní praxe.

Pojem „doplňková látka“ se v této části přílohy vztahuje na aktivní substanci nebo přípravek obsahující aktivní substanci ve stavu, v jakém bude zapracována do premixů a krmiv. Aktivní substancí může být látka chemicky stanovitelná nebo mikroorganizmus nebo enzymatický preparát. Látkou chemicky stanovitelnou se rozumí chemická látka, jejíž chemický název je shodný s názvoslovím podle Mezinárodní unie pro čistou a užitou chemii (IUPAC.)

  1. A. OVĚŘENÍ IDENTITY, VLASTNOSTÍ A PODMÍNEK UŽITÍ DOPLŇKOVÉ LÁTKY A ZPŮSOBY KONTROLY
    1. 1. Ověření identity doplňkové látky
      1. 1.1. Navržený název doplňkové látky
      2. 1.2. Typ doplňkové látky podle její hlavní funkce
      3. 1.3. Kvalitativní a kvantitativní složení (aktivní substance, jiné složky, nečistoty)
      4. 1.4. Fyzikální vlastnosti, velikost částic
      5. 1.5. Výrobní proces včetně zvláštních výrobních postupů
    2. Poznámka: Pokud je aktivní substance směsí aktivních komponent, z nichž každá je spolehlivě stanovitelná, musí být hlavní složky zvlášť popsány a musí být uveden jejich skutečný podíl ve směsi.
    1. 2. Specifikace týkající se aktivní substance
      1. 2.1. U chemicky stanovitelných látek se uvede:
        1. generické označení, chemické označení podle nomenklatury IUPAC, jiná generická mezinárodní označení a zkratky. Číslo podle Chemical Abstracts Service Number (CAS).

        U mikroorganismů se uvede:

        1. název a taxonomický popis podle mezinárodního nomenklatorického kodexu. K determinaci mohou být použity jiné mezinárodně uznávané klasifikační příručky, např. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, The Yeasts, a taxonomic study (Lodder a Kreger van Rijn, Ainsworth and Bisby's Dictionary of the Fungi (Hawksworth, Sutton a Ainsworth), the Genus Aspergillus (Raper a Fennel).

        U enzymových přípravků se uvede:

        1. označení podle hlavních enzymových aktivit ve smyslu požadavků IUB/IUPAC, European Inventory of Existing Commercial Substances (EINECS) a CAS Number.
      1. 2.2. Empirické a strukturní vzorce a molekulová hmotnost, kvalitativní a kvantitativní složení hlavních komponent, pokud je aktivní substance fermentačním produktem.

        U mikroorganismů:

        1. název a místo sbírek kultur schválených mezinárodním deposičním orgánem v tomto oboru. U deponovaného kmene se uvede sbírkové číslo, genové úpravy a všechny důležité identifikační znaky. Dále se uvede: původ, příslušné morfologické a fyziologické vlastnosti, vývojová stadia, závažné faktory týkající se biologické aktivity jako doplňkové látky a jiné genetické identifikační údaje. Počet jednotek tvořících kolonie (CFU) na 1 gram.

        U enzymových přípravků:

        1. biologický původ (u mikrobiálního původu: název a místo sbírky kultur schválené mezinárodním deposičním orgánem, ve které je kmen pod příslušným číslem přechováván, dále se uvedou genové úpravy a všechny důležité identifikační vlastnosti, a to včetně genetických údajů), aktivity týkající se chemicky čistých modelových substrátů a další fyzikální a chemické vlastnosti.

        Ve všech případech musí být připojena kopie o příjmu deponovaného mikroorganismu označeného názvem a taxonomickým popisem podle mezinárodních nomenklaturních pravidel.

      1. 2.3. Stupeň čistoty

        Kvalitativní a kvantitativní složení nečistot.

        U mikroorganismů:

        1. genetická stabilita a čistota kultivovaných kmenů.

        U enzymových přípravků:

        1. a) čistota (počet kontaminujících mikroorganismů, koncentrace těžkých kovů, výskyt toxinů, např. mykotoxinů - k detekci se použijí vhodné metody),
        2. b) absence antimikrobiální aktivity při hodnotách koncentrace v krmivu - ke stanovení se použijí vhodné metody,
        3. c) složení neenzymových komponent, zvláště veškeré organické hmoty (TOS).
      1. 2.4. Důležité vlastnosti u chemicky stanovitelných látek:
        1. elektrostatické vlastnosti, bod tání, bod varu, teplota rozkladu, hustota, tlak páry, rozpustnost ve vodě a v organických rozpouštědlech, hmotová a absorpční spektra a jiné fyzikální vlastnosti.

        U mikroorganismů:

        1. závazné identifikační vlastnosti a předpokládané využití, například vegetativní nebo sporulující forma, CFU na 1 gram.

        U enzymových přípravků:

        1. optimální hodnoty pH, optimální teplota (-y) a další vhodné vlastnosti.
      1. 2.5. Výroba, procesy čištění a použitá media.

        Změny ve složení kultivačního prostředí během výroby.

    1. 3. Fyzikálně-chemické, technologické a biologické vlastnosti doplňkové látky
      1. 3.1. Stabilita (u mikroorganismů pokles biologické aktivity, např. životnost) při působení podmínek prostředí, tzn. světla, teploty, pH, vlhkosti a kyslíku. Životnost in vitro.
      2. 3.2. Stabilita (u mikroorganismů pokles biologické aktivity, např. životnost) během výroby premixů a krmiv, zvláště termostabilita, stabilita vůči tlaku a vlhkosti. Možné rozkladné produkty.
      3. 3.3. Stabilita (u mikroorganismů pokles biologické aktivity, např. životnost) během skladování premixů a krmiv za definovaných podmínek. Životnost in vitro.

        U enzymových přípravků:

        1. podrobnosti o přítomnosti neočekávaných reakčních produktů vznikajících při enzymových či chemických reakcích enzymového přípravku se složkami krmiva nebo během poklesu účinnosti enzymového přípravku při skladování krmných směsí.
      1. 3.4. Ostatní důležité fyzikálně chemické, technologické nebo biologické vlastnosti, např. možnost vytvářet homogenní směsi v premixech a v krmných směsích, prašnost. U mikroorganismů a enzymů vyhodnocení odolnosti k poklesu nebo ztrátě biologické účinnosti v trávicí soustavě (in vivo) nebo za modelových podmínek in vitro.
      2. 3.5. Fyzikálně chemické nebo biologické nesnášenlivosti a interakce, např.s krmivy, jinými povolenými doplňkovými látkami nebo léčivy.
    1. 4. Podmínky pro použití doplňkové látky
      1. 4.1. Navržený způsob užití ve výživě zvířat (např. druh a kategorie zvířat, typ krmné směsi, fáze podávání a doba vyřazení - ochranná lhůta).
      2. 4.2. Kontraindikace.
      3. 4.3. Navržené dávkování v premixech a krmných směsích. Vyjadřuje se v:
        1. a) v procentech aktivní substance u premixů a v mg/kg u krmných směsí (krmiv), jedná-li se o chemicky stanovitelné látky,
        2. b) v příslušných jednotkách biologické aktivity, např. v CFU na gram produktu u mikroorganismů nebo v jednotkách účinnosti u enzymových přípravků.
      1. 4.4. Ostatní známé způsoby využití aktivní substance nebo přípravku (např. v potravinách, v humánní nebo veterinární medicíně, zemědělství a průmyslu). Pro každý způsob využití se uvedou příslušné názvy, indikace a kontraindikace.
      2. 4.5. Nezbytné informace o prevenci nebezpečí a použití ochranných prostředků během výroby, přepravy, skladování a zapracování do krmné směsi.
    1. 5. Kontrolní metody
      1. 5.1. Popis metod použitelných k určení kriterií uvedených v bodech 1.3, 2.3, 2.4, 2.5, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4 a 4.3
      2. 5.2. Popis kvalitativních a kvantitativních analytických metod pro rutinní kontrolu doplňkových látek v premixech a krmných směsích (krmivech).
      3. 5.3. Popis kvalitativních a kvantitativních analytických metod pro stanovení reziduí doplňkových látek v živočišném produktu.
    2. Poznámka: Specifické metodiky a dosažené výsledky musí obsahovat informace o specifitě a citlivosti vyšetření, limitech detekce, možných interferencích, opakovatelnosti a způsobu vzorkování. K dispozici musí být rovněž referenční standardy přípravku a aktivní substance. U mikroorganismů oficiální metody detekce, vyhodnocování, identifikace a odpovídající tržní ukazatele.
  1. B. ZKOUŠENÍ ÚČINNOSTI DOPLŇKOVÉ LÁTKY
    1. 1. Zkoušky zaměřené na zlepšení vlastností krmiv

      Do těchto zkoušek jsou zahrnuty technologické doplňkové látky, a to antioxidanty, konzervanty, pojiva, emulgátory, stabilizátory, želírující látky atd., které mají zlepšit nebo stabilizovat vlastnosti premixů a krmiv. Mezi technologické doplňkové látky se zařazují rovněž některé mikroorganismy a enzymové přípravky, pokud mohou zlepšit vlastnosti krmiva.

      Účinnost doplňkové látky je nutno prokázat vhodně stanovenými kriterii s přihlédnutím k předpokládaným podmínkám užití, a to vždy při souběžném porovnání s negativní kontrolní skupinou a pokud je možno, v porovnání s krmivem obsahujícím technologickou doplňkovou látku známých účinků.

      U každého pokusu je nutno jednotlivě uvést přesnou charakteristiku (vlastnosti) zkoušené účinné substance, přípravků, premixů a krmiv, referenční čísla šarží, koncentrace aktivní substance v premixech a krmivech, podmínky zkoušení (např. teplota, vlhkost) a data a doba trvání zkoušení, nepříznivé a negativní účinky, které se projevili v průběhu jednotlivých pokusů.

    1. 2. Zkoušky zaměřené na účinky doplňkových látek na živočišnou výrobu

      Do těchto zkoušek jsou zahrnuty doplňkové látky, určené pro výživu zvířat, které mohou příznivě ovlivnit živočišnou produkci. Následující zkoušky je nutno provádět vždy na příslušných cílových zvířatech v porovnání s negativní kontrolní skupinou a pokud možno též ve srovnání se skupinami, kterým se podávají krmiva obsahující doplňkové látky se známými účinky. Vyhodnotí se také vztah mezi výší dávky doplňkové látky a odpovědí pokusných zvířat.

      Pokud je účinná látka směsí účinných komponent, musí být vyhodnocena přítomnost každé jednotlivé komponenty.

      1. 2.1. U antikokcidik a jiných léčebných substancí se zkoušení na prvém místě zaměřuje na jejich specifické účinky a částečné profylaktické účinky (např. nemocnost, počet oocyst a výskyt chorobných změn - lesion score). Údaje o vlivu na konverzi krmiva a na ekonomické ukazatele růstu živočišné produkce mohou být připojeny.
      2. 2.2. U ostatních doplňkových látek, v daném případě včetně mikroorganismů a enzymových přípravků se zkoušení zaměřuje na účinky na konverzi krmiva, přírůstky, užitkovost a vlastnosti živočišného produktu, pohoda a chování pokusných zvířata a další ukazatele, které příznivě ovlivňujíc živočišnou výrobu.
      3. 2.3. Pokusné podmínky

        Provedené pokusy a zjištěné výsledky se dokládají podrobnou dokumentací. Provede se statistické vyhodnocení a uvedou se požité metody.

        Zaznamenává se:

        1. 2.3.1. druh, plemeno, pohlaví a stáří zvířat, způsoby označení,
        2. 2.3.2. počet pokusných a kontrolní skupin, počet zvířat v každé skupině, počet zvířat samčího a samičího pohlaví musí vyhovovat požadavkům statistiky,
        3. 2.3.3. koncentrace účinné látky (popřípadě látek používaných ke srovnávacím účelům v krmivech), které byly stanoveny kontrolní analýzou s použitím příslušných závazných metod, referenční čísla šarží, kvalitativní a kvantitativní výživářské složení krmné dávky,
        4. 2.3.4. místo každého pokusu, zdravotní stav, fyziologické, výživářské a chovatelské podmínky běžně používané, kontroly krmení a opatření zabraňující kontaminaci kontrolních skupin během pokusu (především u mikroorganismu vznik křížové kontaminace mikroorganismy přítomnými v krmivu),
        5. 2.3.5. datum a přesná délka zkoušení, datum a druh provedených vyšetření,
        6. 2.3.6. nepříznivé účinky a další skutečnosti, které se projevily během pokusů s uvedením času jejich zjištění.
    1. 3. Zkoušky zaměřené na jakost živočišného produktu

      Smyslové, kulinární, hygienické a technologické vlastnosti živočišného produktu získaného ze zvířat, jimž se podávala krmiva obsahující doplňkovou látku.

  1. C. ZKOUŠENÍ BEZPEČNOSTI UŽITÍ DOPLŇKOVÝCH LÁTEK
    1. 1. Zkoušky na cílovém druhu zvířat
      1. 1.1. Toxikologické testy doplňkové látky

        Testy tolerance

        Při testaci se sledují účinky biologické, toxikologické, makroskopické a histologické. Pro stanovení limitu bezpečnosti se využijí údaje o maximální doporučené dávce a množství, které již vyvolává nepříznivé účinky. Ke stanovení minimálních nebo přibližných dávek dolní hranice limitu bezpečnosti lze využít údajů o výrazném překročení maximálních doporučených dávek, které způsobují nepříznivé účinky.

      1. 1.2. Mikrobiologické testy doplňkové látky
        1. 1.2.1. Antibakteriální účinnost testované chemicky stanovitelné látky, která vykazuje antimikrobiální účinky v koncentracích, ve kterých je přítomna v krmivu, se prověří stanovením mikrobiální inhibiční koncentrace (MIK) vůči různým patogenním a nepatogenním Grampozitivním i Gramnegativním bakteriím.
        2. 1.2.2. Průkaz křížové rezistence k léčebným antibiotikům stanovením MIK u těch mutantů, vytvářených in vitro, které vykazují chromozomální rezistenci vůči doplňkové látce. U těch mikroorganismů, které jsou rezistentní vůči léčebným antibiotikům, nutno objasnit genetický základ rezistence.
        3. 1.2.3. Testy pro stanovení schopností doplňkových látek působit jako selekční resistentní faktor. Testy se provádějí v provozních podmínkách a na tom druhu zvířat, pro který je příslušná doplňková látka primárně určena. Následně se musí stanovit zda, R-faktory, které mohou být nalezeny, podmiňují mnohonásobnou rezistenci a jsou přenosné.
        4. 1.2.4. Testy určující účinnost doplňkové látky sledují vliv na:
          1. - mikrofloru trávící soustavy,
          2. - kolonizaci trávící soustavy jedním nebo směsí několika druhů mikroorganismů,
          3. - pomnožování a vylučování patogenních mikroorganismů, pokud je aktivní substance chemicky stanovitelná a vykazuje antimikrobiání aktivitu.
        1. 1.2.5. Při zjištění antimikrobiální aktivity se v provozních podmínkách monitoruje procentuální podíl bakterií rezistentních k testované doplňkové látce. To se provádí v časově dostačujících intervalech před, během a po (1 měsíc) podávání doplňkové látky.
        2. 1.2.6. Pokud je aktivní substancí mikroorganismus, je nutno stanovit, je-li rezistentní k antibiotikům.
        3. 1.2.7. Pokud aktivní substanci (např. enzymové přípravky) vytváří mikroorganismus, je nutno stanovit odpovídající počet živých mikroorganismů.
        4. 1.2.8. Pokud doplňková látka obsahuje nebo se přímo skládá z geneticky modifikovaných mikroorganismů, požadovaná informace obsahuje
          1. - kopii písemného souhlasu nebo schválení kompetentních orgánů k uvolnění geneticky modifikovaných mikroorganismů k výzkumu a vývojovému využití, a to v souladu se zvláštním právním předpisem2),
          2. - úplnou technickou dokumentaci, pokud je nepostradatelné zohlednit rozmanitost možností využití doplňkové látky, a to včetně údajů o místě a výsledcích výzkumu a
          3. - vývojového využití, a to s přihlédnutím k těm vlivům na ekosystémy, které by mohly být ovlivněny používáním doplňkové látky a vyhodnocení rizika pro zdraví lidí a zvířat i pro životní prostředí ve vztahu k přítomnosti geneticky modifikovaných organismů (GMO),
          4. - podmínky pro uvádění doplňkové látky do oběhu, a to včetně podmínek upravujících její používání.
      1. 1.3. Testy metabolismu a reziduí (u chemicky stanovitelných aktivních substancí)
        1. 1.3.1. Testy látkové výměny
          1. a) metabolická bilance, rychlost a úroveň vstřebávání a vylučování aktivní substance,
          2. b) identifikace metabolických procesů a hlavních klíčových metabolitů,
          3. c) distribuce a exkrece metabolitů (žlučí, močí, výkaly aj.),
          4. d) případné vlivy střevní nebo předžaludkové mikroflory, enterohepatického cyklu a činnosti slepého střeva na metabolismus.
        1. 1.3.2. Analytika reziduí:
          1. kvalitativní a kvantitativní složení reziduí (aktivní substance, metabolismus) v různých živočišných produktech při metabolické rovnováze a při běžných praktických podmínkách použití doplňkové látky.
        1. 1.3.3. Kinetika reziduí (po opakovaném podávání doplňkové látky při navrženém užití) perzistence aktivní substance a hlavních klíčových metabolitů v různých orgánech a tkáních po vysazení krmiv, obsahujících prověřovanou doplňkovou látku.
        2. 1.3.4. Biologická využitelnost reziduí v živočišných produktech
        3. 1.3.5. Metabolický monitoring

          Kvantitativní a kvalitativní metody detekce testů, použitých podle odstavců 1. 3. 1. až 1. 3. 4., dále informace o reprodukovatelnosti, specifitě a limitech detekce. Metody stanovení reziduí musí být dostatečně citlivé, aby umožnily detekci reziduí i při toxikologicky zanedbatelných koncentracích.

    1. 2. Zkoušky vylučovaných reziduí, jsou-li aktivní substance chemické látky
      1. 2.1. Charakteristika a koncentrace reziduí odvozených od doplňkové látky (aktivní substance, metabolity) v exkretech
      2. 2.2. Perzistence (hodnota poločasu) a kinetika vylučování těchto reziduí ve výkalech, hnoji, podestýlce, kejdě
      3. 2.3. Účinky na tvorbu metanu
      4. 2.4. Degradace, perzistence (hodnota poločasu) a kinetika vylučování do půdy (různé typy půd.
      5. 2.5. Účinky na půdní zvířenu a mikrobiální procesy transformace (např. ukládání reziduí v rostlinách a těle zvířat)
      6. 2.6. Účinky na suchozemské rostliny (např. klíčivost semen, růst rostliny a ukládání v rostlině)

        Testy se musí uskutečnit za exaktních kontrolovatelných podmínek i v provozních podmínkách, použijí se různé rostlinné druhy.

      1. 2.7. Vodorozpustnost a stabilita doplňkové látky a metabolitů, vzniklých z doplňkové látky ve vodě
      2. 2.8. Účinky na život ve vodě
        1. 2.8.1. Účinky na rostliny (např. Chlorella).
        2. 2.8.2. Toxické účinky na bezobratlé živočichy (např. Daphnia magna) - toxicita.
        3. 2.8.3. Toxické účinky na ryby (alespoň na dva druhy).
    1. 3. Zkoušky na laboratorních zvířatech

      Tyto zkoušky se uskuteční s aktivní látkou nebo s jejími hlavními metabolity nebo produkty, pokud se tyto vyskytují v potravinách nebo jsou biologicky využitelné. Pokud možno, mají se uskutečnit na těch zvolených laboratorních zvířatech, u nichž se procesy trávení, zažívání, vstřebávání a intermediárního metabolismu doplňkové látky podobají pochodům, probíhajícím u člověka nebo u cílových zvířat. Testy je nutno provést podle závazných metodických postupů, a to do všech podrobností.

      V metodikách musí být obsaženy následující údaje: živočišný druh, plemeno, linie, velikost a počet pokusných i kontrolních skupin, množství podávané látky, složení krmné dávky a výsledky laboratorního vyšetření, podmínky chovu a ošetřování, přesná délka testu, data provedení různých vyšetření, úroveň hynutí. Uvede se podrobný popis makroskopických, patologických a histopatologických nálezů u všech testovaných zvířat, včetně časového výskytu všech patologických lézí. Všechny dosažené výsledky, a to včetně jejich statistického vyhodnocení, se uvádějí ve všech podrobnostech.

      1. 3.1. Akutní toxicita (nezávazné pro mikroorganismy)
        1. 3.1.1. Akutní orální toxicitu je nutno uskutečnit na dvou druzích živočichů (jedním z nich se přednostně doporučuje potkan). Maximální dávka nemá převýšit 2000 mg x kg živé hmotnosti. Podrobné vyhodnocování biologických účinků se provádí maximálně po dobu 14 dnů aplikace ověřované doplňkové látky. Tyto testy nejsou závazné pro enzymové přípravky.
        2. 3.1.2. Testy akutní inhalační toxicity, drážditelnosti kůže a kde je to nezbytné, sliznic i alergických účinků, se uskuteční s pečlivým přihlédnutím k možným nebezpečím při manipulaci (skladování, vážení, balení, přeprava doplňkové látky).
      1. 3.2. Mutagenita
        1. 3.2.1. Aktivní substance je chemicky stanovitelná látka

          K průkazu mutagenních vlastností aktivních substancí nebo jejich metabolitů nebo produktů se provádějí vybrané kombinační mutagenní testy, při nichž se stanoví různé konečné genetické ukazatele. Uskutečnění těchto testů podmiňuje přítomnost či absence metabolicky aktivovaných mikrosomálních savčích přípravků.

          Doporučuje se následující zaměření testů:

          1. a) test genových mutací Prokaryontů,
          2. b) test genových mutací in vitro pro Eukaryonty a nebo test recesivního letálního a na pohlaví vázaného faktoru u octomilky Drosophila melanogaster,
          3. c) test chromozomálních aberací in vitro a in vivo.

          Vedle výše uváděné skupiny navržených testů lze však přijmout alternativně také ostatní testy, zvláště ty, které se provedly in vivo. Vývěr zvolených testů se vždy zdůvodní.

          Ve všech případech se zvolí takové testy, pro něž jsou k disposici validované metodiky. Dodatečná doplňující vyšetření se případně mohou uskutečnit v závislosti na charakteru dosažených výsledků, celkovém toxikologickém profilu látky, a také s přihlédnutím k doporučenému využití doplňkové látky.

        1. 3.2.2. U enzymových přípravků, izolovaných z mikroorganismů, se běžně požadují následující testy:
          1. a) test genových mutací bakterií,
          2. b) test chromozomálních aberací (přednostně in vitro).

            Pokud možno, mají se toxikologické testy uskutečňovat s použitím šarže přečistěného finálního fermentačního produktu, a to před přidáním nosičů, ředidel nebo jiných látek. Závazně se uskutečňují v souladu se všemi metodickými postupy uznávaných mezinárodních vědeckých ústavů. Účinky látek bílkovinné povahy nebo aktivit enzymových přípravků, sledované na buněčné úrovni, zvláště testy in vitro, lze vyhodnocovat modifikovanými standardními metodikami. Tyto odchylky lze přijmout tehdy, pokud jsou podloženy odpovídajícími argumenty.

            Při testaci se mají objasnit nespecifické toxické reakce a prokázat genotoxické účinky. Zobecněné specifikace a skupinový test umožňují v produktu stanovit spolehlivě definované a specifické toxiny i neznámé toxické sloučeniny.

            Toxikologická zpráva obsahuje vyčerpávající dokumentaci. Testy se provedou s materiálem jehož charakteristiky jako komerčního přípravku jsou popsány v technologické části dokumentace.

      1. 3.3. Farmakokinetické aspekty

        U chemicky definované aktivní substance se musí provést testy bilance a identifikace metabolitů, a to s použitím vhodně značených molekul nebo jiných vhodných technik a při podávání jedné nebo více dávek aktivní substance ve stanovených časových obdobích. Metabolické testy musí také zahrnovat farmakokinetiku aktivní substance a hlavních klíčových metabolitů. Je nutno respektovat druhovou specifitu při volbě nejcitlivějšího živočišného druhu pro následná toxikologická vyšetření.

      1. 3.4. Subchronická toxicita

        Zásadně nutno tyto testy provádět na dvou živočišných druzích (jedním z nich se přednostně doporučuje potkan). Druhým živočišným druhem má být cílový živočich. Prověřovaná substance se podává per os, přičemž je nutno vyhodnotit odpovídající reakce na její rozdílné dávky. Délka pokusu na hlodavcích je nejméně 90 dní.

        Ve zvláštních případech se uskutečňují pokusy v délce od 6 měsíců do 2 let, a to na jiných živočišných druzích než jsou hlodavci, aby se tak prokázala druhová specifita citlivosti zvířat vůči prověřované substanci.

        Tyto testy nejsou závazné pro mikroorganismy. U enzymových přípravků mikrobiálního původu stačí test perorální toxicity na hlodavcích v délce 90 dnů.

      1. 3.5. Chronická toxicita, karcinogenita

        Testy chronické toxicity musí být provedeny na jednom živočišnému druhu (doporučuje se potkan), pro testy karcinogenity se doporučují dva druhy hlodavců. Prověřované látky je nutno podávat per os v různých přesně stanovených dávkách. Přijatelný je rovněž kombinovaný test chronické toxicity a karcinogenity in utero. Testy musí trvat nejméně 24 měsíce u potkanů a 18 měsíců u myší. Pokud se překročí minimální zkušební období, je nutno se pokus ukončit v případě, že při nejvyšší dávce dosáhne mortalita 20%.

        V průběhu pokusu nutno zaznamenávat všechny výsledky vyšetření krve, moči a klinické biochemie při jednotlivých odběrech ve vhodných intervalech. U všech zvířat uhynulých během pokusu a u všech zvířat přeživších a utracených na konci pokusu, je nutno zaznamenat výsledky patomorfologického a histologického vyšetření.

        Uvedené testy nejsou závazné pro mikroorganismy a enzymové přípravky.

      1. 3.6. Reprodukční toxicita (u aktivních substancí chemicky definovatelných)

        Přednostně se musí testy provádět na potkanech. Testy musí pokračovat nejméně u dvou filiálních generací a mohou být spojeny s testy embryotoxicity a teratogenity. Povinně se zaznamenávají a vyhodnocují všechny ukazatele oplození, zabřeznutí, březosti, porodu a ukazatele perinatální a postnatální. Specifické testy teratogenity je nutno provést minimálně na dvou vyhovujících živočišných druzích.

      1. 3.7. Toxikologie metabolitů (aktivní substance je chemicky definovatelná)

        Údaje se vyžadují pro stanovení koncentrací reziduí a pro vyhodnocení nebezpečí pro člověka. K dispozici musí být hodnověrné údaje pro stanovení předpokládané doby vysazení doplňkové látky z krmné dávky (ochranná lhůta). Testy zmíněné v bodě 1. 3. 4. je nutno uskutečnit na laboratorních zvířatech.

      1. 3.8. Jiné vhodné testy

        Při zvláštních testech se doporučuje poskytnout pro prověřovanou doplňkovou látku další dodatečné údaje (biologická využitelnost, neurotoxicita, imunotoxicita).

Příloha č. 23

část II k vyhlášce č. 451/2000 Sb.

BIOLOGICKÉ ZKOUŠENÍ URČITÝCH PROTEINOVÝCH KRMIV

Biologické zkoušení určitých proteinových krmiv zahrnuje provedení zkoušek uvedených v této příloze.

Zpracovaná dokumentace o výsledcích těchto zkoušek musí obsahovat přesné údaje, které musí být v předepsaném pořadí dle této přílohy očíslovány, a musí k nim být přiložen souhrn. Neuvedení některé zkoušky je nutno zdůvodnit. Publikace, na něž je odkazováno, je nutno doložit v předkládané dokumentaci. Ústav si může dodatečně vyžádat další podklady.

V této příloze se pojem produkt vztahuje na jakýkoli proteinový produkt ve stavu, v jakém by měl být použit jako samostatná surovina nebo jako součást krmiva.

Každá změna výrobního postupu produktu nebo každá změna jako použití podléhá ohlášení, na jehož základě může ústav požadovat předložení podkladů, které umožní nové posouzení.

  1. 1. Údaje o použitém mikroorganismu
    1. 1.1. Taxonomie, původ, morfologie, biologické vlastnosti, v daném případě genetické změny
    2. 1.2. Neškodnost, případná stálost mimo kultivační medium a případné účinky na životní prostředí
    3. 1.3. Stálost a stupeň čistoty kultivovaných kmenů mikroorganismů. Metody použitelné k ověření těchto znaků.
  1. 2. Kultivační media a výrobní postup
    1. 2.1. Složení substrátů, přidávaných látek atd.
    2. 2.2. Postupy výroby, sušení a čištění. Postup devitalisace mikroorganismů. Metody použitelné k ověření stálosti složení krmiva vyrobeného kultivací mikroorganismů a ke stanovení případných chemických, fyzikálních nebo biologických nečistot v průběhu výroby
    3. 2.3. Technický postup úpravy pro použití.
  1. 3. Znaky produktu
    1. 3.1. Fyzikální a fyzikálně-chemické vlastnosti:

      makro-a mikroskopická morfologie, velikost částic, hustota, specifická hmotnost, vazba vody, rozpustnost, elektrostatické vlastnosti atd.

    1. 3.2. Chemické složení a znaky
      1. 3.2.1. Vlhkost, obsah dusíkatých látek, tuku, vlákniny, popela, veškerých cukrů jako sacharosa. Kolísání rozpětí obsahů.
      2. 3.2.2. Obsah celkového dusíku, bílkovin, nukleových kyselin, amoniakálního dusíku, aminového dusíku, nitrátů a nitritů. Kvalitativní a kvantitativní složení aminokyselin celkem a volných aminokyselin a rovněž purinových a pyrimidinových bází.
      3. 3.2.3. Kvalitativní a kvantitativní složení tuků (mastné kyseliny, nezmýdelnitelné látky, pigmenty rozpustné v tuku, fosfolipidy).
      4. 3.2.4. Složení obsažených cukrů
      5. 3.2.5. Kvalitativní a kvantitativní složení obsahu minerálních složek.
      6. 3.2.6. Kvalitativní a kvantitativní složení obsahu vitamínů.
      7. 3.2.7. Kvalitativní a kvantitativní složení obsahu specielních složek: doplňkové látky, zbytky substrátů a zřeďovacích prostředků, jiné případně škodlivé zbytky látkové přeměny substrátu, kultivačního media, výrobního postupu.
    1. 3.3. Mikrobiologická kontaminace výrobku
    2. 3.4. Chování a stabilita produktu ve směsi s jinými krmivy při skladování.
  1. 4. Úprava a podmínky pro použití
    1. 4.1. Navržený název produktu pro uvádění do oběhu
    2. 4.2. Úprava produktu navrhovaná pro uvádění do oběhu
    3. 4.3. Předpokládané užití produktu ve výživě zvířat. Navržené koncentrace v kompletní krmné směsi a navržené množství krmiva v denní krmné dávce pro uvažované druhy a kategorie zvířat.
  1. 5. Kontrolní metody

    Kvalitativní a kvantitativní analytické metody ke kontrole produktu v kompletních krmných směsích a premixech.

    Popis těchto metod musí být doplněn následujícími údaji:

    1. zvláštnost, citlivost, hranice důkazu, rozpětí chyby a případné interference s jinými látkami. Vzorky výrobku v různých předpokládaných úpravách musí být k dispozici.
  1. 6. Ověření výživářsko-fyziologických vlastností výrobku
    1. 6.1. Určení hodnoty bílkoviny
      1. 6.1.1. Chemické, biochemické a mikrobiologické zkoušky.
      2. 6.1.2. Zkoušky produktu na laboratorních zvířatech ve srovnání s kontrolní bílkovinou.
    1. 6.2. Zkoušky produktu provedené na druzích a kategoriích zvířat, pro něž je určen jako krmivo. Na každém druhu a kategorii zvířat, u něhož je předpoklad užití produktu, musí být provedeny následující zkoušky ve srovnání s kontrolní skupinou, která je krmena obvyklým krmivem s ekvivalentním podílem dusíkatých látek bílkovinné povahy - u přežvýkavců ekvivalentním podílem celkového dusíku za naprosto stejných podmínek výživářsko-fyziologické srovnatelnosti.
      1. 6.2.1. Stanovení hodnoty bílkovin a hodnoty energie přidávaného produktu v krmné dávce v navržených podmínkách použití a v různých fyziologických obdobích zvířat (např. růst, březost, snáška).
      2. 6.2.2. Stanovení vlivu produktu na růst (přírůstky), produkční účinnost, zdravotní stav, případné úhyny v navržených podmínkách užití.
      3. 6.2.3. Stanovení optimálního podílu produktu v krmné dávce.
      4. 6.2.4. Ověření působení produktu za navržených podmínek užití na technologické, organoleptické a ostatní kvalitativní vlastnosti živočišných produktů.
    1. 6.3. Pokusné podmínky pro zkoušení produktu na použitelnost u předpokládaných druhů a kategorií zvířat. Provedené pokusy je nutno zevrubně popsat s uvedením následujících podrobností.
      1. 6.3.1. Druh, plemeno, stáří a pohlaví zvířat a označení.
      2. 6.3.2. Počet pokusných a kontrolních skupin; počet zvířat v každé skupině (tento počet musí být dostatečný pro statistické vyhodnocení při použití vhodných statistických parametrů).
      3. 6.3.3. Procentický podíl produktu v krmné dávce, kvalitativní a kvantitativní složení krmné dávky a její analýza.
      4. 6.3.4. Místo pokusů, fyziologický a zdravotní stav zvířat a podmínky chovu podle obecně prováděné praxe.
      5. 6.3.5. Přesná doba trvání pokusů a datum zkoušek.
      6. 6.3.6. Vedlejší účinky v průběhu pokusů a časové označení jejich projevu.
  1. 7. Ověření biologických vlivů použití produktu ve výživě zvířat
    1. 7.1. Ověření na kategoriích zvířat, která přicházejí v úvahu pro užití krmiva. Na každém druhu a kategorii zvířat, u něhož je předpoklad užití krmiva, se provádějí dále uvedené zkoušky ve srovnání s kontrolní skupinou, která je krmena obvyklým krmivem s ekvivalentním podílem dusíkatých látek bílkovinné povahy, u přežvýkavců ekvivalentním podílem celkového dusíku, za naprosto stejných srovnatelných výživářských a fyziologických podmínek.
      1. 7.1.1. Stanovení nejvyššího možného podílu produktu v denní krmné dávce bez projevu vedlejších účinků.
      2. 7.1.2. Stanovení možných účinků produktu na plodnost a provedení generačních pokusů, pokud je pro jejich provedení důvod.
      3. 7.1.3. Stanovení účinků v navržených praktických podmínkách použití na mikroorganismy trávícího traktu, vliv na přítomnost pathogenních mikroorganismů v trávícím traktu.
      4. 7.1.4. Stanovení možných reziduí produktu (substrátu, kultivačního media, rozpouštědel, kontaminantů) za navržených podmínek užití v živočišných produktech.
      5. 7.1.5. Stanovení možných reziduí produktu (substrátu, kultivačního media, rozpouštědel, kontaminantů) za navržených podmínek užití v exkrementech.
    1. 7.2. Ověření produktu na laboratorních zvířatech
      1. 7.2.1. Chování produktu v organismu, sledování metabolismu, tj. (absorpce, akumulace, biologická přeměna, vylučování atd.).
      2. 7.2.2. Ověření možné mutagenity vyvolané kontaminanty (zejména mykotoxiny a bakteriemi) nebo rezidui produktu (substrátu, kultivačního media, rozpouštědla), včetně pokusů in vitro s aktivací výměny látkové.
      3. 7.2.3. Toxikologické zkoušky.

        Dále uvedené zkoušky produktu se provádějí ve srovnání s kontrolními skupinami, kterým jsou podávána obvyklá krmiva s ekvivalentními podíly dusíkatých látek bílkovinné povahy za naprosto stejných a srovnatelných výživářských a fyziologických podmínek. Zjištěné toxické účinky musí být prozkoumány, aby byla zdůvodněna jejich příčina a průběh, a aby se zejména zjistilo, zda pocházejí z výživářsko-fyziologické nevyváženosti nebo předávkování zkoušeného produktu.

        1. 7.2.3.1. Zkouška krátkodobé toxicity (minimálně 90 dní).