Platné znění

Vyhláška, kterou se stanoví analytické metody kontroly složení kosmetických prostředků

  1. účinné od 1. 1. 20061. Rozsah a oblast použití

    účinné od 1. 1. 2006Tato metoda je vhodná pro kvantitativní stanovení chloru přítomného ve formě chloridových iontů v chloro(hydroxo)komplexech hliníku a zirkonia v neaerosolových antiperspirantech.

  1. účinné od 1. 1. 20062. Princip

    účinné od 1. 1. 2006Obsah chloridových iontů v prostředku se stanoví potenciometrickou titrací standardním roztokem dusičnanu stříbrného.

  1. účinné od 1. 1. 20063. POUŽITÉ CHEMIKÁLIE

    účinné od 1. 1. 2006Všechny použité chemikálie musí být čistoty p.a. nebo vyšší

    1. účinné od 1. 1. 20063.1 Kyselina dusičná, koncentrovaná (d20 = 1,42 g/ml)
    2. účinné od 1. 1. 20063.2 Kyselina dusičná, 5% (V/V) roztok: ke 250 ml vody v kádince se za stálého míchání přidá 25 ml koncentrované kyseliny dusičné (3.1). Tento roztok se přenese do odměrné baňky na 500 ml a doplní se po rysku vodou.
    3. účinné od 1. 1. 20063.3 Aceton
    4. účinné od 1. 1. 20063.4 Dusičnan stříbrný, 0,1 mol/l odměrný roztok („AnalaR“ nebo ekvivalentní)
  1. účinné od 1. 1. 20064. Přístroje a pomůcky
    1. účinné od 1. 1. 20064.1 Obvyklé laboratorní vybavení
    2. účinné od 1. 1. 20064.2 Topná deska s magnetickým míchadlem
    3. účinné od 1. 1. 20064.3 Stříbrná elektroda
    4. účinné od 1. 1. 20064.4 Kalomelová referentní elektroda
    5. účinné od 1. 1. 20064.5 pH-metr nebo milivoltmetr vhodný pro potenciometrickou titraci
  1. účinné od 1. 1. 20065. Postup
    1. účinné od 1. 1. 20065.1 Příprava vzorku
      1. účinné od 1. 1. 20065.1.1 Do kádinky na 250 ml se odváží přibližně 1,0 g (m gramů) homogenního vzorku prostředku přesně. Přidá se 80 ml vody a 20 ml roztoku 5% kyseliny dusičné (3.2).
      2. účinné od 1. 1. 20065.1.2 Kádinka se umístí na topnou desku s magnetickým míchadlem (4.2). Zapne se míchání a zahřeje se až k varu. Aby se zabránilo rychlému odpaření, umístí se na kádinku hodinové sklo. Vaří se 5 minut, kádinka se sejme z topné desky a ochladí se na laboratorní teplotu.
      3. účinné od 1. 1. 20065.1.3 Přidá se 10 ml acetonu (3.3), elektrody (4.3 a 4.4) se ponoří pod hladinu roztoku a zapne se míchání. Provede se potenciometrická titrace 0,1 mol/l roztokem dusičnanu stříbrného (3.4) a sestrojí se diferenciální křivka za účelem stanovení bodu ekvivalence (V ml).
  1. účinné od 1. 1. 20066. Výpočet

    účinné od 1. 1. 2006Obsah chloru ve vzorku, vyjádřený v hmotnostních procentech, se vypočítá podle vzorce:

    účinné od 1. 1. 2006

    1. účinné od 1. 1. 2006kde
      účinné od 1. 1. 2006
      m =hmotnost anylyzovaného vzorku (5.1.1) v g,
      V =objem 0,1 mol/l roztoku dusičnanu stříbrného v mililitrech, spotřebovaného pro titraci do bodu ekvivalence.
  1. účinné od 1. 1. 20067. Opakovatelnost

    účinné od 1. 1. 2006Pro výrobky obsahující asi 4 % (m/m) chloru nesmí rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení na stejném vzorku překročit absolutní hodnotu 0,10 %.

  1. účinné od 1. 1. 2006E. Výpočet poměru obsahu atomů hliníku k obsahu atomů zirkonia a výpočet poměru obsahu atomů hliníku a zirkonia k obsahu atomů chloru
    1. účinné od 1. 1. 20061. Výpočet poměru obsahu atomů hliníku k obsahu atomů zirkonia

      účinné od 1. 1. 2006Poměr Al:Zr se vypočítá podle vzorce:

      účinné od 1. 1. 2006

    1. účinné od 1. 1. 20062. Výpočet poměru obsahu atomů hliníku a zirkonia k obsahu atomů chloru

      účinné od 1. 1. 2006Poměr (Al + Zr):Cl se vypočítá podle vzorce:

      účinné od 1. 1. 2006

  1. účinné od 1. 1. 200635. KVALITATIVNÍ A KVANTITATIVNÍ STANOVENÍ HEXAMIDINU, DIBROMHEXAMIDINU, DIBROMPROPAMIDINU A CHLORHEXIDINU
    1. účinné od 1. 1. 20061. Rozsah a oblast použití

      účinné od 1. 1. 2006V této metodě je popsáno kvalitativní a kvantitativní stanovení

      1. účinné od 1. 1. 2006— hexamidinu a jeho solí včetně 2-hydroxyethansulfonátu a 4-hydroxybenzoátu,
      2. účinné od 1. 1. 2006— dibromhexamidinu a jeho solí včetně 2-hydroxyethansulfonátu,
      3. účinné od 1. 1. 2006— dibrompropamidinu a jeho solí včetně 2-hydroxyethansulfonátu,
      4. účinné od 1. 1. 2006— diacetátu, diglukonátu a dihydrochloridu chlorhexidinu
      5. účinné od 1. 1. 2006v kosmetických prostředcích.
    1. účinné od 1. 1. 20062. Definice

      účinné od 1. 1. 2006Koncentrace hexamidinu, bromdibromhexamidinu, bromdibrompropamidinu a chlorhexidinu stanovené touto metodou se vyjádří v hmotnostních procentech (% m/m).

    1. účinné od 1. 1. 20063. Podstata metody

      účinné od 1. 1. 2006Kvalitativní a kvantitativní stanovení se provádí pomocí chromatografie iontových párů za použití vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC) s obrácenými fázemi s následnou detekcí UV spektrofotometrií. Hexamidin, dibromhexamidin, dibrompropamidin a chlorhexidin se kvalitativně stanovují podle svých retenčních časů v chromatografické koloně.

    1. účinné od 1. 1. 20064. POUŽITÉ CHEMIKÁLIE

      účinné od 1. 1. 2006Všechny použité chemikálie musí být čistoty p.a. nebo vyšší a podle potřeby musí být vhodná pro HPLC.

      1. účinné od 1. 1. 20064.1 Methanol
      2. účinné od 1. 1. 20064.2 Natrium-heptan-1-sulfonát monohydrát
      3. účinné od 1. 1. 20064.3 Ledová kyselina octová (d20 = 1,05 g/ml)
      4. účinné od 1. 1. 20064.4 Chlorid sodný
      5. účinné od 1. 1. 20064.5 Mobilní fáze
        1. účinné od 1. 1. 20064.5.1 Eluent I: 0,005 mol/l roztok natrium-heptan-1-sulfonátu monohydrátu (4.2) v methanolu (4.1) upravený ledovou kyselinou octovou (4.3) na hodnotu pH 3,5.
        2. účinné od 1. 1. 20064.5.2 Eluent II: 0,005 mol/l roztok natrium-heptan-1-sulfonátu monohydrátu (4.2) ve vodě upravený ledovou kyselinou octovou (4.3) na hodnotu pH 3,5.
      6. účinné od 1. 1. 2006Poznámka: Je-li nutné zlepšit tvar píků, lze mobilní fáze upravit a připravit níže uvedeným způsobem:
        1. účinné od 1. 1. 2006— eluent I: 5,84 g chloridu sodného (4.4) a 1,1013 g natrium-heptan-1-sulfonátu monohydrátu (4.2) se rozpustí ve 100 ml vody. Přidá se 900 ml methanolu (4.1) a upraví se ledovou kyselinou octovou (4.3) na hodnotu pH 3,5.
        2. účinné od 1. 1. 2006— eluent II: 5,84 g chloridu sodného (4.4) a 1,1013 g natrium-heptan-1-sulfonátu monohydrátu (4.2) se rozpustí v jednom litru vody a upraví se ledovou kyselinou octovou (4.3) na hodnotu pH 3,5.
      1. účinné od 1. 1. 20064.6 Hexamidin-di(2-hydroxyethansulfonát) [C20H26N4O2·2C2H6O4S]
      2. účinné od 1. 1. 20064.7 Dibromhexamidin-di(2-hydroxyethansulfonát) [C20H24Br2N4O2·2C2H6O4S]
      3. účinné od 1. 1. 20064.8 Dibrompropamidin-di(2-hydroxyethansulfonát) [C17H18Br2N4O2·2C2H6O4S]
      4. účinné od 1. 1. 20064.9 Chlorhexidin-diacetát [C22H30Cl2N10·2C2H4O2]
      5. účinné od 1. 1. 20064.10 Standardní roztoky: v eluentu I (4.5.1) se připraví 0,05% (m/V) roztoky všech čtyř konzervantů (4.6 až 4.9).
      6. účinné od 1. 1. 20064.11 3,4,4'-Trichlorkarbanilid (Triclocarban - INN)
      7. účinné od 1. 1. 20064.12 4,4'-Dichlor-3-(trifluormethyl)karbanilid (Halocarban - INN)
    1. účinné od 1. 1. 20065. Přístroje a pomůcky
      1. účinné od 1. 1. 20065.1 Obvyklé laboratorní vybavení
      2. účinné od 1. 1. 20065.2 Chromatograf pro vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii s UV detektorem s nastavitelnou vlnovou délkou
      3. účinné od 1. 1. 20065.3 Analytická dělicí kolona: kolona z nerezové oceli o délce 30 cm a vnitřním průměru 4 mm, s náplní μ-Bondapack C18, 10 μm, nebo s ekvivalentní náplní.
      4. účinné od 1. 1. 20065.4 Ultrazvuková lázeň
    1. účinné od 1. 1. 20066. Kvalitativní stanovení
      1. účinné od 1. 1. 20066.1 Příprava vzorku

        účinné od 1. 1. 2006Do odměrné baňky na 10 ml se naváží asi 0,5 g vzorku přesně a doplní se po rysku eluentem I (4.5.1). Baňka se na 10 minut vloží do ultrazvukové lázně (5.4). Roztok se zfiltruje nebo odstředí. Filtrát nebo supernatant se použije pro chromatografii.

      1. účinné od 1. 1. 20066.2 Chromatografie
        1. účinné od 1. 1. 20066.2.1 Gradient mobilní fáze
          účinné od 1. 1. 2006
          Čas (min)eluent I (% V/V) (4.5.1)eluent II (% V/V) (4.5.2)
          05050
          156535
          306535
          455050
        1. účinné od 1. 1. 20066.2.2 Průtok mobilní fáze (6.2.1) se nastaví na 1,5 ml/min a teplota kolony se nastaví na 35 °C.
        2. účinné od 1. 1. 20066.2.3 Vlnová délka detektoru se nastaví na 264 nm.
        3. účinné od 1. 1. 20066.2.4 Provede se nástřik 10 μl každého z referenčních roztoků (4.10) a zaznamenají se jejich chromatogramy.
        4. účinné od 1. 1. 20066.2.5 Provede se nástřik 10 μl roztoku vzorku (6.1) a zaznamená se jeho chromatogram.
      1. účinné od 1. 1. 20066.3 Důkaz přítomnosti hexamidinu, dibromhexamidinu, dibrompropamidinu nebo chlorhexidinu se provede porovnáním retenčních časů píků zaznamenaných v bodě 6.2.5 s píky získanými pro referenční roztoky v bodě 6.2.4.
    1. účinné od 1. 1. 20067. Kvantitativní stanovení
      1. účinné od 1. 1. 20067.1 Příprava standardních roztoků

        účinné od 1. 1. 2006Jako vnitřní standard se použije jeden z konzervantů (4.6 až 4.9), který není ve vzorku přítomen. Není-li to možné, může být použit Triclocarban (4.11) nebo Halocarban (4.12).

        1. účinné od 1. 1. 20067.1.1 Zásobní roztok konzervantu, jehož přítomnost je prokázána v bodě 6.3, 0,05% (m/V) v eluentu I (4.5.1).
        2. účinné od 1. 1. 20067.1.2 Zásobní roztok konzervantu zvoleného jako vnitřní standard, 0,05% (m/V) v eluentu I (4.5.1).
        3. účinné od 1. 1. 20067.1.3 Pro každý nalezený konzervant se připraví čtyři standardní roztoky tak, že se do odměrných baněk na 10 ml odměří podle níže uvedené tabulky množství zásobního roztoku prokázaného konzervantu (7.1.1) a množství zásobního roztoku vnitřního standardu (7.1.2).
          účinné od 1. 1. 2006
          Standardní roztokZásobní roztok vnitřního standarduZásobní roztok konzervantu, jehož přítomnost byla prokázána
          počet přidaných ml (7.1.2)počet přidaných ml (7.1.1)μg/ml (*)
          I1,00,525
          II1,01,050
          III1,01,575
          IV1,02,0100
          (*) Tyto hodnoty jsou uvedeny jako ukazatele a odpovídají koncentracím standardních roztoků prokázaných konzervantů, připravených ze zásobních roztoků obsahujících přesně 0,05 % prokázaného konzervantu.
      1. účinné od 1. 1. 20067.2 Příprava vzorku
        1. účinné od 1. 1. 20067.2.1 Do odměrné baňky na 10 ml se naváží asi 0,5 g (p gramů) vzorku přesně, přidá se 1,0 ml roztoku vnitřního standardu (7.1.2) a 6 ml eluentu I (4.5.1) a promíchá se.
        2. účinné od 1. 1. 20067.2.2 Baňka se umístí na 10 minut do ultrazvukové lázně (5.4). Ochladí se. Doplní se po rysku eluentem I a promíchá. Odstředí se nebo se zfiltruje přes skládaný filtrační papír. Supernatant nebo popřípadě filtrát se použije pro chromatografii.
      1. účinné od 1. 1. 20067.3 Chromatografie
        1. účinné od 1. 1. 20067.3.1 Gradient mobilní fáze, průtok, teplota kolony a vlnová délka detektoru zařízení pro HPLC (5.2) se nastaví podle podmínek požadovaných při kvalitativním stanovení (6.2.1 až 6.2.3).
        2. účinné od 1. 1. 20067.3.2 Nastříkne se 10 μl roztoku vzorku (7.2.2) a změří se plochy píků. Tento postup se opakuje s dalšími 10μl alikvotními podíly roztoku vzorku tak dlouho, dokud se nezískají shodné výsledky. Vypočítá se poměr plochy píku analyzované sloučeniny k ploše píku vnitřního standardu.
      1. účinné od 1. 1. 20067.4 Kalibrace
        1. účinné od 1. 1. 20067.4.1 Nastříkne se 10 μl každého standardního roztoku (7.1.3) a změří se plochy píků.
        2. účinné od 1. 1. 20067.4.2 Pro každý standardní roztok (7.1.3) se vypočítá poměr plochy píku hexamidinu, dibromhexamidinu, dibrompropamidinu nebo chlorhexidinu k ploše píku vnitřního standardu. Kalibrační křivka se sestrojí vynesením těchto poměrů na osu y a odpovídajících koncentrací standardních roztoků prokázaných konzervantů v μg/ml na osu x.
        3. účinné od 1. 1. 20067.4.3 Z kalibrační křivky (7.4.2) se odečte koncentrace prokázaného konzervantu odpovídající poměru ploch píků vypočítanému v bodě 7.3.2.
    1. účinné od 1. 1. 20068. Výpočet
      1. účinné od 1. 1. 20068.1 Obsah hexamidinu, dibromhexamidinu, dibrompropamidinu nebo chlorhexidinu ve vzorku v hmotnostních procentech se vypočítá podle vzorce:

        účinné od 1. 1. 2006

        1. účinné od 1. 1. 2006kde
          účinné od 1. 1. 2006
          p =hmotnost analyzovaného vzorku (7.2.1) v g,
          c = koncentrace konzervantu v roztoku vzorku, odečtená z kalibrační křivky, v μg/ml,
          MW1 = molekulová hmotnost základní formy přítomného konzervantu,
          MW2 = molekulová hmotnost odpovídající soli (viz bod 10).
    1. účinné od 1. 1. 20069. Opakovatelnost

      účinné od 1. 1. 2006Pro výrobky obsahující asi 0,1 % (m/m) hexamidinu, dibromhexamidinu, dibrompropamidinu nebo chlorhexidinu nesmí rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení na stejném vzorku překročit absolutní hodnotu 0,005 %.

    1. účinné od 1. 1. 200610. Tabulka molárních hmotností
      účinné od 1. 1. 2006
      HexamidinC20H26N4O2354,45
      Hexamidin-di(2-hydroxyethansulfonát)C20H26N4O2·2C2H6O4S606,72
      Hexamidin-di-p-hydroxybenzoátC20H26N4O2·2C7H6O3630,71
      DibromhexamidinC20H24Br2N4O2512,24
      Dibromhexamidin-di(2-hydroxyethansulfonát)C20H24Br2N4O2·2C2H6O4S764,51
      DibrompropamidinC17H18Br2N4O2470,18
      Dibrompropamidin-di(2-hydroxyethansulfonát)C17H18Br2N4O2·2C2H6O4S722,43
      ChlorhexidinC22H30Cl2N10505,45
      Chlorhexidin-diacetátC22H30Cl2N10·2C2H4O2625,56
      Chlorhexidin-diglukonátC22H30Cl2N10·2C6H12O7897,76
      Chlorhexidin-dihydrochloridC22H30Cl2N10·2HCl578,37
  1. účinné od 1. 1. 200636. KVALITATIVNÍ A KVANTITATIVNÍ STANOVENÍ KYSELINY BENZOOVÉ, KYSELINY 4-HYDROXYBENZOOVÉ, KYSELINY SORBOVÉ, KYSELINY SALICYLOVÉ A KYSELINY PROPIONOVÉ V KOSMETICKÝCH PROSTŘEDCÍCH
    1. účinné od 1. 1. 20061. Rozsah a oblast použití

      účinné od 1. 1. 2006Metoda je použitelná pro kvalitativní a kvantitativní stanovení kyseliny benzoové, kyseliny 4-hydroxybenzoové, kyseliny sorbové, kyseliny salicylové a kyseliny propionové v kosmetických prostředcích. Samostatně jsou popsány postupy kvalitativního stanovení těchto konzervantů, kvantitativního stanovení kyseliny propionové a kvantitativního stanovení kyseliny 4-hydroxybenzoové, kyseliny salicylové, kyseliny sorbové a kyseliny benzoové.

    1. účinné od 1. 1. 20062. Definice

      účinné od 1. 1. 2006Množství kyseliny benzoové, kyseliny 4-hydroxybenzoové, kyseliny salicylové, kyseliny sorbové a kyseliny propionové stanovená touto metodou se vyjádří v hmotnostních procentech volných kyselin.

    1. účinné od 1. 1. 2006A. KVALITATIVNÍ STANOVENÍ
      1. účinné od 1. 1. 20061. Princip

        účinné od 1. 1. 2006Po kyselé/zásadité extrakci konzervantů se extrakt analyzuje chromatografií na tenké vrstvě (TLC) a reakční chromatografií („derivatizace na desce“). V závislosti na výsledcích se kvalitativní stanovení potvrdí vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) nebo, v případě kyseliny propionové, plynovou chromatografií (GC).

      1. účinné od 1. 1. 20062. POUŽITÉ CHEMIKÁLIE
        1. účinné od 1. 1. 20062.1 Všeobecně

          účinné od 1. 1. 2006Všechny použité chemikálie musí být čistoty p.a. nebo vyšší. Musí být použita destilovaná voda nebo voda alespoň ekvivalentní čistoty.

        1. účinné od 1. 1. 20062.2 Aceton
        2. účinné od 1. 1. 20062.3 Diethylether
        3. účinné od 1. 1. 20062.4 Acetonitril
        4. účinné od 1. 1. 20062.5 Toluen
        5. účinné od 1. 1. 20062.6 n-Hexan
        6. účinné od 1. 1. 20062.7 Parafin, tekutý
        7. účinné od 1. 1. 20062.8 Kyselina chlorovodíková, 4 mol/l
        8. účinné od 1. 1. 20062.9 Hydroxid draselný,4 mol/l vodný roztok
        9. účinné od 1. 1. 20062.10 Chlorid vápenatý, CaCl2·2H2O
        10. účinné od 1. 1. 20062.11 Uhličitan lithný, Li2CO3
        11. účinné od 1. 1. 20062.12 2-Brom-2'-acetonafton
        12. účinné od 1. 1. 20062.13 Kyselina 4-hydroxybenzoová
        13. účinné od 1. 1. 20062.14 Kyselina salicylová
        14. účinné od 1. 1. 20062.15 Kyselina benzoová
        15. účinné od 1. 1. 20062.16 Kyselina sorbová
        16. účinné od 1. 1. 20062.17 Kyselina propionová
        17. účinné od 1. 1. 20062.18 Standardní roztoky

          účinné od 1. 1. 2006Připraví se 0,1% (m/V) roztoky (100 mg/100 ml) každého z pěti konzervantů (2.13 až 2.17) v diethyletheru.

        1. účinné od 1. 1. 20062.19 Derivatizační činidlo

          účinné od 1. 1. 20060,5% roztok 2-bromo-2'-acetonaftonu (2.12) v acetonitrilu (2.4) (50 mg/10 ml). Tento roztok by měl být připravován každý týden a uchováván v ledničce.

        1. účinné od 1. 1. 20062.20 Roztok katalyzátoru

          účinné od 1. 1. 20060,3% (m/V) roztok uhličitanu lithného (2.11) ve vodě (300 mg/100 ml). Tento roztok by měl být připravován vždy čerstvý.

        1. účinné od 1. 1. 20062.21 Mobilní fáze

          účinné od 1. 1. 2006Toluen (2.5)/aceton (2.2) (20:0,5, V/V)

        1. účinné od 1. 1. 20062.22 Tekutý parafin (2.7)/n-hexan (2.6) (1:2, V/V)
      1. účinné od 1. 1. 20063. Přístroje a pomůcky

        účinné od 1. 1. 2006Obvyklé laboratorní vybavení

        1. účinné od 1. 1. 20063.1 Vodní lázeň nastavitelná na teplotu 60 °C
        2. účinné od 1. 1. 20063.2 Vyvíjecí komora
        3. účinné od 1. 1. 20063.3 Zdroj ultrafialového světla, 254 a 366 nm
        4. účinné od 1. 1. 20063.4 Hotové desky pro chromatografii na tenké vrstvě, Silikagel 60, bez fluorescenčního indikátoru, 20 x 20 cm, tloušťka vrstvy 0,25 mm s koncentrační zónou 2,5 x 20 cm (Merck 11845 nebo ekvivalentní)
        5. účinné od 1. 1. 20063.5 Mikrostříkačka na 10 μl
        6. účinné od 1. 1. 20063.6 Mikrostříkačka na 25 μl
        7. účinné od 1. 1. 20063.7 Sušárna nastavitelná na teplotu až 105 °C
        8. účinné od 1. 1. 20063.8 Erlenmeyerovy baňky na 50 a 200 ml se zábrusovou zátkou
        9. účinné od 1. 1. 20063.9 Filtrační papír, průměr 90 mm, Schleicher & Schüll, Weissband No. 5892, nebo ekvivalentní
        10. účinné od 1. 1. 20063.10 Univerzální indikátorový papírek, pH 1 - 11
        11. účinné od 1. 1. 20063.11 Skleněné vzorkovací lahvičky na 5 ml
        12. účinné od 1. 1. 20063.12 Rotační vakuová odparka (Rotavapor nebo ekvivalentní)
        13. účinné od 1. 1. 20063.13 Topná deska
      1. účinné od 1. 1. 20064. Postup
        1. účinné od 1. 1. 20064.1 Příprava vzorků

          účinné od 1. 1. 2006Do Erlenmeyerovy baňky na 50 ml se zábrusovou zátkou (3.8) se odváží přibližně 1 g vzorku. Přidají se čtyři kapky 4 mol/l kyseliny chlorovodíkové (2.8) a 40 ml acetonu (2.2). U silně zásaditých prostředků, jako je toaletní mýdlo, by mělo být přidáno 20 kapek 4 mol/l kyseliny chlorovodíkové (2.8). Pomocí indikátorového papírku (3.10) se zkontroluje, zda je pH přibližně 2. Baňka se uzavře a po dobu 1 minuty se silně protřepává.

          účinné od 1. 1. 2006Je-li nezbytné usnadnit extrakci konzervantů do acetonové fáze, směs se opatrně zahřeje na asi 60 °C, aby se tekutá fáze rozpustila.

          účinné od 1. 1. 2006Roztok se zchladí na laboratorní teplotu a přefiltruje přes filtrační papír (3.9) do Erlenmeyerovy baňky.

          účinné od 1. 1. 200620 ml filtrátu se převede do Erlenmeyerovy baňky na 200 ml, přidá se 20 ml vody a promíchá se. pH směsi se upraví přibližně na 10 pomocí 4 mol/l hydroxidu draselného (2.9) za použití indikátorového papírku (3.10).

          účinné od 1. 1. 2006Přidá se 1 g chloridu vápenatého (2.10) a silně se protřepe. Zfiltruje se přes filtrační papír (3.9) do dělicí nálevky na 250 ml obsahující 75 ml diethyletheru (2.3) a silně se třepe 1 minutu. Vrstvy se nechají oddělit a vodná vrstva se převede do Erlenmeyerovy baňky na 250 ml. Etherová vrstva se zlikviduje. Za použití indikátorového papírku (3.10) se pH vodného roztoku upraví na přibližně 2 okyselením 4 mol/l kyselinou chlorovodíkovou (2.8). Přidá se 10 ml diethyletheru (2.3), baňka se zazátkuje a silně protřepává 1 minutu; vrstvy se nechají oddělit a etherová vrstva se převede do rotační odparky (3.12). Vodná vrstva se zlikviduje.

          účinné od 1. 1. 2006Etherová vrstva se odpaří téměř do sucha a zbytek se znovu rozpustí v 1 ml diethyletheru (2.3). Roztok se převede do vzorkovací lahvičky (3.11).

        1. účinné od 1. 1. 20064.2 Chromatografie na tenké vrstvě

          účinné od 1. 1. 2006Na startovní linii koncentrační zóny TLC desky (3.4) se do bodů, jejichž počet odpovídá počtu referenčních roztoků a roztoků vzorků, které mají být analyzovány, nanese stříkačkou (3.5) ve stejných odstupech vždy po 3 μl uhličitanu lithného (2.20) a vysuší se v proudu studeného vzduchu.

          účinné od 1. 1. 2006Chromatografická deska se přenese na topnou desku (3.13) zahřátou na 40 °C, aby se skvrny udržely co nejmenší. Mikrostříkačkou (3.5) se na startovní linii desky nanese vždy 10 μl každého standardního roztoku (2.18) a roztoku vzorku (4.1) přesně do bodů, kam byl nanesen uhličitan lithný.

          účinné od 1. 1. 2006Nakonec se opět přesně do bodů, kam byly naneseny referenční roztoky/roztoky vzorku a roztok uhličitanu lithného, nanese přibližně 15 μl derivatizačního činidla (2.19) (roztok 2-bromo-2'-acetonaftonu).

          účinné od 1. 1. 2006Chromatografická deska se zahřívá v sušárně (3.7) 45 minut při 80 °C. Po vychladnutí se deska vyvíjí v komoře (3.2), která byla 15 minut (bez vyložení filtračním papírem) sycena mobilní fází 2.21 (toluen/aceton), dokud čelo rozpouštědla nedosáhne vzdálenosti 15 cm (doba vyvíjení je přibližně 80 minut).

          účinné od 1. 1. 2006Deska se vysuší v proudu studeného vzduchu a získané skvrny se vyhodnotí pod UV světlem (3.3). Pro zesílení fluorescence slabých skvrn může být chromatografická deska ponořena do tekutého parafinu/n-hexanu (2.22).

      1. účinné od 1. 1. 20065. Kvalitativní stanovení

        účinné od 1. 1. 2006Pro každou skvrnu se vypočte hodnota Rf.

        účinné od 1. 1. 2006Hodnoty Rf a chování vzorku pod UV světlem se porovnají s hodnotami a chováním referenčních vzorků.

        účinné od 1. 1. 2006Učiní se předběžné závěry o přítomnosti a kvalitativním stanovení konzervantů. Provede se vysokoúčinná kapalinová chromatografie popsaná v oddílu B, nebo ukazuje-li se, že je přítomna kyselina propionová, provede se plynová chromatografie popsaná v oddílu C. Získané retenční časy se porovnají s retenčními časy referenčních vzorků.

        účinné od 1. 1. 2006Výsledky TLC a HPLC nebo GC se zkombinují a konečný důkaz konzervantů vychází z kombinace výsledků.

    1. účinné od 1. 1. 2006B. KVANTITATIVNÍ STANOVENÍ KYSELINY BENZOOVÉ, KYSELINY 4-HYDROXYBENZOOVÉ, KYSELINY SORBOVÉ A KYSELINY SALICYLOVÉ
      1. účinné od 1. 1. 20061. Princip

        účinné od 1. 1. 2006Vzorek se po okyselení extrahuje směsí ethanolu a vody. Po filtraci se konzervanty stanoví vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC).

      1. účinné od 1. 1. 20062. POUŽITÉ CHEMIKÁLIE
        1. účinné od 1. 1. 20062.1 Všechny použité chemikálie musí být čistoty p.a. nebo vyšší a musí být vhodná pro HPLC. Musí být použita destilovaná voda nebo voda alespoň ekvivalentní čistoty.
        2. účinné od 1. 1. 20062.2 Ethanol, absolutní
        3. účinné od 1. 1. 20062.3 Kyselina 4-hydroxybenzoová
        4. účinné od 1. 1. 20062.4 Kyselina salicylová
        5. účinné od 1. 1. 20062.5 Kyselina benzoová
        6. účinné od 1. 1. 20062.6 Kyselina sorbová
        7. účinné od 1. 1. 20062.7 Octan sodný, (CH3COONa·3H2O)
        8. účinné od 1. 1. 20062.8 Kyselina octová,
        9. účinné od 1. 1. 20062.9 Acetonitril
        10. účinné od 1. 1. 20062.10 Kyselina sírová, 2 mol/l
        11. účinné od 1. 1. 20062.11 Hydroxid draselný, 0,2 mol/l vodný roztok
        12. účinné od 1. 1. 20062.12 Kyselina 2-methoxybenzoová
        13. účinné od 1. 1. 20062.13 Směs ethanol/voda

          účinné od 1. 1. 2006Devět dílů ethanolu (2.2) se smíchá s jedním dílem vody (2:1)

        1. účinné od 1. 1. 20062.14 Roztok vnitřního standardu

          účinné od 1. 1. 2006Připraví se roztok obsahující 1 g kyseliny 2-methoxybenzoové (2.12) v 500 ml směsi ethanol/voda (2.13).

        1. účinné od 1. 1. 20062.15 Mobilní fáze pro HPLC
          1. účinné od 1. 1. 20062.15.1 Acetátový tlumivý roztok: do 1 litru vody se přidá 6,35 g octanu sodného (2.7) a 20,0 ml kyseliny octové (2.8) a smíchá se.
          2. účinné od 1. 1. 20062.15.2 Mobilní fáze se připraví smícháním devíti dílů acetátového tlumivýho roztoku (2.15.1) a jednoho dílu acetonitrilu (2.9).
        1. účinné od 1. 1. 20062.16 Zásobní roztok konzervantů

          účinné od 1. 1. 2006Do odměrné baňky na 50 ml se naváží asi 0,05 g kyseliny 4-hydroxybenzoové (2.3), 0,2 g kyseliny salicylové (2.4), 0,2 g kyseliny benzoové (2.5) a 0,05 g kyseliny sorbové (2,6) přesně a objem se doplní směsí ethanol/voda (2.13). Roztok se uchovává v ledničce. Roztok je stabilní jeden týden.

        1. účinné od 1. 1. 20062.17 Standardní roztoky konzervantů

          účinné od 1. 1. 2006Do odměrných baněk na 20 ml se odměří 8,00; 4,00; 2,00; 1,00 a 0,50 ml zásobního roztoku (2.16). Do každé baňky se přidá 10,00 ml roztoku vnitřního standardu (2.14) a 0,5 ml 2 mol/l kyseliny sírové (2.10). Objem se doplní směsí ethanol/voda (2.13). Tyto roztoky musí být připravovány čerstvé.

      1. účinné od 1. 1. 20063. Přístroje a pomůcky

        účinné od 1. 1. 2006Obvyklé laboratorní vybavení, které není nijak specifikováno a

        1. účinné od 1. 1. 20063.1 Vodní lázeň, nastavená na 60 °C
        2. účinné od 1. 1. 20063.2 Chromatograf pro vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii s UV detektorem s nastavitelnou vlnovou délkou a 10μl nastřikovací smyčkou
        3. účinné od 1. 1. 20063.3 Analytická kolona

          účinné od 1. 1. 2006Nerezová ocel, délka 12,5 až 25 cm, vnitřní průměr 4,6 mm, plněná Nucleosilem 5C18 nebo ekvivalentní náplní

        1. účinné od 1. 1. 20063.4 Filtrační papír, průměr: 90 mm, Schleicher and Schüll, Weissband No 5892 nebo ekvivalentní
        2. účinné od 1. 1. 20063.5 Erlenmeyerovy baňky na 50 ml
        3. účinné od 1. 1. 20063.6 Skleněné vzorkovací lahvičky na 5 ml
        4. účinné od 1. 1. 20063.7 Varné kamínky, karborundum, velikost 2 – 4 mm, nebo ekvivalentní
      1. účinné od 1. 1. 20064. Postup
        1. účinné od 1. 1. 20064.1 Příprava vzorku
          1. účinné od 1. 1. 20064.1.1 Příprava vzorku bez přidání vnitřního standardu

            účinné od 1. 1. 2006Do Erlenmeyerovy baňky na 50 ml (3.5) se naváží 1 g vzorku. Do baňky se odpipetuje 1,00 ml 2 mol/l kyseliny sírové (2.10) a 40,0 ml směsi ethanol/voda (2.13). Přidá se přibližně 1 g varných kamínků (3.7), zkumavka se uzavře a silně se alespoň 1 minutu protřepává, dokud nevznikne homogenní suspenze. Pro usnadnění extrakce konzervantů do ethanolové fáze se baňka zahřívá přesně 5 minut na vodní lázni (3.1) při 60 °C.

            účinné od 1. 1. 2006Baňka se ihned ochladí v proudu studené vody a extrakt se na hodinu uloží při 5 °C.

            účinné od 1. 1. 2006Extrakt se zfiltruje přes filtrační papír (3.4). Asi 2 ml extraktu se převedou do vzorkovací lahvičky (3.6). Extrakt se uchovává při 5 °C a stanovení pomocí HPLC se provede do 24 hodin.

          1. účinné od 1. 1. 20064.1.2 Příprava vzorku s přidáním vnitřního standardu

            účinné od 1. 1. 2006Do Erlenmeyerovy baňky na 50 ml (3.5) se s přesností na tři desetinná místa naváží 1 ± 0,1 g vzorku (a gramů). Pipetou se přidá 1,00 ml 2 mol/l kyseliny sírové (2.10) a 30,0 ml směsi ethanol/voda (2.13). Přidá se přibližně 1 g varných kamínků (3.7) a 10,00 ml roztoku vnitřního standardu. Baňka se uzavře a silně se alespoň 1 minutu protřepává, dokud nevznikne homogenní suspenze. Pro usnadnění extrakce konzervantů do ethanolové fáze se baňka zahřívá přesně 5 minut na vodní lázni (3.1) při 60 °C.

            účinné od 1. 1. 2006Zkumavka se ihned ochladí v proudu studené vody a extrakt se uloží na hodinu při 5 °C.

            účinné od 1. 1. 2006Extrakt se zfiltruje přes filtrační papír (3.4). Asi 2 ml extraktu se převedou do vzorkovací lahvičky (3.6). Extrakt se uchovává při 5 °C a stanovení pomocí HPLC se provede do 24 hodin.

        1. účinné od 1. 1. 20064.2 Vysokoúčinná kapalinová chromatografie

          účinné od 1. 1. 2006Mobilní fáze: acetonitril/acetátový tlumivý roztok (2.15).

          účinné od 1. 1. 2006Průtok mobilní fáze kolonou se nastaví na 2,0 ± 0,5 ml/min. Vlnová délka detektoru se nastaví na 240 nm.

          1. účinné od 1. 1. 20064.2.1 Kalibrace

            účinné od 1. 1. 2006Do kapalinového chromatografu (3.2) se nastříkne po 10 μl standardních roztoků konzervantů (2.17). Pro každý roztok se ze získaných chromatogramů stanoví poměr výšky píku vyšetřovaného konzervantu k výšce píku vnitřního standardu získaného z chromatogramů. Sestrojí se graf závislosti poměru výšek píků na koncentraci každého standardního roztoku.

            účinné od 1. 1. 2006Přesvědčte se, že při kalibraci byla pro standardní roztoky získána lineární odezva.

          1. účinné od 1. 1. 20064.2.2 Stanovení

            účinné od 1. 1. 2006Do kapalinového chromatografu (3.2) se nastříkne 10 μl extraktu vzorku (4.1.1) a zaznamená se chromatogram. Nastříkne se 10 μl standardního roztoku konzervantu (2.17) a zaznamená se chromatogram. Obdržené chromatogramy se porovnají. Není-li v chromatogramu extraktu vzorku (4.1.1) žádný pík s přibližně stejným retenčním časem jako pík kyseliny 2-methoxybenzoové (doporučený vnitřní standard), nastříkne se do kapalinového chromatografu 10 μl extraktu vzorku s přidaným vnitřním standardem (4.1.2) a zaznamená se chromatogram.

            účinné od 1. 1. 2006Je-li v chromatogramu extraktu vzorku (4.1.1) rušivý pík se stejným retenčním časem jako kyselina 2-methoxybenzoová, měl by být vybrán jiný vnitřní standard. (Není-li jeden z vyšetřovaných konzervantů v chromatogramu přítomen, lze tento konzervant použít jako vnitřní standard.)

            účinné od 1. 1. 2006Je třeba se ujistit, že při kalibraci byla pro standardní roztoky získána lineární odezva.

            účinné od 1. 1. 2006Je třeba ověřit, zda chromatogramy získané pro standardní roztok a roztok vzorku splňují následující požadavky:

            1. účinné od 1. 1. 2006— rozlišení píků nejhůře odděleného páru je alespoň 0,90. (Definice rozlišení píků je uvedena na obrázku 12);

              účinné od 1. 1. 2006Obrázek

              účinné od 1. 1. 2006Obrázek 12: Rozlišení píků

              účinné od 1. 1. 2006Není-li požadovaného rozlišení dosaženo, měla by být buď použita účinnější kolona nebo by mělo být složení mobilní fáze upraveno tak, aby byl požadavek splněn;

            1. účinné od 1. 1. 2006— faktor asymetrie As všech získaných píků by se měl pohybovat od 0,9 do 1,5. (Definice faktoru asymetrie je uvedena na obrázku 13) Při zaznamenání chromatogramu za účelem stanovení faktoru asymetrie je doporučená rychlost papíru 2 cm/min.

              účinné od 1. 1. 2006Obrázek

              účinné od 1. 1. 2006Obrázek 13: Faktor asymetrie píku

            1. účinné od 1. 1. 2006— Základna musí být stabilní.
      1. účinné od 1. 1. 20065. Výpočet

        účinné od 1. 1. 2006Pro výpočet koncentrace konzervantů v roztoku vzorku se použijí poměry výšek píků vyšetřovaných konzervantů a výšky píku kyseliny 2-methoxybenzoové (vnitřní standard) a dále kalibrační graf. Obsah kyseliny benzoové, kyseliny 4-hydroxybenzoové, kyseliny sorbové nebo kyseliny salicylové ve vzorku v hmotnostních procentech (xi) se vypočte pomocí vzorce

        účinné od 1. 1. 2006

        1. účinné od 1. 1. 2006kde
          účinné od 1. 1. 2006
          Obrázek 12: Rozlišení píků Obrázek 13: Faktor asymetrie píku
          a =hmotnost zkušebního vzorku (4.1.2) (g),
          b = koncentrace konzervantu v extraktu vzorku (4.1.2) (μl/ml) odečtená z kalibračního grafu.
      1. účinné od 1. 1. 20066. Opakovatelnost

        účinné od 1. 1. 2006Pro výrobky obsahující asi 0,4 % (m/m) kyseliny 4-hydroxybenzoové nesmí rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení na stejném vzorku překročit absolutní hodnotu 0,035 %.

        účinné od 1. 1. 2006Pro výrobky obsahující asi 0,5 % (m/m) kyseliny benzoové nesmí rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení na stejném vzorku překročit absolutní hodnotu 0,050 %.

        účinné od 1. 1. 2006Pro výrobky obsahující asi 0,5 % (m/m) kyseliny salicylové nesmí rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení na stejném vzorku překročit absolutní hodnotu 0,045 %.

        účinné od 1. 1. 2006Pro výrobky obsahující asi 0,6 % (m/m) kyseliny sorbové nesmí rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení na stejném vzorku překročit absolutní hodnotu 0,035 %.

      1. účinné od 1. 1. 20067. Poznámky
        1. účinné od 1. 1. 20067.1 Výsledky testování robustnosti metody ukazují, že množství kyseliny sírové přidané do extraktu kyselin ze vzorku je rozhodující a množství zpracovávaného vzorku by tedy mělo být v předepsaném rozmezí.
        2. účinné od 1. 1. 20067.2 Je-li to žádoucí, lze použít vhodnou ochrannou kolonu.
    1. účinné od 1. 1. 2006C. KVANTITATIVNÍ STANOVENÍ KYSELINY PROPIONOVÉ
      1. účinné od 1. 1. 20061. Rozsah a oblast použití

        účinné od 1. 1. 2006Tato metoda je vhodná pro stanovení kyseliny propionové v kosmetických prostředcích až do maximální koncentrace 2 % (m/m).

      1. účinné od 1. 1. 20062. Definice

        účinné od 1. 1. 2006Koncentrace kyseliny propionové stanovená touto metodou se vyjádří v procentech hmotnosti (% m/m) prostředku.

      1. účinné od 1. 1. 20063. Princip

        účinné od 1. 1. 2006Po extrakci kyseliny propionové z prostředku se kvantitativní stanovení provede plynovou chromatografií za použití kyseliny 2-methylpropionové jako vnitřního standardu.

      1. účinné od 1. 1. 20064. POUŽITÉ CHEMIKÁLIE

        účinné od 1. 1. 2006Všechny použité chemikálie musí být čistoty p.a. nebo vyšší a musí být použita destilovaná voda nebo voda alespoň ekvivalentní čistoty.

        1. účinné od 1. 1. 20064.1 Ethanol, 96% (V/V)
        2. účinné od 1. 1. 20064.2 Kyselina propionová
        3. účinné od 1. 1. 20064.3 Kyselina 2-methylpropionová
        4. účinné od 1. 1. 20064.4 Kyselina trihydrogenfosforečná, 10% (m/V)
        5. účinné od 1. 1. 20064.5 Roztok kyseliny propionové

          účinné od 1. 1. 2006Do odměrné baňky na 50 ml se naváží 1,00 g (p gramů) kyseliny propionové přesně a doplní se na objem ethanolem (4.1).

        1. účinné od 1. 1. 20064.6 Roztok vnitřního standardu

          účinné od 1. 1. 2006Do odměrné baňky na 50 ml se přesně naváží 1,00 g (e gramů) kyseliny 2-methylpropionové a doplní se na objem ethanolem (4.1).

      1. účinné od 1. 1. 20065. Přístroje a pomůcky
        1. účinné od 1. 1. 20065.1 Obvyklé laboratorní vybavení
        2. účinné od 1. 1. 20065.2 Plynový chromatograf s plamenovým ionizačním detektorem
        3. účinné od 1. 1. 20065.3 Skleněná zkumavka (20 x 150 mm) se šroubovacím uzávěrem
        4. účinné od 1. 1. 20065.4 Vodní lázeň nastavená na 60 °C
        5. účinné od 1. 1. 20065.5 Skleněná injekční stříkačka na 10 ml s filtrační membránou (průměr pórů 0,45 μm)
      1. účinné od 1. 1. 20066. Postup
        1. účinné od 1. 1. 20066.1 Příprava vzorku
          1. účinné od 1. 1. 20066.1.1 Příprava vzorku bez vnitřního standardu

            účinné od 1. 1. 2006Do skleněné zkumavky (5.3) se naváží asi 1 g vzorku přesně. Přidá se 0,5 ml kyseliny trihydrogenfosforečné(4.4) a 9,5 ml ethanolu (4.1).

            účinné od 1. 1. 2006Zkumavka se uzavře a silně protřepe. Je-li to nezbytné, umístí se zkumavka na 5 minut na vodní lázeň zahřátou na 60 °C (5.4), aby se zcela rozpustila tuková fáze. Zkumavka se rychle zchladí pod tekoucí vodou. Část roztoku se zfiltruje přes membránový filtr (5.5). Chromatografie filtrátu se provede tentýž den.

          1. účinné od 1. 1. 20066.1.2 Příprava vzorku s vnitřním standardem

            účinné od 1. 1. 2006Do skleněné zkumavky (5.3) se s přesností na 3 desetinná místa naváží 1 ±0,1 g vzorku. Přidá se 0,5 ml kyseliny trihydrogenfosforečné (4.4), 0,50 ml roztoku vnitřního standardu a 9 ml ethanolu (4.1).

            účinné od 1. 1. 2006Zkumavka se uzavře a silně protřepe. Je-li to nezbytné, umístí se zkumavka na 5 minut na vodní lázeň zahřátou na 60 °C (5.4), aby se zcela rozpustila tuková fáze. Zkumavka se rychle zchladí pod tekoucí vodou. Část roztoku se zfiltruje přes membránový filtr (5.5). Chromatografie filtrátu se provede tentýž den.

        1. účinné od 1. 1. 20066.2 Podmínky pro plynovou chromatografii

          účinné od 1. 1. 2006Doporučují se následující provozní podmínky

          účinné od 1. 1. 2006
          Obrázek 12: Rozlišení píků Obrázek 13: Faktor asymetrie píku
          Kolona
          Typnerezová ocel
          Délka2 m
          Průměr3 mm
          Náplň10% SP™ 1000 (nebo ekvivalentní) + 1% H3PO4 na Chromosorbu WAW 100 - 120 mesh
          účinné od 1. 1. 2006
          Obrázek 12: Rozlišení píků Obrázek 13: Faktor asymetrie píku
          Teplota
          Nástřik200 °C
          Kolona120 °C
          Detektor200 °C
          Nosný plyndusík
          Průtoková rychlost25 ml/min
        1. účinné od 1. 1. 20066.3 Chromatografie
          1. účinné od 1. 1. 20066.3.1 Kalibrace

            účinné od 1. 1. 2006Do řady odměrných baněk na 20 ml se odpipetuje 0,25; 0,50; 1,00; 2,00 a 4,00 ml roztoku kyseliny propionové (4.5). Do každé odměrné baňky se odpipetuje 1,00 ml roztoku vnitřního standardu (4.6); doplní se na objem ethanolem a zamíchá. Takto připravené roztoky obsahují kyselinu 2-methylpropionovou jako vnitřní standard v koncentraci e mg/ml (to znamená 1 mg/ml, je-li e= 1,000) a kyselinu propionovou v koncentraci p/4, p/2, p, 2p, 4p mg/ml (to znamená 0,25; 0,50; 1,00; 2,00; 4,00 mg/ml, je-li p = 1,000).

            účinné od 1. 1. 2006Nastříkne se 1 μl těchto roztoků a kalibrační křivka se sestrojí vynesením poměru hmotností kyseliny propionové a kyseliny 2-methylpropionové na osu x a poměru odpovídajících ploch píků na osu y.

            účinné od 1. 1. 2006Nastříknou se 3 dávky z každého roztoku a vypočte se průměr poměrů ploch píku.

          1. účinné od 1. 1. 20066.3.2 Kvantitativní stanovení

            účinné od 1. 1. 2006Nastříkne se 1 μl filtrátu vzorku 6.1.1. Chromatogram se porovná s chromatogramem jednoho ze standardních roztoků (6.3.1). Má-li pík přibližně stejný retenční čas jako pík kyseliny 2-methylpropionové, změní se vnitřní standard. Není-li pozorován žádný rušivý vliv, nastříkne se 1 μl filtrátu vzorku 6.1.2 a změří se plochy píku kyseliny propionové a píku vnitřního standardu.

            účinné od 1. 1. 2006Nastříknou se 3 dávky z každého roztoku a vypočte se průměr poměrů ploch píku.

      1. účinné od 1. 1. 20067. Výpočty
        1. účinné od 1. 1. 20067.1 Z kalibrační křivky sestrojené podle bodu 6.3.1 se odečte poměr hmotností (K), který odpovídá poměru ploch píků vypočtenému v bodě 6.3.2.
        2. účinné od 1. 1. 20067.2 Z takto získaného poměru hmotností se vypočte obsah kyseliny propionové ve vzorku (x) v hmotnostních procentech pomocí vzorce

          účinné od 1. 1. 2006

          1. účinné od 1. 1. 2006kde
            účinné od 1. 1. 2006
            Obrázek 12: Rozlišení píků Obrázek 13: Faktor asymetrie píku
            K = poměr vypočtený v bodě 7.1,
            e = hmotnost vnitřního standardu v g podle bodu 4.6,
            a = hmotnost vzorku v g podle bodu 6.1.2.

          účinné od 1. 1. 2006Výsledky se zaokrouhlí na jedno desetinné místo.

      1. účinné od 1. 1. 20068. Opakovatelnost

        účinné od 1. 1. 2006Pro výrobky obsahující asi 2 % (m/m) kyseliny propionové nesmí rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení na stejném vzorku překročit absolutní hodnotu 0,12 %.

  1. účinné od 1. 1. 200637. KVALITATIVNÍ A KVANTITATIVNÍ STANOVENÍ HYDROCHINONU, HYDROCHINON-MONOMETHYLETHERU, HYDROCHINON-MONOETHYLETHERU A HYDROCHINON- MONOBENZYLETHERU V KOSMETICKÝCH PROSTŘEDCÍCH
    1. účinné od 1. 1. 2006A. KVALITATIVNÍ STANOVENÍ
      1. účinné od 1. 1. 20061. Rozsah a oblast použití

        účinné od 1. 1. 2006V metodě je popsána detekce a kvalitativní stanovení hydrochinonu, hydrochinon-monomethyletheru, hydrochinon-monoethyletheru a hydrochinon-monobenzyletheru (monobenzonu) v kosmetických prostředcích pro zesvětlení kůže.

      1. účinné od 1. 1. 20062. Podstata metody

        účinné od 1. 1. 2006Kvalitativní stanovení hydrochinonu a jeho etherů se provede chromatografií na tenké vrstvě (TLC).

      1. účinné od 1. 1. 20063. POUŽITÉ CHEMIKÁLIE

        účinné od 1. 1. 2006Všechny použité chemikálie musí být čistoty p.a. nebo vyšší

        1. účinné od 1. 1. 20063.1 Ethanol, 96% (V/V)
        2. účinné od 1. 1. 20063.2 Chloroform
        3. účinné od 1. 1. 20063.3 Diethylether
        4. účinné od 1. 1. 20063.4 Mobilní fáze:

          účinné od 1. 1. 2006Chloroform/diethylether, 66:33 (V/V)

        1. účinné od 1. 1. 20063.5 Amoniak, 25% (m/m)
        2. účinné od 1. 1. 20063.6 Kyselina askorbová
        3. účinné od 1. 1. 20063.7 Hydrochinon
        4. účinné od 1. 1. 20063.8 Hydrochinon-monomethylether
        5. účinné od 1. 1. 20063.9 Hydrochinon-monoethylether
        6. účinné od 1. 1. 20063.10 Hydrochinon-monobenzylether (monobenzon)
        7. účinné od 1. 1. 20063.11 Standardní roztoky

          účinné od 1. 1. 2006Následující standardní roztoky se připravují čerstvé a jsou stabilní jeden den.

          1. účinné od 1. 1. 20063.11.1 Do dělené zkumavky na 10 ml se naváží 0,05 g hydrochinonu (3.7). Přidá se 0,250 g kyseliny askorbové (3.6) a 5 ml ethanolu (3.1). Přidává se amoniak (3.5), dokud není dosaženo pH 10, a doplní se ethanolem na objem 10 ml (3.1).
          2. účinné od 1. 1. 20063.11.2 Do dělené zkumavky na 10 ml se naváží 0,05 g hydrochinon-monomethyletheru (3.8). Přidá se 0,250 g kyseliny askorbové (3.6) a 5 ml ethanolu (3.1). Přidává se amoniak (3.5), dokud není dosaženo pH 10, a doplní se ethanolem na objem 10 ml (3.1).
          3. účinné od 1. 1. 20063.11.3 Do dělené zkumavky na 10 ml se naváží 0,05 g hydrochinon-monoethyletheru (3.9). Přidá se 0,250 g kyseliny askorbové (3.6) a 5 ml ethanolu (3.1). Přidává se amoniak (3.5), dokud není dosaženo pH 10, a doplní se ethanolem na objem 10 ml (3.1).
          4. účinné od 1. 1. 20063.11.4 Do dělené zkumavky na 10 ml se naváží 0,05 g hydrochinon-monobenzyletheru (3.10). Přidá se 0,250 g kyseliny askorbové (3.6) a 5 ml ethanolu (3.1). Přidává se amoniak (3.5), dokud není dosaženo pH 10, a doplní se ethanolem na objem 10 ml (3.1).
        1. účinné od 1. 1. 20063.12 Dusičnan stříbrný
        2. účinné od 1. 1. 20063.13 Kyselina 12-molybdofosforečná
        3. účinné od 1. 1. 20063.14 Kyanoželezitan draselný hexahydrát
        4. účinné od 1. 1. 20063.15 Chlorid železitý hexahydrát
        5. účinné od 1. 1. 20063.16 Detekční činidla
          1. účinné od 1. 1. 20063.16.1 Do 5% vodného roztoku (m/V) dusičnanu stříbrného (3.12) se přidává amoniak (3.5), dokud se tvořící se sraženina opět nerozpustí.

            účinné od 1. 1. 2006Upozornění:

            účinné od 1. 1. 2006Při delším stání se v roztoku tvoří výbušné sloučeniny a měl by být po použití zlikvidován.

          1. účinné od 1. 1. 20063.16.2 10% (m/V) roztok kyseliny 12-molybdofosforečné (3.13) v ethanolu (3.1).
          2. účinné od 1. 1. 20063.16.3 Připraví se 1 % (m/V) vodný roztok kyanoželezitanu draselného (3.14) a 2% (m/V) vodný roztoku chloridu železitého (3.15). Těsně před použitím se smíchají stejné díly obou roztoků.
      1. účinné od 1. 1. 20064. Přístroje a pomůcky

        účinné od 1. 1. 2006Obvyklé laboratorní vybavení, a

        1. účinné od 1. 1. 20064.1 Obvyklé vybavení pro chromatografii na tenké vrstvě
        2. účinné od 1. 1. 20064.2 Hotové TLC desky: silikagel GHR/UV254; 20 x 20 cm (Machery, Nagel nebo ekvivalentní). Tloušťka vrstvy 0,25 mm.
        3. účinné od 1. 1. 20064.3 Ultrazvuková lázeň
        4. účinné od 1. 1. 20064.4 Odstředivka
        5. účinné od 1. 1. 20064.5 UV lampa, 254 nm
      1. účinné od 1. 1. 20065. Postup
        1. účinné od 1. 1. 20065.1 Příprava vzorku

          účinné od 1. 1. 2006Do dělené zkumavky na 10 ml se naváží 3,0 g vzorku. Přidá se 0,250 g kyseliny askorbové (3.6) a 5 ml ethanolu (3.1). pH roztoku se upraví amoniakem (3.5) na 10. Objem se doplní ethanolem (3.1) na 10 ml. Zkumavka se uzavře zátkou a homogenizuje se 10 minut v ultrazvukové lázni. Zfiltruje se přes filtrační papír nebo se odstředí při 3 000 ot./min.

        1. účinné od 1. 1. 20065.2 Chromatografie na tenké vrstvě (TLC)
          1. účinné od 1. 1. 20065.2.1 Chromatografická komora se nasytí mobilní fází (3.4).
          2. účinné od 1. 1. 20065.2.2 Na desku se nanese po 2 μl standardních roztoků (3.11) a 2 μl roztoku vzorku (5.1). Vyvíjí se ve tmě při teplotě okolí, dokud čelo rozpouštědla nedosáhne vzdálenosti 15 cm od startu.
          3. účinné od 1. 1. 20065.2.3 Deska se vyjme, nechá se vyschnout při laboratorní teplotě.
        1. účinné od 1. 1. 20065.3 Detekce
          1. účinné od 1. 1. 20065.3.1 Deska se pozoruje pod UV světem při 254 nm a poloha skvrn se označí.
          2. účinné od 1. 1. 20065.3.2 Deska se postříká
            1. účinné od 1. 1. 2006— dusičnanem stříbrným (3.16.1), nebo
            2. účinné od 1. 1. 2006— kyselinou 12-molybdofosforečnou (3.16.2); zahřeje se na asi 120 °C; nebo
            3. účinné od 1. 1. 2006— roztokem kyanoželezitanu draselného a roztokem chloridu železitého (3.16.3).
      1. účinné od 1. 1. 20066. Kvalitativní stanovení

        účinné od 1. 1. 2006Spočítá se hodnota Rf každé skvrny.

        účinné od 1. 1. 2006Skvrny získané pro roztok vzorku se porovnají se skvrnami získanými pro standardní roztoky, pokud jde o jejich hodnoty Rf, barvu skvrn v UV světle a barvu skvrn po zviditelnění detekčním činidlem.

        účinné od 1. 1. 2006Provede se vysokoúčinná kapalinová chromatografie popsaná v následujícím oddílu (B) a porovnají se retenční časy získané pro pík (píky) vzorku s retenčními časy píků referenčních roztoků.

        účinné od 1. 1. 2006Výsledky z TLC a HPLC se zkombinují s cílem dokázat přítomnost hydrochinonu a/nebo jeho etherů.

      1. účinné od 1. 1. 20067. Poznámky

        účinné od 1. 1. 2006Za uvedených podmínek byly pozorovány následující hodnoty Rf:

        účinné od 1. 1. 2006
        Obrázek 12: Rozlišení píků Obrázek 13: Faktor asymetrie píku
        hydrochinon: 0,32
        hydrochinon-monomethylether: 0,53
        hydrochinon-monoethylether: 0,55
        hydrochinon-monobenzylether: 0,58
    1. účinné od 1. 1. 2006B. KVANTITATIVNÍ STANOVENÍ
      1. účinné od 1. 1. 20061. Rozsah a oblast použití

        účinné od 1. 1. 2006V metodě je specifikován postup pro stanovení hydrochinonu, hydrochinon-monomethyletheru, hydrochinon-monoethyletheru a hydrochinon-monobenzyletheru v kosmetických prostředcích pro zesvětlení pleti.

      1. účinné od 1. 1. 20062. Princip

        účinné od 1. 1. 2006Vzorek je extrahován směsí voda/methanol za mírného zahřátí, kterým se rozpustí tukový materiál. Kvantitativní stanovení analytů ve výsledném roztoku se provede kapalinovou chromatografií s obrácenou fází s UV detekcí.

      1. účinné od 1. 1. 20063. POUŽITÉ CHEMIKÁLIE
        1. účinné od 1. 1. 20063.1 Všechny použité chemikálie musí být čistoty p.a. nebo vyšší. Musí být použita destilovaná voda nebo voda alespoň ekvivalentní čistoty.
        2. účinné od 1. 1. 20063.2 Methanol
        3. účinné od 1. 1. 20063.3 Hydrochinon
        4. účinné od 1. 1. 20063.4 Hydrochinon-monomethylether
        5. účinné od 1. 1. 20063.5 Hydrochinon-monoethylether
        6. účinné od 1. 1. 20063.6 Hydrochinon-monobenzylether (monobenzon)
        7. účinné od 1. 1. 20063.7 Tetrahydrofuran, čistoty pro HPLC
        8. účinné od 1. 1. 20063.8 Směs voda/methanol 1:1 (V/V). Smíchá se jeden díl vody a jeden díl methanolu (3.2).
        9. účinné od 1. 1. 20063.9 Mobilní fáze: směs tetrahydrofuran/voda 45:55 (V/V). Smíchá se 45 dílů tetrahydrofuranu (3.7) a 55 dílů vody.
        10. účinné od 1. 1. 20063.10 Standardní roztok

          účinné od 1. 1. 2006Do odměrné baňky na 50 ml se naváží 0,06 g hydrochinonu (3.3), 0,08 g hydrochinon-monomethyletheru (3.4), 0,10 g hydrochinon-monoethyletheru (3.5) a 0,12 g hydrochinon-monobenzyletheru (3.6). Rozpustí se a doplní se na objem methanolem (3.2). Standardní roztok se připraví zředěním 10,00 ml tohoto roztoku na 50,00 ml směsí voda/methanol (3.8). Tyto roztoky se připravují čerstvé.

      1. účinné od 1. 1. 20064. Přístroje a pomůcky

        účinné od 1. 1. 2006Obvyklé laboratorní vybavení

        1. účinné od 1. 1. 20064.1 Vodní lázeň nastavitelná na teplotu 60 °C
        2. účinné od 1. 1. 20064.2 Chromatograf pro vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii s UV detektorem s nastavitelnou vlnovou délkou a 10μl nastřikovací smyčkou
        3. účinné od 1. 1. 20064.3 Analytická kolona:

          účinné od 1. 1. 2006Chromatografická kolona z nerezové oceli, délka 250 mm, vnitřní průměr 4,6 mm, plněná Zorbax fenylem (chemicky vázaným fenethylsilanem na Zorbaxu SIL, uzavřená trimethylchlorsilanem), velikost částic 6 μm, nebo ekvivalentní náplní. Nepoužívá se ochranná kolona, s výjimkou fenylové kolony nebo kolony s ekvivalentní náplní.

        1. účinné od 1. 1. 20064.4 Filtrační papír, průměr 90 mm, Schleicher and Schüll, Weissband No 5892 nebo ekvivalentní
      1. účinné od 1. 1. 20065. Postup
        1. účinné od 1. 1. 20065.1 Příprava vzorku

          účinné od 1. 1. 2006Do odměrné baňky na 50 ml se s přesností na tři desetinná místa naváží 1 ± 0,1 g (a gramů) vzorku. Vzorek se rozptýlí ve 25 ml směsi voda/methanol (3.8). Baňka se uzavře a silně se protřepe, dokud se nevytvoří homogenní suspenze. Protřepává se alespoň 1 minutu. Baňka se umístí do vodní lázně (4.1) nastavené na 60 °C, aby se usnadnila extrakce. Baňka se ochladí a doplní se na objem směsí voda/methanol (3.8). Extrakt se zfiltruje přes filtrační papír (4.4). Kvalitativní stanovení HPLC se provede do 24 hodin od přípravy extraktu.

        1. účinné od 1. 1. 20065.2 Vysokoúčinná kapalinová chromatografie
          1. účinné od 1. 1. 20065.2.1 Průtoková rychlost mobilní fáze (3.9) se upraví na 1,0 ml/min a vlnová délka detektoru se nastaví na 295 nm.
          2. účinné od 1. 1. 20065.2.2 Nastříkne se 10 μl roztoku vzorku získaného podle bodu 5.1 a zaznamená se chromatogram. Změří se plochy píků. Provede se kalibrace podle bodu 5.2.3. Porovnají se chromatogramy získané pro vzorek a standardní roztoky. Pro výpočet koncentrace analytu v roztoku vzorku se použijí plochy píků a faktory odezvy (RF) vypočtené podle 5.2.3.
          3. účinné od 1. 1. 20065.2.3 Kalibrace

            účinné od 1. 1. 2006Nastříkne se 10 μl standardního roztoku (3.10) a zaznamená se chromatogram. Nástřik se provede několikrát, dokud není plocha píku konstantní.

            účinné od 1. 1. 2006Stanoví se faktor odezvy RFi:

            účinné od 1. 1. 2006

            1. účinné od 1. 1. 2006kde
              účinné od 1. 1. 2006
              Obrázek 12: Rozlišení píků Obrázek 13: Faktor asymetrie píku
              pi = plocha píku pro hydrochinon, hydrochinon-monomethylether, hydrochinon- monoethylether nebo hydrochinon- monobenzylether
              ci = koncentrace hydrochinonu, hydrochinon-monomethyletheru, hydrochinon- monoethyletheru nebo hydrochinon-monobenzyletheru v standardním roztoku (3.10) (g/50 ml).

            účinné od 1. 1. 2006Je třeba ověřit, zda chromatogramy získané pro standardní roztok a roztok vzorku splňují následující požadavky:

            1. účinné od 1. 1. 2006— rozlišení píků nejhůře odděleného páru je alespoň 0,90. (Definice rozlišení píků je uvedena na obrázku 14);
              účinné od 1. 1. 2006Obrázek

              účinné od 1. 1. 2006Obrázek 14: Rozlišení píků

              účinné od 1. 1. 2006Není-li požadovaného rozlišení dosaženo, měla by být buď použita účinnější kolona nebo by mělo být složení mobilní fáze upraveno tak, aby byl požadavek splněn;

            1. účinné od 1. 1. 2006— faktor asymetrie As všech získaných píků by se měl pohybovat od 0,9 do 1,5. (Definice faktoru asymetrie je uvedena na obrázku 15) Při zaznamenání chromatogramu za účelem stanovení faktoru asymetrie je doporučená rychlost zaznamenávání 2 cm/min.
              účinné od 1. 1. 2006Obrázek

              účinné od 1. 1. 2006Obrázek 15: Faktor asymetrie píku

            1. účinné od 1. 1. 2006— Základna musí být stabilní.
      1. účinné od 1. 1. 20066. Výpočet

        účinné od 1. 1. 2006Pro výpočet koncentrace analytu (koncentrací analytů) ve vzorku se použijí plochy píků analytů. Koncentrace analytu ve vzorku vyjádřená v hmotnostních procentech (xi) se vypočte pomocí vzorce

        účinné od 1. 1. 2006

        1. účinné od 1. 1. 2006kde
          účinné od 1. 1. 2006
          Obrázek 12: Rozlišení píků Obrázek 13: Faktor asymetrie píku Obrázek 14: Rozlišení píků Obrázek 15: Faktor asymetrie píku
          a = hmotnost vzorku v g,
          bi = plocha píku analytu i ve vzorku.
      1. účinné od 1. 1. 20067. Opakovatelnost
        1. účinné od 1. 1. 20067.1 Pro výrobky obsahující asi 2 % (m/m) hydrochinonu nesmí rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení na stejném vzorku překročit absolutní hodnotu 0,13 %.
        2. účinné od 1. 1. 20067.2 Pro výrobky obsahující asi 1 % (m/m) hydrochinon-monomethyletheru nesmí rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení na stejném vzorku překročit absolutní hodnotu 0,1%.
        3. účinné od 1. 1. 20067.3 Pro výrobky obsahující asi 1 % (m/m) hydrochinon-monoethyletheru nesmí rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení na stejném vzorku překročit absolutní hodnotu 0,11%.
        4. účinné od 1. 1. 20067.4 Pro výrobky obsahující asi 1 % (m/m) hydrochinon-monobenzyletheru nesmí rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení na stejném vzorku překročit absolutní hodnotu 0,11%.
      1. účinné od 1. 1. 20068. Reprodukovatelnost
        1. účinné od 1. 1. 20068.1 Pro výrobky obsahující asi 2 % (m/m) hydrochinonu nesmí absolutní hodnota rozdílu mezi výsledky dvou paralelních stanovení na stejném vzorku provedených stejnou metodou za různých podmínek (různé laboratoře, různí experimentátoři, různé přístroje a/nebo různá doba), překročit absolutní hodnotu 0,37 %.
        2. účinné od 1. 1. 20068.2 Pro výrobky obsahující asi 1 % (m/m) hydrochinon-monomethyletheru nesmí absolutní hodnota rozdílu mezi výsledky dvou paralelních stanovení na stejném vzorku, provedených stejnou metodou za různých podmínek (různé laboratoře, různí experimentátoři, různé přístroje a/nebo různá doba), překročit absolutní hodnotu 0,21 %.
        3. účinné od 1. 1. 20068.3 Pro výrobky obsahující asi 1 % (m/m) hydrochinon-monoethyletheru nesmí absolutní hodnota rozdílu mezi výsledky dvou paralelních stanovení na stejném vzorku, za různých podmínek (různé laboratoře, různí experimentátoři, různé přístroje a/nebo různá doba), překročit absolutní hodnotu 0,19%.
        4. účinné od 1. 1. 20068.4 Pro výrobky obsahující asi 1 % (m/m) hydrochinon-monobenzyletheru nesmí absolutní hodnota rozdílu mezi výsledky dvou paralelních stanovení na stejném vzorku, provedených stejnou metodou za různých podmínek (různé laboratoře, různí experimentátoři, různé přístroje a/nebo různá doba), překročit absolutní hodnotu 0,11%.
      1. účinné od 1. 1. 20069. Poznámky
        1. účinné od 1. 1. 20069.1 Je-li zjištěn obsah hydrochinonu výrazně vyšší než 2 % a je požadován přesný odhad obsahu, měl by se extrakt vzorku (5.1) zředit na podobnou koncentraci, kterou by měl vzorek obsahující 2 % hydrochinonu, a stanovení se opakuje.

          účinné od 1. 1. 2006(U některých přístrojů může při vysokých koncentracích hydrochinonu ležet hodnota absorbance mimo lineární rozsah detektoru.)

        1. účinné od 1. 1. 20069.2 Rušivé vlivy

          účinné od 1. 1. 2006Výše popsaná metoda umožňuje stanovení hydrochinonu a jeho etherů v jednom izokratickém průběhu. Použití fenylové kolony zajistí dostatečnou retenci hydrochinonu, kterou nelze zajistit při použití kolony C18 s uvedenou mobilní fází.

          účinné od 1. 1. 2006U této metody však snadno dochází k rušivému vlivu celé řady parabenů. V takovém případě by stanovení mělo být zopakováno s jiným systémem mobilní fáze/stacionární fáze. Vhodné metody lze najít v odkazech:

          1. účinné od 1. 1. 2006„Magnesium as modifier for the determination of baryum by flame atomic emission spectrometry“. Jerrow M. et al., Analytical proceedings, 1991, 28, 40.
          2. účinné od 1. 1. 2006M. Herpol-Borremans et. M.-O. Masse, Identification et dosage de l'hydro-quinone et de ses éthers méthylique et benzylique dans les produits cosmétiques pour blanchir la peau. Int. J. Cosmet. Sci. 8-203-214 (1986).

          účinné od 1. 1. 2006Kolona:Zorbax ODS, 4,6 mm x 25 mm nebo ekvivalentní:

          1. účinné od 1. 1. 2006teplota: 36 °C
          2. účinné od 1. 1. 2006průtok: 1,5 ml/min
          3. účinné od 1. 1. 2006mobilní fáze:
          4. účinné od 1. 1. 2006pro hydrochinon: methanol/voda 5/95 (V/V)
          5. účinné od 1. 1. 2006pro hydrochinon-monomethylether: methanol/voda 30/70 (V/V)
          6. účinné od 1. 1. 2006pro hydrochinon-monobenzylether: methanol/voda 80/20(V/V).

          účinné od 1. 1. 2006Kolona: Spherisorb S5-ODS nebo ekvivalentní:

          1. účinné od 1. 1. 2006mobilní fáze: voda/methanol 90/10 (V/V)
          2. účinné od 1. 1. 2006průtok: 1,5 ml/min

          účinné od 1. 1. 2006Tyto podmínky jsou vhodné pro hydrochinon (J. Firth and I. Rix, Determination of hydroquinone in skin toning creams, Analyst (1986), 111, p. 129).

  1. účinné od 1. 1. 200638. KVALITATIVNÍ A KVANTITATIVNÍ STANOVENÍ 2-FENOXYETHANOLU, 1-FENOXYPROPAN-2-OLU, METHYL-, ETHYL-, PROPYL-, BUTYL- A BENZYL-4-HYDROXYBENZOÁTU V KOSMETICKÝCH PROSTŘEDCÍCH
    1. účinné od 1. 1. 2006A. KVALITATIVNÍ STANOVENÍ
      1. účinné od 1. 1. 20061. Rozsah a oblast použití

        účinné od 1. 1. 2006V této metodě je specifikován postup chromatografie na tenké vrstvě, který v kombinaci s metodou kvantitativního stanovení, popsanou v oddílu B, umožní identifikaci 2-fenoxyethanolu, 1-fenoxypropan-2-olu, methyl-4-hydroxybenzoátu, ethyl-4-hydroxybenzoátu, propyl-4-hydroxybenzoátu, butyl-4-hydroxybenzoátu a benzyl-4-hydroxybenzoátu v kosmetických prostředcích.

      1. účinné od 1. 1. 20062. Princip

        účinné od 1. 1. 2006Konzervační přísady se extrahují z okyselených vzorků kosmetických prostředků acetonem. Po filtraci se acetonový roztok smíchá s vodou a mastné kyseliny se v alkalickém prostředí vysrážejí jako vápenaté soli. Alkalická směs aceton/voda je extrahována diethyletherem, čímž se odstraní lipofilní látky. Po okyselení se konzervační přísady extrahují diethyletherem. Alikvotní část diethyletherového extraktu se nanese na desku pokrytou tenkou vrstvou silikagelu. Po vyvíjení se získaný chromatogram pozoruje v UV světle a zviditelní se za použití Millonova činidla.

      1. účinné od 1. 1. 20063. POUŽITÉ CHEMIKÁLIE
        1. účinné od 1. 1. 20063.1 Všeobecně

          účinné od 1. 1. 2006Všechny použité chemikálie musí být čistoty p.a. nebo vyšší Musí být použita destilovaná voda nebo voda alespoň stejné čistoty.

          1. účinné od 1. 1. 20063.2 Aceton
          2. účinné od 1. 1. 20063.3 Diethylether
          3. účinné od 1. 1. 20063.4 n-Pentan
          4. účinné od 1. 1. 20063.5 Methanol
          5. účinné od 1. 1. 20063.6 Kyselina octová, ledová
          6. účinné od 1. 1. 20063.7 Roztok kyseliny chlorovodíkové, 4 mol/l
          7. účinné od 1. 1. 20063.8 Roztok hydroxidu draselného, 4 mol/l
          8. účinné od 1. 1. 20063.9 Chlorid vápenatý dihydrát (CaCl2·2H2O)
          9. účinné od 1. 1. 20063.10 Detekční činidlo: Millonovo činidlo

            účinné od 1. 1. 2006Millonovo činidlo (dusičnan rtuťnatý) je komerčně dostupný roztok (Fluka 69820).

          1. účinné od 1. 1. 20063.11 2-Fenoxyethanol
          2. účinné od 1. 1. 20063.12 1-Fenoxy-propan-2-ol
          3. účinné od 1. 1. 20063.13 Methyl-4-hydroxybenzoát (methylparaben)
          4. účinné od 1. 1. 20063.14 Ethyl-4-hydroxybenzoát (ethylparaben)
          5. účinné od 1. 1. 20063.15 n-Propyl-4-hydroxybenzoát (propylparaben)
          6. účinné od 1. 1. 20063.16 n-Butyl-4-hydroxybenzoát (butylparaben)
          7. účinné od 1. 1. 20063.17 Benzyl-4-hydroxybenzoát (benzylparaben)
          8. účinné od 1. 1. 20063.18 Standardní roztoky

            účinné od 1. 1. 2006Připraví se 0,1% (m/V) roztoky každé z referenčních látek 3.11, 3.12, 3.13, 3.14, 3.15, 3.16 a 3.17 v methanolu.

          1. účinné od 1. 1. 20063.19 Mobilní fáze

            účinné od 1. 1. 2006Smíchá se 88 dílů n-pentanu (3.4) s 12 díly ledové kyseliny octové (3.6).

      1. účinné od 1. 1. 20064 Přístroje a pomůcky

        účinné od 1. 1. 2006Běžné laboratorní vybavení a

        1. účinné od 1. 1. 20064.1 Vodní lázeň nastavitelná na teplotu 60 °C
        2. účinné od 1. 1. 20064.2 Vyvíjecí komora (nevyložená filtračním papírem)
        3. účinné od 1. 1. 20064.3 Zdroj ultrafialového světla, 254 nm
        4. účinné od 1. 1. 20064.4 Hotové desky 20 cm x 20 cm se sorbční vrstvou: silikagel 60F254 (fluorescenční indikátor), tloušťka vrstvy: 0,25 mm, s koncentrační zónou 25 x 200 mm (Merck No 11798, Darmstadt, nebo ekvivalentní)
        5. účinné od 1. 1. 20064.5 Sušárna nastavitelná na teplotu až do 105 °C
        6. účinné od 1. 1. 20064.6 Horkovzdušný fén
        7. účinné od 1. 1. 20064.7 Vlněný malířský váleček o délce přibližně 10 cm, vnější průměr přibližně 3,5 cm. Vlněná vrstva by měla být 2 až 3 mm silná. Podle potřeby se vlna zastřihne.

          účinné od 1. 1. 2006Viz poznámka v bodě 5.2.

        1. účinné od 1. 1. 20064.8 Erlenmeyerovy baňky na 50 a 200 ml, se zábrusovou zátkou
        2. účinné od 1. 1. 20064.9 Elektrická topná deska s termostatem. Nastavení teploty: asi 80 °C. Topná deska se pokryje hliníkovou deskou o velikosti 20 cm x 20 cm a tloušťce asi 6 mm, čímž se dosáhne rovnoměrného rozložení tepla.
      1. účinné od 1. 1. 20065. Postup
        1. účinné od 1. 1. 20065.1 Příprava vzorku

          účinné od 1. 1. 2006Do Erlenmeyerovy baňky na 50 ml se zábrusovou zátkou (4.8.) se odváží přibližně 1 g vzorku. Přidají se čtyři kapky roztoku kyseliny chlorovodíkové (3.7) a 40 ml acetonu.

          účinné od 1. 1. 2006V případě silně zásaditých kosmetických přípravků, jako je toaletní mýdlo, se přidá 20 kapek roztoku kyseliny chlorovodíkové. Baňka se uzavře, směs se zlehka zahřeje na asi 60 °C, aby se usnadnila extrakce konzervačních látek do acetonové fáze, a 1 minutu se silně třepe.

          účinné od 1. 1. 2006Indikátorovým papírkem se změří pH roztoku a upraví se na hodnotu ≤3 roztokem kyseliny chlorovodíkové. Znovu se 1 minutu silně třepe.

          účinné od 1. 1. 2006Roztok se ochladí na laboratorní teplotu a zfiltruje se přes filtrační papír do Erlenmeyerovy baňky. 20 ml filtrátu se převede do Erlenmeyerovy baňky na 200 ml, přidá se 60 ml vody a promíchá. Hodnota pH směsi se upraví hydroxidem draselným (3.8.) přibližně na 10 za použití indikátorového papírku.

          účinné od 1. 1. 2006Přidá se 1 g chloridu vápenatého dihydrátu (3.9) a silně se protřepe.

          účinné od 1. 1. 2006Roztok se zfiltruje přes filtrační papír do dělicí nálevky na 250 ml, která obsahuje 75 ml diethyletheru, a silně se 1 minutu protřepává. Fáze se nechají oddělit a vodná fáze se vypustí do Erlenmeyerovy baňky na 200 ml. Hodnota pH roztoku se upraví roztokem kyseliny chlorovodíkové na přibližně 2 za použití indikátorového papírku. Poté se přidá 10 ml diethyletheru a silně se 1 minutu protřepává. Fáze se nechají oddělit a asi 2 ml fáze diethyletheru se převede do vzorkovací lahvičky na 5 ml.

        1. účinné od 1. 1. 20065.2 Chromatografie na tenké vrstvě (TLC)

          účinné od 1. 1. 2006TLC deska se umístí na zahřátou hliníkovou desku (4.9.) Na startovní linii koncentrační zóny TLC desky se nanese 10 μl každého z referenčních roztoků a 100 μl roztoku vzorku (vzorků) (5.1).

          účinné od 1. 1. 2006Podle potřeby lze podpořit odpaření rozpouštědla proudem vzduchu. TLC deska se odstraní z topné desky a nechá se vychladnout na laboratorní teplotu. Vyvíjecí komora (4.2) se naplní 100 ml mobilní fází (3.19).

          účinné od 1. 1. 2006TLC deska se ihned vloží do nenasycené komory a vyvíjí se při laboratorní teplotě, dokud čelo rozpouštědla nepostoupí asi 15 cm od základní linie. Deska se z vyvíjecí komory vyjme a vysuší v proudu horkého vzduchu pomocí horkovzdušného fénu.

          účinné od 1. 1. 2006Deska se prohlédne v UV světle (4.3) a pozice skvrn se vyznačí. Deska se zahřívá 30 minut v sušárně (4.5) při 100 °C, aby se odstranila nadbytečná kyselina octová. Konzervační přísady v chromatogramu se zviditelní Millonovým činidlem (3.10) tak, že válečkem (4.7) namočeným do činidla se TLC deska přejede tak, aby byla rovnoměrně navlhčená.

        2. účinné od 1. 1. 2006Poznámka: Skvrny lze rovněž zviditelnit opatrným nanesením kapky Millonova činidla na každou skvrnu označenou pod UV světlem.

          3. účinné od 1. 1. 2006Estery kyseliny 4-hydroxybenzoové se projeví jako červené skvrny, 2-fenoxyethanol a 1-fenoxypropan-2-ol jako žluté skvrny. Je však třeba dávat pozor na to, že kyselina 4-hydroxybenzoová, která může být přítomná ve vzorcích jako konzervační látka nebo produkt rozkladu parabenů, se sama o sobě projeví jako červená skvrna. Viz 7.3 a 7.4.

      1. účinné od 1. 1. 20066. Kvalitativní stanovení

        účinné od 1. 1. 2006Pro každou skvrnu se vypočte hodnota Rf. Skvrny získané z roztoku vzorku se porovnají se skvrnami získanými z referenčních roztoků, pokud jde o jejich hodnoty Rf, jejich chování v UV světle a barvu po zviditelnění. Učiní se předběžné závěry o identitě konzervantů.

        účinné od 1. 1. 2006Pokud se zdá, že jsou přítomny parabeny, provede se analýza vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) popsanou v oddílu B. Výsledky chromatografie na tenké vrstvě (TLC) a vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC) se zkombinují, aby se potvrdila přítomnost 2-fenoxyethanolu, 1-fenoxypropan-2-olu a parabenů.

      1. účinné od 1. 1. 20067. Poznámky
        1. účinné od 1. 1. 20067.1 Vzhledem k toxicitě Millonova činidla je nejvhodnější aplikovat toto činidlo jedním z popsaných způsobů. Postřik se nedoporučuje.
        2. účinné od 1. 1. 20067.2 Jiné sloučeniny obsahující hydroxylové skupiny mohou rovněž při reakci s Milionovým činidlem dávat zbarvení. Tabulka barev a hodnot Rf získaných pro řadu konzervantů použitím chromatografie na tenké vrstvě je uvedena v práci N. de Kruijf, M.A.H. Rijk, L.A. Pranato-Soetardhi a A. Schouten (1987): Determination of preservatives in cosmetic products I: Thin-layer chromatographic procedure for the identification of preservatives in cosmetic products (J. Chromatography 410, 395-411).
        3. účinné od 1. 1. 20067.3 Hodnoty Rf uvedené v následující tabulce slouží jako ukazatele hodnot, které lze získat:
          účinné od 1. 1. 2006
          Obrázek 12: Rozlišení píků Obrázek 13: Faktor asymetrie píku Obrázek 14: Rozlišení píků Obrázek 15: Faktor asymetrie píku
          SloučeninahRfBarva
          Kyselina 4-hydroxybenzoová11červená
          Methylparaben12červená
          Ethylparaben17červená
          Propylparaben21červená
          Butylparaben26červená
          Benzylparaben16červená
          2-fenoxyethanol29žlutá
          1-fenoxypropan-2-ol50žlutá
        1. účinné od 1. 1. 20067.4 V případě kyseliny 4-hydroxybenzoové a methylparabenu a ani v případě benzylparabenu a ethylparabenu nedochází k oddělení. Kvalitativní stanovení těchto sloučenin by mělo být potvrzeno metodou HPLC popsanou v oddílu B a porovnáním retenčních časů vzorku s retenčními časy standardů.
    1. účinné od 1. 1. 2006B. KVANTITATIVNÍ STANOVENÍ
      1. účinné od 1. 1. 20061. Rozsah a oblast použití

        účinné od 1. 1. 2006V této metodě je specifikován postup pro stanovení 2-fenoxyethanolu, 1-fenoxypropan-2-olu, methyl-4-hydroxybenzoátu, ethyl-4-hydroxybenzoátu, propyl-4-hydroxybenzoátu, butyl-4-hydroxybenzoátu a benzyl-4-hydroxybenzoátu v kosmetických prostředcích.

      1. účinné od 1. 1. 20062. Definice

        účinné od 1. 1. 2006Množství konzervačních přísad stanovená touto metodou se vyjádří v hmotnostních procentech.

      1. účinné od 1. 1. 20063. Princip

        účinné od 1. 1. 2006Vzorek se okyselí přidáním kyseliny sírové a poté se suspenduje ve směsi ethanolu a vody. Směs se opatrně zahřeje do rozpuštění tukové fáze, aby se zajistila kvantitativní extrakce, a poté se zfiltruje.

        účinné od 1. 1. 2006Konzervační látky ve filtrátu se stanoví vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) s obrácenou fází za použití isopropyl-4-hydroxybenzoátu jako vnitřního standardu.

      1. účinné od 1. 1. 20064. POUŽITÉ CHEMIKÁLIE
        1. účinné od 1. 1. 20064.1 Všeobecně

          účinné od 1. 1. 2006Všechny použité chemikálie musí být čistoty p.a. nebo vyšší a podle potřeby musí být vhodná pro HPLC. Musí být použita destilovaná voda nebo voda alespoň stejné čistoty.

        1. účinné od 1. 1. 20064.2 Ethanol, absolutní
        2. účinné od 1. 1. 20064.3 2-Fenoxyethanol
        3. účinné od 1. 1. 20064.4 1-Fenoxypropan-2-ol
        4. účinné od 1. 1. 20064.5 Methyl-4-hydroxybenzoát (methylparaben)
        5. účinné od 1. 1. 20064.6 Ethyl-4-hydroxybenzoát (ethylparaben)
        6. účinné od 1. 1. 20064.7 n-Propyl-4-hydroxybenzoát (propylparaben)
        7. účinné od 1. 1. 20064.8 Isopropyl-4-hydroxybenzoát (isopropylparaben)
        8. účinné od 1. 1. 20064.9 n-Butyl-4-hydroxybenzoát (butylparaben)
        9. účinné od 1. 1. 20064.10 Benzyl-4-hydroxybenzoát (benzylparaben)
        10. účinné od 1. 1. 20064.11 Tetrahydrofuran
        11. účinné od 1. 1. 20064.12 Methanol
        12. účinné od 1. 1. 20064.13 Acetonitril
        13. účinné od 1. 1. 20064.14 Roztok kyseliny sírové, 2 mol/l
        14. účinné od 1. 1. 20064.15 Směs ethanol/voda

          účinné od 1. 1. 2006Smíchá se devět dílů ethanolu (4.2) a jeden díl vody.

        1. účinné od 1. 1. 20064.16 Roztok vnitřního standardu

          účinné od 1. 1. 2006Naváží se přibližně 0,25 g isopropylparabenu (4.8) přesně, převede se do odměrné baňky na 500 ml, rozpustí se a doplní se na objem směsí ethanol/voda (4.15).

        1. účinné od 1. 1. 20064.17 Mobilní fáze: směs tetrahydrofuran/voda/methanol/acetonitril

          účinné od 1. 1. 2006Smíchá se 5 dílů tetrahydrofuranu, 60 dílů vody, 10 dílů methanolu a 25 dílů acetonitrilu.

        1. účinné od 1. 1. 20064.18 Zásobní roztok standardů

          účinné od 1. 1. 2006Do odměrné baňky na 100 ml se přesně naváží přibližně 0,2 g 2-fenoxyethanolu, 0,2 g 1-fenoxypropan-2-olu, 0,05 g methylparabenu, 0,05 g ethylparabenu, 0,05 g propylparabenu, 0,05 g butylparabenu a 0,025 g benzylparabenu, rozpustí se a doplní se na objem směsí ethanol/voda.

          účinné od 1. 1. 2006Roztok se uchovává v ledničce a je stabilní 1 týden.

        1. účinné od 1. 1. 20064.19 Standardní roztoky konzervačních přísad

          účinné od 1. 1. 2006Do odměrných baněk na 50 ml se ze zásobního roztoku (4.18) převede 20,00 ml, 10,00 ml, 5,00 ml, 2,00 ml a 1,00 ml. Do každé baňky se přidá 10,00 ml roztoku vnitřního standardu (4.16) a 1,0 ml roztoku kyseliny sírové (4.14) a doplní se na objem směsí ethanol/voda. Tyto roztoky se připravují vždy čerstvé.

      1. účinné od 1. 1. 20065. Přístroje a pomůcky

        účinné od 1. 1. 2006Obvyklé laboratorní vybavení a

        1. účinné od 1. 1. 20065.1 Vodní lázeň nastavitelná na teplotu 60 °C ± 1 °C
        2. účinné od 1. 1. 20065.2 HPLC chromatograf s UV detektorem, vlnová délka 280 nm
        3. účinné od 1. 1. 20065.3 Analytická kolona:

          účinné od 1. 1. 2006Nerezová ocel, délka 25 cm, vnitřní průměr 4,6 mm, (nebo délka 12,5 cm a vnitřní průměr 4,6 mm), naplněná Nucleosilem 5C18 nebo ekvivalentním (viz 10.1).

        1. účinné od 1. 1. 20065.4 Erlenmeyerovy baňky na 100 ml, se zábrusovou zátkou
        2. účinné od 1. 1. 20065.5 Varné kamínky, karborundum, velikost 2 až 4 mm, nebo ekvivalentní
      1. účinné od 1. 1. 20066. Postup
        1. účinné od 1. 1. 20066.1 Příprava vzorku
          1. účinné od 1. 1. 20066.1.1 Příprava vzorku bez přidání vnitřního standardu

            účinné od 1. 1. 2006Do Erlenmeyerov baňky na 100 ml se zábrusovou zátkou se odváží asi 1,0 g vzorku přesně. Do baňky se pipetou přidá 1,0 ml roztoku kyseliny sírové (4.14) a 50,0 ml směsi ethanol/voda (4.15). Přidá se přibližně 1 g varných kamínků (5.5), baňka se uzavře a silně se protřepe, dokud nevznikne homogenní suspenze. Protřepává se alespoň 1 minutu. Baňka se vloží na 5 minut do vodní lázně (5.1) o teplotě 60 °C ± 1°C, aby se podpořila extrakce konzervantů do ethanolové fáze.

            účinné od 1. 1. 2006Baňka se ihned ochladí pod proudem studené vody a extrakt se uloží na jednu hodinu do ledničky. Extrakt se zfiltruje přes filtrační papír.

            účinné od 1. 1. 2006Asi 2 ml filtrátu se převedou do 5 ml vzorkovací lahvičky. Extrakty se uloží do chladničky a stanovení metodou HPLC se provede do 24 hodin.

          1. účinné od 1. 1. 20066.1.2 Příprava vzorků včetně přidání vnitřního standardu

            účinné od 1. 1. 2006Do Erlenmeyerov baňky na 100 ml se zábrusovou zátkou se s přesností na tři desetinná místa odváží 1,0 g ± 0,1 g vzorku.

            účinné od 1. 1. 2006Do baňky se pipetou přidá 1,0 ml roztoku kyseliny sírové (4.14) a 40,0 ml směsi ethanol/voda (4.15). Přidá se přibližně 1 g varných kamínků (5.5) a přesně 10,00 ml roztoku vnitřního standardu. Baňka se uzavře a silně se protřepe, dokud nevznikne homogenní suspenze. Protřepává se alespoň 1 minutu. Baňka se vloží na 5 minut do vodní lázně (5.1) o teplotě 60 °C ± 1°C, aby se podpořila extrakce konzervantů do ethanolové fáze.

            účinné od 1. 1. 2006Baňka se ihned ochladí pod proudem studené vody a extrakt se uloží na jednu hodinu do chladničky. Extrakt se zfiltruje přes filtrační papír.

            účinné od 1. 1. 2006Asi 2 ml filtrátu se převedou do 5 ml vzorkovací lahvičky (zkušební roztok). Extrakt se uloží do chladničky a stanovení metodou HPLC se provede do 24 hodin.

        1. účinné od 1. 1. 20066.2 Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC)
          1. účinné od 1. 1. 20066.2.1 Chromatografické podmínky
            1. účinné od 1. 1. 2006— Mobilní fáze: směs tetrahydrofuran/voda/methanol/acetonitril (4.17)
            2. účinné od 1. 1. 2006— Průtoková rychlost: 1,5 ml/min
            3. účinné od 1. 1. 2006— Detekční vlnová délka: 280 nm
          1. účinné od 1. 1. 20066.2.2 Kalibrace

            účinné od 1. 1. 2006Nastříkne se 10 μl každého ze standardních roztoků konzervantů (4.19). Ze získaných chromatogramů se stanoví poměr výšek píků standardních roztoků konzervantů k píku vnitřního standardu. Pro každý konzervant se sestrojí křivka závislosti těchto poměrů na koncentraci standardních roztoků.

          1. účinné od 1. 1. 20066.2.3 Stanovení

            účinné od 1. 1. 2006Do chromatogafu se nastříkne 10 μl roztoku vzorku bez vnitřního standardu (6.1.1) a zaznamená se chromatogram.

            účinné od 1. 1. 2006Nastříkne se 10 μl jednoho ze standardních roztoků konzervantů (4.19) a zaznamená se chromatogram. Získané chromatogramy se porovnají.

            účinné od 1. 1. 2006Není-li v chromatogramu extraktu vzorku (6.1.1) přítomen pík s přibližně stejným retenčním časem, jako je retenční čas píku isopropylparabenu (doporučený vnitřní standard), pokračuje se nastříknutím 10 μl roztoku vzorku s vnitřním standardem (6.1.2). Chromatogram se zaznamená a změří se výšky píků.

            účinné od 1. 1. 2006Je-li v chromatogramu roztoku vzorku rušivý pík s retenčním časem přibližně stejným jako retenční čas isopropylparabenu, měl by být vybrán jiný vnitřní standard.

            účinné od 1. 1. 2006Není-li jeden z vyšetřovaných konzervantů v chromatogramu vzorku přítomen, lze tento konzervant použít jako vnitřní standard.

            účinné od 1. 1. 2006Vypočítají se poměry výšek píků vyšetřovaných konzervantů k výšce píku vnitřního standardu.

            účinné od 1. 1. 2006Je třeba ověřit, že kalibrační křivka použitého standardu je lineární.

            účinné od 1. 1. 2006Je třeba ověřit, zda chromatogramy získané pro standardní roztok a roztok vzorku splňují následující požadavky:

            1. účinné od 1. 1. 2006— separace píků nejhůře odděleného páru je alespoň 0,90. (Definice separace píků je uveden na obrázku 16.)
              účinné od 1. 1. 2006Obrázek

              účinné od 1. 1. 2006Obrázek 16: Separace píků

              účinné od 1. 1. 2006Není-li požadované separace dosaženo, měla by být buď použita účinnější kolona, nebo by mělo být složení mobilní fáze upraveno tak, aby byl požadavek splněn.

            1. účinné od 1. 1. 2006— faktor asymetrie (As) všech získaných píků by se měl pohybovat od 0,9 do 1,5. (Definice faktoru asymetrie je uvedena na obrázku 17.) Při zaznamenání chromatogramu za účelem stanovení faktoru asymetrie je doporučená rychlost zaznamenávání 2 cm/min.
              účinné od 1. 1. 2006Obrázek

              účinné od 1. 1. 200617: Faktor asymetrie píku

            1. účinné od 1. 1. 2006— Základna by měla být stabilní.
      1. účinné od 1. 1. 20067. Výpočet

        účinné od 1. 1. 2006Pro výpočet koncentrace konzervantů v roztoku vzorku se použije kalibrační křivka (6.2.2) a hodnoty poměrů výšek píků vyšetřovaných konzervantů k výšce píku vnitřního standardu.

        účinné od 1. 1. 2006Obsah (wi) 2-fenoxyethanolu, 1-fenoxypropan-2-olu, methyl-4-hydroxybenzoátu, ethyl-4-hydroxybenzoátu, propyl-4-hydroxybenzoátu, butyl-4-hydroxybenzoátu a benzyl-4-hydroxybenzoátu v hmotnostních procentech (% m/m) se vypočte pomocí vzorce:

        účinné od 1. 1. 2006

        1. účinné od 1. 1. 2006kde
          účinné od 1. 1. 2006
          Obrázek 12: Rozlišení píků Obrázek 13: Faktor asymetrie píku Obrázek 14: Rozlišení píků Obrázek 15: Faktor asymetrie píku Obrázek 16: Separace píků 17: Faktor asymetrie píku
          bi = koncentrace konzervantu i ve zkušebním roztoku (μg/ml) odečtená z kalibrační křivky, a
          a = hmotnost zkušebního vzorku (g).
      1. účinné od 1. 1. 20068. Opakovatelnost

        účinné od 1. 1. 2006Viz poznámka v bodě 10.5.