Platné znění

Vyhláška, kterou se stanoví analytické metody kontroly složení kosmetických prostředků

  1. 4.2.1.18.1 Kyselina thiglykolová (4.2.1.1), 0,4% roztok (m/V) ve vodě.
  2. 4.2.1.18.2 2,2'-dithiodi(octová kyselina) (4.2.1.2), 0,4% roztok (m/V) ve vodě.
  3. 4.2.1.18.3 Kyselina 2-merkaptopropionová (4.2.1.3), 0,4% roztok (m/V) ve vodě.
  4. 4.2.1.18.4 Kyselina 3-merkaptopropionová (4.2.1.4), 0,4% roztok (m/V) ve vodě.
  5. 4.2.1.18.5 3-merkaptopropan-1,2-diol (4.2.1.5), 0,4% roztok (m/V) ve vodě.
  1. 4.2.2 Přístroje a pomůcky

    Obvyklé vybavení pro chromatografii na tenké vrstvě

  1. 4.2.3 Postup
    1. 4.2.3.1 Příprava vzorků

      Vzorek se okyselí několika kapkami kyseliny chlorovodíkové (4.2.1.8) na pH 1 a v případě potřeby zfiltruje.

      V některých případech může být účelné vzorek zředit. V tomto případě se okyselení kyselinou chlorovodíkovou provede před zředěním.

    1. 4.2.3.2 Vyvíjení

      Na desku se nanese 1 μl roztoku vzorku (4.2.3.1) a 1 μl každého z pěti referenčních roztoků (4.2.1.18). Pečlivě se vysuší v mírném proudu dusíku a deska se vyvíjí rozpouštědly (4.2.1.16.1 nebo 4.2.1.16.2). Deska se usuší co nejrychleji pod dusíkem, aby nedošlo k oxidaci thiolů.

    1. 4.2.3.3 Detekce

      Deska se postříká jedním ze tří činidel (4.2.1.17.1, 4.2.1.17.3 nebo 4.2.1.17.4). Pokud se deska postříká činidlem (4.2.1.17.3), vystaví se poté parám bromu (např. v nádobě obsahující malou kádinku činidla (4.2.1.17.2)), dokud se skvrny nezviditelní. Detekce postřikem činidlem (4.2.1.17.4) bude úspěšná jen tehdy, nepřekročí-li doba sušení desky 30 minut.

    1. 4.2.3.4 Interpretace

      Hodnoty Rf a barvy referenčních roztoků se porovnají s roztoky vzorků. Průměrné hodnoty Rf uváděné dále jako hrubé vodítko slouží pouze pro srovnání. Závisí na:

      1. — úrovni aktivace tenké vrstvy v době vyvíjení chromatogramu,
      2. — teplotě ve vyvíjecí komoře.

      Příklady hodnot Rf získaných na silikagelové vrstvě

      Příklady hodnot Rf získaných na silikagelové vrstvě
      Vyvíjecí rozpouštědla
      4.2.1.16.14.2.1.16.2
      Kyselina thioglykolová0,250,80
      Kyselina 2-merkaptopropionová0,400,95
      2,2'-dithiodi(octová kyselina)0,000,35
      Kyselina 3-merkaptopropionová0,450,95
      3-merkaptopropan-1,2-diol0,450,35
  1. 5. KVANTITATIVNÍ STANOVENÍ

    (Stanovení kyseliny thioglykolové se provádí s dosud nepoužitým výrobkem z čerstvě otevřeného obalu, aby se zamezilo oxidaci.)

    Stanovení musí vždy začínat jodometrií.

    1. 5.1 Jodometrie
      1. 5.1.1 Princip

        Stanovení se provádí oxidací skupiny „-SH“ jodem v kyselém prostředí podle rovnice:

        2 HOOC − CH2SH + I2 → (HOOC − CH2 − S)2 + 2I- + 2H+

      1. 5.1.2 POUŽITÉ CHEMIKÁLIE

        Jod, 0,05 mol/l odměrný roztok

      1. 5.1.3 Přístroje a pomůcky

        Obvyklé laboratorní vybavení

      1. 5.1.4 Postup

        Do Erlenmeyerovy baňky na 150 ml s uzávěrem, obsahující 50 ml destilované vody, se přesně naváží 0,5 až 1 g vzorku. Přidá se 5 ml kyseliny chlorovodíkové (4.1.1.2) (pH roztoku asi 0) a titruje se roztokem jodu (5.1.2), dokud se neobjeví žluté zabarvení. Lze použít také indikátor (např. roztok škrobu nebo tetrachlormethan).

      1. 5.1.5 Výpočet

        Obsah kyseliny thioglykolové se vypočte podle vzorce:

        1. kde:
          Příklady hodnot Rf získaných na silikagelové vrstvě
          m =hmotnost zkušebního vzorku (v g),
          n =objem spotřebovaného roztoku jodu (5.1.2).
      1. 5.1.6 Poznámky

        Je-li vypočtený výsledek pro kyselinu thioglykolovou nejméně o 0,1 % nižší než nejvyšší povolená koncentrace, není další stanovení nutné. Jestliže se výsledek rovná nebo je vyšší než povolená maximální koncentrace a kvalitativní stanovení odhalilo přítomnost několika redukčních činidel, je nezbytné provést stanovení plynovou chromatografií.

  1. 5.2 Plynová chromatografie
    1. 5.2.1 Princip

      Kyselina thioglykolová se oddělí od pomocných látek vysrážením roztokem octanu kademnatého. Po methylaci diazomethanem, který se buď připraví in situ nebo předem jako roztok v diethyletheru, se methylderivát kyseliny thioglykolové stanoví chromatografií plyn/kapalina s methyl-oktanoátem jako vnitřním standardem.

    1. 5.2.2 POUŽITÉ CHEMIKÁLIE

      Všechny použité chemikálie musí být čistoty p.a. nebo vyšší

      1. 5.2.2.1 Kyselina thioglykolová, 98 %
      2. 5.2.2.2 Kyselina chlorovodíková,
      3. 5.2.2.3 Methanol
      4. 5.2.2.4 Octan kademnatý, dihydrát, 10% roztok (m/V) ve vodě
      5. 5.2.2.5 Methyl-oktanoát, 2% roztok (m/V) v methanolu
      6. 5.2.2.6 Acetátový tlumivý roztok (pH 5):
        1. Octan sodný, trihydrát, 77 g.
        2. Kyselina octová (ledová), 27,5 g.
        3. Demineralizovaná voda do konečného objemu jeden litr.
      1. 5.2.2.7 Kyselina chlorovodíková, čerstvě připravený 3M roztok v methanolu (5.2.2.3)
      2. 5.2.2.8 1-methyl-3-nitro-1-nitrosoguanidin
      3. 5.2.2.9 Hydroxid sodný, 5M roztok
      4. 5.2.2.10 Jod, 0,05M odměrný roztok
      5. 5.2.2.11 Diethylether
      6. 5.2.2.12 Roztok diazomethanu připravený z N-methyl-N-nitrosotoluen-4-sulfonamidu (Fieser, Reagents for Organic Synthesis (Wiley), 1967)

        Získaný roztok obsahuje asi 1,5 g diazomethanu ve 100 ml diethyletheru. Protože diazomethan je toxický a velmi nestabilní plyn, je třeba všechny operace provádět v dobře táhnoucí digestoři, a je třeba se vyvarovat použití zábrusové aparatury (pro tento účel jsou k dispozici speciální soupravy).

    1. 5.2.3 Přístroje a pomůcky
      1. 5.2.3.1 Obvyklé laboratorní vybavení
      2. 5.2.3.2 Aparatura pro přípravu diazomethanu pro methylaci in situ (viz Fales, H.M., Jaouni, T.M. a Babashak, J.F., Analyt. Chem. 1973, 45, 2302)
      3. 5.2.3.3 Přístroj pro přípravu diazomethanu předem (podle Fiesera)
    1. 5.2.4 Příprava vzorku

      Do centrifugační kyvety na 50 ml se přesně naváží dostatek vzorku, aby obsahoval předpokládané množství 50 až 70 mg kyseliny thioglykolové. Okyselí se několika kapkami kyseliny chlorovodíkové (5.2.2.2), aby se dosáhlo pH asi 3.

      Přidá se 5 ml demineralizované vody a 10 ml acetátového tlumivýho roztoku (5.2.2.6).

      Pomocí pH papírku se ověří, zda je hodnota pH asi 5. Poté se přidá 5 ml roztoku octanu kademnatého (5.2.2.4).

      Vyčká se 10 minut a poté se odstřeďuje nejméně 15 minut při 4000 g. Odstraní se supernatant, který může obsahovat nerozpustný tuk (v případě krémových prostředků). Tento tuk nelze zaměňovat s thioly, které se hromadí jako kompaktní hmota na dně nádobky. Ověří se, že se po přidání několika kapek roztoku octanu kademnatého (5.2.2.4) k supernatantu netvoří sraženina.

      Jestliže předchozí kvalitativní stanovení neodhalilo přítomnost jiných redukčních činidel než thiolů, ověří se jodometricky, že množství thiolu přítomného v supernatantu nepřekračuje 6 až 8 % původního množství.

      Do centrifugační zkumavky obsahující sraženinu se přidá 10 ml methanolu (5.2.2.3) a sraženina se jemně rozptýlí tyčinkou. Znovu se odstřeďuje nejméně 15 minut při 4000 g. Supernatant se slije a ověří se, že neobsahuje thioly.

      Sraženina se ještě jednou stejným postupem promyje.

      Do téže centrifugační kyvety se přidá

      1. — 2 ml roztoku methyl-oktanoátu (5.2.2.5),
      2. — 5 ml kyseliny chlorovodíkové v methanolu (5.2.2.7).

      Thioly se úplně rozpustí (může zbývat malé množství nerozpustného zbytku pomocných látek).Toto je roztok „S“.

      Na alikvotním podílu tohoto roztoku se jodometricky ověří, že obsah thiolů činí alespoň 90 % hodnoty získané v bodě 5.1.

    1. 5.2.5 Methylace

      Methylace se provádí buď pomocí přípravy in situ (5.2.5.1), nebo předem připraveným roztokem diazomethanu (5.2.5.2).

      1. 5.2.5.1 Methylace in situ

        Do methylační aparatury (5.2.3.2) obsahující 1 ml diethyletheru (5.2.2.11) se převede 50 μl roztoku „S“ a methyluje se postupem (5.2.3.2) s asi 300 mg 1-methyl-3-nitro-1-nitrosoguanidinu (5.2.2.8). Po 15 minutách (etherický roztok by měl být žlutý, což indikuje nadbytek diazomethanu) se roztok vzorku převede do nádobky na 2 ml opatřené vzduchotěsnou zátkou. Ponechá se v ledničce přes noc. Methylují se dva vzorky současně.

      1. 5.2.5.2 Methylace předem připraveným roztokem diazomethanu

        Do nádobky na 5 ml opatřené zátkou se převede 1 ml roztoku diazomethanu (5.2.2.12) a poté 50 μl roztoku „S“. Ponechá se v ledničce přes noc.

    1. 5.2.6 Příprava standardu

      Připraví se standardní roztok kyseliny thioglykolové (5.2.2.1) o známé koncentraci, obsahující asi 60 mg čisté kyseliny thioglykolové (5.2.2.1) ve 2 ml.

      Toto je roztok „E“.

      Vysrážení, zkouška a methylace se provedou tak, jak je popsáno v bodech 5.2.4 a 5.2.5.

    1. 5.2.7 Podmínky pro plynovou chromatografii
      1. 5.2.7.1 Kolona
        1. Typ: nerezová ocel.
        2. Délka: 2 m.
        3. Průměr: 3 mm.
      1. 5.2.7.2 Náplň

        20 % didecylftalát/Chromosorb WAW, 80 až 100 mesh.

      1. 5.2.7.3 Detektor

        Plamenový ionizační. Vhodné nastavení citlivosti elektrometru plamenového ionizačního detektoru je 8 x 10-10 A.

      1. 5.2.7.4 Plyny
        1. Nosný plyn: dusík.
        2. tlak: 2,2 bar,
        3. průtok: 35 ml/min.
        4. Pomocný plyn: vodík.
        5. tlak: 1,8 bar,
        6. průtok: 15 ml/min.
        7. Plyny pro detektor: podle specifikace výrobce přístroje.
      1. 5.2.7.5 Teplotní podmínky
        1. Nástřik: 200 °C
        2. Detektor: 200 °C
        3. Kolona: 90 °C.
      1. 5.2.7.6 Rychlost posuvu papíru v zapisovači

        5 mm/min.

      1. 5.2.7.7 Nastřikované množství

        3 μl. Provede se pět nástřiků.

      1. 5.2.7.8 Chromatografické podmínky jsou uvedeny pouze jako vodítko. Umožní dosáhnout rozlišení „R“ rovné nebo lepší než 1,5, kde:

        1. kde
          Příklady hodnot Rf získaných na silikagelové vrstvě
          r1 a r2 =retenční časy dvou píků (v min.),
          W1 a W2 =šířka píků v polovině výšky píků (v mm),
          d' = rychlost posuvu papíru (v mm/min.).

        Doporučuje se zvyšovat na závěr chromatografického měření teplotu z 90 °C na 150 °C rychlostí 10 °C za minutu, aby se vyloučily látky, které by mohly rušit následující měření.

    1. 5.2.8 Výpočty
      1. 5.2.8.1 Koeficient úměrnosti pro kyselinu thioglykolovou

        Počítá se vzhledem k methyloktanoátu na základě standardní směsi.

        Označí-li se kyselina thioglykolová jako „t“,

        1. přičemž
          Příklady hodnot Rf získaných na silikagelové vrstvě
          kt = její koeficient úměrnosti,
          m't = její hmotnost ve směsi (v mg),
          S't =plocha jejího píku,
        1. a označí-li se methyloktanoát jako „c“,
        2. přičemž
          Příklady hodnot Rf získaných na silikagelové vrstvě
          m'c =jeho hmotnost ve směsi (v mg),
          S'c=plocha jeho píku,
        1. potom

        Tento koeficient se liší podle použitého přístroje.

      1. 5.2.8.2 Koncentrace kyseliny thioglykolové přítomné ve vzorku

        Označí-li se kyselina thioglykolová jako „t“,

        1. přičemž
          Příklady hodnot Rf získaných na silikagelové vrstvě
          kt = její koeficient úměrnosti,
          St = plocha jejího píku,
        1. a označí-li se methyloktanoát jako „c“,
        2. přičemž
          Příklady hodnot Rf získaných na silikagelové vrstvě
          mc =jeho hmotnost ve směsi (v mg),
          Sc =plocha jeho píku,
          M = hmotnost původního zkušebního vzorku (v mg),
        1. potom % (m/m) kyseliny thioglykolové přítomné ve vzorku je:

  1. 8. OPAKOVATELNOST

    Pro výrobky obsahující asi 8 % (m/m) kyseliny thioglykolové nesmí rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení na stejném vzorku překročit absolutní hodnotu 0,8 %.

  1. 19. KVALITATIVNÍ A KVANTITATIVNÍ STANOVENÍ HEXACHLOROFENU (INN)
    1. A. KVALITATIVNÍ STANOVENÍ
      1. 1. ROZSAH A OBLAST POUŽITÍ

        Tato metoda je vhodná pro všechny kosmetické prostředky.

      1. 2. PRINCIP

        Hexachlorofen ve vzorku se extrahuje ethylacetátem a kvalitativně se stanoví chromatografií na tenké vrstvě.

      1. 3. POUŽITÉ CHEMIKÁLIE

        Všechny použité chemikálie musí být čistoty p.a. nebo vyšší

        1. 3.1 Kyselina sírová, 4 mol/l
        2. 3.2 Celit AW
        3. 3.3 Ethylacetát
        4. 3.4 Mobilní fáze: Benzen obsahující 1 % (V/V) ledové kyseliny octové.
        5. 3.5 Detekční činidlo I:

          Roztok rhodaminu B: Rozpustí se 100 mg rhodaminu B ve směsi 150 ml diethyletheru, 70 ml absolutního ethanolu a 16 ml vody.

        1. 3.6 Detekční činidlo II:

          Roztok 2,6-dibrom-4-(chlorimino)cyklohexa-2,5-dienonu: 400 mg 2,6-dibrom-4-(chlorimino)cyklohexa-2,5-dienonu se rozpustí ve 100 ml methanolu (připravuje se čerstvý každý den).

          Roztok uhličitanu sodného: 10 g uhličitanu sodného se rozpustí ve 100 ml demineralizované vody.

        1. 3.7 Standardní roztok:

          Hexachlorofen, 0,05% roztok (m/V) v ethylacetátu

      1. 4. PŘÍSTROJE A POMŮCKY
        1. 4.1 TLC desky Kieselgel 254, 200 x 200 mm (nebo ekvivalentní)
        2. 4.2 Obvyklé vybavení pro TLC
        3. 4.3 Lázeň pro temperaci chromatografické komory udržovaná na teplotě 26 °C
      1. 5. PŘÍPRAVA ZKUŠEBNÍHO VZORKU
        1. 5.1 1 g homogenizovaného vzorku se důkladně promíchá s 1 g Celitu AW (3.2) a 1 ml kyseliny sírové (3.1).
        2. 5.2 Suší se 2 hodiny při 100 °C.
        3. 5.3 Nechá se vychladnout a vysušený zbytek se rozdrtí na jemný prášek.
        4. 5.4 Dvakrát se extrahuje vždy 10 ml ethylacetátu (3.3), po každé extrakci se odstředí a ethylacetátové vrstvy se sloučí.
        5. 5.5 Odpaří se při 60 °C.
        6. 5.6 Odparek se rozpustí ve 2 ml ethylacetátu (3.3).
      1. 6. POSTUP
        1. 6.1 2 μl roztoku zkušebního vzorku (5.6) a 2 μl standardního roztoku (3.7) se nanesou na desku pro chromatografii na tenké vrstvě (4.1).
        2. 6.2 Komora (4.3) se nasytí mobilní fází (3.4).
        3. 6.3 Deska pro chromatografii na tenké vrstvě se vloží do komory a vyvíjí se do vzdálenosti čela 150 mm.
        4. 6.4 Deska pro chromatografii na tenké vrstvě se vyjme z komory a suší se v sušárně s nuceným oběhem vzduchu při teplotě asi 105 °C.
        5. 6.5 Detekce

          Skvrny hexachlorofenu na desce pro chromatografii na tenké vrstvě se detekují způsobem popsaným v bodě 6.5.1 nebo 6.5.2.

          1. 6.5.1 Deska se rovnoměrně postříká detekčním činidlem I (3.5). Po 30 minutách se deska pozoruje v UV světle při 254 nm.
          2. 6.5.2 Deska se rovnoměrně postříká roztokem 2,6-dibrom-4-(chlorimino)cyklohexa-2,5-dienonu detekčního činidla II (3.6). Následně se deska postříká roztokem uhličitanu sodného (3.6). Deska se po 10 minutách sušení při pokojové teplotě pozoruje v denním světle.
      1. 7. INTERPRETACE
        1. 7.1 Detekční činidlo I (3.5):

          Hexachlorofen se detekuje jako namodralá skvrna na žluto-oranžovém fluoreskujícím pozadí a má Rf přibližně 0,5.

        1. 7.2 Detekční činidlo II (3.6):

          Hexachlorofen se detekuje jako blankytně modrá až tyrkysově zbarvená skvrna na bílém pozadí a má Rf přibližně 0,5.

    1. B. KVANTITATIVNÍ STANOVENÍ
      1. 1. ROZSAH A OBLAST POUŽITÍ

        Tato metoda je vhodná pro všechny kosmetické prostředky.

      1. 2. DEFINICE

        Obsah hexachlorofenu ve vzorku stanovený touto metodou se vyjádří v hmotnostních procentech hexachlorofenu.

      1. 3. PRINCIP

        Hexachlorofen se stanovuje po přeměně na methylderivát plynovou chromatografií s detektorem elektronového záchytu.

      1. 4. POUŽITÉ CHEMIKÁLIE

        Všechny použité chemikálie musí být čistoty p.a. nebo vyšší

        1. 4.1 Ethylacetát
        2. 4.2 N-methyl-N-nitroso-p-toluensulfonamid (diazald)
        3. 4.3 Diethylether
        4. 4.4 Methanol
        5. 4.5 2-(2-ethoxyethoxy)ethanol (karbitol)
        6. 4.6 Kyselina mravenčí
        7. 4.7 Hydroxid draselný, 50% vodný roztok (m/m) (připravuje se vždy čerstvý)
        8. 4.8 Hexan pro spektroskopii
        9. 4.9 Bromchlorofen (standard č. 1)
        10. 4.10 4,4',6,6'-tetrachlor-2,2'-thiodifenol (standard č. 2)
        11. 4.11 2,4,4'-trichlor-2-hydroxydifenylether (standard č. 3)
        12. 4.12 Aceton
        13. 4.13 Kyselina sírová, 4M
        14. 4.14 Celit AW
        15. 4.15 Kyselina mravenčí v ethylacetátu, 10% roztok (V/V)
        16. 4.16 Hexachlorofen
      1. 5. PŘÍSTROJE A POMŮCKY
        1. 5.1 Obvyklé laboratorní sklo
        2. 5.2 Miniaparatura pro přípravu diazomethanu (Analyt. Chem. 1973, 45, 2302-2)
        3. 5.3 Plynový chromatograf vybavený detektorem elektronového záchytu se zdrojem 63Ni
      1. 6. POSTUP
        1. 6.1 Příprava standardního roztoku

          Standard se zvolí tak, aby neinterferoval se žádnou látkou obsaženou v analyzovaném výrobku jako pomocná látka. Obvykle je nejvhodnější standard č. 1 (4.9).

          1. 6.1.1 Do odměrné baňky na 100 ml se naváží asi 50 mg standardu č. 1, 2 nebo 3 přesně (4.9, 4.10 nebo 4.11) a 50 mg hexachlorofenu (4.16). Doplní se na objem ethylacetátem (4.1) (roztok A). 10 ml roztoku A se zředí ethylacetátem (4.1) na 100 ml (roztok B).
          2. 6.1.2 Do odměrné baňky na 100 ml se naváží asi 50 mg standardu č. 1, 2 nebo 3 přesně (4.9, 4.10 nebo 4.11). Doplní se na objem ethylacetátem (4.1) (roztok C).
        1. 6.2 Příprava vzorku

          Naváží se asi 1 g homogenizovaného vzorku přesně a důkladně se promíchá s 1 ml kyseliny sírové (4.13), 15 ml acetonu (4.12) a 8 g Celitu AW (4.14). Směs se 30 minut suší vzduchem na vodní lázni, poté se jeden a půl hodiny suší v sušárně s nuceným oběhem vzduchu. Nechá se vychladnout, zbytek se rozdrtí na jemný prášek a převede do skleněné kolony. Eluuje se ethylacetátem (4.1) a jímá se 100 ml. Přidají se 2 ml roztoku vnitřního standardu (roztok C) (6.1.2).

          (Vzhledem k tomu, že hexachlorofen je obsažen v celé řadě typů výrobků, je důležité před definitivním zaznamenáním výsledků stanovit výtěžek hexachlorofenu při stanovení v dotyčném vzorku tímto postupem. Jsou-li výtěžky nízké, mohou být se souhlasem zúčastněných stran provedeny změny, například změna rozpouštědla (benzen místo ethylacetátu) apod.)

        1. 6.3 Methylace vzorku

          Všechna reakční činidla a aparatura se 2 hodiny chladí na teplotu 0 až 4 °C. Do vnějšího zásobníku diazomethanové aparatury se převede 1,2 ml roztoku připraveného podle bodu 6.2 a 0,1 ml methanolu (4.4). Do středního zásobníku se převede asi 200 mg diazaldu (4.2), přidá se 1 ml karbitolu (4.5) a 1 ml diethyletheru (4.3) a nechá se rozpustit. Aparatura se sestaví, z poloviny se ponoří do lázně o teplotě 0 °C a do středního zásobníku se injekční stříkačkou zavede asi 1 ml vychlazeného roztoku hydroxidu draselného (4.7). Je třeba se přesvědčit, že žluté zbarvení způsobené vzniklým diazomethanem přetrvává. Pokud žluté zbarvení nepřetrvává, methylace se opakuje s dalšími 200 mg diazaldu (4.2).

          (Přetrvávání tohoto žlutého zbarvení je známkou přebytku diazomethanu, který je nezbytný pro zajištění úplné methylace vzorku.)

          Aparatura se po 15 minutách vyjme z lázně a ponechá se uzavřená při laboratorní teplotě 12 hodin. Aparatura se otevře, přebytek diazomethanu se odstraní přídavkem několika kapek 10% (V/V) roztoku kyseliny mravenčí v ethylacetátu (4.15), organický roztok se převede do odměrné baňky na 25 ml. Doplní se na objem hexanem (4.8).

          1,5 μl tohoto roztoku se nastříkne do chromatografu.

        1. 6.4 Methylace standardu

          Všechna reakční činidla a aparatura se 2 hodiny chladí na teplotu 0 až 4 °C. Do vnějšího zásobníku diazomethanové aparatury se umístí:

          1. 0,2 ml roztoku B (6.1.1),
          2. 1 ml ethylacetátu (4.1),
          3. 0,1 ml methanolu (4.4).

          V methylaci se pokračuje tak, jak je popsáno v bodě 6.3. 1,5 μl výsledného roztoku se nastříkne do chromatografu.

      1. 7. PLYNOVÁ CHROMATOGRAFIE

        Kolona musí zaručit rozlišení „R“ rovné nebo lepší než 1,5, kde:

        1. kde
          Příklady hodnot Rf získaných na silikagelové vrstvě
          r1 a r2 =retenční časy dvou píků (v min.),
          W1 a W2 =šířky píků v polovině výšky píků (v mm),
          d' = rychlost posuvu papíru (v mm/min.).

        Jako vhodné se ukázaly následující chromatografické podmínky:

        1. Kolona: nerezová ocel.
        2. Délka: 1,7 m.
        3. Průměr: 3 mm.
        4. Nosič:
        5. Chromosorb WAW
        6. zrnitost: 80 až 100 mesh.
        7. Stacionární fáze: 10% OV 17.
        8. Teploty:
        9. kolona: 280 °C,
        10. nástřik: 280 °C,
        11. detektor: 280 °C.
        12. Nosný plyn: dusík zbavený kyslíku.
        13. Tlak: 2,3 bar.
        14. Průtok: 30 ml/min.
      1. 8. VÝPOČET
        1. 8.1 Koeficient úměrnosti hexachlorofenu

          Bude odpovídat zvolenému standardu a jeho poměru ve standardní směsi.

          1. Označí-li se
            1. h = hexachlorofen,
            2. kh = jeho koeficient úměrnosti,
            3. m'h = jeho hmotnost ve směsi (v g),
            4. A'h = plocha jeho píku,
            5. s = vybraný standard,
            6. m's = jeho hmotnost ve směsi (v g),
            7. A's = plocha jeho píku,
          1. potom:

        1. 8.2 Množství hexachlorofenu ve vzorku
          1. Označí-li se
            1. h = hexachlorofen,
            2. kh = jeho koeficient úměrnosti,
            3. Ah = plocha jeho píku,
            4. s = vybraný standard,
            5. ms = jeho hmotnost ve směsi (v g),
            6. As = plocha jeho píku,
            7. M = hmotnost odebraného vzorku (v g),
          1. potom % (m/m) hexachlorofenu ve vzorku je

      1. 8. OPAKOVATELNOST

        Pro výrobky obsahující asi 0,1 % (m/m) hexachlorofenu nesmí rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení na stejném vzorku překročit absolutní hodnotu 0,005 %.

  1. 20. KVANTITATIVNÍ STANOVENÍ TOSYLCHLORAMIDU SODNÉHO, (CHLORAMINU-T)(INN)
    1. 1. ROZSAH A OBLAST POUŽITÍ

      V této metodě je popsáno kvantitativní stanovení tosylchloramidu sodného (chloraminu-T) v kosmetických prostředcích chromatografií na tenké vrstvě.

    1. 2. DEFINICE

      Obsah chloraminu-T ve vzorku stanovený touto metodou se vyjádří v hmotnostních procentech (m/m).

    1. 3. PRINCIP

      Chloramin-T se kvantitativně hydrolyzuje na 4-toluensulfonamid varem s kyselinou chlorovodíkovou.

      Množství vzniklého 4-toluensulfonamidu se po chromatografii na tenké vrstvě stanoví fotodenzitometricky.

    1. 4. POUŽITÉ CHEMIKÁLIE

      Všechny použité chemikálie musí být čistoty p.a. nebo vyšší

      1. 4.1 Tosylchloramid sodný (chloramin-T)
      2. 4.2 Standardní roztok 4-toluensulfonamidu: 50 mg 4-toluensulfonamidu ve 100 ml ethanolu (4.5)
      3. 4.3 Kyselina chlorovodíková, 37% (m/m),
      4. 4.4 Diethylether
      5. 4.5 Ethanol, 96% (V/V)
      6. 4.6 Mobilní fáze
      7. 4.6.1 Butan-1-ol/ethanol (4.5)/voda (40:4:9, V/V/V), nebo
      8. 4.6.2 Chloroform/aceton (6:4, V/V)
      9. 4.7 Hotové desky pro chromatografii na tenké vrstvě, silikagel 60, bez fluorescenčního indikátoru
      10. 4.8 Manganistan draselný
      11. 4.9 Kyselina chlorovodíková, 15% (m/m)
      12. 4.10 Detekční činidlo: 2-toluidin, 1% roztok (m/V) v ethanolu (4.5)
    1. 5. PŘÍSTROJE A POMŮCKY
      1. 5.1 Obvyklé laboratorní vybavení
      2. 5.2 Obvyklé vybavení pro chromatografii na tenké vrstvě
      3. 5.3 Fotodenzitometr
    1. 6. POSTUP
      1. 6.1 Hydrolýza

        Do baňky na 50 ml s kulatým dnem se naváží asi 1 g vzorku přesně (m). Přidá se 5 ml vody a 5 ml kyseliny chlorovodíkové (4.3) a vaří se jednu hodinu pod zpětným chladičem. Horká suspenze se okamžitě převede vodou do odměrné baňky na 50 ml. Nechá se vychladnout a doplní po rysku vodou. Odstřeďuje se 5 minut alespoň při 3000 ot./min a supernatant se zfiltruje.

      1. 6.2 Extrakce
        1. 6.2.1 Odebere se 30 ml filtrátu a extrahuje se třikrát 15 ml diethyletheru (4.4). V případě potřeby se etherové fáze vysuší a shromáždí v 50 ml odměrné baňce. Doplní se na objem diethyletherem (4.4).
        2. 6.2.2 Odebere se 25 ml vysušeného etherického extraktu a odpaří se do sucha v proudu dusíku. Odparek se rozpustí v 1 ml ethanolu (4.5).
      1. 6.3 Chromatografie na tenké vrstvě
        1. 6.3.1 20 μl ethanolického roztoku odparku (6.2.2) se nanese na desku pro chromatografii na tenké vrstvě (4.7).

          Současně a stejným způsobem se nanese 8, 12, 16 a 20 μl standardních roztoků 4-toluensulfonamidu (4.2).

        1. 6.3.2 Nechá se vyvíjet v mobilní fázi (4.6.1 nebo 4.6.2) až čelo dosáhne vzdálenosti asi 150 mm.
        2. 6.3.3 Po úplném odpaření mobilní fáze se deska umístí na 2 až 3 minuty do atmosféry par chloru, vzniklých nalitím asi 100 ml kyseliny chlorovodíkové (4.9) na asi 2 g manganistanu draselného (4.8) v uzavřené nádobě. Přebytek chloru se odstraní zahřátím desky na 100 °C po dobu 5 minut. Poté se deska postříká detekčním činidlem (4.10).
      1. 6.4 Měření

        Přibližně po jedné hodině se fialové skvrny proměří fotodenzitometrem při 525 nm.

      1. 6.5 Vynesení kalibračních křivek

        Hodnoty maximálních výšek píků stanovených pro čtyři skvrny 4-toluensulfonamidu se vynesou proti odpovídajícím množstvím 4-toluensulfonamidu (tj. 4, 6, 8 a 10 μg 4-toluensulfonamidu na skvrnu).

    1. 7. POZNÁMKA

      Metodu je možno ověřit pomocí 0,1 nebo 0,2% roztoku (m/V) chloraminu-T (4.1), který se podrobí stejnému postupu jako vzorek (6).

    1. 8. VÝPOČET

      Obsah chloraminu-T ve vzorku vyjádřený v hmotnostních procentech se vypočte takto

      1. kde
        Příklady hodnot Rf získaných na silikagelové vrstvě
        1,33 =přepočítávací faktor 4-toluensulfonamid/Chloramin-T,
        a =množství 4-toluensulfonamidu ve vzorku, odečtené z kalibračních křivek (v μg),
        m =hmotnost odebraného vzorku (v g).
    1. 9. OPAKOVATELNOST

      Pro výrobky obsahující asi 0,2 % (m/m) chloraminu-T nesmí rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení na stejném vzorku překročit absolutní hodnotu 0,03 %.

  1. 21. KVANTITATIVNÍ STANOVENÍ CELKOVÉHO FLUORU V ZUBNÍCH PASTÁCH
    1. 1. ROZSAH A OBLAST POUŽITÍ

      Tato metoda je určena ke kvantitativnímu stanovení celkového fluoru v zubních pastách. Je vhodná pro obsah nepřesahující 0,25 %.

    1. 2. DEFINICE

      Obsah fluoru ve vzorku stanovený touto metodou se vyjádří v hmotnostních procentech.

    1. 3. PRINCIP

      Stanovení se provádí plynovou chromatografií. Fluor se ze sloučenin obsahujících fluor převede na triethylfluorsilan (TEFS) přímou reakcí s chlortriethylsilanem (TECS) v kyselém prostředí a současně se extrahuje xylenem obsahujícím cyklohexan jako vnitřní standard.

    1. 4. POUŽITÉ CHEMIKÁLIE

      Všechny použité chemikálie musí být čistoty p.a. nebo vyšší

      1. 4.1 Fluorid sodný, sušený při 120 °C do konstantní hmotnosti
      2. 4.2 Voda, dvakrát destilovaná nebo ekvivalentní kvality
      3. 4.3 Kyselina chlorovodíková,
      4. 4.4 Cyklohexan (C6H12)
      5. 4.5 Xylen nevykazující na chromatogramu při chromatografii za stejných podmínek jako vzorek (6.1) žádné píky před píkem rozpouštědla. V případě potřeby se čistí destilací (5.8).
      6. 4.6 Chlortriethylsilan (TECS Merck nebo ekvivalentní)
      7. 4.7 Standardní roztoky fluoru
        1. 4.7.1 Zásobní roztok, 0,250 mg F- /ml. Naváží se přesně 138,1 mg fluoridu sodného (4.1) a rozpustí se ve vodě (4.2). Roztok se kvantitativně převede do odměrné baňky na 250 ml (5.5). Zředí se po rysku vodou (4.2) a promíchá.
        2. 4.7.2 Zředěný zásobní roztok, 0,050 mg F- /ml. Do odměrné baňky na 100 ml (5.5) se pipetou převede 20 ml zásobního roztoku (4.7.1). Zředí se po rysku vodou a promíchá.
      1. 4.8 Roztok vnitřního standardu

        Smíchá se 1 ml cyklohexanu (4.4) a 5 ml xylenu (4.5).

      1. 4.9 Roztok chlortriethylsilan/vnitřní standard

        Do odměrné baňky na 10 ml se pipetou (5.7) převede 0,6 ml TECS (4.6) a 0,12 ml roztoku vnitřního standardu (4.8). Zředí se xylenem po rysku a promíchá. Připravuje se čerstvý každý den.

      1. 4.10 Kyselina chloristá, 70% (m/V)
      2. 4.11 Kyselina chloristá, 20% (m/V) ve vodě (4.2)
    1. 5. PŘÍSTROJE A POMŮCKY
      1. 5.1 Obvyklé laboratorní vybavení
      2. 5.2 Plynový chromatograf vybavený plamenovým ionizačním detektorem
      3. 5.3 Míchačka Vortex nebo ekvivalentní
      4. 5.4 Třepačka Bühler, typ SMB1 nebo ekvivalentní
      5. 5.5 Odměrné baňky na 100 a 250 ml z polypropylenu
      6. 5.6 Centrifugační kyvety (skleněné) na 20 ml se šroubovacími uzávěry potaženými teflonem, Sovirel typ 611-56 nebo ekvivalentní. Kyvety a uzávěry se čistí louhováním v kyselině chloristé (4.11) několik hodin, poté se pětkrát vypláchnou vodou (4.2) a nakonec se suší při 100 °C.
      7. 5.7 Pipety s nastavitelným objemem na 50 až 200 μl, se špičkami z plastu na jedno použití.
      8. 5.8 Destilační přístroj s třídílnou Schneiderovou kolonou nebo ekvivalentní kolonou Vigreux.
    1. 6. POSTUP
      1. 6.1 Analýza vzorku
        1. 6.1.1 Vybere se dosud neotevřená tuba se zubní pastou, rozřízne se a veškerý obsah se vyjme. Převede se do nádoby z plastu, důkladně se promíchá a uchovává se za podmínek, při nichž nedojde ke znehodnocení vzorku.
        2. 6.1.2 Do centrifugační zkumavky (5.6) se naváží přesně 150 mg vzorku (m), přidá se 5 ml vody (4.2) a zhomogenizuje se (5.3).
        3. 6.1.3 Přidá se 1 ml xylenu (4.5).
        4. 6.1.4 Po kapkách se přidá 5 ml kyseliny chlorovodíkové (4.3) a zhomogenizuje se (5.3).
        5. 6.1.5 Do centrifugační kyvety (5.6) se pipetou přidá 0,5 ml roztoku chlortriethylsilan/vnitřní standard (4.9).
        6. 6.1.6 Kyveta se uzavře šroubovacím uzávěrem (5.6) a důkladně se třepe 45 minut na třepačce (5.4) nastavené na 150 kmitů za minutu.
        7. 6.1.7 Odstřeďuje se 10 minut při takové rychlosti, aby došlo ke zřetelné separaci fází, kyveta se otevře, organická vrstva se oddělí a 3 μl organické fáze se nastříknou do kolony plynového chromatografu (5.2).
      2. Poznámka:

        Eluce všech složek trvá asi 20 minut.

        1. 6.1.8 Nástřik se opakuje, vypočte se průměrný poměr ploch píků (ATEFS/ACH), a odpovídající obsah fluoru (v mg (m1)) se odečte z kalibrační křivky (6.3).
        2. 6.1.9 Celkový obsah fluoru ve vzorku (v hmotnostních procentech fluoru) se vypočte způsobem popsaným v bodě 7.
    1. 6.2 Chromatografické podmínky
      1. 6.2.1 Kolona: nerezová ocel.

        Délka: 1,8 m.

        Průměr: 3 mm.

        Nosič: Gaschrom Q, 80 až 100 mesh.

        Stacionární fáze: silikonový olej DC 200 nebo ekvivalentní, 20 %. Kolona se kondicionuje přes noc při 100 °C (při průtoku nosného plynu 25 ml dusíku za minutu), což se opakuje každou noc. Po každém čtvrtém nebo pátém nástřiku se kolona znovu kondicionuje zahřátím na 100 °C na dobu 30 minut.

        Teplotní režim:

        1. kolona: 70 °C,
        2. nástřik: 150 °C,
        3. detektor. 250 °C.

        Průtok nosného plynu: 35 ml dusíku za minutu.

    1. 6.3 Kalibrační křivka
      1. 6.3.1 Do řady šesti centrifugačních kyvet (5.6) se pipetou odměří 0, 1, 2, 3, 4 a 5 ml zředěného standardního roztoku fluoridu (4.7.2). Každá zkumavka se doplní vodou (4.2) na objem 5 ml.
      2. 6.3.2 Pokračuje se tak, jak je popsáno v bodech 6.1.3 až 6.1.6 včetně.
      3. 6.3.3 Do kolony plynového chromatografu (5.2) se nastříknou 3 μl organické fáze.
      4. 6.3.4 Nástřik se opakuje a vypočítá se průměrný poměr ploch píků (ATEFS/ACH).
      5. 6.3.5 Vynese se kalibrační křivka závislosti hmotnosti fluoru (v mg) ve standardních roztocích (6.3.1) a poměr ploch píku (ATEFS/ACH) změřených podle bodu 6.3.4. Pomocí regresní analýzy se provede nejlepší proložení bodů křivky přímkou.
    1. 7. VÝPOČET

      Koncentrace celkového fluoru ve vzorku (v hmotnostních procentech fluoru) (% (m/m) F) je dána vztahem

      1. kde
        Příklady hodnot Rf získaných na silikagelové vrstvě
        m =zkušební vzorek (6.1.2) (v mg),
        m1 = množství F (v mg) odečtené z kalibrační křivky (6.1.8).
    1. 8. OPAKOVATELNOST

      Pro výrobky obsahující asi 0,15 % (m/m) fluoru nesmí rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení na stejném vzorku překročit absolutní hodnotu 0,012 %.

  1. 22. KVANTITATIVNÍ STANOVENÍ ORGANICKÝCH SLOUČENIN RTUTI

    ROZSAH A OBLAST POUŽITÍ

    Dále popsanou metodu lze použít pro kvalitativní a kvantitativní stanovení organických derivátů rtuti používaných jako konzervační přísady v kosmetických prostředcích k líčení a odličování očí. Metodu lze použít pro thiomersal (INN), merthiolát a fenylrtuťnaté soli.

    1. A. KVALITATIVNÍ STANOVENÍ
      1. 1. PRINCIP

        Organické sloučeniny rtuti se převedou na komplex s 1,5-difenyl-3-thiokarbazonem. Po extrakci dithizonátu tetrachlormethanem se provede chromatografie na tenké vrstvě na silikagelu. Dithizonáty se na chromatogramu projeví jako oranžově zbarvené skvrny.

      1. 2. POUŽITÉ CHEMIKÁLIE

        Všechny použité chemikálie musí být čistoty p.a. nebo vyšší

        1. 2.1 Kyselina sírová, 25% (V/V)
        2. 2.2 1,5-difenyl-3-thiokarbazon (dithizon): 0,8 mg ve 100 ml tetrachlormethanu (2.4)
        3. 2.3 Dusík
        4. 2.4 Tetrachlormethan
        5. 2.5 Mobilní fáze: hexan/aceton, 90:10 (V/V)
        6. 2.6 Standardní roztok, 0,001 % ve vodě:
          1. 2-(ethylmercuriothio)benzoátu sodného,
          2. chloridu ethylrtuti nebo chloridu methylrtuti,
          3. dusičnanu fenylrtuti nebo octanu fenylrtuti,
          4. chloridu rtuťnatého nebo octanu rtuťnatého.
        1. 2.7 Hotové silikagelové desky (např. Merck 5721 nebo ekvivalentní)
        2. 2.8 Chlorid sodný
      1. 3. PŘÍSTROJE A POMŮCKY
        1. 3.1 Obvyklé laboratorní vybavení
        2. 3.2 Obvyklé vybavení pro TLC
        3. 3.3 Filtr pro separaci fází
      1. 4. POSTUP
        1. 4.1 Extrakce
          1. 4.1.1 1 g vzorku se zředí v centrifugační kyvetě 20 ml destilované vody. Co nejvíce se rozptýlí a zahřeje na vodní lázni na 60 °C. Přidají se 4 g chloridu sodného (2.8). Protřepe se. Nechá se vychladnout.
          2. 4.1.2 Odstřeďuje se alespoň 20 minut při 4500 ot./min, aby se oddělila větší část pevné fáze od kapaliny. Přefiltruje se do dělicí nálevky a přidá se 0,25 ml roztoku kyseliny sírové (2.1).
          3. 4.1.3 Několikrát se extrahuje 2 až 3 ml roztoku dithizonu (2.2), dokud nezůstane poslední organická fáze zelená.
          4. 4.1.4 Všechny organické fáze se postupně přefiltrují přes filtr pro separaci fází (3.3).
          5. 4.1.5 Odpaří se do sucha v proudu dusíku (2.3).
          6. 4.1.6 Rozpustí se v 0,5 ml tetrachlormethanu (2.4). Roztok se okamžitě použije způsobem popsaným v bodě 4.2.1.
        1. 4.2 Separace a kvalitativní stanovení
          1. 4.2.1 Na silikagelovou desku (2.7) se ihned nanese 50 μl roztoku v tetrachlormethanu, připraveného podle bodu 4.1.6. Současně se 10 ml standardního roztoku (2.6) podrobí postupu popsanému v bodě 4.1 a 50 μl získaného roztoku se nanese na tutéž desku.
          2. 4.2.2 Deska se umístí do mobilní fáze (2.5) a mobilní fáze se nechá vystoupit do výšky 150 mm. Organické sloučeniny rtuti se objeví jako oranžové skvrny, jejichž barva je stálá, jestliže se okamžitě po odpaření rozpouštědla přikryjí skleněnou deskou.

          Lze získat například následující hodnoty Rf:

          Příklady hodnot Rf získaných na silikagelové vrstvě
          RfBarva
          Thiomersal0,33Oranžová
          Chlorid ethylrtuti0,29Oranžová
          Chlorid methylrtuti0,29Oranžová
          Soli fenylrtuti0,21Oranžová
          Rtuťnaté soli0,10Oranžová
          Octan rtuťnatý0,10Oranžová
          1,5-difenyl-3-thiokarbazon0,09Růžová
    1. B. KVANTITATIVNÍ STANOVENÍ
      1. 1. DEFINICE

        Obsah organických sloučenin rtuti stanovený touto metodou se vyjádří v hmotnostních procentech (m/m) rtuti ve vzorku.

      1. 2. PRINCIP

        Metoda je založena na měření celkového obsahu přítomné rtuti. Je proto nezbytné se nejprve ujistit, že není přítomna anorganická rtuť, a identifikovat organické sloučeniny rtuti přítomné ve vzorku. Po mineralizaci se uvolněná rtuť stanoví bezplamenovou atomovou absorpcí.

      1. 3. POUŽITÉ CHEMIKÁLIE

        Všechny použité chemikálie musí být čistoty p.a. nebo vyšší

        1. 3.1 Koncentrovaná kyselina dusičná,
        2. 3.2 Koncentrovaná kyselina sírová,
        3. 3.3 Redestilovaná voda
        4. 3.4 Manganistan draselný, 7% roztok (m/V)
        5. 3.5 Hydroxylamoniumchlorid, 1,5% roztok (m/V)
        6. 3.6 Peroxodisíran draselný, 5% roztok (m/V)
        7. 3.7 Chlorid cínatý, 10% roztok (m/V)
        8. 3.8 Koncentrovaná kyselina chlorovodíková,
        9. 3.9 Skelná vata impregnovaná chloridem palladnatým, 1% (m/m)
      1. 4. PŘÍSTROJE A POMŮCKY
        1. 4.1 Obvyklé laboratorní vybavení
        2. 4.2 Přístroj pro stanovení rtuti bezplamenovou atomovou absorpční spektrometrií (technika generování studených par) včetně potřebného skleněného nádobí. Optická dráha kyvety alespoň 100 mm.
      1. 5. POSTUP

        Zachovávají se všechna bezpečnostní opatření obvyklá pro stopovou analýzu rtuti.

        1. 5.1 Rozklad
          1. 5.1.1 Naváží se 150 mg vzorku přesně (m). Přidá se 10 ml kyseliny dusičné (3.1) a ponechá se působit tři hodiny ve vzduchotěsné nádobce ve vodní lázni při 55 °C, v pravidelných intervalech se protřepává. Současně se provede slepý pokus s reakčními činidly.
          2. 5.1.2 Po vychladnutí se přidá 10 ml kyseliny sírové (3.2) a ještě jednou se zahřívá 30 minut ve vodní lázni vyhřáté na 55 °C.
          3. 5.1.3 Nádoba se vloží do ledové lázně a opatrně se přidá 20 ml vody (3.3).
          4. 5.1.4 Po dávkách se přidají 2 ml 7% roztoku manganistanu draselného (3.4), dokud roztok nezůstane zbarvený. Vrátí se na dalších 15 minut do vodní lázně vyhřáté na 55 °C.
          5. 5.1.5 Přidají se 4 ml roztoku peroxodisíranu draselného (3.6). V zahřívání na vodní lázni při 55 °C se pokračuje po dobu 30 minut.
          6. 5.1.6 Nechá se vychladnout a obsah se převede do odměrné baňky na 100 ml. Nádobka se vypláchne 5 ml roztoku hydroxylamonium-chloridu (3.5) a poté čtyřikrát 10 ml vody (3.3). Roztok by se měl úplně odbarvit. Doplní se po rysku vodou (3.3).
        1. 5.2 Kvantitativní stanovení
          1. 5.2.1 10 ml zkušebního roztoku (5.1.6) se převede do skleněné nádobky pro stanovení rtuti technikou generování studených par (4.2). Zředí se 100 ml vody (3.3) a následně se přidá 5 ml kyseliny sírové (3.2) a 5 ml roztoku chloridu cínatého (3.7). Po každém přídavku se promíchá. Vyčká se 30 sekund, aby se veškeré ionty rtuti zredukovaly na kovovou rtuť, a odečte se výsledná hodnota (n).
          2. 5.2.2 Skelná vata impregnovaná chloridem paladnatým (3.9) se vloží mezi redukční nádobku a průtočnou kyvetu přístroje (4.2). Postup podle bodu 5.2.1 se opakuje a odečte se výsledná hodnota. Pokud hodnota není nulová, mineralizace byla neúplná a analýza se musí opakovat.
      1. 7. VÝPOČET
        1. Označí-li se
          1. m = hmotnost zkušebního vzorku (v mg)
          2. n = množství rtuti odečtené na přístroji (v μg)

        Množství rtuti vyjádřené v hmotnostních procentech rtuti se vypočte ze vzorce:

      1. 7. POZNÁMKY
        1. 7.1 Ke zlepšení mineralizace může být nezbytné začít zředěním vzorku.
        2. 7.2 Je-li podezření, že se rtuť absorbuje na substrát, mělo by se provést kvantitativní stanovení metodou standardních přídavků.
      1. 8. OPAKOVATELNOST

        Pro výrobky obsahující asi 0,007 % (m/m) rtuti nesmí rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení na stejném vzorku překročit absolutní hodnotu 0,00035 %.

  1. 23. KVANTITATIVNÍ STANOVENÍ ALKALICKÝCH SULFIDŮ A SULFIDŮ KOVŮ ALKALICKÝCH ZEMIN
    1. 1. ROZSAH A OBLAST POUŽITÍ

      V této metodě je popsáno kvantitativní stanovení sulfidů přítomných v kosmetických prostředcích. Přítomnost thiolů nebo jiných redukčních činidel (včetně siřičitanů) neruší.

    1. 2. DEFINICE

      Koncentrace sulfidů stanovená touto metodou se vyjádří v hmotnostních procentech síry.

    1. 3. PRINCIP

      V okyseleném prostředí se sirovodík odvede proudem dusíku a poté se vysráží ve formě sulfidu kademnatého. Ten se odfiltruje, propláchne a stanoví jodometricky.

    1. 4. POUŽITÉ CHEMIKÁLIE

      Všechny použité chemikálie musí být čistoty p.a. nebo vyšší

      1. 4.1 Koncentrovaná kyselina chlorovodíková,
      2. 4.2 Thiosíran sodný, 0,1 mol/l odměrný roztok
      3. 4.3 Jod, 0,05 mol/l odměrný roztok
      4. 4.4 Sulfid sodný
      5. 4.5 Octan kademnatý
      6. 4.6 Koncentrovaný amoniak,
      7. 4.7 Amoniakální roztok octanu kademnatého: 10 g octanu kademnatého (4.5) se rozpustí v přibližně 50 ml vody. Přidává se amoniak (4.6), dokud se sraženina nerozpustí (tj. přibližně 20 ml). Doplní se vodou po rysku do 100 ml.
      8. 4.8 Dusík
      9. 4.9 Roztok amoniaku M
    1. 5. PŘÍSTROJE A POMŮCKY
      1. 5.1 Obvyklé laboratorní vybavení
      2. 5.2 Tříhrdlá zábrusová baňka na 100 ml s kulatým dnem
      3. 5.3 Dvě Erlenmeyrovy baňky se zábrusem na 150 ml, s trubičkou pro přívod a odvod plynu.
      4. 5.4 Jedna nálevka s dlouhým stonkem
    1. 6. POSTUP
      1. 6.1 Uvolnění sulfidů
        1. 6.1.1 Použije se dosud neotevřené balení prostředku. Do baňky s kulatým dnem (5.2) se přesně naváží množství výrobku (m) (vyjádřeno v g), které odpovídá nejvýše 30 mg sulfidových iontů. Přidá se 60 ml vody a 2 kapky odpěňovače.
        2. 6.1.2 Do obou Erlenmeyerových baněk (5.3) se převede po 50 ml roztoku (4.7).
        3. 6.1.3 Na tříhrdlou baňku (5.2) se připojí dělicí nálevka, trubice pro přívod a odvod plynu. Trubice pro odvod plynu se připojí pomocí hadiček z PVC na Erlenmeyerovy baňky (5.3) řazené za sebou.
        4. Poznámka: Aparatura na uvolnění sulfidů musí projít následující zkouškou těsnosti: za stejných zkušebních podmínek se prostředek, který má být zkoumán, nahradí 10 ml roztoku sulfidu (připraveného podle bodu 4.4), obsahujícího „X mg“ sulfidu (stanoví se jodometricky). Nechť „Y“ je počet miligramů sulfidu zjištěný na konci této operace. Rozdíl mezi množstvím „X“ a „Y“ nesmí překročit 3 %.
        1. 6.1.4 Pro odstranění vzduchu se nechá baňkou s kulatým dnem (5.2) 15 minut procházet dusík (4.8) rychlostí 2 bublinky za sekundu.
        2. 6.1.5 Baňka s kulatým dnem se ohřeje na 85 ± 5 °C.
        3. 6.1.6 Proud dusíku (4.8) se zastaví a po kapkách se přidá 40 ml kyseliny chlorovodíkové (4.1).
        4. 6.1.7 Proud dusíku (4.8) se obnoví po přidání téměř veškeré kyseliny, ponechá se minimální množství kapaliny, aby se zamezilo úniku sirovodíku.
        5. 6.1.8 Po 30 minutách se ohřev přeruší. Baňka (5.2) se nechá nejméně hodinu a půl chladnout za stálého proudu dusíku (4.8).
      1. 6.2 Titrace
        1. 6.2.1 Sraženina sulfidu kademnatého se odfiltruje přes nálevku s dlouhým stonkem (5.4).
        2. 6.2.2 Erlenmeyerovy baňky (5.3) se nejprve propláchnou roztokem amoniaku (4.9) a kapalina se nalije na filtr. Poté se vypláchnou destilovanou vodou a voda se použije k promytí sraženiny zadržované na filtru.
        3. 6.2.3 Promývání sraženiny se dokončí promytím dalšími 100 ml vody.
        4. 6.2.4 Papírový filtr se vloží do první Erlenmeyerovy baňky, která obsahovala sraženinu. Přidá se 25 ml (n1) roztoku jodu (4.3), přibližně 20 ml kyseliny chlorovodíkové (4.1) a 50 ml destilované vody.
        5. 6.2.5 Nadbytek jodu se stanoví roztokem thiosíranu sodného (n2) (4.2).
    1. 7. VÝPOČET

      Obsah sulfidů ve vzorku vyjádřený v hmotnostních procentech síry se vypočte podle následujícího vzorce:

      1. kde:
        Příklady hodnot Rf získaných na silikagelové vrstvě
        n1 = použité množství odměrného roztoku jodu (4.3) (v mililitrech),
        x1 = molarita tohoto roztoku,
        n2 =použité množství odměrného roztoku thiosíranu sodného (4.2) (v mililitrech),
        x2 = molarita tohoto roztoku,
        m = hmotnost zkušebního vzorku (v g).
    1. 8. OPAKOVATELNOST

      Pro výrobky obsahující asi 2 % (m/m) sulfidů nesmí rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení na stejném vzorku překročit absolutní hodnotu 0,2 %.

  1. 24. KVALITATIVNÍ A KVANTITATIVNÍ STANOVENÍ 2,3-DIHYDROXYPROPYL-4-AMINOBENZOÁTU
    1. A. KVALITATIVNÍ STANOVENÍ
      1. 1. ROZSAH A OBLAST POUŽITÍ

        Tato metoda slouží ke kvalitativnímu stanovení 2,3-dihydroxypropyl-4-aminobenzoátu (glycerol-1-(4-aminobenzoátu)). Slouží rovněž ke kvalitativnímu stanovení ethyl-4-aminobenzoátu (benzokainu INN), který může být přítomen jako nečistota.

      1. 2. PRINCIP

        Kvalitativní stanovení se provádí chromatografií na tenké vrstvě

        s použitím silikagelu a fluorescentního indikátoru a důkazem volné primární aminoskupiny prostřednictvím tvorby diazobarviva na desce.

      1. 3. POUŽITÉ CHEMIKÁLIE

        Všechny použité chemikálie musí být čistoty p.a. nebo vyšší

        1. 3.1 Směs rozpouštědel: cyklohexan/propan-2-ol/stabilizovaný dichlormethan 48/64/9 (V/V/V).
        2. 3.2 Mobilní fáze: petrolether (40-60)/benzen/aceton/roztok hydroxidu amonného (alespoň 25 % amoniaku): 35/35/35/1 (V/V/V/V).
        3. 3.3 Detekční činidlo: a) dusitan sodný: 1 g ve 100 ml 1M HCl (připravený těsně před použitím),
          1. b) 2-naftol: 0,2 g ve 100 ml 1M hydroxidu draselného.
        1. 3.4 Standardní roztoky:

          2,3-dihydroxypropyl-4-aminobenzoát: 0,05 g ve 100 ml směsného rozpouštědla 3.1;

          ethyl-4-aminobenzoát: 0,05 g ve 100 ml směsného rozpouštědla 3.1.

        1. 3.5 Silikagelové desky 60 F254, o tloušťce vrstvy 0,25 mm, 200 mm x 200 mm.
      1. 4. PŘÍSTROJE A POMŮCKY
        1. 4.1 Obvyklé zařízení pro chromatografii na tenké vrstvě
        2. 4.2 Ultrazvuková lázeň
        3. 4.3 Filtr Millipore FH 0,5 μm nebo ekvivalentní
      1. 5. POSTUP
        1. 5.1 Příprava vzorku

          Do odměrné baňky s uzávěrem na 10 ml se naváží 1,5 g prostředku, který má být analyzován. Doplní se po rysku rozpouštědlem 3.1. Uzavře se a 1 hodinu ponechá při laboratorní teplotě v ultrazvukové lázni (4.2.). Zfiltruje se přes filtr Millipore (4.3) a filtrát se použije pro chromatografii.

        1. 5.2 Chromatografie na tenké vrstvě

          Na desku (3.5) se nanese 10 μl roztoku vzorku (5.1) a každého ze standardních roztoků (3.4). Chromatogram se vyvíjí do výšky 150 mm v komoře předem nasycené mobilní fází 3.2. Deska se nechá vyschnout při teplotě okolí.

        1. 5.3 Detekce
          1. 5.3.1 Deska se pozoruje pod UV světlem 254 nm.
          2. 5.3.2 Zcela vysušená deska se postříká detekčním roztokem 3.3 a).

            Deska se nechá schnout 1 minutu při laboratorní teplotě a ihned se postříká detekčním roztokem 3.3 b). Vysuší se v sušárně při 60 °C. Objeví se skvrny oranžové barvy. 2,3-dihydroxypropyl-4-aminobenzoát: Rf asi 0,07, ethyl-4-aminobenzoát: Rf 0,55.

    1. B. KVANTITATIVNÍ STANOVENÍ
      1. 1. ROZSAH A OBLAST POUŽITÍ

        Tato metoda slouží ke kvantitativnímu stanovení 2,3-dihydroxypropyl-4-aminobenzoátu rovněž stanovuje ethyl-4-aminobenzoát. Nelze stanovit více než 5 % (m/m) 2,3-dihydroxypropyl-4-aminobenzoátu a více než 1 % (m/m) ethyl-4-aminobenzoátu.

      1. 2. DEFINICE

        Obsah 2,3-dihydroxypropyl-4-aminobenzoátu a obsah ethyl-4-aminobenzoátu stanovené touto metodou se vyjádří v procentech (% m/m) hmotnosti prostředku.

      1. 3. PRINCIP

        Prostředek, který má být analyzován, se suspenduje v methanolu a po vhodné úpravě vzorku se stanoví vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC).

      1. 4. POUŽITÉ CHEMIKÁLIE

        Všechny použité chemikálie musí být čistoty p.a. nebo vyšší a musí být vhodná pro HPLC.

        1. 4.1 Methanol
        2. 4.2 Dihydrogenfosforečnan draselný (KH2PO4)
        3. 4.3 Octan zinečnatý (Zn(CH3COO)2·2H2O)
        4. 4.4 Kyselina octová
        5. 4.5 Hexakyanoželeznatan draselný (K4(Fe(CN)6)·3H2O)
        6. 4.6 Ethyl-4-hydroxybenzoát
        7. 4.7 2,3-dihydroxypropyl-4-aminobenzoát
        8. 4.8 Ethyl-4-aminobenzoát
        9. 4.9 Fosfátový tlumivý roztok (0,02M): rozpustí se 2,72 g dihydrogenfosforečnanu draselného (4.2) v 1 litru vody.
        10. 4.10 Mobilní fáze: fosfátový tlumivý roztok (4.9)/methanol (4.1) 61/39 (V/V)

          Složení mobilní fáze může být změněno s cílem dosáhnout faktoru rozlišení R ≥1,5.

          1. kde
            Příklady hodnot Rf získaných na silikagelové vrstvě
            R1 a R2=retenční časy píků v min.,
            W1 a W2 =šířky píků v polovině výšky píků v mm,
            d' = rychlost posuvu papíru v mm/min..
        1. 4.11 Zásobní roztok 2,3-dihydroxypropyl-4-aminobenzoátu: Naváží se asi 40 mg 2,3-dihydroxypropyl-4-aminobenzoátu přesně a převede se do odměrné baňky na 100 ml. Rozpustí se ve 40 ml methanolu (4.1). Doplní se tlumivým roztokem (4.9) po rysku a promíchá se.
        2. 4.12 Zásobní roztok ethyl-4-aminobenzoátu: Naváží se asi 40 mg ethyl-4-aminobenzoátu přesně a převede se do odměrné baňky na 100 ml. Rozpustí se ve 40 ml methanolu (4.1). Doplní se tlumivým roztokem (4.9) po rysku a promíchá se.
        3. 4.13 Roztok vnitřního standardu: Naváží se asi 50 mg ethyl-4-hydroxybenzoátu přesně a převede se do odměrné baňky na 100 ml. Rozpustí se ve 40 ml methanolu (4.1). Doplní se tlumivým roztokem (4.9) po rysku a promíchá se.
        4. 4.14 Standardní roztoky: Připraví se čtyři standardní roztoky rozpuštěním následujících látek ve 100 ml mobilní fáze (4.10) podle následující tabulky:
          Příklady hodnot Rf získaných na silikagelové vrstvě
          Standardní roztok2,3-dihydroxypropyl-4-aminobenzoátethyl-4-aminobenzoátethyl-4-hydroxybenzoát
          (μg/ml) (*)ml (4.11)(μg/ml) (*)ml (4.12)(μg/ml) (*)ml (4.13)
          I82825010
          II1641235010
          III2461645010
          IV40102055010
          (*) Tyto hodnoty jsou informativní a odpovídají přesným hmotnostem v 4.11, 4.12 a 4.13.
          Poznámka: Tyto roztoky mohou být připraveny jiným způsobem.
        1. 4.15 Carrezovo činidlo I: Rozpustí se 26,5 g hexakyanoželeznatanu draselného (4.5) ve vodě a doplní se do 250 ml.
        2. 4.16 Carrezovo činidlo II: Rozpustí se 54,9 g octanu zinečnatého (4.3) a 7,5 ml kyseliny octové (4.4) ve vodě a doplní se do 250 ml.
        3. 4.17 Merck Lichrosorb RP-18, nebo ekvivalentní, s průměrnou velikostí částic 5 μm
      1. 5. PŘÍSTROJE A POMŮCKY
        1. 5.1 Obvyklé laboratorní vybavení
        2. 5.2 Zařízení pro vysokoúčinnou chromatografii s UV detektorem s nastavitelnou vlnové délce a komorou s termostatem nastaveným na 45 °C
        3. 5.3 Kolona z nerezové oceli: délka: 250 mm; vnitřní průměr: 4,6 mm; náplň Lichrosorb RP-18 (4.17)
        4. 5.4 Ultrazvuková lázeň
      1. 6. POSTUP
        1. 6.1 Příprava vzorku
          1. 6.1.1 Do kádinky na 100 ml se přesně naváží 1 g vzorku a přidá se 10 ml methanolu (4.1).
          2. 6.1.2 Kádinka se na 20 minut umístí do ultrazvukové lázně (5.4), aby se vytvořila suspenze. Takto vytvořená suspenze se kvantitativně převede nejvýše 75 ml mobilní fáze (4.10) do odměrné baňky na 100 ml.

            Postupně se přidá 1 ml Carrezova činidla I (4.15) a 1 ml Carrezova činidla II (4.16) a po každém přidání se promíchá. Doplní se elučním roztokem (4.10) po rysku, znovu se promíchá a zfiltruje se přes skládaný filtrační papír.

          1. 6.1.3 Do odměrné baňky na 50 ml se pipetou převede 3,0 ml filtrátu získaného podle bodu 6.1.2 a 5,0 ml roztoku vnitřního standardu (4.13). Doplní se mobilní fází po rysku a promíchá se. Takto získaný roztok se použije pro provedení chromatografické analýzy popsané v bodě 6.2.
        1. 6.2 Chromatografie
          1. 6.2.1 Průtok mobilní fáze (4.10) se upraví na 1,2 ml/min a teplota kolony se nastaví na 45 °C.
          2. 6.2.2 Detektor (5.2) se nastaví na 274 nm.
          3. 6.2.3 Do chromatografu se mikrostříkačkou alespoň dvakrát nastříkne 20 μl roztoku (6.1.3) a změří se plochy píků.
        1. 6.3 Kalibrační křivka
          1. 6.3.1 Nastříkne se 20 μl každého ze standardních roztoků (4.14) a změří se plochy píků.
          2. 6.3.2 Pro každou koncentraci se vypočte poměr ploch píků 2,3-dihydroxypropyl-4-aminobenzoátu k plochám píků vnitřního standardu. Tento poměr se vynese na osu x a na osu y se vynese poměr odpovídajících hmotností.
          3. 6.3.3 Stejným způsobem se postupuje v případě ethyl-4-hydroxybenzoátu.
      1. 7. VÝPOČET
        1. 7.1 Z kalibrační křivky získané v bodě 6.3 se odečtou poměry hmotností (RP1, RP2) odpovídající poměrům mezi plochami píků vypočítanými v bodě 6.2.3, kde
          Příklady hodnot Rf získaných na silikagelové vrstvě
          RP1 =hmotnost 2,3-dihydroxypropyl-4-aminobenzoátu /hmotnost ethyl-4-hydroxybenzoátu,
          RP2 =hmotnost ethyl-4-aminobenzoátu/hmotnost ethyl-4-hydroxybenzoátu,
        1. 7.2 Z takto získaných poměrů hmotností se vypočítá obsah 2,3-dihydroxypropyl-4-aminobenzoátu a obsah ethyl-4-aminobenzoátu v hmotnostních procentech (% m/m) pomocí vzorce:

          Příklady hodnot Rf získaných na silikagelové vrstvě
          q =množství ethyl-4-hydroxybenzoátu (vnitřního standardu) navážené v bodě 4.12 v mg,
          p = množství vzorku navážené v bodě 6.1.1 v g.
      1. 8. OPAKOVATELNOST
        1. 8.1 Pro výrobky obsahující asi 5 % (m/m) 2,3-dihydroxypropyl-4-aminobenzoátu nesmí rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení na stejném vzorku překročit absolutní hodnotu 0,25 %.
        2. 8.2 Pro výrobky obsahující asi 1 % (m/m) ethyl-4-aminobenzoátu nesmí rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení na stejném vzorku překročit absolutní hodnotu 0,10 %.
      1. 9. POZNÁMKY
        1. 9.1 Před provedením analýzy je třeba zkontrolovat, zda vzorek neobsahuje látky, jejichž píky by mohly interferovat s vnitřním standardem (ethyl-4-aminobenzoát).
        2. 9.2 Pro kontrolu, zda nedochází k další interferenci, se stanovení opakuje, přičemž se podíl methanolu v mobilní fázi změní relativně o 10 %.
  1. 25. KVANTITATIVNÍ STANOVENÍ CHLORBUTANOLU
    1. 1. ROZSAH A OBLAST POUŽITÍ

      Tato metoda je vhodná pro kvantitativní stanovení chlorbutanolu (INN) až do maximální koncentrace 0,5 % (m/m) ve všech kosmetických prostředcích s výjimkou aerosolů.

    1. 2. DEFINICE

      Obsah chlorbutanolu stanovený touto metodou se vyjádří v procentech hmotnosti (% m/m) prostředku.

    1. 3. PRINCIP

      Po vhodném zpracování prostředku, který má být analyzován, se stanovení provede plynovou chromatografií s 2,2,2-trichlorethanolem jako vnitřním standardem.

    1. 4. POUŽITÉ CHEMIKÁLIE:

      Všechny použité chemikálie musí být čistoty p.a. nebo vyšší

      1. 4.1 Chlorbutanol (1,1,1-trichlor-2-methylpropan-2-ol)
      2. 4.2 2,2,2-trichlorethanol
      3. 4.3 Absolutní ethanol
      4. 4.4 Standardní roztok chlorbutanolu: 0,025 g ve 100 ml ethanolu (4.3) (m/V)
      5. 4.5 Standardní roztok 2,2,2-trichlorethanolu: 4 mg ve 100 ml ethanolu (4.3) (m/V)
    1. 5. PŘÍSTROJE A POMŮCKY
      1. 5.1 Obvyklé laboratorní vybavení
      2. 5.2 Plynový chromatograf s detektorem elektronového záchytu s 63Ni
    1. 6. POSTUP
      1. 6.1 Příprava vzorku

        Do odměrné baňky na 100 ml se odváží od 0,1 až 0,3 g vzorku přesně (p gramů). Obsah se rozpustí v ethanolu (4.3), přidá se 1 ml roztoku vnitřního standardu (4.5) a doplní po rysku ethanolem.

      1. 6.2 Chromatografické podmínky
        1. 6.2.1 Provozní podmínky musí dávat rozlišovací faktor R ≥1,5.

          1. kde
            1. R1 a R2 = retenční časy píků v min.,
            2. W1 a W2 = šířky píků v polovině výšky píků v mm,
            3. d' = rychlost posuvu papíru v mm/min.
        1. 6.2.2 Požadované rozlišení poskytnou například následující provozní podmínky:
          Příklady hodnot Rf získaných na silikagelové vrstvě
          KolonaIII
          MateriálSkloNerezová ocel
          Délka1,8 m3 m
          Průměr3 mm3 mm
          Stacionární fáze10% Carbowax 20 M TPA na Gaschromu Q 80 - 100 mesh5% OV 17 na Chromosorbu WAW DMCS 80 - 100 mesh
          Kondicionování2 až 3 dny při 190 °C
          Teplota:
          – nástřik200 °C150 °C
          – kolona150 °C100 °C
          – detektor200 °C150 °C
          Nosný plynDusíkArgon/methan (95/5 V/V)
          Průtok35 ml/min35 ml/min
      1. 6.3 Kalibrační křivka