Vyhláška, kterou se stanoví analytické metody kontroly složení kosmetických prostředků

1. 4.1.1 2 g prostředku se rozptýlí v 50 ml vody a pH suspenze se upraví přibližně na hodnotu 1 kyselinou chlorovodíkovou (B.2.3).
2. 4.1.2 Suspenze se pomocí vody převede do odměrné baňky na 100 ml, doplní se po rysku vodou a promíchá se. Tato suspenze se použije pro analýzu papírovou chromatografií popsanou v oddíle 5 a pro kvalitativní stanovení barya vysrážením síranu.

1. 4.2.1 2 g prostředku se rozptýlí ve 100 ml vody a přefiltruje se.
2. 4.2.2 K vysušenému zbytku se přidá množství uhličitanu sodného odpovídající sedmi až desetinásobku hmotnosti zbytku (B.2.7), promíchá se a směs se půl hodiny taví v platinovém kelímku (B.3.2).
3. 4.2.3 Ochladí se na laboratorní teplotu, tavenina se rozpustí v 50 ml vody a přefiltruje se (B.3.5).
4. 4.2.4 Zbytek z taveniny se rozpustí v kyselině chlorovodíkové (B.2.3) a doplní se vodou na 100 ml. Tento roztok se použije pro analýzu papírovou chromatografií popsanou v oddíle 5 a pro kvalitativní stanovení barya vysrážením síranu.

Tato metoda je vhodná pro kvalitativní a semikvantitativní stanovení následujících látek v barvách na vlasy ve formě krému nebo kapaliny:

Oxidační barviva se extrahují z barev ve formě krému nebo kapaliny při pH 10 96% ethanolem a identifikují se jedno- nebo dvourozměrnou chromatografií na tenké vrstvě.

K semikvantitativnímu stanovení těchto látek se chromatogram vzorků porovná pomocí čtyř vyvíjecích systémů s chromatogramy referenčních látek vyvíjenými současně a za co nejpodobnějších podmínek.

Všechny použité chemikálie musí být čistoty p.a. nebo vyšší

1. 3.1 Ethanol, bezvodý
2. 3.2 Aceton
3. 3.3 Ethanol, 96 % (V/V)
4. 3.4 Roztok amoniaku, 25 %
5. 3.5 L-(+)-askorbová kyselina
6. 3.6 Chloroform
7. 3.7 Cyklohexan
8. 3.8 Dusík, technický
9. 3.9 Toluen
10. 3.10 Benzen
11. 3.11 Butan-1-ol
12. 3.12 Butan-2-ol
13. 3.13 Kyselina fosforná, 50% roztok (V/V)
14. 3.14 Diazotační činidlo. Buď:
    1. — 3-nitro-1-benzendiazonium-chlorbenzensulfonát (ve formě stabilní soli), jako např. v červeni 2 JN - Francolor,
    2. — 2-chlor-4-nitro-1-benzendiazonium-naftalenbenzoát (ve formě stabilní soli), jako např. v činidle NNCD - referenční č. 74 150 FLUKA,

       nebo ekvivalentní.

1. 3.15 Dusičnan stříbrný
2. 3.16 p-dimethylaminobenzaldehyd
3. 3.17 2,5-dimethylfenol
4. 3.18 Chlorid železitý, hexahydrát
5. 3.19 Kyselina chlorovodíková, 10% roztok (m/V)
6. 3.20 Standardy

   Standardy jsou sloučeniny uvedené v oddíle 1 „Rozsah a oblast použití“. V případě aminosloučenin musí být standardní sloučenina buď ve formě hydrochloridu (mono nebo di), nebo jako volná báze.

1. 3.21 Standardní roztoky 0,5 % (m/V)

   Připraví se 0,5% roztoky (m/V) standardů uvedených v bodě 3.20.

   Naváží se 50 ± 1 mg standardu do odměrné baňky na 10 ml.

   Přidá se 5 ml 96% ethanolu (3.3) a 250 ml kyseliny askorbové (3.5).

   Roztok se alkalizuje přidáním roztoku amoniaku (3.4) na hodnotu pH 10 (zjišťuje se indikátorovým papírkem).

   Doplní se na 10 ml 96 % ethanolem (3.3) a promíchá.

   Roztoky je možno uchovávat po dobu jednoho týdne v chladu a temnu.

   V některých případech může po přidání askorbové kyseliny a roztoku amoniaku vzniknout sraženina. Před dalším postupem je třeba ji nechat usadit.

1. 3.22 mobilní fáze
   1. 3.22.1 Aceton ‒ chloroform ‒ toluen (35:25:40, V/V/V)
   2. 3.22.2 Chloroform ‒ cyklohexan ‒ ethanol ‒ 25% roztok amoniaku (80:10:10:1, V/V/V/V)
   3. 3.22.3 Benzen ‒ butan-2-ol ‒ voda (50:25:25, V/V/V). Důkladně se protřepe a po dekantaci při pokojové teplotě (20 až 25 °C) se k vyvíjení použije horní fáze.
   4. 3.22.4 n-butanol ‒ chloroform ‒ činidlo M (7:70:23, V/V/V). Fáze se pečlivě dekantují při pokojové teplotě (20 až 25 °C) a použije se spodní fáze.

      Příprava činidla M

      Roztok amoniaku, 25 % (V/V)	24 objemových jednotek
      Kyselina fosforná, 50 % (3.13)	1 objemová jednotka
      Voda	75 objemových jednotek

   5. Poznámka:

      Mobilní fáze obsahující amoniak je třeba bezprostředně před použitím dobře protřepat.

1. 3.23 Detekční činidla
   1. 3.23.1 Diazotační činidlo

      Připraví se 5% (m/V) vodný roztok zvoleného činidla (3.14). Tento roztok se musí připravit bezprostředně před použitím.

   1. 3.23.2 Ehrlichovo činidlo

      2 g p-dimethylaminobenzaldehydu (3.16) se rozpustí ve 100 ml 10% vodného roztoku kyseliny chlorovodíkové (m/V) (3.19).

   1. 3.23.3 2,5-dimethylfenol – hexahydrát chloridu železitého

      Roztok 1: Rozpustí se 1 g dimethylfenolu (3.17) ve 100 ml 96% ethanolu (3.3).

      Roztok 2: Rozpustí se 4 g hexahydrátu chloridu železitého (3.18) ve 100 ml 96% ethanolu (3.3).

      Při vyvolání chromatogramu se těmito roztoky provádí postřik samostatně, nejprve roztokem 1, poté roztokem 2.

   1. 3.23.4 Amoniakální dusičnan stříbrný

      25% amoniak (3.4) se přidává k 5% (m/V) vodnému roztoku dusičnanu stříbrného (3.15), až se sraženina právě rozpustí. Toto reakční činidlo se připravuje bezprostředně před použitím. Nelze jej uchovávat.

1. 4.1 Obvyklé laboratorní vybavení pro chromatografii na tenké vrstvě.
   1. 4.1.1 Plastový nebo skleněný kryt konstruovaný tak, aby chromatografickou desku během nanášení skvrn a sušení mohl obtékat dusík. Toto opatření je nezbytné vzhledem k náchylnosti určitých barviv k oxidaci.
   2. 4.1.2 Mikrostříkačka na 10 μl, dělená po 0,2 μl, s jehlou s rovným koncem, nebo lépe dávkovač na 50 μl uchycený v držáku tak, aby deska mohla být udržována pod atmosférou dusíku.
   3. 4.1.3 Hotové silikagelové desky, tloušťka 0,25 mm, rozměry 20 x 20 cm (Macherey and Nagel, Silica G-HR, na plastové podložce, nebo ekvivalentní).

1. 4.2 Odstředivka, 4000 ot./min.
2. 4.3 Centrifugační zkumavky na 10 ml se šroubovacími uzávěry potaženými PTFE nebo ekvivalentní.

1. 5.1 Příprava vzorků k analýze

   První 2 až 3 cm krému vytlačeného z tuby se odstraní.

   Do centrifugační zkumavky (4.3) předem propláchnuté dusíkem se převede: 300 mg kyseliny askorbové se 3 g krému nebo 3 g homogenizované kapaliny.

   Přidává se po kapkách 25 % amoniak (3.4) až pH dosáhne hodnoty 10. Doplní se na 10 ml 96 % ethanolem (3.3).

   Homogenizuje se pod atmosférou dusíku (3.8), zazátkuje se a centrifuguje se po 10 minut při 4000 ot./min.

   Použije se supernatant.

1. 5.2 Chromatografie
   1. 5.2.1 Nanášení na desku

      Pod atmosférou dusíku (3.8) se na chromatografickou desku (4.1.3) nanese po 1 μl každé shora uvedené referenční látky v devíti bodech vzdálených od sebe 1,5 cm podél linie vzdálené asi 1,5 cm od okraje desky.

      Referenční látky se nanášejí v tomto uspořádání:

      1	2	3	4	5	6	7	8	9
      R	P	H	PPD	DAP	PTD	OPD	OTD	MPD
      MTD	α-N

      Dále se v bodech 10 a 11 nanesou vždy 2 μl zkoumaných roztoků získaných podle bodu 5.1.

      Deska se uchovává pod atmosférou dusíku (3.8) až do okamžiku, kdy je zahájeno vyvíjení chromatogramu.

   1. 5.2.2 Vyvíjení

      Deska se vloží do komory předem propláchnuté dusíkem (3.8) a nasycené jedním ze čtyř rozpouštědel (3.22) a nechá se vyvíjet při laboratorní teplotě (20 až 25 °C) ve tmě, dokud čelo rozpouštědla nedosáhne vzdálenosti asi 15 cm od startovací linie.

      Deska se vyjme a usuší pod atmosférou dusíku (3.8) při laboratorní teplotě.

   1. 5.2.3 Vyvolání

      Deska se postříká odpovídajícím detekčním činidlem uvedeným v bodě 3.23.

   1. 5.2.4 Kvalitativní stanovení

      Porovnají se hodnoty R_f a barvy skvrn vzorku a chromatografovaných referenčních látek.

      V tabulce 1 jsou uvedeny příklady hodnot R_f a barev skvrn pro jednotlivé látky v závislosti na použitém rozpouštědle a indikátoru.

      Nejistý důkaz je někdy možno potvrdit metodou standardního přípravku.

   1. 5.2.5 Semikvantitativní odhad

      Intenzita skvrn jednotlivých látek identifikovaných v bodě 5.2.4 se porovnává vizuálně s odpovídajícím rozsahem koncentrací standardních látek.

      Při nadměrně vysoké koncentraci jedné nebo více látek nalezených ve vzorku se extrakt vzorku zředí a měření se opakuje.

TABULKA 1

Hodnoty R_f a barvy získané bezprostředně po vyvolání

Tato metoda dvourozměrné chromatografie vyžaduje použití dalších standardů a reakčních činidel.

1. 6.1 Další standardy a činidla
   1. 6.1.1 β-naftol (β-N)
   2. 6.1.2 2-aminofenol (OAP)
   3. 6.1.3 3-aminofenol (MAP)
   4. 6.1.4 4-aminofenol (PAP)
   5. 6.1.5 2-nitro-1,4-fenylendiamin (2-NPPD)
   6. 6.1.6 4-nitro-1,2-fenylendiamin (4-NOPD)

      Připraví se 0,5 % (m/V) roztoky všech dalších standardů způsobem popsaným v bodě 3.21.

1. 6.2 Další mobilní fáze
   1. 6.2.1 Ethylacetát – cyklohexan – 25 % roztok amoniaku (65:30:0,5, V/V/V)

1. 6.3 Další detekční systém

   Do vyvíjecí komory pro chromatografii na tenké vrstvě se vloží skleněná nádobka, přidají se asi 2 g krystalického jodu a komora se uzavře odpovídajícím víkem.

1. 6.4 Chromatografie
   1. 6.4.1 Podle obrázku 6 se na desce pro chromatografii na tenké vrstvě (4.1.3) vyznačí na straně s adsorbentem dvě linky.
   2. 6.4.2 V dusíkové atmosféře (4.1.1) se nanese 1 až 4 μl extraktu (5.1) do základního bodu 1 (obr. 6), který leží asi 2 cm od obou okrajů. Množství extraktu závisí na intenzitě skvrn na chromatogramech podle bodu 5.2.
   3. 6.4.3 Mezi body 2 a 3 (obr. 6) se nanesou oxidační barviva identifikovaná nebo pokládaná za identifikovaná podle bodu 5.2 (vzdálenost mezi body je 1,5 cm). Nanáší se 2 μl každého referenčního roztoku – kromě DAP, který je nutno nanést v objemu 6 μl. Nanášení se provádí v atmosféře dusíku (6.4.2).
   4. 6.4.4 Postup podle bodu 6.4.3 se opakuje v základních bodech 4 a 5 (obr. 6) a deska se uchovává pod dusíkem až do zahájení vyvolávání chromatogramu (vzdálenost mezi body je 1,5 cm).
   5. 6.4.5 Chromatografická komora se propláchne dusíkem (3.8) a umístí se do ní vhodné množství mobilní fáze 3.22.2. Deska (6.4.4) se vloží do komory a vyvíjí se ve tmě v prvním vyvíjecím směru (obr. 6).

      Vyvíjí se, dokud čelo rozpouštědla nedosáhne linie vyznačené na desce (přibližně 13 cm).

   1. 6.4.6 Deska se z komory vyjme a umístí do jiného chromatografické komory, předem propláchnuté dusíkem, aby se vyvíjecí rozpouštědlo odpařovalo alespoň 60 minut.
   2. 6.4.7 Pomocí dělené zkumavky se do komory předem propláchnuté dusíkem (3.8) vnese vhodné množství mobilní fáze (6.2), do komory se vloží deska otočená o 90° (6.4.6) a chromatogram se vyvíjí ve druhém směru (opět ve tmě), dokud čelo rozpouštědla nedosáhne linie vyznačené na straně s adsorbentem. Deska se vyjme z komory a rozpouštědlo se nechá odpařit na vzduchu.
   3. 6.4.8 Deska se na 10 minut umístí do chromatografické komory obsahující páry jodu (6.3) a dvourozměrný chromatogram se interpretuje s využitím hodnot R_f a barev současně chromatografovaných standardů (hodnoty R_f a barvy skvrn jsou uvedeny v tabulce II).
   4. Poznámka

      Nejlepšího vybarvení skvrn se dosáhne tehdy, ponechá-li se po vyvíjení chromatogram v atmosféře par jódu po dobu půl hodiny.

   1. 6.4.9 Přítomnost oxidačních barviv nalezených podle bodu 6.4.8 je možno definitivně potvrdit opakováním postupu popsaného v bodech 6.4.1 až 6.4.8, kdy se v základním bodě 1 přes množství extraktu podle bodu 6.4.2 nanese 1 μl referenčních látek identifikovaných v bodu 6.4.8. Neobjeví-li se oproti chromatogramu získaného podle bodu 6.4.8 žádná jiná skvrna, je interpretace chromatogramu podle bodu 6.4.8 správná.

Tabulka II

Barvy skvrn standardů po chromatografii a vyvíjení parami jodu

Obrázek 6

V této metodě je specifikováno kvantitativní stanovení resorcinolu v šamponech a vlasových vodách plynovou chromatografií. Metoda je vhodná pro koncentrace od 0,1 až do 2,0 hmotnostních procent vzorku.

Obsah resorcinolu stanovený ve vzorku touto metodou se vyjadřuje v hmotnostních procentech.

Resorcinol a 3,5-dihydroxytoluen (5-methylresorcinol), přidávaný jako vnitřní standard, se ze vzorku oddělí chromatografií na tenké vrstvě. Obě sloučeniny se izolují seškrabáním jejich skvrn z horní vrstvy desky a extrakcí methanolem. Nakonec se vyextrahované sloučeniny vysuší, podrobí silylaci a stanoví se plynovou chromatografií.

Všechny použité chemikálie musí být čistoty p.a. nebo vyšší

1. 4.1 Kyselina chlorovodíková, 25% (m/m)
2. 4.2 Methanol
3. 4.3 Ethanol, 96 % (V/V)
4. 4.4 Hotové silikagelové TLC desky (plastové nebo hliníkové) s fluorescenčním indikátorem. Desky se deaktivují následujícím postupem: silikagelová deska se nastříká vodou, dokud se povrch neleskne. Nastříkané desky se nechají schnout při laboratorní teplotě jednu až tři hodiny.
5. Poznámka

   Bez deaktivace může docházet ke ztrátám resorcinolu v důsledku ireverzibilní adsorpce na silikagelu.

1. 4.5 Vyvíjecí rozpouštědlo: aceton – chloroform – kyselina octová (20:75:5, V/V/V).
2. 4.6 Standardní roztok resorcinolu: rozpustí se 400 mg resorcinolu ve 100 ml 96% ethanolu (4.3) (1 ml odpovídá 4000 μg resorcinolu).
3. 4.7 Roztok vnitřního standardu: rozpustí se 400 mg 3,5-dihydroxytoluenu (DHT) ve 100 ml 96% ethanolu (4.3) (1 ml odpovídá 4000 μg DHT).
4. 4.8 Směs standardů: v odměrné baňce na 100 ml se smíchá 10 ml roztoku 4.6 a 10 ml roztoku 4.7, doplní se po rysku 96% ethanolem (4.3) a promíchá (1 ml roztoku odpovídá 400 μg resorcinolu a 400 μg DHT).
5. 4.9 Silylační činidla:
   1. 4.9.1 N,O-bis(trimethylsilyl)trifluoracetamid (BSTFA)
   2. 4.9.2 Hexamethyldisilazan (HMDS)
   3. 4.9.3 Chlortrimethylsilan (TMCS)

1. 5.1 Obvyklé vybavení pro chromatografii na tenké vrstvě a plynovou chromatografii
2. 5.2 Skleněné laboratorní nádobí

1. 6.1 Příprava vzorku
   1. 6.1.1 Do kádinky na 150 ml se přesně naváží zkušební vzorek (m gramů) prostředku, který obsahuje asi 20 až 50 mg resorcinolu.
   2. 6.1.2 Okyselí se kyselinou chlorovodíkovou (4.1) do kyselé reakce (je potřeba přibližně 2 až 4 ml), přidá se 10 ml (40 mg DHT) roztoku vnitřního standardu (4.7) a promíchá se. Ethanolem (4.3) se převede do odměrné baňky na 100 ml, doplní se ethanolem po rysku a promíchá.
   3. 6.1.3 250 μl roztoku (6.1.2) se nanese na deaktivovanou desku se silikagelem (4.4) jako nepřerušovaná linie o délce přibližně 8 cm. Je třeba dbát na to, aby linie byla co nejužší.
   4. 6.1.4 Na stejnou desku se stejným způsobem (6.1.3) nanese 250 μl směsi standardů (4.8).
   5. 6.1.5 Do dvou bodů startovací linie se nanese po 5 μl roztoků 4.6 a 4.7 k usnadnění lokalizace skvrn po vyvolání.
   6. 6.1.6 Deska se vyvíjí v nenasycené komoře naplněné vyvíjecím rozpouštědlem (4.5), dokud čelo rozpouštědla nedosáhne vzdálenosti 12 cm od startovací linie; obvykle to trvá asi 45 minut. Deska se usuší na vzduchu a zóna resorcinolu/DHT se lokalizuje pod krátkovlnným UV světlem (254 nm). Obě tyto sloučeniny mají přibližně stejnou hodnotu R_f. Poloha pásů se vyznačí tužkou ve vzdálenosti 2 mm od vnějšího tmavého rozhraní pásů. Tyto zóny se z desky odstraní a adsorbenty každého pásu se shromáždí v lahvi na 10 ml.
   7. 6.1.7 Adsorbent obsahující vzorek a adsorbent obsahující směs standardů se extrahují následujícím způsobem:

      Přidají se 2 ml methanolu (4.2) a extrahuje se jednu hodinu za neustálého míchání. Směs se zfiltruje a extrakce se opakuje po dobu dalších 15 minut se 2 ml methanolu.

   1. 6.1.8 Extrakty se spojí a rozpouštědlo se nechá přes noc odpařit ve vakuovém exsikátoru naplněném vhodným sušicím prostředkem. Nezahřívat.
   2. 6.1.9 Odparky (6.1.8) se silylují způsobem popsaným v bodě 6.1.9.1 nebo 6.1.9.2.
      1. 6.1.9.1 Mikrostříkačkou se přidá 200 μl BSTFA (4.9.1) a směs se nechá v uzavřené nádobě 12 hodin při pokojové teplotě.
      2. 6.1.9.2 Mikrostříkačkou se postupně přidá 200 μl HMDS (4.9.2) a 100 μl TMCS (4.9.3), směs se zahřívá v uzavřené nádobě 30 minut na 60 °C. Směs se ochladí.

1. 6.2 Plynová chromatografie
   1. 6.2.1 Chromatografické podmínky

      Kolona musí poskytovat rozlišení R rovné nebo lepší než 1,5, kde:

      1. kde:

         TABULKA 1 Hodnoty Rf a barvy získané bezprostředně po vyvolání Tabulka II Barvy skvrn standardů po chromatografii a vyvíjení parami jodu Obrázek 6

         r1 a r2	= retenční časy dvou píků v min.,
         w1 a w2	= šířky píků v polovině výšky píků v mm,
         d'	= rychlost posuvu papíru v mm/min.

      Následující kolona a podmínky pro plynovou chromatografii se ukázaly jako vhodné:

      1. Materiál kolony: nerezová ocel
      2. Délka 200 cm
      3. Vnitřní průměr: ≈3 mm
      4. Náplň: 10% OV-17 na Chromosorbu WAW, 100 až 120 mesh
      5. Plamenový ionizační detektor
      6. Teplotní režim:
      7. Kolona: 185 °C (izotermální)
      8. Detektor: 250 °C
      9. Nástřik: 250 °C
      10. Nosný plyn: dusík
      11. Průtok: 45 ml/min

      Průtoky vodíku a vzduchu se nastaví podle pokynů výrobce.

   1. 6.2.2 Do plynového chromatografu se nastříkne 1 až 3 μl roztoků připravených podle bodu 6.1.9. Pro každý roztok (6.1.9) se provede pět nástřiků, změří se plochy píků, vypočte se průměr a poměr ploch píků: S = plocha píku resorcinolu/plocha píku DHT.

Koncentrace resorcinolu ve vzorku, vyjádřená v hmotnostních procentech (% m/m), je dána vztahem:

Pro výrobky obsahující asi 0,5 % (m/m) resorcinolu nesmí rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení na stejném vzorku překročit absolutní hodnotu 0,025 %.

V metodě je popsána analýza methanolu ve všech typech kosmetických prostředků (včetně aerosolů) plynovou chromatografií.

Metodou je možno stanovit relativní hladiny od 0 do 10 %.

Obsah methanolu, stanovený podle této metody, se vyjadřuje v hmotnostních procentech methanolu vzhledem k ethanolu nebo propan-2-olu.

Stanovení se provádí plynovou chromatografií.

Všechny použité chemikálie musí být čistoty p.a. nebo vyšší

1. 4.1 Methanol
2. 4.2 Absolutní ethanol
3. 4.3 Propan-2-ol
4. 4.4 Chloroform zbavený alkoholů promytím vodou

1. 5.1 Plynový chromatograf:
   1. s tepelně vodivostním detektorem (katarometr) pro aerosolové vzorky,
   2. s plamenovým ionizačním detektorem pro jiné než aerosolové vzorky.

1. 5.2 Odměrné baňky na 100 ml
2. 5.3 Pipety na 2 ml, 20 ml a 0 až 1 ml
3. 5.4 Mikrostříkačky na 0 až 100 μl a 0 až 5 μl

   a (pouze pro aerosolové vzorky) speciální plynotěsná injekční stříkačka s posuvným ventilem (viz obrázek 5, kapitola „Příprava vzorků v laboratoři“).

1. 6.1 Příprava vzorku
   1. 6.1.1 Vzorky z prostředků v obalech na aerosoly se odebírají postupem podle kapitoly „Příprava vzorků v laboratoři“ a poté se analyzují plynovou chromatografií za podmínek popsaných v bodě 6.2.1.
   2. 6.1.2 Vzorky jiných než aerosolových prostředků, odebíraných postupem podle výše uvedené kapitoly „Příprava vzorků v laboratoři“, se zředí vodou na koncentraci 1 až 2 % ethanolu či propan-2-olu a poté se analyzují plynovou chromatografií za podmínek popsaných v bodě 6.2.2.

1. 6.2 Plynová chromatografie
   1. 6.2.1 Pro aerosolové vzorky se použije tepelně vodivostní detektor (katarometr).
      1. 6.2.1.1 Náplní kolony je 10 % Hallcomid M18 na Chromosorbu WAW, 100 až 200 mesh.
      2. 6.2.1.2 Kolona musí poskytovat rozlišení R rovné nebo lepší než 1,5, kde:
         1. kde:

            TABULKA 1 Hodnoty Rf a barvy získané bezprostředně po vyvolání Tabulka II Barvy skvrn standardů po chromatografii a vyvíjení parami jodu Obrázek 6

            r1 a r2	= retenční časy dvou píků v min.,
            w1 a w2	= šířky píků v polovině výšky píků v mm,
            d'	= rychlost posuvu papíru v mm/min.

      1. 6.2.1.3 Tohoto rozlišení je možno dosáhnout za následujících podmínek:

         TABULKA 1 Hodnoty Rf a barvy získané bezprostředně po vyvolání Tabulka II Barvy skvrn standardů po chromatografii a vyvíjení parami jodu Obrázek 6

         Materiál kolony:	nerezová ocel
         Délka:	3,5 metru
         Průměr:	3 mm
         Proud můstkem katarometru:	150 mA
         Nosný plyn:	helium
         Tlak:	2,5 bar
         Průtok:	45 ml/min
         Teplotní režim:
         Nástřik:	150 °C
         Detektor:	150 °C
         Kolona:	65 °C

         Měření plochy píků je možno vylepšit elektronickou integrací.

   1. 6.2.2 Jiné než aerosolové vzorky:
      1. 6.2.2.1 Náplní kolony je Chromosorb 105 nebo Porapak QS; použije se plamenový ionizační detektor.
      2. 6.2.2.2 Kolona musí dávat rozlišení R rovné nebo lepší než 1,5, kde:

         TABULKA 1 Hodnoty Rf a barvy získané bezprostředně po vyvolání Tabulka II Barvy skvrn standardů po chromatografii a vyvíjení parami jodu Obrázek 6

         r1 a r2	= retenční časy dvou píků v min.
         w1 a w2	= šířky píků v polovině výšky píků v mm,
         d'	= rychlost posuvu záznamu v mm/min.

      1. 6.2.2.3 Tohoto rozlišení je možno dosáhnout za následujících podmínek:

         TABULKA 1 Hodnoty Rf a barvy získané bezprostředně po vyvolání Tabulka II Barvy skvrn standardů po chromatografii a vyvíjení parami jodu Obrázek 6

         Materiál kolony:	nerezová ocel
         Délka:	2 metry
         Průměr:	3 mm
         Citlivost elektrometru:	8×10-10 A
         Plyny:
         Nosný plyn:	dusík
         Tlak:	2,1 bar
         Průtok:	40 ml/min
         Pomocný plyn:	vodík
         Tlak:	1,5 bar
         Průtok:	20 ml/min
         Teplotní režim:
         Nástřik:	150 °C
         Detektor:	230 °C
         Kolona:	120 až 130 °C

1. 7.1 Pro plynovou chromatografii podle bodu 6.2.1 (náplň kolony Hallcomid M18) se použijí následující standardní směsi. Tyto směsi se připraví odměřením pomocí pipet, ale přesné množství se stanoví zvážením pipety nebo baňky po každém přidání.

   TABULKA 1 Hodnoty Rf a barvy získané bezprostředně po vyvolání Tabulka II Barvy skvrn standardů po chromatografii a vyvíjení parami jodu Obrázek 6

   Relativní koncentrace (% m/m):	Methanol (ml)	Ethanol nebo propan-2-ol (ml)	Doplněno chloroformem na objem
   Přibližně 2,5 %	0,5	20	100 (ml)
   Přibližně 5,0 %	1,0	20	100 (ml)
   Přibližně 7,5 %	1,5	20	100 (ml)
   Přibližně 10,0 %	2,0	20	100 (ml)

   Do chromatografu se nastřikují 2 až 3 μl za podmínek uvedených v bodě 6.2.1.

   Pro každou směs se vypočtou poměry ploch píků (methanol/ethanol) nebo (methanol/propan-2-ol). Sestrojí se kalibrační graf vynesením

   1. na osu x: množství methanolu vzhledem k ethanolu nebo propan-2-olu v %
   2. na osu y: poměr ploch píků (methanol/ethanol) nebo (methanol/ propan-2-ol).