Český lékopis 1997

Výrobní postup zahrnuje stupeň nebo stupně, které prokazatelně odstraňují nebo inaktivují známá infekční agens; jsou-li k inaktivaci virů použity nějaké látky, ověří se, že jejich rezidua přítomná v konečném výrobku nemají žádné nežádoucí účinky na nemocné léčené imunoglobulinem.

U přípravku se prokáže vhodnými zkouškami na zvířatech a klinicky se ověří, že přípravek je dobře snášen po intramuskulámím podání.

Připravuje se ze směsi od nejméně 1000 dárců metodou, u které je prokázáno, že vede k výrobě přípravku, který:

- nepřenáší infekci,

- při koncentraci bílkoviny 160 g/l obsahuje protilátky, z nichž alespoň pro dvě (jednu virovou a jednu bakteriální) je dosažitelný mezinárodní standard nebo referenční přípravek, a koncentrace těchto protilátek je alespoň 10x vyšší oproti výchozímu směsnému materiálu.

Normální lidský imunoglobulin se připravuje jako stabilizovaný roztok např. v roztoku chloridu sodného (9 g/l), v roztoku glycinu (22,5 g/l), nebo jedná-li se o přípravek k lyofilizaci, v roztoku glycinu (60 g/l). Vícedávkové přípravky obsahují protimikrobní konzervační látky, jednodávkové přípravky je neobsahují. Jak u protimikrobních látek, tak stabilizátorů se prokáže, že v množství, ve kterém jsou přítomny, nemají škodlivý vliv na hotový přípravek. Roztok se filtruje přes bakteriální filtry.

Stabilita přípravku se dokládá vhodnými zkouškami prováděnými během vývojové studie.

Vlastnosti

Tekutý přípravek je čirý, světle žlutý nebo světle hnědý, při uchovávání se může vytvořit slabý zákal nebo malé množství jemných částic. Lyofilizovaný přípravek je bílý nebo světle žlutý prášek nebo tuhá drobivá hmota.

Lyofilizovaný přípravek se rozpouští podle návodu uvedeného v označení bezprostředně před provedením zkoušek totožnosti a zkoušek na čistotu, kromě zkoušky Rozpustnost a Voda, semimikrostanovení.

Zkoušky totožnosti

1. A. U zkoušeného přípravku se provedou precipitační zkoušky s druhově specifickými antiséry. Doporučuje se provést zkoušky se specifickými séry proti plazmatickým bílkovinám všech druhů domácích zvířat v příslušné zemi obvykle používaných k přípravě látek biologického původu. Přípravek obsahuje lidské bílkoviny a dává negativní reakci se specifickými séry proti plazmatickým bílkovinám jiných druhů.
2. B. Provádí se vhodnou elektroforetickou technikou. Použije se sérum proti normálnímu lidskému séru a porovná se normální lidské sérum a zkoušený přípravek, obojí zředěno tak, aby 1 l obsahoval 10 g bílkovin. Hlavní složka zkoušeného přípravku odpovídá IgG složce normálního lidského séra. Roztok může vykazovat malá množství jiných plazmatických bílkovin.

Zkoušky na čistotu

Rozpustnost. Lyofilizovaný přípravek se rozpustí předepsaným způsobem. Přípavek se do 20 min při teplotě 20 °C až 25 °C úplně rozpustí.

Hodnota pH (2.2.3). 6,4 až 7,2; zkoušený přípravek se zředí roztokem chloridu sodného R (9 g/l) na roztok obsahující v litru 10 g bílkovin.

Celkové bílkoviny. Přípravek obsahuje 100 g až 180 g bílkovin v litru a 90 % až 110 % deklarovaného množství bílkovin. Zkoušený přípravek se zředí roztokem chloridu sodného R (9 g/l) tak, aby se získal roztok obsahující ve 2 ml asi 15 mg bílkovin. Ke 2,0 ml tohoto roztoku v centrifugační zkumavce s kulatým dnem se přidají 2 ml roztoku molybdenanu sodného R (75 g/l) a 2 ml směsi, která obsahuje 1 objemový díl kyseliny sírové bez dusíku R a 30 objemových dílů vody R. Protřepe se, 5 min se odstřeďuje, supernatantní tekutina se sleje a převrácená zkumavka se nechá odkapat na filtrační papír. Ve zbytku se stanoví dusík mineralizací s kyselinou sírovou (2.5.9) a obsah bílkovin se vypočítá vynásobením výsledku faktorem 6,25.

Složení bílkovin. Stanoví se zónovou elektroforézou (2.2.31) za použití proužků vhodného celulosoacetatového gelu jako nosiče a tlumivého roztoku barbitalového o pH 8,6 (1) jako elektrolytu.

Zkoušený roztok. Zkoušený přípravek se zředí roztokem chloridu sodného R (9 g/l) tak, aby koncentrace bílkovin byla 50 g/l.

Porovnávací roztok. Lidský imunoglobulin pro elektroforézu BRP se rozpustí v roztoku chloridu sodného R (9 g/l) tak, aby koncentrace bílkovin byla 50 g/l.

Na proužek se nanese 2,5 μl zkoušeného roztoku jako pruh 10 mm nebo se nanese 0,25 μl na milimetr, jsou-li použity užší proužky. Stejným způsobem se na jiný proužek nanese porovnávací roztok. Nechá se působit takové elektrické pole, aby se pruh albuminu normálního lidského séra, nanesený na kontrolní proužek, posunul alespoň o 30 mm. Proužek se 5 min barví černí amido 10B RS. Odbarvení se provede směsí 10 objemových dílů kyseliny octové ledové R a 90 objemových dílů methanolu R tak, aby došlo k odbarvení pozadí. Transparence pruhů se vyvolá směsí objemových dílů kyseliny octové ledové R a methanolu R (19 + 81). Změří se absorbance pruhů při 600 nm na přístroji, který dává lineární odpověď v rozsahu celého měření. Stanoví se výsledek jako průměr ze tří měření z každého proužku. Na elektroforeogramu zkoušeného roztoku má nejvýše 10 % bílkovin mobilitu odlišnou od hlavního pásu. Zkoušku lze hodnotit pouze v případě, jestliže na elektroforeogramu porovnávacího roztoku je podíl bílkovin hlavního pásu v mezích uvedených v příbalovém letáku referenčního přípravku.

Rozdělení podle molekulární velikosti. Stanoví se kapalinovou chromatografií (2.2.29)

Zkoušený roztok. Zkoušený přípravek se rozpustí v roztoku chloridu sodného R (9 g/l) na koncentraci vhodnou pro použitý chromatografický systém. Zpravidla je tato koncentrace v rozmezí 4 g/l až 12 g/l a vstřikuje se 50 μg až 600 μg bílkovin.

Porovnávací roztok. Lidský imunoglobulin BRP se zředí roztokem chloridu sodného R (9 g/l) na stejnou koncentraci bílkovin jako u zkoušeného roztoku.

Chromatografický postup se obvykle provede za použití:

- kolony délky 0,6 m a vnitřního průměru 7,5 mm naplněné silikagelem hydrofilním pro chromatografii R,

- mobilní fáze s průtokovou rychlostí 0,5 ml/min, kterou je roztok obsahující v litru: 4,873 g hydrogenfosforečnanu sodného dihydrátu R, 1,741 g dihydrogenfosforečnanu sodného monohydrátu R, 11,688 g chloridu sodného R a 50 mg azidu sodného R,

- spektrofotometrického detektoru, 280 nm.

Na chromatogramu porovnávacího roztoku odpovídá hlavní pík monomeru IgG a pík odpovídající dimeru má relativní retenční čas asi 0,85, vztaženo k monomeru. Píky na chromatogramu zkoušeného roztoku se porovnají s chromatogramem porovnávacího roztoku. Každý pík s retenčním časem kratším, než je retenční čas dimeru, odpovídá polymerům a agregátům.

Zkoušený přípravek vyhovuje, jestliže relativní retenční čas píků monomeru a dimeru se shoduj e s odpovídajícími píky na chromatogramu porovnávacího roztoku a je 1 ± 0,02; součet ploch píků odpovídajících monomeru a dimeru je nejméně 85 % celkové plochy píků a plocha píků odpovídajících polymerům a agregátům je nejvýše 10 % celkové plochy píků.

Voda, semimikrostanovení (2.5.12). Nejvýše 3,0 %; zkouší se u lyofilizovaných přípravků s 0,500 g zkoušené látky.

Sterilita (2.6.1). Vyhovuje zkoušce na sterilitu.

Pyrogenní látky (2.6.8). Vyhovuje zkoušce na pyrogenní látky. Na 1 kg hmotnosti králíka se vstříkne nitrožilně 1 ml zkoušeného přípravku.

Protilátky proti povrchovému antigenu hepatitidy B. Nejméně 0,5 m.j. na gram imunoglobulinu, stanoví se vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1).

Normální lidský imunoglobulin určený k profylaxi hepatitidy A vyhovuje následující doplňující zkoušce:

Protilátky proti viru hepatitidy A. Stanoví se srovnáním s porovnávacím přípravkem kalibrovaným v mezinárodních jednotkách za použití imunoanalýzy vhodné citlivosti a specifity (2.7.1).

Mezinárodní jednotka je účinnost obsažená v deklarovaném množství mezinárodního referenčního přípravku imunoglobulinu proti hepatitidě A. Hodnotu účinnosti mezinárodního referenčního přípravku v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Světová zdravotnická organizace.

Deklarovaná účinnost je nejméně 100 m.j. v mililitru. Stanovená účinnost není nižší než deklarovaná účinnost. Interval spolehlivosti (P = 0,95) stanovené účinnosti je nejméně 80 % a nejvýše 125 %.

Uchovávání

Tekutý přípravek se uchovává v bezbarvých skleněných obalech chráněn před světlem. Lyofilizovaný přípravek se uchovává v bezbarvých skleněných obalech ve vakuu nebo v atmosféře inertního plynu, chráněn před světlem.

Označování

V označení obalu se uvede:

1. - u tekutého přípravku jeho objem v obalu a obsah bílkovin vyjádřený v gramech na litr,
2. - u lyofilizovaného přípravku množství bílkovin v obalu,
3. - způsob podání,
4. - podmínky uchovávání,
5. - doba použitelnosti,
6. - u lyofilizovaného přípravku název nebo složení a objem tekutiny k rekonstituci, jež se má přidat,
7. - kde je to vhodné, že přípravek je vhodný k profylaxi infekce hepatitidy A,
8. - kde je to vhodné, účinnost proti hepatitidě A v mezinárodních jednotkách v mililitru,
9. - kde je to vhodné, název a množství protimikrobní konzervační látky v přípravku.

Immunoglobulinum humanum normale ad usum intravenosum

Normální lidský imunoglobulin pro nitrožilní podání

Je to tekutý nebo lyofilizovaný přípravek obsahující imunoglobuliny, zvláště imunoglobulin G (IgG). Přítomny mohou být i jiné bílkoviny. Obsahuje IgG-protilátky normálních dárců krve. Tento článek se nevztahuje na záměrně připravené přípravky obsahující fragmenty nebo chemicky pozměněný IgG.

Získává se z plazmy, která vyhovuje požadavkům článku Plasma humanum ad separationem. K použité plazmě se nepřidávají žádná antibiotika.

Výroba

Výrobní postup zahrnuje stupeň nebo stupně, které prokazatelně odstraňují nebo inaktivuj í známá infekční agens; jsou-li k inaktivaci virů použity nějaké látky, musí být ověřeno, že jejich rezidua přítomná v konečném výrobku nemají žádný nežádoucí účinek na nemocné léčené imunoglobulinem.

U přípravku se prokáže vhodnými zkouškami na zvířatech a klinicky ověří, že přípravek je dobře snášen po nitrožilním podání.

Připravuje se ze směsi od nejméně 1000 dárců metodou, u které je prokázáno, že vede k výrobě přípravku, který:

1. - nepřenáší infekci,
2. - při koncentraci imunoglobulinu 50 g/l obsahuje protilátky, z nichž na nejméně dvě (jednu virovou a jednu bakteriální) jsou dosažitelné mezinárodní standardy nebo referenční přípravky; koncentrace těchto protilátek je ve srovnání s výchozí směsnou surovinou nejméně trojnásobná,
3. - má definované rozdělení podtříd imunoglobulinu G,
4. - vyhovuje zkoušce na Fc funkci imunoglobulinu (2.7.9).

Normální lidský imunoglobulin pro nitrožilní podání se připravuje jako stabilizovaný roztok nebo jako lyofilizovaný přípravek. Může se přidat stabilizátor. V obou případech se přípravek filtruje filtrem zadržujícím bakterie. Nepřidává se žádná protimikrobní konzervační látka ani při frakcionaci, ani k hotovému nerozplněnému roztoku.

Stabilita přípravku se doloží vhodnými zkouškami prováděnými během vývojové studie.

Vlastnosti

Tekutý přípravek je čirý nebo slabě opalizující, bezbarvý nebo slabě žlutý. Lyofilizovaný přípravek je bílý nebo světle žlutý prášek nebo tuhá drobivá hmota.

Lyofilizovaný přípravek se rozpouští podle návodu uvedeného na štítku bezprostředně před provedením zkoušek totožnosti a zkoušek na čistotu, kromě zkoušky Rozpustnost a Voda, semimikrostanovení.

Zkoušky totožnosti

1. A. U zkoušeného přípravku se provede precipitační zkouška s druhově specifickými antiséry. Doporučuje se provést zkoušky se specifickými séry proti plazmatickým bílkovinám všech druhů domácích zvířat v příslušné zemi obvykle používaných k přípravě látek biologického původu. Přípravek obsahuje lidské bílkoviny a dává negativní reakci se specifickými séry proti plazmatickým bílkovinám jiných druhů.
2. B. Provádí se vhodnou elektroforetickou technikou. Použije se sérum proti normálnímu lidskému séru a porovná se normální lidské sérum a zkoušený přípravek, obojí zředěno tak, aby 11 obsahoval 10 g bílkovin. Hlavní složka zkoušeného přípravku odpovídá IgG složkám normálního lidského séra. Roztok může vykazovat malá množství jiných plazmatických bílkovin; je-li jako stabilizátor přidán lidský albumin, může být považován za hlavní složku.

Zkoušky na čistotu

Rozpustnost. Lyofilizovaný přípravek se rozpustí předepsaným způsobem. Přípravek se do 30 min při teplotě 20 °C až 25 °C úplně rozpustí.

Hodnota pH (2.2.3). 4,0 až 7,4; zkoušený přípravek se zředí roztokem chloridu sodného R (9 g/l) na roztok obsahující 10 g bílkovin v litru.

Osmolalita (2.2.35). Nejméně 240 mosmol/kg.

Celkové bílkoviny. Přípravek obsahuje nejméně 30 g/l a 90 % až 110 % deklarovaného množství bílkovin. Zkoušený přípravek se zředí roztokem chloridu sodného R (9 g/l) tak, aby se získal roztok obsahující ve 2 ml asi 15 mg bílkovin. Ke 2,0 ml tohoto roztoku v centrifugační zkumavce s kulatým dnem se přidají 2 ml roztoku molybdenanu sodného R (75 g/l) a 2 ml směsi, která obsahuje 1 objemový díl kyseliny sírové bez dusíku R a 30 objemových dílů vody R. Protřepe se, 5 min se odstřeďuje, supernatantní tekutina se sleje a převrácená zkumavka se nechá odkapat na filtrační papír. Ve zbytku se stanoví dusík mineralizací s kyselinou sírovou (2.5.9) a obsah bílkovin se vypočítá vynásobením výsledku faktorem 6,25.

Složení bílkovin. Stanoví se zónovou elektroforézou (2.2.31) za použití proužků vhodného celulosoacetatového gelu jako nosiče a tlumivého roztoku barbitalového o pH 8,6 (1) jako elektrolytu.

Zkoušený roztok. Zkoušený přípravek se zředí roztokem chloridu sodného R (9 g/l) tak, aby koncentrace imunoglobulinu byla 30 g/l.

Porovnávací roztok. Lidský imunoglobulin pro elektroforézu BRP se rozpustí v roztoku chloridu sodného R (9 g/l) tak, aby koncentrace bílkovin byla 30 g/l.

Na proužek se nanese 4,0 μl zkoušeného roztoku jako pruh 10 mm nebo se nanese 0,4 μl na milimetr, jsou-li použity užší proužky. Stejným způsobem se na jiný proužek nanese porovnávací roztok. Nechá se působit takové elektrické pole, aby se pruh albuminu normálního lidského séra, nanesený na kontrolní proužek, posunul alespoň o 30 mm. Proužek se 5 min barví černí amido 10BRS. Odbarvení se provede směsí 10 objemových dílů kyseliny octové ledové R a 90 objemových dílů methanolu R tak, aby došlo k odbarvení pozadí. Transparence pruhů se vyvolá směsí objemových dílů kyseliny octové ledové R a methanolu R (19 + 81). Změří se absorbance pruhů při 600 nm na přístroji, který dává lineární odpověď v rozsahu celého měření. Stanoví se výsledek jako průměr ze tří měření z každého proužku. Na elektroforeogramu zkoušeného roztoku má nejvýše 5 % bílkovin mobilitu odlišnou od hlavního pásu. Tuto hodnotu nelze použít, je-li k přípravku přidán albumin jako stabilizátor; u takových přípravků se zkouška na složení bílkovin provádí při výrobě před přidáním stabilizátoru. Zkoušku lze hodnotit pouze v případě, jestliže na elektroforeogramu porovnávacího roztoku je podíl bílkovin hlavního pásu v mezích uvedených v příbalovém letáku referenčního přípravku.

Rozdělení podle molekulární velikosti. Stanovuje se kapalinovou chromatografií (2.2.29)

Zkoušený roztok. Zkoušený přípravek se rozpustí v roztoku chloridu sodného R (9 g/l) na koncentraci vhodnou pro použitý chromatografický systém. Zpravidla je tato koncentrace v rozmezí 4 g/l až 12 g/l a vstřikuje se 50 μg až 600 μg bílkovin.

Porovnávací roztok. Lidský imunoglobulin BRP se zředí roztokem chloridu sodného R (9 g/l) na stejnou koncentraci bílkovin jako u zkoušeného roztoku.

Chromatografický postup se obvykle provede za použití:

1. - kolony délky 0,6 m a vnitřního průměru 7,5 mm naplněné silikagelem hydrofilním pro chromatografii R,
2. - mobilní fáze s průtokovou rychlostí 0,5 ml/min, kterou je roztok obsahující v litru: 4,873 g hydrogenfosforečnanu sodného dihydrátu R, 1,741 g dihydrogenfosforečnanu sodného monohydrátu R, 11,688 g chloridu sodného R a 50 mg azidu sodného R,
3. - spektrofotometrického detektoru, 280 nm.

Na chromatogramu porovnávacího roztoku odpovídá hlavní pík monomeru IgG a pík odpovídající dimeru má relativní retenční čas asi 0,85, vztaženo k monomeru. Píky na chromatogramu zkoušeného roztoku se porovnají s chromatogramem porovnávacího roztoku. Každý pík s retenčním časem kratším, než je retenční čas dimeru, odpovídá polymerům a agregátům.

Zkoušený přípravek vyhovuje, jestliže relativní retenční čas píků monomem a dimeru se shoduj e s odpovídajícími píky na chromatogramu porovnávacího roztoku a je 1 ± 0,02; součet ploch píků odpovídajících monomeru a dimeru je nejméně 90 % celkové plochy píků a plocha píků odpovídajících polymerům a agregátům je nejvýše 3 % celkové plochy píků. Tento požadavek se nevztahuj e na přípravky, u nichž je přidán albumin jako stabilizátor; u přípravků stabilizovaných albuminem se zkouška rozdělení podle molekulární velikosti provádí při výrobě před přidáním stabilizátoru.

Antikomplementární účinnost (2.6.17). Spotřeba komplementu je nejvýše 50 % (1 CH₅₀ na miligram imunoglobulinu).

Aktivátor prekalikreinu (2.6.15). Nejvýše 35 m.j. v mililitru, počítáno na roztok obsahující 30 g imunoglobulinu v litru.

Hemaglutininy anti-A a anti-B (2.6.20). Provedou se zkoušky na hemaglutininy anti-A a anti-B. Obsahuje-li zkoušený přípravek více než 30 g imunoglobulinu v litru, zředí se na tuto koncentraci před přípravou ředění pro tuto zkoušku. Ředění 1 : 64 nevykazuje aglutinaci.

Voda, semimikrostanovení (2.5.12). Nejvýše 3,0 %; zkouší se u lyofilizovaných přípravků s nejméně 0,500 g zkoušené látky.

Sterilita (2.6.1). Vyhovuje zkoušce na sterilitu.

Pyrogenní látky (2.6.8). Vyhovuje zkoušce na pyrogenní látky. Na 1 kg hmotnosti králíka se vstříkne nitrožilně objem odpovídající 0,5 g imunoglobulinu, ale nejvýše 10 ml na kilogram tělesné hmotnosti.

Protilátky proti povrchovému antigenu hepatitidy B. Nejméně 0,5 m.j. na gram imunoglobulinu, stanoví se vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1).

Uchovávání

Tekutý přípravek se uchovává v bezbarvých skleněných obalech, chráněn před světlem, při teplotě uvedené v označení. Lyofilizovaný přípravek se uchovává v bezbarvých skleněných obalech ve vakuu nebo v atmosféře inertního plynu, chráněn před světlem, při teplotě nepřevyšující 25 °C.

Označování

V označení obalu se uvede:

1. - u tekutého přípravku jeho objem v obalu a obsah bílkovin vyjádřený v gramech na litr,
2. - u lyofilizovaných přípravků množství bílkovin v obalu,
3. - způsob podání,
4. - podmínky uchovávání,
5. - doba použitelnosti,
6. - u lyofilizovaných přípravků název nebo složení a objem tekutiny k rekonstituci, jež se má přidat,
7. - rozdělení podtříd imunoglobulinu G obsažených v přípravku,
8. - kde je to vhodné, množství albuminu přidaného jako stabilizátor,
9. - nejvyšší obsah imunoglobulinu A.

Immunoglobulinum humanum rabicum

Lidský imunoglobulin proti vzteklině

Je to tekutý nebo lyofilizovaný přípravek obsahující imunoglobuliny, zvláště immunoglobulin G. Přípravek je určen pro intramuskulární podání. Vyrábí se z plazmy dárců imunizovaných proti vzteklině. Obsahuje specifické protilátky neutralizující rabický virus. Může se přidat normální lidský imunoglobulin odpovídající článku Immunoglobulinum humanum normale.

Přípravek vyhovuje požadavkům uvedeným v článku Immunoglobulinum humanum normale s výjimkou minimálního počtu dárců a minimálního obsahu celkových bílkovin.

Stanovení účinnosti

Účinnost se stanoví porovnáním dávky imunoglobulinu potřebné k neutralizaci infekěnosti suspenze rabického viru s dávkou referenčního přípravku, kalibrovaného v mezinárodních jednot kách, potřebnou k dosažení téhož stupně neutralizace (2.7.1 Imunochemické metody). Zkouška se provádí na citlivých buněčných kulturách a přítomnost viru, který není zneutralizován, se prokáže imunofluorescencí.

Mezinárodní jednotka je specifická neutralizační účinnost proti rabickému viru obsažená v deklarovaném množství mezinárodního standardu lidského imunoglobulinu proti vzteklině. Hodnotu účinnosti mezinárodního standardu v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Světová zdravotnická organizace.

Zkouška se provede na vhodných citlivých buňkách. Obvykle se používají buňky buněčné linie BHK 21, rostoucí v médiu popsaném dále, mezi 18. a 30. pasáží od ATCC inokula. Buňky se sklízejí po 2 až 4 dnech růstu, uvolňují se trypsinem a připraví se suspenze obsahující 500 000 buněk v mililitru (buněčná suspenze). Je-li třeba, 10 min před použitím suspenze se přidá 10 μg diethylaminoethyldextranu R na mililitr ke zvýšení citlivosti buněk.

Použije se stálý virový kmen rostoucí na citlivých buňkách, jako je např. kmen CVS viru rabies adaptovaný na růst na buňkách linie BHK 21 (inokulační virová suspenze). Metodou popsanou dále se stanoví titr inokulační virové suspenze.

Připraví se sériová ředění virové suspenze. Do komůrek na sklech pro tkáňové kultury (8 komůrek na sklo) se nakape po 0,1 ml každého ředění a 0,1 ml média a přidá se 0,2 ml buněčné suspenze. Inkubuje se 24 h v atmosféře oxidu uhličitého při 37 °C. Po fixaci a imunofluorescenčním barvení se skla vyhodnotí. Stanoví se konečný bod titrace inokulační virové suspenze a připraví se pracovní ředění viru, které v 0,1 ml obsahuje 100 CCID₅₀.

Pro každou zkoušku se ověří množství použitého viru provedením kontrolní titrace: z ředění odpovídajícího 100 CCID₅₀ v 0,1 ml se připraví tři desetinásobná ředění. Po 0,1 ml každého ředění se nakape do čtyř komůrek obsahujících 0,1 ml média a přidá se po 0,2 ml buněčné suspenze. Zkouška je platná, když titr leží mezi 30 CCID₅₀ a 300 CCID₅₀.

Referenční přípravek se zředí neobohaceným médiem na koncentraci 2 m.j. v mililitru (zásobní referenční ředění; uchovává se při teplotě nižší než -80 °C). Připraví se dvě vhodná předředění (1 : 8 a 1 :10) ze zásobního referenčního ředění tak, aby ředění referenčního přípravku, které sníží počet fluoreskujících polí o 50 %, bylo v rozsahu čtyř ředění na kultivačním skle. Přidá se 0,1 ml média do všech komůrek s výjimkou prvních ve dvou řadách, do kterých se případně přidá 0,2 ml ze dvou předředění zásobního referenčního ředění postupným přenášením 0,1 ml do dalších komůrek.

Zkoušený přípravek se zředí v poměru 1 : 100 neobohaceným médiem (zásobní ředění imunoglobulinu), aby se snížily na minimum chyby způsobené viskozitou neředěného přípravku. Připraví se tři vhodná předředění tak, aby ředění zkoušeného přípravku, které sníží počet fluoreskujících polí o 50 %, bylo v rozsahu čtyř ředění na kultivačním skle. Přidá se 0,1 ml média do všech komůrek s výjimkou prvních ve všech třech řadách, do nichž se přidá 0,2 ml ze tří předředění zásobního ředění imunoglobulinu. Připraví se řada dvojnásobných ředění postupným přenášením 0,1 ml do dalších komůrek.

Do všech komůrek obsahujících ředění referenčního přípravku a ředění zkoušeného přípravku se přidá 0,1 ml virové suspenze odpovídající 100 CCID₅₀ v 0,1 ml (pracovní ředění viru), protřepe se v ruce a inkubuje se 90 min v atmosféře oxidu uhličitého při 37 °C. Přidá se 0,2 ml buněčné suspenze, protřepe se v ruce a inkubuje 24 h v atmosféře oxidu uhličitého při 37 °C.

Po 24 h se odstraní médium a sejmou se plastové stěny. Buněčný monolayer se promyje tlumivým roztokem fosforečnanovým s chloridem sodným o pH 7,4 a směsí objemových dílů vody R a acetonu R (20 + 80). Fixuje se 3 min směsí objemových dílů vody R a acetonu R (20 + 80) při -20 °C. Na skla se nanese fluorescein-konjugované rabické antisérum R. Ponechá se 30 min při 37 °C v prostoru s vysokou vlhkostí. Promyje se tlumivým roztokem fosforečnanovým s chloridem sodným o pH 7,4 a usuší se. Vyšetří se dvacet polí v každé komůrce mikroskopem se zařízením pro fluorescenci při zvětšení 250x. Zaznamenává se počet polí s nejméně jednou fluorescenčně označenou buňkou. Přepočítá se zkoušená dávka použitá při titraci viru a stanoví se ředění referenčního přípravku a ředění zkoušeného přípravku, které snižuje počet fluorescenčních polí o 50 %. Ředění se spočítá ze dvou nebo tří ředění společně použitím probitové analýzy. Zkoušku lze hodnotit pouze tehdy, jestliže statistická analýza nevykazuje signifikantní odchylku od křivky dávka - odpověď a odchylku od linearity nebo rovnoběžnosti.

Deklarovaná účinnost je nejméně 150 m.j. v mililitru. Stanovená účinnost není menší než deklarovaná účinnost a není větší než dvojnásobek deklarované účinnosti. Interval spolehlivosti (P = 0,95) stanovené účinnosti je nejméně 80 % a nejvýše 125 %.

Médium pro růst buněk BHK 21

Komerčně vyráběná média, která mají pouze malé odchylky od dále uvedeného média, se mohou také použít.

Médium se doplňuje:

Uchovávání

Viz článek Immunoglobulinum humanum normale.

Označování

Viz článek Immunoglobulinum humanum normale.

V označení na obalu se uvede počet mezinárodních jednotek v balení.

Immunoglobulinum humanum rubellae

Lidský imunoglobulin proti zarděnkám

Je to tekutý nebo lyofilizovaný přípravek obsahující imunoglobuliny, zvláště imunoglobulin G. Přípravek je určen k nitrosvalovému podání. Získává se z plazmy, která obsahuje specifické protilátky proti viru zarděnek. Může se přidat normální lidský imunoglobulin.

Vyhovuje článku Immunoglobulinum humanum normale s výjimkou minimálního počtu dárců a minimálního obsahu celkových bílkovin.

Stanovení účinnosti

Účinnost se stanoví porovnáním účinnosti zkoušeného přípravku ve zkoušce inhibice hemaglutinace s účinností referenčního přípravku kalibrovaného v mezinárodních jednotkách.

Mezinárodní jednotka je účinnost obsažená v deklarovaném množství mezinárodního referenčního přípravku lidského séra proti zarděnkám. Hodnotu účinnosti mezinárodního referenčního přípravku v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Světová zdravotnická organizace.

Stanovená účinnost je nejméně 4500 m.j. v mililitru. Interval spolehlivosti (P = 0,95) stanovené účinnosti je nejméně 50 % a nejvíce 200 % deklarované účinnosti.

Uchovávání

Viz článek Immunoglobulinum humanum normale.

Označování

Viz článek Immunoglobulinum humanum normale.

V označení na obalu se uvede počet mezinárodních jednotek v mililitru.

Immunoglobulinum humanum tetanicum

Lidský tetanický imunoglobulin

Synonymum. Immunoglobulinum antitetanicum humanum

Je to tekutý nebo lyofilizovaný přípravek obsahující imunoglobuliny, zvláště imunoglobulin G. Získává se z plazmy obsahující specifické protilátky proti toxinu vytvářenému mikroorganismem Clostridium tetani. Může se přidat normální lidský imunoglobulin.

Vyhovuje článku Immunoglobulinum humanum normale s výjimkou minimálního počtu dárců a minimálního obsahu celkových bílkovin.

Výroba

Při vývoji přípravku se má určit uspokojivý vztah mezi účinností stanovenou imunoanalýzou, jak je uvedeno ve zkoušce Stanovení účinnosti, a mezi účinností stanovenou následující zkouškou schopnosti neutralizovat toxin, provedenou na myších.

Schopnost neutralizovat toxin. Účinnost se stanoví porovnáním dávky potřebné na ochranu myší před paralytickým účinkem neměnné dávky tetanického toxinu s množstvím porovnávacího přípravku lidského tetanického imunoglobulinu kalibrovaného v mezinárodních jednotkách, které je potřebné k dosažení stejné ochrany.

Mezinárodní jednotka antitoxinu je specifická neutralizační účinnost proti tetanickému toxinu obsažená v deklarovaném množství mezinárodního standardu lidského tetanického imunoglobulinu. Hodnotu účinnosti mezinárodního standardu v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Světová zdravotnická organizace. Lidský tetanický imunoglobulin BRP je kalibrován v mezinárodních jednotkách porovnáním s mezinárodním standardem.

Výběr zvířat. Použijí se myši hmotnosti 16 g až 20 g.

Příprava zkušebního toxinu. Zkušební toxin se připraví vhodnou metodou ze sterilního filtrátu Cl. tetani v tekuté živné půdě. Jako příklad jsou uvedeny dvě metody a může se použít i jiná vhodná metoda.

1. 1. K filtrátu asi devítidenní kultury se přidají 1 až 2 objemové díly glycerolu R a uchovává se těsně pod 0 °C.
2. 2. Vysráží se toxin přidáním síranu amonného R k filtrátu, sraženina se vysuší ve vakuu nad oxidem fosforečným R, upráškuje se a uchovává v suchu buď v zatavených ampulkách, nebo ve vakuu nad oxidem fosforečným R.

Stanovení zkušební dávky toxinu (Lp/10 dávka). Připraví se roztok referenčního přípravku ve vhodné tekutině tak, aby v mililitru bylo obsaženo 0,5 m.j. antitoxinu. Jestliže je toxin uchováván jako suchý, rozpustí se ve vhodném rozpouštědle. Připraví se směsi roztoků porovnávacího přípravku a zkušebního toxinu tak, aby každá směs obsahovala 2,0 ml roztoku porovnávacího přípravku, jeden z řady odstupňovaných objemů roztoku zkušebního toxinu a vhodnou tekutinou doplňující směsi na 5,0 ml. Směsi se 60 min uchovávají chráněny před světlem. Z každé směsi se subkutánně vstříkne šesti myším po 0,5 ml a myši se pozorují 96 h. Myši s příznaky paralýzy se mohou utratit.

Zkušební dávka toxinu je ono množství, jež je obsaženo v 0,5 ml směsi s nejnižším obsahem toxinu, která přes jeho částečnou neutralizaci referenčním přípravkem je ještě schopna způsobit paralýzu všech šesti myší v průběhu pozorovací doby.

Stanovení účinnosti imunoglobulinu. Připraví se roztok referenčního přípravku ve vhodné tekutině tak, aby v mililitru bylo obsaženo 0,5 m.j. antitoxinu. Připraví se roztok zkušebního toxinu ve vhodné tekutině tak, aby v mililitru bylo obsaženo pět zkušebních dávek. Připraví se směsi roztoků zkušebního toxinu a zkoušeného přípravku tak, aby každá směs obsahovala 2,0 ml roztoku zkušebního toxinu, jeden z řady odstupňovaných objemů roztoku zkoušeného přípravku a vhodnou tekutinu doplňující směsi na 5,0 ml. Podobně se připraví směsi roztoků zkušebního toxinu a referenčního přípravku tak, aby každá směs obsahovala 2,0 ml roztoku zkušebního toxinu, jeden z řady odstupňovaných objemů roztoku referenčního přípravku s tím, že uprostřed řady je objem (2,0 ml), který obsahuje 1 m.j. imunoglobulinu a vhodnou tekutinou doplňující směsi na 5,0 ml. Směsi se 60 min uchovávají chráněny před světlem. Z každé směsi se subkutánně vstříkne šesti myším po 0,5 ml a myši se pozorují 96 h. Myši s příznaky paralýzy se mohou utratit. Směs obsahující největší objem imunoglobulinu, který nestačí ochránit myši před paralýzou, obsahuje 1 m.j. Toto množství se použije k výpočtu účinnosti zkoušeného přípravku v mezinárodních jednotkách v mililitru.

Zkoušku lze hodnotit, jestliže všechny myši, kterým byla vstříknuta směs s obsahem 2,0 ml nebo méně roztoku referenčního přípravku, mají příznaky paralýzy a všechny myši, kterým byla vstříknuta směs s vyšším obsahem referenčního přípravku, příznaky paralýzy nemají.

Stanovení účinnosti

Účinnost se stanoví porovnáním protilátkového titru zkoušeného přípravku s referenčním přípravkem kalibrovaným v mezinárodních jednotkách za použití imunoanalýzy vhodné citlivosti a specifíty (2.7.1).

Lidský tetanický imunoglubulin BRP je kalibrován v mezinárodních jednotkách porovnáním s mezinárodním standardem.

Deklarovaná účinnost je nejméně 100 m.j. tetanického antitoxinu v mililitru. Stanovená účinnost není menší než deklarovaná účinnost. Interval spolehlivosti (P = 0,95) stanovené účinnosti je 80 % až 125 %.

Uchovávání

Viz článek Immunoglobulinum humanum normale.

Označování

Viz článek Immunoglobulinum humanum normale.

V označení na obalu se uvede množství mezinárodních jednotek v balení.

Immunoglobulinum humanum varicellae

Lidský imunoglobulin proti planým neštovicím

Je to tekutý nebo lyofilizovaný přípravek obsahující imunoglobuliny, zvláště imunoglobulin G. Přípravek je určen k nitrosvalovému podání. Získává se z plazmy vybraných dárců obsahující protilátky proti Herpesvirus varicellae. Může se přidat normální lidský imunoglobulin.

Vyhovuje článku Immunoglobulinum humanum normale s výjimkou minimálního počtu dárců, minimálního celkového obsahu bílkovin, a je-li schváleno autoritou, s výjimkou zkoušky na protilátky proti povrchovému antigenu hepatitidy B.

Stanovení účinnosti

Účinnost se stanoví porovnáním titru protilátek zkoušeného přípravku s titrem protilátek referenčního přípravku kalibrovaného v mezinárodních jednotkách. Pro stanovení se použije imunoanalýza vhodné citlivosti a specificity (2.7.1) Imunochemické metody).

Mezinárodní jednotka je účinnost obsažená v deklarovaném množství mezinárodního standardu lidského imunoglobulinu proti planým neštovicím. Hodnotu účinnosti mezinárodního standardu v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Světová zdravotnická organizace.

Deklarovaná účinnost je nejméně 100 m.j. v mililitru. Stanovená účinnost není menší než deklarovaná účinnost. Interval spolehlivosti (P = 0,95) stanovené účinnosti je nejméně 80 % a nejvýše 125 %.

Uchovávání

Viz článek Immunoglobulinum humanum normale.

Označování

Viz článek Immunoglobulinum humanum normale.

V označení na obalu se uvede počet mezinárodních jednotek v nádobce.

Immunoserum botulinicum

Imunní sérum proti botulinickému toxinu

Je to přípravek obsahující antitoxické globuliny schopné specificky neutralizovat toxiny, které vytváří Clostridium botulinum typu A, B nebo E, nebo jejich směsi.

Výroba

Získává se frakcionací ze séra koní nebo jiných savců, kteří byli imunizováni proti toxinům Cl. botulinum typu A, B nebo E.

Zkouška totožnosti

Specificky neutralizuje toxiny typů Cl. botulinum uvedené v označení a činí je neškodnými pro vnímavá zvířata.

Zkoušky na čistotu

Vyhovuje zkouškám předepsaným v článku Immunoglobulinum humanum normale.

Stanovení účinnosti

Nejméně 500 m.j. antitoxinu v mililitru pro typy A a B a nejméně 50 m.j. antitoxinu v mililitru pro typ E.

Účinnost zkoušeného přípravku se stanoví porovnáním dávky potřebné na ochranu myší před letálním účinkem neměnné zkušební dávky botulinického toxinu s dávkou referenčního přípravku botulinického antitoxinu potřebnou k dosažení stejné ochrany. Pro toto srovnání je zapotřebí referenční přípravek každého typu botulinického antitoxinu, kalibrovaný v mezinárodních jednotkách, a vhodné přípravky botulinických toxinů, které se používají jako zkušební toxiny. Účinnost každého zkušebního toxinu se stanoví ve vztahu ke specifickému referenčnímu přípravku, účinnost zkoušeného přípravku se stanoví stejnou metodou ve vztahu k účinnosti zkušebních toxinů.

Mezinárodní jednotky antitoxinu jsou specifické neutralizační účinnosti proti botulinickému toxinu typu A, B a E obsažené v deklarovaných množstvích mezinárodních standardů, které obsahují vysušená koňská séra proti typům A, B a E. Hodnotu účinnosti mezinárodního standardu v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Světová zdravotnická organizace.

Výběr zvířat. Používají se myši takových hmotností, aby rozdíl v hmotnosti mezi nejlehčí a nejtěžší nepřesáhl 5 g.

Příprava zkušebních toxinů. Výstraha: Botulinický toxin je extrémně toxický; při jakékoliv manipulaci je nutno zachovávat mimořádnou opatrnost. Připraví se toxiny typu A, B a E ze sterilních filtrátů asi sedmidenních kultur Cl. botulinum typu A, B a E v tekuté živné půdě. K filtrátu se přidají dva objemy glycerolu, je-li třeba, zahustí se dialýzou proti glycerolu a uchovávají se při nebo slabě pod 0°C.

Výběr zkušebních toxinů. Zkušební toxiny od každého typu se vyberou podle stanovení dávek L+/10 a LD 50; doba pozorování je 96 h. Zkušební toxiny obsahují nejméně 1000 LD 50 v jedné L+/10 dávce.

Stanovení zkušebních dávek toxinů (L+/10 dávka). Připraví se roztoky referenčních přípravků ve vhodné tekutině tak, aby každý obsahoval 0,25 m.j. antitoxinu v 1 ml. Postupně se pomocí připravených roztoků stanoví zkušební dávky jednotlivých zkušebních toxinů.

Připraví se směsi roztoků referenčních přípravků a zkušebních toxinů tak, aby každá směs obsahovala 2,0 ml roztoku referenčního přípravku, jeden z odstupňovaných objemů zkušebního toxinu, a zbytek do 5,0 ml se doplní vhodnou tekutinou. Směsi se 60 min uchovávají při pokojové teplotě, chráněny před světlem. Z každé směsi se intraperitoneálně vstříkne čtyřem myším po 1,0 ml a myši se pozorují 96 h.

Zkušební dávka toxinu je ono množství, jež je obsaženo v 1,0 ml směsi s nejnižším obsahem toxinu, které přes jeho částečnou neutralizaci referenčním přípravkem je ještě schopno vyvolat smrt všech čtyř myší v průběhu pozorovací doby.

Stanovení účinnosti zkoušeného přípravku. Připraví se roztoky referenčních přípravků ve vhodné tekutině tak, aby v mililitru bylo obsaženo 0,25 m.j. antitoxinu. Připraví se roztoky všech zkušebních toxinů ve vhodné tekutině tak, aby v mililitru bylo obsaženo 2,5 zkušební dávky.

Účinnost zkoušeného přípravku se určí postupným použitím každého roztoku toxinu a odpovídajícího referenčního přípravku. Připraví se směsi roztoku zkušebního toxinu a zkoušeného přípravku tak, aby každá směs obsahovala 2,0 ml roztoku zkušebního toxinu, jeden z odstupňovaných objemů zkoušeného přípravku a zbytek do 5,0 ml se doplní vhodnou tekutinou. Podobně se připraví směsi roztoků zkušebního toxinu a referenčního přípravku tak, aby každá směs obsahovala 2,0 ml roztoku zkušebního toxinu, dále jeden z odstupňovaných objemů roztoku referenčního přípravku s tím, že uprostřed řady je objem (2,0 ml), který obsahuje 0,5 m.j., a zbytek do 5 ml se doplní vhodnou tekutinou. Směsi se 60 min uchovávají při pokojové teplotě chráněny před světlem. Z každé směsi se intraperitoneálně vstříkne čtyřem myším po 1,0 ml a myši se pozorují 96 h. Směs obsahující největší objem antitoxinu, který nestačí ochránit myši před uhynutím, obsahuje 0,5 m.j. Toto množství se použije k výpočtu účinnosti zkoušeného přípravku v mezinárodních jednotkách v mililitru.

Zkoušku lze hodnotit pouze v případě, pokud uhynou všechny myši, kterým byly vstříknuty směsi obsahující 2,0 ml nebo méně roztoku referenčního přípravku, a přežijí ty, kterým byly vstříknuty směsi obsahující více referenčního přípravku.

Uchovávání

Viz článek Immunosera ad usum humanum.

Označování

Viz článek Immunosera ad usum humanum.

V označení se uvede typ Cl. botulinum, jehož toxin je přípravkem neutralizován.

Immunoserum clostridii novyi alpha ad usum veterinarium

Imunní sérum proti toxinu alfa Clostridia novyi pro veterinární použití

Je to přípravek obsahující globuliny schopné specificky neutralizovat alfa-toxin, který vytváří Clostridium novyi (starší názvosloví: Clostridium oedematiens). Je to sérum nebo přípravek získaný ze séra zvířat imunizovaných proti alfa-toxinu Cl. novyi.

Zkouška totožnosti

Specificky neutralizuje alfa-toxin vytvořený Cl. novyi a činí jej neškodným pro vnímavá zvířata.

Zkoušky na čistotu

Vyhovuje zkouškám předepsaným v článku Immunosera ad usum veterinarium.

Stanovení účinnosti

Účinnost nativního séra je nejméně 750 m.j./ml u koňského séra a nejméně 250 m.j./ml u séra skotu.

Účinnost koncentrovaného séra je nejméně 1500 m.j./ml u koňského séra a nejméně 500 m.j./ml u séra skotu.

Mezinárodní jednotka je specifická neutralizační účinnost proti alfa-toxinu Cl. novyi obsažená v deklarovaném množství mezinárodního standardu, který pozůstává z určitého množství sušeného imunního koňského séra. Hodnotu účinnosti mezinárodního standardu v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Světová zdravotnická organizace.

Účinnost zkoušeného přípravku se stanoví porovnáváním dávky potřebné k ochraně myší nebo jiných vhodných zvířat před toxickým účinkem neměnné zkušební dávky alfa-toxinu Cl. novyi s množstvím referenčního přípravku imunního séra proti alfa-toxinu Cl. novyi, které je nezbytné k dosažení stejné ochrany. Referenční přípravek je kalibrován v mezinárodních jednotkách. Pro toto porovnání je zapotřebí vhodný přípravek alfa-toxinu Cl. novyi, který se použije jako zkušební toxin. Dávka zkušebního toxinu se stanoví ve vztahu k referenčnímu přípravku. Účinnost zkoušeného přípravku se stanoví ve vztahu k referenčnímu přípravku za použití zkušebního toxinu.

Příprava zkušebního toxinu. Zkušební toxin se připraví ze sterilního filtrátu asi pětidenní kultury Cl. novyi typ B v tekuté živné půdě a vysuší se vhodnou metodou.

Toxin se vybere podle stanovení dávek L+/10 a LD₅₀ na myších; doba pozorování je 72 h. Vhodný alfa-toxin obsahuje nejméně jednu L+/10 dávku v 0,050 mg a nejméně 10 LD₅₀ v každé L+/10 dávce.

Stanovení zkušební dávky toxinu. Referenční přípravek se zředí vhodnou tekutinou tak, aby 1 ml obsahoval 1 m.j. Zkušební toxin se rozpustí a zředí tak, aby 1 ml roztoku obsahoval přesně známé množství, např. 1 mg. Dále se připraví směsi roztoků referenčního přípravku a zkušebního toxinu tak, aby každá směs obsahovala 1,0 ml roztoku referenčního přípravku (1 m.j.) a jeden z odstupňovaných objemů roztoku zkušebního toxinu, a zbytek do 2,0 ml se doplní vhodnou tekutinou. Směsi se uchovávají 60 min při pokojové teplotě. Pro každou směs se použijí nejméně dvě myši hmotnosti 17 g až 22 g. Každé myši se nitrosvalově nebo podkožně vstříkne dávka 0,2 ml a myši se pozorují 72 h. Pokud všechny myši uhynou, je v 0,2 ml směsi nadbytek toxinu vzhledem ke zkušební dávce. Neuhyne-li žádná myš, je množství toxinu v 0,2 ml směsi nižší, než je zkušební dávka. Obdobně se připraví další čerstvé směsi tak, aby 2,0 ml směsi obsahovaly 1,0 ml referenčního přípravku (1 m.j.) a jeden z odstupňovaných objemů roztoku zkušebního toxinu. Rozdíly mezi sousedními objemy jsou nejvýše 20 % a řada ředění přesahuje předpokládaný mezní bod. Směsi se 60 min uchovávají při pokojové teplotě.

Pro každou směs se použijí nejméně dvě myši, z nichž se každé nitrosvalově nebo podkožně vstříkne 0,2 ml. Myši se pozorují 72 h. Stanovení se nejméně jedenkrát opakuje a výsledky jednotlivých zkoušek se směsmi stejného složení se sečtou. Tím se získá konečný výsledek představující mortalitu způsobenou směsí určitého složení. Zkušební dávka toxinu je množství toxinu obsažené v 0,2 ml té směsi, která způsobila úhyn poloviny celkového počtu myší.

Stanovení účinnosti zkoušeného přípravku.

Předběžná zkouška: Ve vhodné tekutině se rozpustí takové množství zkušebního toxinu, aby 1 ml obsahoval desetinásobek zkušební dávky. Připraví se směsi roztoků zkušebního toxinu a zkoušeného přípravku tak, aby každá směs obsahovala 1,0 ml zkušebního toxinu a jeden z řady stoupajících objemů zkoušeného přípravku. Zbytek do 2,0 ml se doplní vhodnou tekutinou a směsi se 60 min uchovávají při pokojové teplotě. Pro každou směs se použijí nejméně dvě myši, z nichž se každé nitrosvalově nebo podkožně vstříkne 0,2 ml, a myši se pozorují 72 h. Pokud žádná myš neuhyne, 0,2 ml směsi obsahuje více než 0,1 m.j. Pokud uhynou všechny myši, 0,2 ml směsi obsahuje méně než 0,1 m.j.

Konečná zkouška: Připraví se směsi roztoku zkušebního toxinu a zkoušeného přípravku tak, aby 2,0 ml každé směsi obsahovaly 1,0 ml roztoku zkušebního toxinu a jeden z řady stoupajících objemů zkoušeného přípravku (v řadě se stoupající objemy mezi sebou liší nejvýše o 20 % a řada přesahuje předpokládaný mezní bod stanovený v předběžné zkoušce). Aby se potvrdila zkušební dávka toxinu, připraví se další směsi, které v objemu 2,0 ml obsahují 1,0 ml roztoku zkušebního toxinu a jeden z řady stoupajících objemů roztoku referenčního přípravku. Směsi se 60 min uchovávají při pokojové teplotě. Pro každou směs se použijí nejméně dvě myši a postupuje se stejně jako v předběžné zkoušce. Zkoušená směs, která v 0,2 ml obsahuje 0,1 m.j., je ta směs, která způsobí úhyn stejného nebo téměř stejného počtu myší jako směs referenčního přípravku obsahující 0,1 m.j. v 0,2 ml. Stanovení se nejméně jedenkrát opakuje a vypočítá se průměr všech platných výsledků. Výsledky jsou platné pouze tehdy, když výsledek referenčního přípravku je v rozmezí ±20 % od očekávané hodnoty.

Intervaly spolehlivosti (P = 0,95) jsou stanoveny takto:

1. - 85 % a 114 %, použila-li se dvě zvířata na dávku,
2. - 91,5 % a 109 %, použila-li se čtyři zvířata na dávku,
3. - 93 % a 108 %, použilo-li se šest zvířat na dávku.

Uchovávání

Viz článek Immunosera ad usum veterinarium.

Označování

Viz článek Immunosera ad usum veterinarium.

V označení obalu se uvede, zda přípravek obsahuje nativní nebo koncentrované sérum.

Immunoserum clostridii perfringentis beta ad usum veterinarium

Imunní sérum proti toxinu beta Clostridia perfringens pro veterinární použití

Je to přípravek obsahující hlavně globuliny schopné specificky neutralizovat beta-toxin, který vytváří Clostridium perfringens (typ B a typ C). Je to sérum nebo přípravek ze séra zvířat imunizovaných proti beta-toxinu Cl. perfringens.

Zkouška totožnosti

Specificky neutralizuje beta-toxin vytvořený Cl. perfringens a činí jej neškodným pro vnímavá zvířata.

Zkoušky na čistotu

Vyhovuje zkouškám předepsaným v článku Immunosera ad usum veterinarium.

Stanovení účinnosti

Účinnost nativního séra je nejméně 1000 m.j./ml u koňského séra a nejméně 250 m.j./ml u séra skotu.

Účinnost koncentrovaného séra je nejméně 3000 m.j./ml u koňského séra a nejméně 1000 m.j./ml u séra skotu.

Mezinárodní jednotka je specifická neutralizační účinnost proti beta-toxinu Cl. perfringens obsažená v deklarovaném množství mezinárodního standardu, který pozůstává z určitého množství sušeného imunního koňského séra. Hodnotu účinnosti mezinárodního standardu v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Světová zdravotnická organizace.

Účinnost zkoušeného přípravku se stanoví porovnáváním dávky potřebné k ochraně myší nebo jiných vhodných zvířat před toxickým účinkem neměnné zkušební dávky beta-toxinu Cl. perfringens s množstvím referenčního přípravku imunního séra proti beta-toxinu Cl. perfringens, které je nezbytné k dosažení stejné ochrany. Referenční přípravek je kalibrován v mezinárodních jednotkách. Pro toto porovnání je zapotřebí vhodný přípravek beta-toxinu Cl. perfringens, který se použije jako zkušební toxin. Dávka zkušebního toxinu se stanoví ve vztahu k referenčnímu přípravku. Účinnost zkoušeného přípravku se stanoví ve vztahu k referenčnímu přípravku za použití zkušebního toxinu.

Příprava zkušebního toxinu. Zkušební toxin se připraví ze sterilního filtrátu čerstvé kultury Cl. perfringens typu B nebo C v tekuté živné půdě a vysuší se vhodnou metodou.

Zkušební toxin se vybere podle stanovení dávek L+ a LD ₅₀na myších, doba pozorování je 72 h. Vhodný beta-toxin obsahuje nejméně jednu L+ dávku v 0,2 mg a nejméně 25 LD₅₀ v každé L+ dávce.

Stanovení zkušební dávky toxinu. Referenční přípravek se zředí vhodnou tekutinou tak, aby 1 ml obsahoval 5 m.j. Zkušební toxin se rozpustí a zředí tak, aby 1 ml obsahoval přesně známé množství, např. 10 mg. Dále se připraví směsi roztoků referenčního přípravku a zkušebního toxinu tak, aby každá směs obsahovala 2,0 ml roztoku referenčního přípravku (10 m.j.) a jeden z odstupňovaných objemů roztoku zkušebního toxinu, a zbytek do 5,0 ml se doplní vhodnou tekutinou. Směsi se 30 min uchovávají při pokojové teplotě.

Pro každou směs se použijí nejméně dvě myši hmotnosti 17 g až 22 g. Každé myši se intravenózně nebo intraperitoneálně vstříkne dávka 0,5 ml a pozorují se 72 h. Pokud všechny myši uhynou, je v 0,5 ml směsi nadbytek toxinu vzhledem ke zkušební dávce. Neuhyne-li žádná myš, je množství toxinu v 0,5 ml směsi nižší, než je zkušební dávka. Obdobně se připraví čerstvé směsi ták, aby 5,0 ml každé směsi obsahovalo 2,0 ml roztoku referenčního přípravku (10 m.j.) a jeden z odstupňovaných objemů roztoku zkušebního toxinu. Rozdíly mezi sousedními objemy jsou nejvýše 20 % a řada ředění přesahuje předpokládaný mezní bod. Směsi se 30 min uchovávají při pokojové teplotě. Pro každou směs se použijí nejméně dvě myši, z nichž se každé intravenózně nebo intraperitoneálně vstříkne 0,5 ml. Myši se pozorují 72 h. Stanovení se nejméně jedenkrát opakuje a výsledky jednotlivých zkoušek se směsmi stejného složení se sečtou. Tím se získá konečný výsledek představující mortalitu způsobenou směsí určitého složení. Zkušební dávka toxinu je množství toxinu obsažené v 0,5 ml té směsi, která způsobila úhyn poloviny celkového počtu myší.

Stanovení účinnosti zkoušeného přípravku.

Předběžná zkouška: Ve vhodné tekutině se rozpustí takové množství toxinu, aby 2,0 ml obsahovaly desetinásobek zkušební dávky. Připraví se směsi roztoků zkušebního toxinu a zkoušeného přípravku tak, aby každá směs obsahovala 2,0 ml roztoku zkušebního toxinu a jeden z řady stoupajících objemů zkoušeného přípravku. Zbytek do 5,0 ml se doplní vhodnou tekutinou a směsi se 30 min uchovávají při pokojové teplotě. Pro každou směs se použijí nejméně dvě myši, z nichž se každé intravenózně nebo intraperitoneálně vstříkne 0,5 ml, a myši se pozorují 72 h. Pokud žádná myš neuhyne, 0,5 ml směsi obsahuje více než 1 m.j. Pokud uhynou všechny myši, 0,5 ml směsi obsahuje méně než 1 m.j.

Konečná zkouška: Připraví se směsi roztoku zkušebního toxinu a zkoušeného přípravku tak, aby 5,0 ml každé směsi obsahovalo 2,0 ml roztoku zkušebního toxinu a jeden z řady stoupajících objemů zkoušeného přípravku (v řadě se stoupající objemy mezi sebou liší nejvýše o 20 % a řada přesahuje předpokládaný mezní bod stanovený v předběžném testu). Aby se potvrdila zkušební dávka toxinu, připraví se další směsi, které v objemu 5,0 ml obsahují 2,0 ml roztoku zkušebního toxinu a jeden z řady stoupajících objemů roztoku referenčního přípravku. Směsi se 30 min uchovávají při pokojové teplotě. Pro každou směs se použijí nejméně dvě myši a postupuje se stejně jako v předběžné zkoušce. Zkoušená směs, která obsahuje 1 m.j. v 0,5 ml, je ta směs, která způsobí úhyn stejného nebo téměř stejného počtu myší jako směs s referenčním přípravkem obsahující 1 m.j. v 0,5 ml. Stanovení se nejméně jedenkrát opakuje a vypočítá se průměr všech platných výsledků. Výsledky jsou platné pouze tehdy, když výsledek referenčního přípravku je v rozmezí ±20 % od očekávané hodnoty.

Intervaly spolehlivosti (P = 0,95) jsou stanoveny takto:

1. - 85% a 114%, použila-li se dvě zvířata na dávku,
2. - 91,5% a 109%, použila-li se čtyři zvířata na dávku,
3. - 93% a 108%, použilo-li se šest zvířat na dávku.

Uchovávání

Viz článek Immunosera ad usum veterinarium.

Označování

Viz článek Immunosera ad usum veterinarium.

V označení se uvede, zda přípravek obsahuje nativní nebo koncentrované sérum.

Immunoserum clostridii perfringentis epsilon ad usum veterinarium

Imunní sérum proti toxinu epsilon Clostridia perfringens pro veterinární použití

Je to přípravek obsahující globuliny schopné specificky neutralizovat toxin epsilon, který vytváří Clostridium perfringens typu D. Je to sérum nebo přípravek ze séra zvířat imunizovaných proti toxinu epsilon Cl. petfringens.

Zkouška totožnosti

Specificky neutralizuje epsilon-toxin vytvořený Cl. petfringens typu D a činí jej neškodným pro vnímavá zvířata.

Zkoušky na čistotu

Vyhovuje zkouškám předepsaným v článku Immunosera ad usum veterinarium.

Stanovení účinnosti

Účinnost nativního séra je nejméně 120 m.j./ml u koňského séra a nejméně 100 m.j./ml u séra skotu.

Účinnost koncentrovaného séra je nejméně 300 m.j./ml u koňského séra a 150 m.j./ml u séra skotu.

Mezinárodní jednotka je specifická neutralizační účinnost proti epsilon-toxinu Cl. petfringens obsažená v deklarovaném množství mezinárodního standardu, který pozůstává z určitého množství sušeného imunního koňského séra. Hodnotu účinnosti mezinárodního standardu v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Světová zdravotnická organizace.

Účinnost zkoušeného přípravku se stanoví porovnáváním dávky potřebné k ochraně myší nebo jiných vhodných zvířat před toxickým účinkem neměnné zkušební dávky toxinu-epsilon Cl. petfringens s množstvím referenčního přípravku imunního séra proti toxinu-epsilon Cl. petfringens, které je nezbytné k dosažení stejné ochrany. Referenční přípravek je kalibrován v mezinárodních jednotkách. Pro toto porovnání je zapotřebí vhodný přípravek epsilon-toxinu Cl. petfringens, který se použije jako zkušební toxin. Dávka zkušebního toxinu se stanoví ve vztahu k referenčnímu přípravku. Účinnost zkoušeného přípravku se stanoví ve vztahu k referenčnímu přípravku za použití zkušebního toxinu.