Platné znění

Český lékopis 1997

účinné od 1. 2. 1998Opice použité v této zkoušce vyhovují požadavkům uvedeným v článku Vaccinum poliomyelitidis perorale a váží nejméně 1,5 kg. Patogenita se stanoví u opic rodu Macaca nebo Cercopithecus v porovnání s referenčním virem připraveným pro zkoušku neurovirulence inokulací do bederní oblasti centrálního nervového systému po předchozím podání vhodného sedativa, např. ketaminiumchloridu. Vzorky séra odebrané před injekcí prokazatelně neobsahují neutralizační protilátky v ředění 1 : 4 při zkoušení proti nejvýše 1000 CCID 50 každého ze tří typů polioviru.

účinné od 1. 2. 1998Počet opic. Vakcína a vhodný homotypický referenční virus se zkouší současně v téže skupině opic. Stejnému počtu zvířat se vstříkne zkoušená vakcína a referenční přípravek. Zvířata se rozdělí náhodně do ošetřovacích skupin a klecí a jejich totožnost se kóduje při očkování. Zařazení jednotlivých zvířat se před ošetřovatelem a pitvajícím tají. Počet naočkovaných opic je takový, aby při vyhodnocení zkoušené vakcíny a referenčního přípravku bylo nejméně jedenáct pozitivních opic u typů 1 a 2 a nejméně osmnáct pozitivních opic u typu 3 (pozitivní opice jsou takové, které v centrálním nervovém systému mají specifické poliovirové léze neuronu). S týmž homotypickým referenčním přípravkem může být zkoušena více než jedna šarže vakcíny. Je-li to možné, použijí se opice z téže karanténní skupiny. V opačném případě se použijí opice ze dvou skupin a stejná množství z každé skupiny se použijí pro podání vakcíny a referenčního přípravku. Jestliže se zkouška provádí ve dvou pracovních dnech, naočkuje se stejné množství opic z každé skupiny v týž den vakcínou a homotypickým referenčním přípravkem.

účinné od 1. 2. 1998Obsah viru. Obsahy viru ve vakcíně a homotypickém referenčním přípravku se upraví tak, aby byly titry pokud možno stejné a v rozmezí od 105,5 do 106,5 CCID50/0,1 ml.

účinné od 1. 2. 1998Pozorování. Všechny opice se pozorují 17 až 22 dní, aby se zjistily příznaky poliomyelitidy nebo jiné virové infekce. Opice, které přežijí prvních 24 h, ale uhynou před jedenáctým dnem po očkování, se pitvají, aby se určilo, zda byla poliomyelitida příčinou smrti. Zvířata, která uhynula z jiných příčin, než je poliomyelitida, se vyloučí z hodnocení. Umírající nebo těžce paralyzovaná zvířata se usmrtí a pitvají. Všechna zvířata, která přežijí do konce pozorovacího období, se též pitvají. Zkouška není platná, jestliže více než 20 % zvířat vykazuje během pozorovacího období interkurentní infekci.

účinné od 1. 2. 1998Počet vyšetřovaných řezů. Z každé opice se histologicky vyšetří nejméně bederní mícha, krční mícha a nižší i vyšší část prodloužené míchy, střední mozek, talamus a motorická oblast kůry mozkové. Zkoumají se řezy tenčí než 15 μm a barvené gallocyaninem.

  1. účinné od 1. 2. 1998Nejnižší počet vyšetřovaných řezů je následující:
    1. účinné od 1. 2. 1998a) 12 řezů reprezentujících celou bederní ztluštěninu,
    2. účinné od 1. 2. 1998b) 10 řezů reprezentujících celou krční ztluštěninu,
    3. účinné od 1. 2. 1998c) 2 řezy z prodloužené míchy,
    4. účinné od 1. 2. 1998d) 1 řez z mostu a mozečku,
    5. účinné od 1. 2. 1998e) 1 řez ze středního mozku,
    6. účinné od 1. 2. 1998f) 1 řez z levé a pravé části thalamu,
    7. účinné od 1. 2. 1998g) 1 řez z levé a pravé části motorické oblasti mozkové kůry.

účinné od 1. 2. 1998Určení aktivity viru. Pro hodnocení virové aktivity v řezech ze hřbetní míchy a mozkového kmene se používá hodnotící systém pro stupeň poškození, který rozlišuje buněčnou infiltraci a destrukci neuronů následovně:

  1. účinné od 1. 2. 19981. pouze buněčná infiltrace (tyto opice se nepovažují za pozitivní),
  2. účinné od 1. 2. 19982. buněčná infiltrace s minimálním poškozením neuronu,
  3. účinné od 1. 2. 19983. buněčná infiltrace s rozsáhlým poškozením neuronu,
  4. účinné od 1. 2. 19984. masivní poškození neuronu s buněčnou infiltrací nebo bez ní.

účinné od 1. 2. 1998Výsledky se zaznamenávají do standardního formuláře. 7)Opice s neuronálními lézemi v řezech, které ale nevykazují stopy po vpichu, jsou počítány jako pozitivní. Opice vykazující stopy po vpichu v řezech, ale nikoli neuronální léze nejsou počítány jako pozitivní. Řezy, které vykazují traumatické poškození, ale nemají žádné specifické virové léze, se nezahrnují do počtu.

účinné od 1. 2. 1998Závažnost nálezu je založena na odečtení výsledků z bederních (L), krčních (C) a mozkových (B) histologických řezů.

účinné od 1. 2. 1998Ohodnocení lézí (LS) pro každou pozitivní opici se vypočítá takto:

účinné od 1. 2. 1998

účinné od 1. 2. 1998Pro každou skupinu pozitivních opic se vypočítá průměrný počet lézí.

účinné od 1. 2. 1998Hodnocení. Srovnání virové aktivity ve vakcíně a referenčním přípravku je založeno na aktivitě v bederním ztluštění míchy a stupni šíření aktivity z této oblasti do krčního ztluštění a mozku. Vhodnost nebo nevhodnost je založena na celkovém poměru u všech zvířat ve zkoušce. Jednotlivá zvířata vykazující neobvykle vysokou aktivitu jak v bederní oblasti, tak i v důsledku šíření z této oblasti jsou také zavzata do konečného hodnocení. Monovalentní várka vyhovuje ve zkoušce, jestliže je požadovaný počet zvířat pozitivní a žádné z histopatologických a klinických vyšetření nevykazuje významný rozdíl v patogenitě mezi vakcinačním virem a referenčním přípravkem. Podmínky vhodnosti jsou uvedeny níže.

účinné od 1. 2. 1998Požadavky. S každou referenční vakcínou (typ 1,2 a 3) se provede vhodný počet neurovirulenčních kvalifikačních zkoušek (např. čtyři zkoušky) a získaná data o její aktivitě slouží jako základ pro požadavky na zkoušenou vakcínu. Celkový průměrný počet lézí (M) pro opakované zkoušky každého referenčního viru se hodnotí společně se shromážděnými výsledky v testu (s2) jako odhad směrodatné odchylky (s).

účinné od 1. 2. 1998Požadavky na platnost výsledků ve zkoušce referenčního přípravku jsou stanoveny na základě kumulativních dat z kvalifikačních zkoušek. Nejsou stanoveny všeobecně platné podmínky; pro pomoc zkoušejícím laboratořím jsou doporučeny následující empirické metody pro získání přijatelných limitů průměrného počtu lézí pro referenční přípravek (Xref).

účinné od 1. 2. 1998Tab. 2.6.19-1

účinné od 1. 2. 1998
Tab. 2.6.19-1
Spodní limitHorní limit
Typy 1 a 2
Typ 3		M - s
M - s/2		M + s
M + s

účinné od 1. 2. 1998Jestliže je průměrný počet lézí ve vakcíně stanoven Xtesta C1, C2 aC 3 jsou konstanty stanovené postupem uvedeným níže, pak vakcína nevyhovuje, jestliže:

účinné od 1. 2. 1998

účinné od 1. 2. 1998Vakcína se může zkoušet znovu, jestliže:

účinné od 1. 2. 1998

účinné od 1. 2. 1998Při opakovaném zkoušení vakcíny se přepočítává průměrný počet lézí ve zkoušené vakcíně a v referenčním přípravku. Přípravek nevyhovuje, jestliže:

účinné od 1. 2. 1998

účinné od 1. 2. 1998Konstanty C1, C2 a C3 se vypočítají ze vzorců:

účinné od 1. 2. 1998

účinné od 1. 2. 1998

účinné od 1. 2. 1998

účinné od 1. 2. 1998v nichž značí:

  1. účinné od 1. 2. 1998N1 - počet pozitivních opic ve zkoušce vakcíny,
  2. účinné od 1. 2. 1998N2 - počet pozitivních opic ve dvou zkouškách,
  3. účinné od 1. 2. 19982,3 - normální odchylku na 1% hladině,
  4. účinné od 1. 2. 19982,6 - normální odchylku na 0,5% hladině,
  5. účinné od 1. 2. 19981,6 - normální odchylku na 5% hladině.

účinné od 1. 2. 1998Zkoušku neurovirulence, v které průměrný počet lézí pro referenční přípravek (Xref) není shodný s údaji z předešlých pokusů, nelze použít pro určení vhodnosti vakcíny. Jestliže je zkouška vakcíny platná, průměrný počet lézí pro zkoušenou vakcínu (Xtest) lze počítat a srovnávat s homotypickou referenční vakcínou.

  1. účinné od 1. 2. 19982.6.20 Hemaglutininy anti-A a anti-B (nepřímá metoda)

    účinné od 1. 2. 1998Připraví se dvě stejné řady postupně ředěného zkoušeného přípravku roztokem chloridu sodného R (9 g/l). Ke každému ředění první řady se přidá stejný objem 5% (V/V) suspenze erytrocytů krevní skupiny A, předem třikrát promytých v roztoku chloridu sodného R (9 g/l). Ke každému ředění druhé řady se přidá stejný objem 5% ( V/V) suspenze erytrocytů skupiny B předem třikrát promytých v roztoku chloridu sodného R (9 g/l). Tyto suspenze se inkubují 30 min při 37 °C a pak se erytrocyty třikrát promyjí v roztoku chloridu sodného R (9 g/l). Erytrocyty se ponechají 30 min v kontaktu s polyvalentním sérem proti lidským globulinům. Bez dalšího odstředění se mikrosko-

  1. účinné od 1. 2. 19982.7 Metody stanovení účinnosti
    1. účinné od 1. 2. 19982.7.1 Imunochemické metody

      účinné od 1. 2. 1998Imunochemické metody jsou založeny na selektivní, reverzibilní a nekovalentní vazbě antigenů s protilátkami. Tyto metody se používají k důkazu nebo ke stanovení antigenů nebo protilátek. Vznik komplexu antigen-protilátka lze dokázat a množství vytvořeného komplexu lze stanovit různými metodami. Ustanovení tohoto obecného článku se vztahují na imunochemické metody používající podle potřeby buď značená nebo neznačená zkoumadla.

      účinné od 1. 2. 1998Výsledky imunochemických metod závisí na experimentálních podmínkách a povaze a kvalitě použitých zkoumadel. Proto je nezbytné standardizovat složky imunochemických stanovení a použít k tomu, pokud to je možné, mezinárodní referenční přípravky pro ně určené.

      účinné od 1. 2. 1998Zkoumadla potřebná pro mnoho imunochemických metod jsou dostupná jako komerční zkušební soupravy, to jsou sady obsahující zkoumadla (zvláště antigen nebo protilátku) a látky určené ke stanovení specifikované substance in vitro, včetně návodu na jejich správné použití. Soupravy se používají podle návodu výrobce. Je důležité ověřit, zda soupravy jsou vhodné pro analýzu zkoušené látky, se zvláštním zřetelem na jejich selektivitu a citlivost. Přehled o soupravách pro imunochemická stanovení připravila Světová zdravotnická organizace (Technical Report Series 658; 1981).

      účinné od 1. 2. 1998Metody používající značený antigen nebo značenou protilátku

      účinné od 1. 2. 1998Metody používající značené látky mohou využívat vhodná značení, jako jsou enzymy, fluorofory, luminofory a radioizotopy. Je-li ke značení použit radioizotop, metoda se nazývá "radioimunoanalýza". Doporučení pro měření radioaktivity uvedená v článku Radiofarmaca lze použít při imunologických stanoveních spojených s radioizotopy. Veškerá práce s radioaktivním materiálem se provádí ve shodě s národním zákonodárstvím a mezinárodně přijatými pravidly o ochraně před radioaktivním zářením.

      účinné od 1. 2. 1998Metody používající neznačený antigen nebo neznačenou protilátku

      účinné od 1. 2. 1998Imunoprecipitační metody

      účinné od 1. 2. 1998Imunoprecipitační metody zahrnují flokulaci a precipitační reakce. Je-li roztok antigenů smíchán za vhodných podmínek s odpovídající protilátkou, reagující složky vytvoří flokulační nebo precipitační agregáty. Poměr reagujících složek, při němž je doba flokulace nejkratší nebo precipitace nejvýraznější, se nazývá optimální poměr a je obvykle tvořen ekvivalentními množstvími antigenu a protilátky. Imunoprecipitace může být stanovena vizuálně nebo metodami rozptylu světla (nefelometrické nebo turbidimetrické stanovení). Použitím částic (např. latex) pokrytých antigenem nebo protilátkou se může dosáhnout zvýšení citlivosti.

      účinné od 1. 2. 1998Ve flokulačních metodách se obvykle používá postupné ředění jedné z reagujících složek, zatímco v imunodifuzních metodách (ID) se ředění dosahuje difuzí do prostředí gelu: získají se koncentrační gradienty jedné nebo obou reagujících složek a v prostředí gelu se tak vytvoří zóny, kde poměr složek podporuje precipitaci. Zatímco flokulační metody se provádějí ve zkumavkách, v metodách imunodifuze se používají různé pomůcky, jako jsou zkumavky, destičky, sklíčka nebo komůrky.

      účinné od 1. 2. 1998Je-li imunoprecipitační systém složen z jednoho antigenů, který se váže na odpovídající protilátku, označuje se jako systém jednoduchý. Zahmuje-li příbuzné, ale sérologicky neidentické reagující složky, je to systém komplexní, a obsahuje-li několik sérologicky nepříbuzných složek, je to systém složený.

      účinné od 1. 2. 1998V jednoduchých difuzních metodách se koncentrační gradient ustaví pouze pro jednu z reagujících složek, která difunduje z vnějšího zdroje do prostředí gelu obsahujícího odpovídající druhou složku v relativně nízké koncentraci.

      účinné od 1. 2. 1998Jednoduchá radiální imunodifuze (SRID) je jednoduchá kvantitativní imunodifuzní technika. Když je dosaženo rovnováhy mezi vnější a vnitřní reagující složkou, vytvářejí se kruhové precipitační plochy kolem bodu s vnější složkou. Plochy jsou přímo úměrné koncentraci antigenu v gelu a nepřímo úměrné koncentraci protilátky v gelu.

      účinné od 1. 2. 1998V metodách dvojité difuze se koncentrační gradienty ustavují pro obě reagující složky. Antigen i protilátka difundují z oddělených míst do původně imunologicky neutrálního gelu.

      účinné od 1. 2. 1998Komparativní metody dvojité imunodifuze se používají pro kvalitativní porovnávání různých antigenů reakcí s vhodnou protilátkou a naopak. Srovnávání je založeno na přítomnosti nebo nepřítomnosti vzájemného působení mezi precipitačními liniemi. Mohou být rozlišeny reakce totožnosti, rozdílnosti nebo částečné totožnosti mezi antigeny nebo protilátkami.

      účinné od 1. 2. 1998Imunoelektroforetické metody

      účinné od 1. 2. 1998Imunoelektroforéza (IE) je kvalitativní technika spojující dvě metody: gelovou elektroforézu s následnou imunodifuzí.

      účinné od 1. 2. 1998Dvojrozměrná imunoelektroforéza je modifikace imunoelektroforetické metody. Je vhodná pro kvalitativní i kvantitativní analýzy. První část postupu je normální gelová elektroforéza, po které jsou z gelu vyříznuty podélné pásky obsahující rozdělené určované frakce a jsou přeneseny na jinou desku. Elektroforéza ve druhém směru se provádí v úhlu 90 ° k předcházející elektroforéze v gelu, který obsahuje poměrně nízkou koncentraci protilátek odpovídajících antigenům. Pro danou koncentraci protilátky a tloušťku gelu je lineární vztah mezi plochou příslušných precipitačních píků a množstvím odpovídajícího antigenu.

      účinné od 1. 2. 1998Elektroimunoanalýza, často označovaná jako raketková imunoelektroforéza, je rychlá kvantitativní metoda pro stanovení antigenů s nábojem odlišným od náboje protilátek nebo naopak. Elektroforéza stanovovaného antigenu se provádí v gelu, který obsahuje poměrně nízkou koncentraci odpovídající protilátky. Zkoušený materiál a roztoky standardního antigenu použité pro kalibraci jsou naneseny do odlišných jamek v gelu. V průběhu elektroforézy se vytvářejí pohyblivé precipitační zóny ve tvaru píků (raketek), které začínají u jamek. Čelo precipitátu se zastaví, není-li již antigen v přebytku. Pro danou koncentraci protilátky platí lineární vztah mezi výškou píku (raketky) precipitátu a množstvím použitého antigenu.

      účinné od 1. 2. 1998Protisměrná imunoelektroforéza je rychlá kvantitativní metoda, která umožňuje, aby se v elektrickém poli ustavil koncentrační gradient vnějšího antigenu a vnější protilátky v závislosti na odlišných nábojích. Naředěné roztoky standardů pro kalibraci a ředění zkoušené látky se nanesou do řady jamek v gelu a stálé množství odpovídající reagující složky je naneseno do protilehlé řady jamek. Titr zkoušené látky může být určen jako nejvyšší ředění, při kterém se tvoří precipitační linie.

      účinné od 1. 2. 1998Existuje mnoho modifikací dvourozměrné a raketkové imunoelektroforézy.

      účinné od 1. 2. 1998Jiné techniky spojují dělení antigenů podle velikosti molekuly a sérologických vlastností.

      účinné od 1. 2. 1998Zviditelnění a charakterizace imunoprecipitačních linií

      účinné od 1. 2. 1998Může se provádět selektivním nebo neselektivním barvením, fluorescencí, značením enzymy nebo izotopy nebo jinou vhodnou technikou. Metody selektivního barvení se obvykle používají pro charakterizaci nebílkovinných látek v precipitátech.

      účinné od 1. 2. 1998V průsvitných gelech, jako jsou gely agaru nebo agarosy, jsou precipitační linie v gelu jasně viditelné, pokud je vhodná koncentrace reagujících složek.

      účinné od 1. 2. 1998Validace metod

      účinné od 1. 2. 1998Validační požadavky

      1. účinné od 1. 2. 1998Kvantitativní imunochemická metoda je platná, jestliže:
        1. účinné od 1. 2. 19981. protilátka nebo antigen nerozlišuje signifikantně mezi zkouškou a standardem. V případě značených reagujících složek odpovídající složka nerozlišuje signifikantně mezi značenou a neznačenou látkou;
        2. účinné od 1. 2. 19982. metoda není ovlivněna zkoušenou matricí, to je žádnou složkou zkoušeného vzorku nebo jeho pomocnými látkami, které se mohou u vzorků lišit. V tom mohou být zahrnuty vysoké koncentrace jiných bílkovin, solí a konzervačních látek nebo kontaminující proteolytické aktivity,
        3. účinné od 1. 2. 19983. limit kvantitativního vyjádření je nižší než přijatá kritéria uvedená v jednotlivém článku;
        4. účinné od 1. 2. 19984. přesnost metody je taková, že odchylky výsledků vyhovují požadavkům uvedeným v jednotlivých článcích;
        5. účinné od 1. 2. 19985. při postupu v provedení zkoušky nevznikají systematické chyby.

      účinné od 1. 2. 1998Validační metody

      účinné od 1. 2. 1998Ke splnění těchto požadavků validační plán obsahuje následující prvky:

      1. účinné od 1. 2. 19981. stanovení se provede nejméně třikrát,
      2. účinné od 1. 2. 19982. stanovení se provede nejméně se třemi různými ředěními standardu a třemi ředěními vzorku, které mají předpokládanou podobnou účinnost jako ředění standardu,
      3. účinné od 1. 2. 19983. plán stanovení má náhodné uspořádání,
      4. účinné od 1. 2. 19984. je-li zkoušená látka předložena ve formě séra nebo smíchána s dalšími látkami, je standard rovněž připraven stejným způsobem,
      5. účinné od 1. 2. 19985. zkouška zahrnuje měření nespecifické vazby značené reagující složky,
      6. účinné od 1. 2. 19986. pro vytěsňovací imunologické stanovení:
        1. účinné od 1. 2. 1998a) je určena maximální vazba (nulové vytěsnění),
        2. účinné od 1. 2. 1998b) ředění zasahují úplnou reakční řadu od hodnot blízkých nespecifické vazbě až po maximální vazbu, přednostně jak pro standard, tak pro zkoušené přípravky.

      účinné od 1. 2. 1998Statistické výpočty

      účinné od 1. 2. 1998K vyhodnocení výsledků mohou být analyzovány reakční křivky pro vzorek a standard metodami popsanými ve stati Statistické hodnocení výsledků biologických zkoušek (5.3).

      účinné od 1. 2. 1998Signifikantní nerovnoběžnost ukazuje, že protilátka nebo antigen rozlišují mezi vzorkem a standardem a výsledky nejsou platné.

      účinné od 1. 2. 1998Ve vytěsňovacích imunologických stanoveních nesmí být hodnoty nespecifické vazby a maximálního vytěsnění při vysokých koncentracích vzorku nebo standardu signifikantně rozdílné. Rozdíly mohou ukazovat na vliv matrice, která způsobí buď inhibici vazby nebo degradaci značení.

    1. účinné od 1. 2. 19982.7.2 Mikrobiologické stanovení účinnosti antibiotik

      účinné od 1. 2. 1998Účinnost antibiotika se stanoví porovnáním inhibice růstu citlivých mikroorganismů vyvolané známými koncentracemi zkoušeného antibiotika a referenční látky.

      účinné od 1. 2. 1998Referenční látky použité ke stanovení jsou ty, jejichž účinnost byla přesně stanovena v poměru k odpovídajícímu mezinárodnímu standardu nebo mezinárodnímu referenčnímu přípravku.

      účinné od 1. 2. 1998Plán stanovení je takový, aby dovolil ověřit validitu matematického modelu, na němž je založeno porovnání účinnosti. Je-li vybrán model rovnoběžných přímek, dvě logaritmické přímky dávky a odpovědi (nebo transformované odpovědi) zkoušeného přípravku a referenčního přípravku jsou rovnoběžné a jsou lineární v intervalu dávek použitých k výpočtu. Tyto podmínky se validují pro danou hladinu pravděpodobnosti, obvykle P = 0,05. Jiné matematické modely, jako model např. regresního poměru, mohou být též použity, je-li prokázána validita zkoušky.

      účinné od 1. 2. 1998Pokud není v článku uvedeno jinak, je interval spolehlivosti (P = 0,95) stanovení nejméně 95 % a nejvýše 105 % stanovené účinnosti. Stanovení se provádí metodou A nebo metodou B.

      1. účinné od 1. 2. 1998A. Difuzní metoda

        účinné od 1. 2. 1998Živná půda vhodná pro stanovení (viz níže) se rozehřeje a při vhodné teplotě, např. 48 °C až 50 °C pro vegetativní formy, se naočkuje suspenzí mikroorganismů citlivých na zkoušené antibiotikum v takovém množství, které vytváří zřetelně ohraničené inhibiční zóny o průměru přiměřeném koncentraci zkoušeného antibiotika. Naočkovaná půda se ihned vylije do Petriho misek nebo velkých pravoúhlých misek (ploten) v takovém množství, aby se vytvořila jednolitá vrstva silná 2 mm až 5 mm. Živná půda může být též vylita ve dvou vrstvách, z nichž jenom vrchní j e naočkována. Takto připravené misky se uchovávají tak, aby před použitím nedošlo k viditelnému růstu mikroorganismů nebo k jejich usmrcení a aby povrch půd byl v čase použití suchý.

        účinné od 1. 2. 1998Pro přípravu roztoků stejných koncentrací zkoušeného přípravku a referenční látky se použijí rozpouštědla a tlumivé roztoky uvedené v tabulce 2.7.2-1. Roztoky se nanesou buď na povrch půdy, např. do sterilních cylindříků z porcelánu, z nerezavějící oceli, případně z jiných vhodných materiálů, nebo do otvorů vyříznutých v živné půdě. Objem roztoků v každém cylindříků nebo otvoru musí být stejný. Lze též použít sterilní disky z absorbujícího papíru vhodné kvality, které se před položením na půdu napustí roztoky referenční látky nebo zkoušeného antibiotika.

        účinné od 1. 2. 1998K ověření platnosti stanovení se použijí nejméně tři rozdílné dávky referenční látky a tři odpovídající dávky zkoušeného antibiotika. Doporučuje se používat geometrickou řadu dávek. Při běžných zkouškách účinnosti, u nichž je prokázán lineární průběh systému na přiměřeném počtu třídávkových stanovení a u nichž s tím souhlasí oprávněná autorita, nebo může postačovat i dvoudávkové stanovení; ve všech sporných případech se však použije metoda třídávková referenční látky a rovněž tři dávky zkoušeného antibiotika o předpokládané stejné účinnosti jako dávky referenční látky.

        účinné od 1. 2. 1998Do každé Petriho misky nebo pravoúhlé misky se nanesou roztoky podle statisticky vhodného plánu. V případě malých misek, které nepojmou více než šest roztoků, se doporučuje měnit umístění roztoku zkoušeného antibiotika a referenční látky, aby se zabránilo interakcím koncentrovanějších roztoků.

        účinné od 1. 2. 1998Inkubuje se při vhodné teplotě asi 18 h. Doba předinkubační difuze, obvykle 1 h až 4 h, při pokojové teplotě nebo 4 °C, může být vhodná k potlačení účinku časových rozdílů mezi aplikací roztoků a tak zlepšit regresi.

        účinné od 1. 2. 1998Změří se průměry kruhových inhibičních zón s přesností nejméně 0,1 mm nebo jejich plochy s odpovídající přesností. Pomocí vhodných statistických metod se vypočítá účinnost zkoušeného antibiotika.

        účinné od 1. 2. 1998V každé zkoušce se použije pro každou dávku tolik inhibičních zón, aby byla zajištěna požadovaná přesnost. Stanovení účinnosti může být opakováno a výsledky mohou být statisticky sloučeny, aby se dosáhlo požadované přesnosti stanovení a ověřilo se, že účinnost antibiotika není menší než požadované minimum.

        účinné od 1. 2. 1998Tab. 2.7.2-1 Difuzní metoda

        účinné od 1. 2. 1998
        Tab. 2.6.19-1 Metody používající značený antigen nebo značenou protilátku Metody používající neznačený antigen nebo neznačenou protilátku Imunoprecipitační metody Imunoelektroforetické metody Zviditelnění a charakterizace imunoprecipitačních linií Validace metod Validační požadavky Validační metody Statistické výpočty Tab. 2.7.2-1 Difuzní metoda
        AntibiotikumReferenční
        látka        		Rozpouštědlo k přípravě základního roztokuTlumivý roztok (pH)MikroorganismusPůda
        a konečné pH (± 0,1)        		Inkubační teplota ve °C
        Bacitracinum zincicumBacitracinum zincicum CRLkyselina chlorovodíková 0,01 mol/l VSpH 7,0
        (0,05 mol/l)        		Micrococcus flavus NCTC 7743
        CIP 53.160
        ATCC 10240
        CCM 732
        CNCTC M 8/58        		A - pH 7,035 až 39
        Bleomycini
        sulfas        		Bleomycini sulfas CRLvoda RpH 6,8
        (0,1 mol/l)        		Mycobacterium smegmatis
        ATCC 607
        CCM 4622
        CNCTC My 23/64        		G - pH 7,035 až 37
        Colistini sulfasColistini sulfas CRLBordetella bronchiseptica
        NCTC 8344
        CIP 53.157
        ATCC 4617
        CCM 4416
        CNCTC Brb 5/63
        Escherichia coli
        NCIB 8879
        CIP 54.127
        ATCC 10536
        CCM 3988
        CNCTC Ec 326/71        		B - pH 7,335 až 39
        Colistimethatum natricumColistimethatum natricum CRLvoda RpH 6,0
        (0,05 mol/l)        		B - pH 7,335 až 39
        Dihydrostreptomycini sulfasDihydrostreptomycini sulfas CRLvoda RpH 8,0
        (0,05 mol/l)        		Bacillus subtilis
        NCTC 8236
        CIP 1.83
        CCM 2217
        CNCTC Bs 17/65
        Bacillus subtilis
        NCTC 10400
        CIP 52.62
        ATCC 6633
        CCM 1999
        CNCTC Bs 8/58        		A - pH 7,930 až 37
        A - pH 7,930 až 37
        Erythromycini estolas Erythromycini ethylsuccinas Erythromycini
        stearas        		Erythromycinum CRLmethanol R viz článkypH 8,0
        (0,05 mol/l)        		Bacillus pumilus
        NCTC 8241
        CIP 76.18
        CCM 2218
        CNCTC Bac 2/65
        Bacillus subtilis
        NCTC 10400
        CIP 52.62
        ATCC 6633
        CCM 1999
        CNCTC Bs 8/58        		A - pH 7,930 až 37
        methanol RA - pH 7,930 až 37
        Framycetini
        sulfas        		Framycetini sulfas CRLvoda RpH 8,0
        (0,05 mol/l)        		Bacillus subtilis
        NCTC 10400
        CIP 52.62
        ATCC 6633
        CCM 1999
        CNCTC Bs 8/58
        Bacillus pumilus
        NCTC 8241
        CIP 76.18
        CCM 2218
        CNCTC Bac 2/65        		E - pH 7,930 až 37
        E - pH 7,930 až 37
        Gentamicini
        sulfas        		Gentamicini sulfas CRLvoda RpH 8,0
        (0,05 mol/l)        		Bacillus pumilus
        NCTC 8241
        CIP 76.18
        CCM 2218
        CNCTC Bac 2/65
        Staphylococcus epidermidis
        NCIB 8853 CIP 68.21
        ATCC 12228
        CCM 4418
        CNCTC M 12/63        		A - pH 7,935 až 39
        A - pH 7,935 až 39
        Kanamycini monosulfas

        Kanamycini
        sulfas acidus        		Kanamycini monosulfas CRL voda R pH 8,0
        (0,05 mol/l)        		Bacillus subtilis
        NCTC 10400
        CIP 52.62
        ATCC 6633
        CCM 1999
        CNCTC Bs 8/58
        Staphylococcus aureus
        NCTC 7447
        CIP 53.156
        ATCC 6538P
        CCM 2022
        CNCTC Mau 28/58        		A - pH 7,930 až 37
        A - pH 7,935 až 39
        Neomycini
        sulfas        		Neomycini sulfas CRLvoda RpH 8,0
        (0,05 mol/l)        		Bacillus pumilus
        NCTC 8241
        CIP 76.18
        CCM 2218
        CNCTC Bac 2/65
        Bacillus subtilis
        NCTC 10400
        CIP 52.62
        ATCC 6633
        CCM 1999
        CNCTC Bs 8/58        		E - pH 7,930 až 37
        E - pH 7,930 až 37
        NystatinumNystatinum CRLdimethylformamid RpH 6,0
        (0,05 ml/l) obsahující
        5 % (V/V) dimethylformamidu R        		Saccharomyces cerevisiae
        NCYC 87
        CIP 1432.83
        ATCC 9763
        CCM 8191
        CNCTC 51/65        		F - pH 6,030 až 32
        Polymyxini B
        sulfas        		Polymyxini B sulfas CRLvoda RpH 6,0
        (0,05 mol/l)        		Bordetella bronchiseptica
        NCTC 8344
        CIP 53.157
        ATCC 4617
        CCM 4416
        CNCTC Brb 5/63        		B - pH 7,335 až 39
        Rifamycinum natricumRifamycinum natricum CRLmethanol RpH 7,0
        (0,05 mol/l)        		Micrococcus flavus
        NCTC 8340
        CIP 53.45
        ATCC 9341
        CCM 552
        CNCTC Sar 5/58        		A - pH 6,635 až 39
        SpiramycinumSpiramycinum CRLmethanol RpH 8,0
        (0,05 mol/l)        		Bacillus subtilis
        NCTC 10400
        CIP 52.62
        ATCC 6633
        CCM 1999
        CNCTC Bs 8/58        		A - pH 7,930 až 32
        Streptomycini
        sulfas        		Streptomycini sulfas CRLvoda RpH 8,0
        (0,05 mol/l)        		Bacillus subtilis
        NCTC 8236
        CIP 1.83
        CCM 2217
        CNCTC Bs 17/65
        Bacillus subtilis
        NCTC 10400
        CIP 52.62
        ATCC 6633
        CCM 1999
        CNCTC Bs 8/58        		A - pH 7,930 až 37
        A - pH 7,930 až 37
        TobramycinumTobramycinum CRLvoda RpH 8,0
        (0,05 mol/l)        		Bacillus subtilis
        NCTC 10400
        CIP 52.62
        ATCC 6633
        CCM 1999
        CNCTC Bs 8/58        		A - pH 7,930 až 37
        Vancomycini hydrochloridumVancomycini hydrochloridum CRLvoda RpH 8,0Bacillus subtilis
        NCTC 10400
        CIP 52.62
        ATCC 6633
        CCM 1999
        CNCTC Bs 8/58        		A - pH 8,037 až 39
      1. účinné od 1. 2. 1998B. Turbidimetrická metoda

        účinné od 1. 2. 1998Vhodná živná půda se inokuluje suspenzí vybraného mikroorganismu, který je citlivý na zkoušené antibiotikum tak, aby v podmínkách zkoušky bylo dosaženo vhodného potlačení růstu mikrobiální kultury. Použije se známé množství suspenze vybrané tak, aby byl asi po čtyřhodinové inkubaci dobře měřitelný zákal.

        účinné od 1. 2. 1998Inokulovaná půda se musí použít ihned po naočkování.

        účinné od 1. 2. 1998Použije se rozpouštědlo a tlumivý roztok uvedený v tabulce 2.7.2-2 pro přípravu roztoků referenční látky a roztoků zkoušeného antibiotika ve známých koncentracích, u nichž se předpokládá stejná účinnost. K ověření platnosti stanovení se použijí nejméně tři dávky referenční látky a tři odpovídající dávky zkoušené látky. Doporučuje se použít geometrickou řadu dávek. K dosažení linearity je někdy nutné vybrat z většího počtu tří dávek za použití odpovídajících dávek referenční látky a zkoušené látky.

        účinné od 1. 2. 1998Použijí se stejné zkumavky. Do každé z nich se převede stejný objem roztoků a stejný objem naočkované živné půdy (např. 1 ml roztoku a 9 ml živné půdy).

        účinné od 1. 2. 1998Zároveň se připraví dvě kontrolní zkumavky bez antibiotika a s naočkovanou živnou půdou a do jedné se ihned přidá 0,5 ml formaldehydu R. Tyto zkumavky slouží ke standardizaci optického přístroje použitého k měření růstu.

        účinné od 1. 2. 1998Zkumavky se umístí buď náhodně, nebo podle latinského čtverce, nebo náhodného bloku do vodní lázně nebo jiného vhodného přístroje dovolujícího uvést rychle všechny zkumavky na uvedenou inkubační teplotu. Uchovávají se při této teplotě 3 h až 4 h a zabezpečí se stejná teplota a stejná doba inkubace.

        účinné od 1. 2. 1998Po inkubaci se zastaví ve všech zkumavkách růst mikroorganismů přidáním 0,5 ml formaldehydu R nebo zahřátím a změří se zákal s přesností na tři místa za použití vhodného optického přístroje. Alternativně lze použít jiný postup, který dovoluje měřit zákal každé zkumavky po stejné době inkubace.

        účinné od 1. 2. 1998Vypočítá se účinnost za pomoci vhodných statistických metod.

        účinné od 1. 2. 1998Linearita vztahu dávka-odpověď, transformovaná nebo netransformovaná, je často získána pouze ve velmi omezeném intervalu; je to ten interval, který se má použít pro výpočet účinnosti a obsahuje nejméně tři následné dávky dovolující ověřit linearitu. Při běžných zkouškách, pokud byla linearita systému prokázána na přiměřeném počtu třídávkových stanovení, postačí, pokud oprávněná autorita s tím souhlasí, použít k titraci jen dvě dávky. Ve všech sporných případech se však použije třídávková metoda.

        účinné od 1. 2. 1998V každé zkoušce se použije pro každou dávku tolik zkumavek, aby byla zajištěna požadovaná přesnost. Stanovení účinnosti může být opakováno a výsledky mohou být statisticky sloučeny, aby se dosáhlo požadované přesnosti stanovení a ověřilo se, že účinnost zkoušeného antibiotika není menší než požadované minimum.

        účinné od 1. 2. 1998Tab. 2.7.2-2 Turbidimetrická metoda

        účinné od 1. 2. 1998
        Tab. 2.6.19-1 Metody používající značený antigen nebo značenou protilátku Metody používající neznačený antigen nebo neznačenou protilátku Imunoprecipitační metody Imunoelektroforetické metody Zviditelnění a charakterizace imunoprecipitačních linií Validace metod Validační požadavky Validační metody Statistické výpočty Tab. 2.7.2-1 Difuzní metoda Tab. 2.7.2-2 Turbidimetrická metoda
        AntibiotikumReferenční látkaRozpouštědlo k přípravě základního roztokuTlumivý roztok (pH)MikroorganismusPůda a konečné pH (± 0,1)Inkubační teplota ve °C
        Colistini sulfasColistini sulfas
        CRL        		Escherichia
        coli
        NCIB 8666
        CIP 2.83
        ATCC 9637
        CCM 2024        		C - pH 7,035 až 37
        Colistimethatum
        natricum        		Colistimethatum natricum
        CRL        		voda RpH 7,0
        Dihydrostreptomycini
        sulfas        		Dihydro-
        streptomycini
        sulfas CRL        		voda RpH 8,0Klebsiella
        pneumoniae
        NCTC 7427
        CIP 53.153
        ATCC 10031
        CCM 4415
        CNCTC Klp
        85/69        		C - pH 7,035 až 37
        Erythromycini
        estolas        		Erythromycinum CRLmethanol R viz článkyKlebsiella
        pneumoniae
        NCTC 7427
        CIP 53.153
        ATCC 10031
        CCM 4415
        CNCTC Klp
        85/69
        Staphylococcus
        aureus
        NCTC 7447
        CIP 53.156
        ATCC 6538 P
        CCM 2022
        CNCTC Mau
        28/58        		D - pH 7,035 až 37
        Erythromycini
        ethylsuccinas        		pH 8,0
        Erythromycini
        stearas        		C - pH 7,035 až 37
        Framycetini sulfasFramycetini
        sulfas CRL        		voda RpH 8,0Staphylococcus
        aureus
        NCTC 7447
        CIP 53.156
        ATCC 6538 P
        CCM 2022
        CNCTC Mau
        28/58        		C - pH 7,035 až 37
        Gentamicini sulfasGentamicini
        sulfas CRL        		voda RpH 7,0Staphylococcus aureus
        NCTC 7447
        CIP 53.156
        ATCC 6538P
        CCM 2022
        CNCTC Mau
        28/58        		C - pH 7,035 až 37
        GramicidinGramicidin
        CRL        		methanol RpH 7,01)Streptococcus
        faecalis
        ATCC 10541
        CCM 4533
        CNCTC Str
        6/58
        Staphylococcus
        aureus
        ATCC 6538P
        CCM 2022
        CNCTC Mau
        28/58        		C - pH 7,035 až 37
        Kanamycini
        monosulfas        		Kanamycini
        monosulfas
        CRL        		voda RpH 8,0Staphylococcus
        aureus
        NCTC 7447
        CIP 53.156
        ATCC 6538 P
        CCM 2022
        CNCTC Mau
        28/58        		C - pH 7,035 až 37
        Kanamycini
        sulfas acidus
        Neomycini sulfasNeomycini
        sulfas CRL        		voda RpH 8,0Staphylococcus
        aureus
        NCTC 7447
        CIP 53.156
        ATCC 6538P
        CCM 2022
        CNCTC Mau
        28/58        		C - pH 7,035 až 37
        Rifamycinum
        natricum        		Rifamycinum
        natricum CRL        		methanol RpH 7,0Escherichia
        coli
        NICB 8879
        CIP 54.127
        ATCC 10536
        CCM 3988
        CNCTC Ec 32-
        6/71        		C - pH 7,035 až 37
        SpiramycinumSpiramycinum
        CRL        		methanol RpH 7,0Staphylococcus
        aureus
        NCTC 7447
        CIP 53.156
        ATCC 6538P
        CCM 2022
        CNCTC Mau
        28/58        		C - pH 7,035 až 37
        Streptomycini sulfasStreptomycini sulfas CRLvoda RpH 8,0Klebsiella pneumoniae NCTC 7427 CIP 53.153 ATCC 10031 CCM 4415 CNCTC Klp 85/69C - pH 7,035 až 37
        TobramycinumTobramycinum CRLvoda RpH 7,0Staphylococcus aureus NCTC 7447 CIP 53.156 ATCC 6538 P CCM 2022 CNCTC Mau 28/58 NCTC 6571 CIP 53.154 ATCC 9144 CCM 2107 CNCTC Mau 76/69C - pH 7,035 až 37
        Vancomycini hydrochloridumVancomycini hydrochloridum CRLvoda RpH 8,0Staphylococcus aureus CIP 53.156 ATCC 6538P CCM 2022 CNCTC Mau 28/58C - pH 7,037 až 39

        účinné od 1. 2. 1998Následující část se uvádí jako informace a rady; netvoří část, jež by byla v rozporu s obecnou metodou.

      účinné od 1. 2. 1998Doporučení pro mikrobiologické stanovení účinnosti antibiotik

      účinné od 1. 2. 1998Následující text uvádí doporučené mikroorganismy a podmínky zkoušky. Jiné mikroorganismy se mohou použít, pokud mají stejnou citlivost na zkoušené antibiotikum a jsou použity ve vhodné živné půdě a vhodných podmínkách teploty a pH. Výběr koncentrací roztoků musí zaručit, že v podmínkách zkoušky existuje lineární vztah mezi logaritmem dávky a odpovědí.

      účinné od 1. 2. 1998Příprava inokula

      účinné od 1. 2. 1998Bacillus cereus vac. mycoides, Bacillus subtilis, Bacillus pumilus. Suspenze spor použitého mikroorganismu se připraví takto:

      účinné od 1. 2. 1998Mikroorganismy se kultivují 7 dní při 35 °C až 37 °C na vhodné pevné půdě, do které byl přidán síran manganatý R (1 mg/l). Nárůst, který obsahuje zejména spory, se spláchne sterilní vodou R. Suspenze se 30 min zahřívá na 70 °C a potom se zředí na přiměřenou koncentraci spor, obvykle 10 . 106 až 100 . 106 v ml. Suspenze spor se mohou uchovávat po dlouhou dobu při teplotě nepřevyšující 4 °C.

      účinné od 1. 2. 1998Alternativně se mohou suspenze spor připravit kultivací mikroorganismů v půdě C při 26 °C po dobu 4 až 6 dní. Potom se asepticky přidá dostatek síranu manganatého R do koncentrace 1 mg/l a inkubuje se dalších 48 h. V suspenzi se mikroskopicky zjistí, zda proběhla přiměřená tvorba spor (asi 80 %) a suspenze se odstředí. Sediment se resuspenduje ve sterilní vodě R tak, aby se dosáhla koncentrace spor v ml 10 . 106 až 100 . 106 a potom se zahřívá 30 min na 70 °C. Suspenze se uchovává při teplotě nepřevyšující 4 °C.

      účinné od 1. 2. 1998Bordetella bronchiseptica. Testovací mikroorganismus se kultivuje na půdě B 16 h až 18 h při 35 °C až 37 °C. Nárůst se smyje sterilní vodou R a zředí na vhodný zákal.

      účinné od 1. 2. 1998Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Micrococcus flavus, Staphylococcus epidermidis. Připraví se stejně, jak je popsáno v odstavci Bordetella bronchiseptica, ale použije se půda A a naředí se na takový zákal, který při turbidimetrickém stanovení poskytuje uspokojující vztah dávky k odpovědi nebo při difuzním stanovení vytváří zřetelně ohraničené inhibiční zóny postačujícího průměru.

      účinné od 1. 2. 1998Saccharomyces cerevisiae, Candida tropicalis. Testovací mikroorganismus se kultivuje 24 h na půdě F při 30 °C až 37 °C. Nárůst se smyje sterilním roztokem chloridu sodného R (9 g/l) a zředí se jím na vhodný zákal.

      účinné od 1. 2. 1998Tlumivé roztoky

      účinné od 1. 2. 1998Tlumivé roztoky o pH v rozmezí 5,8 až 8,0 se připraví smícháním 50,0 ml dihydrogenfosforečnanu draselného 0,2 mol/l RS s množstvím hydroxidu sodného 0,2 mol/l VS uvedeným v následující tabulce a doplněním čerstvě připravenou vodou destilovanou R na 200,0 ml.

      účinné od 1. 2. 1998Tab. 2.7.2-3

      účinné od 1. 2. 1998
      Tab. 2.6.19-1 Metody používající značený antigen nebo značenou protilátku Metody používající neznačený antigen nebo neznačenou protilátku Imunoprecipitační metody Imunoelektroforetické metody Zviditelnění a charakterizace imunoprecipitačních linií Validace metod Validační požadavky Validační metody Statistické výpočty Tab. 2.7.2-1 Difuzní metoda Tab. 2.7.2-2 Turbidimetrická metoda Doporučení pro mikrobiologické stanovení účinnosti antibiotik Příprava inokula Tlumivé roztoky Tab. 2.7.2-3
      pHMnožství hydroxidu sodného 0,2 mol/l VS v ml
      5,83,72
      6,05,70
      6,28,60
      6,412,60
      6,617,80
      6,823,65
      7,029,63
      7,235,00
      7,439,50
      7,642,80
      7,845,20
      8,046,80

      účinné od 1. 2. 1998Tyto tlumivé roztoky se použijí pro všechny mikrobiologické zkoušky uvedené v tabulce 2.7.2-1 s výjimkou bleomyciniumsulfatu, pro který se tlumivý roztok o pH 6,8 připraví takto: rozpustí se 6,4 g dihydrogenfosforečnanu draselného R a 18,9 g hydrogenfosforečnanu sodného R ve vodě R a zředí se na 1000,0 ml.

      účinné od 1. 2. 1998Živné půdy

      účinné od 1. 2. 1998Mohou se použít následující půdy nebo půdy jim rovnocenné.

      účinné od 1. 2. 1998
      Tab. 2.6.19-1 Metody používající značený antigen nebo značenou protilátku Metody používající neznačený antigen nebo neznačenou protilátku Imunoprecipitační metody Imunoelektroforetické metody Zviditelnění a charakterizace imunoprecipitačních linií Validace metod Validační požadavky Validační metody Statistické výpočty Tab. 2.7.2-1 Difuzní metoda Tab. 2.7.2-2 Turbidimetrická metoda Doporučení pro mikrobiologické stanovení účinnosti antibiotik Příprava inokula Tlumivé roztoky Tab. 2.7.2-3 Živné půdy
      Půda A
      pepton6 g
      pankreatický hydrolyzát kaseinu4 g
      hovězí výtažek1,5 g
      kvasničný výtažek3 g
      glukosa monohydrát1 g
      agar15 g
      vodado 1000 ml
      Půda B
      pankreatický hydrolyzát kaseinu17 g
      papainový hydrolyzát sóji3 g
      chlorid sodný5 g
      hydrogenfosforečnan draselný2,5 g
      glukosa monohydrát2,5 g
      agar15 g
      polysorbát 8010 g
      vodado 1000 ml

      účinné od 1. 2. 1998Polysorbát 80 se přidá k horkému roztoku ostatních složek po jejich rozvaření a bezprostředně před upravením objemu.

      účinné od 1. 2. 1998
      Tab. 2.6.19-1 Metody používající značený antigen nebo značenou protilátku Metody používající neznačený antigen nebo neznačenou protilátku Imunoprecipitační metody Imunoelektroforetické metody Zviditelnění a charakterizace imunoprecipitačních linií Validace metod Validační požadavky Validační metody Statistické výpočty Tab. 2.7.2-1 Difuzní metoda Tab. 2.7.2-2 Turbidimetrická metoda Doporučení pro mikrobiologické stanovení účinnosti antibiotik Příprava inokula Tlumivé roztoky Tab. 2.7.2-3 Živné půdy
      Půda C
      pepton6 g
      hovězí výtažek1,5 g
      kvasničný výtažek3 g
      chlorid sodný3,5 g
      glukosa monohydrát1 g
      hydrogenfosforečnan draselný3,68 g
      dihydrogenfosforečnan draselný1,32 g
      vodado 1000 ml
      Půda D
      výtažek ze srdce1,5 g
      kvasničný výtažek1,5 g
      pepton z kaseinu5,0 g
      glukosa monohydrát1 g
      chlorid sodný3,5 g
      hydrogenfosforečnan draselný3,68 g
      dihydrogenfosforečnan draselný1,32 g
      dusičnan draselný2 g
      vodado 1000 ml
      Půda E
      pepton5 g
      masový výtažek3 g
      hydrogenfosforečnan sodný dodekahydrát26,9 g
      agar10 g
      vodado 1000 ml

      účinné od 1. 2. 1998Hydrogenfosforečnan sodný se přidá jako sterilní roztok po sterilizaci půdy.

      účinné od 1. 2. 1998
      Tab. 2.6.19-1 Metody používající značený antigen nebo značenou protilátku Metody používající neznačený antigen nebo neznačenou protilátku Imunoprecipitační metody Imunoelektroforetické metody Zviditelnění a charakterizace imunoprecipitačních linií Validace metod Validační požadavky Validační metody Statistické výpočty Tab. 2.7.2-1 Difuzní metoda Tab. 2.7.2-2 Turbidimetrická metoda Doporučení pro mikrobiologické stanovení účinnosti antibiotik Příprava inokula Tlumivé roztoky Tab. 2.7.2-3 Živné půdy
      Půda F
      pepton9.4 g
      kvasničný výtažek4,7 g
      hovězí výtažek2.4 g
      chlorid sodný30,0 g
      glukosa monohydrát10,0 g
      agar23,5 g
      vodado 1000 ml
      Půda G
      glycerol10 g
      pepton10 g
      masový výtažek10 g
      chlorid sodný3 g
      agar15 g
      vodado 1000 ml
      pH 7 ± 1 po sterilizaci
    1. účinné od 1. 2. 19982.7.3 Stanovení účinností kortikotropinu

      účinné od 1. 2. 1998Podstata zkoušky. Účinnost kortikotropinu je přímo úměrná poklesu obsahu kyseliny askorbové v nadledvinách potkana po hypofyzektomii. Stanovení se provádí v porovnání s účinkem mezinárodního standardu kortikotropinu nebo referečního přípravku, kalibrovaného v mezinárodních jednotkách.

      účinné od 1. 2. 1998Mezinárodní jednotka je účinnost obsažená v deklarovaném množství mezinárodního standardu, kterým je čištěný a lyofilizovaný prasečí kortikotropin smíchaný s laktosou.

      účinné od 1. 2. 1998Hodnotu účinnosti mezinárodního standardu v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Světová zdravotnická organizace.

      účinné od 1. 2. 1998Pro stanovení se použijí laboratorní potkani o hmotnosti 100 g až 200 g, při čemž rozdíl mezi nejlehčím a nejtěžším zvířetem ve skupině nemá být větší než 15 g. Potkani se chovají za standardních podmínek nejméně 7 dní před pokusem. Den před vlastní zkouškou se zvířata zváží a provede se hypofyzektomie.2) Po operaci se potkani umístí do místnosti se stálou teplotou mezi 24 °C až 27 °C a kromě standardní diety a vody se jim umožní volný přístup k roztoku, obsahujícímu glukosu R (50 g/l) a chlorid sodný R (1,8 g/l). Není-li předepsáno jinak, referenční přípravek i zkoušený přípravek se rozpustí v kyselině chlorovodíkové 0,01 mol/l RS na koncentraci odpovídající 5 m.j. kortikotropinu v 1 ml. K dalšímu ředění pro odstupňované dávky se použije roztok želatiny R (150 g/l). Roztoky se použijí nejpozději do 4 h po přípravě. Za 18 h až 36 h po hypofyzektomii se potkani znovu zváží a rozdělí do šesti skupin po osmi až deseti zvířatech. Třem skupinám se podává referenční přípravek a třem skupinám zkoušený přípravek ve třech odstupňovaných dávkách. Dávky se volí tak, aby po nejnižší dávce nastalo již hodnotitelné snížení obsahu kyseliny askorbové v nadledvinách a po nejvyšší nebylo ještě dosaženo největší snížení. Dávky se přepočtou na tělesnou hmotnost jednotlivého potkana a vstříknou se podkožně v objemu 0,5 ml/kg. Obvykle jsou vhodné dávky v pořadí: 1,0 m.j., 0,5 m.j. a 0,25 m.j. kortikotropinu na 100 g tělesné hmotnosti.

      účinné od 1. 2. 1998Přesně za tři hodiny po podání kortikotropinu se každému potkanovi v celkové anestezii vyjmou obě nadledviny, rychle se očistí od cizí tkáně a co nejrychleji se zváží, aby se předešlo ztrátě hmotnosti.

      účinné od 1. 2. 1998Vloží se do homogenizační zkumavky obsahující 2 ml čerstvě připraveného roztoku kyseliny metafosforečné R (25 g/l). Potkani se usmrtí a provede se kontrola úplnosti hypofyzektomie.

      účinné od 1. 2. 1998Nadledviny se zhomogenizují a obsah zkumavky se zředí stejným roztokem kyseliny metafosforečné R (25 g/l) na 10 ml. Za 30 min stání při pokojové teplotě se homogenát odstřeďuje a 7 ml čiré supematantní tekutiny se přidá k čerstvě připravené směsi tohoto složení: 7 ml roztoku octanu sodného R (45,3 g/l) upraveného přidáním kyseliny octové R na pH 7,3 ml vody R, 2 ml dichlotfenolin dofenolatu sodného RS.

      účinné od 1. 2. 1998Za 30 s po smíchání se měří kolorimetricky absorpce. Použije se filtr s největší transmisí při 470 nm a transmise s rozsahem od 450 nm do 520 nm. Obsah kyseliny askorbové se odečte ze standardní kalibrační křivky, která se sestrojí z výsledků měření vhodných objemů čerstvě připraveného roztoku kyseliny askorbové R přidaných do roztoku kyseliny metafosforečné R (25 g/l). Obsah kyseliny askorbové se vyjádří v miligramech na 100 g tkáně nadledvin každého potkana. Vypočtou se průměrné hodnoty pro potkany ve všech třech dávkových skupinách referenčního přípravku a zkoušeného přípravku a výsledky se vyhodnotí vhodnou statistickou metodou (5.3).

    1. účinné od 1. 2. 19982.7.4 Stanovení účinnosti krevního koagulačního faktoru VIII

      účinné od 1. 2. 1998Podstata zkoušky. Při stanovení účinnosti krevního koagulačního faktoru VIII se využívá jeho biologického účinku jako kofaktoru aktivace faktoru X aktivovaným faktorem IX (faktor IXa) v přítomnosti iontů vápníku a fosfolipidů. Účinnost přípravku faktoru VIII se stanoví porovnáním množství potřebného k dosažení určité rychlosti tvorby faktoru Xa ve zkoušené směsi obsahující látky, jež se účastní aktivace faktoru X, s množstvím mezinárodního standardu nebo referenčního přípravku kalibrovaného v m.j., jež je zapotřebí k dosažení stejné rychlosti tvorby faktoru Xa.

      účinné od 1. 2. 1998Mezinárodní jednotka faktoru VIII je účinnost obsažená v deklarovaném množství mezinárodního standardu, kterým je lyofilizovaný koncetrát krevního koagulačního faktoru VIII. Hodnotu účinnosti mezinárodního standardu v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Světová zdravotnická organizace.

      účinné od 1. 2. 1998Lidský koagulační faktor VIII BRP se kalibruje porovnáním s mezinárodním standardem a jeho účinnost se vyjadřuje v mezinárodních jednotkách.

      účinné od 1. 2. 1998Chromogenní způsob stanovení se skládá ze dvou následných kroků: z aktivace faktoru X, která probíhá v reakční směsi složené z purifikovaných koagulačních faktorů a závisí na obsahu přítomného faktoru VIII, a z enzymatického štěpení chromogenního substrátu faktoru Xa, které je provázeno vznikem chromoforu, jehož množství se dá stanovit kvantitativně spektrofotometricky. Za vhodných podmínek stanovení je závislost rychlosti tvorby faktoru Xa na koncentraci faktoru VIII lineární. Stanovení se dá shrnout do následujícího schématu:

      účinné od 1. 2. 1998

      účinné od 1. 2. 1998

      účinné od 1. 2. 1998Oba kroky zahrnují zkoumadla, která se dají zajistit z různých komerčních zdrojů. Ačkoliv složení jednotlivých zkoumadel může mít některé odlišnosti, jejich základní rysy jsou popsány v následující specifikaci. Odchylky od tohoto popisu jsou přípustné, pokud se prokáže, že výsledky získané za použití mezinárodního standardu lidského koagulačního faktoru VIII se významně neliší.

      účinné od 1. 2. 1998Při použití komerčních testovacích souprav se zachovává návod výrobce; je důležité prokázat, že použitá testovací souprava je pro stanovení vhodná.

      účinné od 1. 2. 1998Zkoumadla

      účinné od 1. 2. 1998Názvem koagulační zkoumadla (dále zkoumadla) se označuje skupina přečištěných bílkovin lidského nebo hovězího původu. Zahrnuje faktor X, faktor IXa a aktivátor faktoru VIII, obvykle trombin. Tyto bílkoviny jsou částečně přečištěné, nejlépe alespoň na 50 % a neobsahují nečistoty, které by mohly zasahovat do aktivace faktoru VIII nebo faktoru X. Faktor X je přítomen v množstvích, jejichž konečná koncentrace během prvého kroku stanovení je 10 nmol/l až 350 nmol/l, obvykle 15 nmol/l až 30 nmol/l. Faktor IXa vzniká aktivací přečištěného faktoru IX na faktor IXaβ pomocí faktoru XIa a následným přečištěním faktoru IXaβ z reakční směsi. Jeho konečná koncentrace během tvorby faktoru Xa je méně než 30 % koncentrace faktoru X, obvykle 1 nmol/l až 100 nmol/l, nejlépe 1 nmol/l až 10 nmol/l. Trombin může být přítomen ve formě svého prekurzoru protrombinu za předpokladu, že jeho aktivace ve zkoumadle je dostatečně rychlá, aby se při stanovení zajistila téměř okamžitá a úplná aktivace faktoru VIII. Fosfolipidy mohou být přírodního původu, např. extrakt z hovězího mozku nebo míchy nebo extrakt ze sójových bohů, nebo se mohou připravit synteticky a musí obsahovat v dostatečné míře, obvykle 15 % až 35 %, fosfatidylserin. Konečná koncentrace fosfolipidu během tvorby faktoru Xa je 1 nmol/l až 50 nmol/l, nejlépe 10 nmol/l až 35 nmol/l. Zkoumadlo obsahuje ionty vápníku v konečné koncentraci 5 nmol/l až 15 mmol/l. Ke konečné tvorbě faktoru Xa dochází v roztoku, který obsahuje nejméně 1 mg/ml lidského nebo hovězího albuminu, jehož pH je vhodně upraveno na hodnotu 7,3 až 8,0. Složky konečného zkoumadla se obvykle rozdělují alespoň do dvou oddělených zkoumadel, z nichž žádné nemá vlastní schopnost tvorby faktoru Xa. Po rekonstituci mohou být spojeny za předpokladu, že v nepřítomnosti faktoru VIII nemůže vzniknout významné množství faktoru Xa. V konečné inkubační směsi musí být faktor VIII jedinou složkou, která určuje rychlost.

      účinné od 1. 2. 1998V druhém kroku se vytvořený faktor Xa stanoví pomocí chromogenního substrátu specifického pro faktor Xa. Tím je obvykle derivát krátkého peptidu ze tří až pěti aminokyselin s připojenou skupinou chromoforu. Při odštěpení této skupiny z peptidického substrátu se její chromoformní vlastnosti posunou do vlnové délky, která umožňuje její spektrofotometrické stanovení. Substrát je obvykle rozpuštěný ve vodě a používá se v konečné koncentraci 0,2 mmol/l až 2 mmol/l. Substrát může dále zahrnovat vhodné inhibitory pro zastavení další tvorby faktoru Xa a pro potlačení aktivity trombinu a tím se zlepšuje selektivita stanovení faktoru Xa.

      účinné od 1. 2. 1998Postup stanovení

      účinné od 1. 2. 1998Pomocí odpovídajícího množstvím vody R se rekonstituuje celý obsah ampule s referenčním přípravkem i obsah ampule se zkoušeným přípravkem; přípravky se použijí ihned po rozpuštění. Rekonstituované přípravky se ještě dostatečně předředí na roztoky s obsahem mezi 0,5 m.j./ml až 2,0 m.j./ml.

      účinné od 1. 2. 1998Předředění se provádí plazmou pacienta s těžkou formou hemofilie A nebo uměle připraveným zkoumadlem poskytujícím výsledky, které se významně neliší od výsledků stanovení s hemofilickou plazmou a se stejným referenčním a zkoušeným přípravkem. Předředěné roztoky musí být stabilní po dobu potřebnou na stanovení, nejméně 30 min při 20 °C a použijí se do 15 min.

      účinné od 1. 2. 1998Připraví se další ředění referenčního a zkoušeného přípravku. K tomu se použije izotonický tlumivý roztok bez chelatotvorných složek, který obsahuje 1 % lidského nebo hovězího albuminu a např. trometamol nebo imidazol a jehož pH se upraví na 7,3 až 8,0. Připraví se alespoň tři samostatná, nezávislá ředění obou přípravků, nejlépe každé samostatné ředění dvojmo. Připravují se ředění tak, aby konečná koncentrace faktoru VIII byla během kroku, kdy dochází k tvorbě faktoru Xa, nižší než 0,03 m.j./ml, přednostně nižší než 0,01 m.j./ml.

      účinné od 1. 2. 1998Připraví se kontrolní roztok, který obsahuje všechny složky kromě faktoru VIII.

      účinné od 1. 2. 1998Všechna ředění se připravují ve zkumavkách z plastu a ihned se použijí.

      účinné od 1. 2. 1998Krok 1. Předehřátá ředění referenčního přípravku faktoru VIII i zkoušeného přípravku se smíchají s odpovídajícím objemem předehřátého koagulačního zkoumadla nebo se směsí jeho oddělených složek. Takto připravené směsi se inkubují ve zkumavkách z plastů nebo v jamkách mikrotitračních destiček při 37 °C. Koncentrace jednotlivých komponent během tvorby faktoru Xa se musí řídit specifikací uvedenou výše v odstavci Zkoumadla. Ponechá se dostatečně dlouhá doba na aktivaci faktoru X, nejlépe taková, aby došlo k ukončení reakce před dosažením maximální hodnoty koncentrace faktoru Xa, aby se dosáhlo dostatečné lineární závislosti odpovědi na dávce. Aktivační čas se také vybírá tak, aby se dosáhlo lineárního průběhu křivky tvorby faktoru Xa v závislosti na čase. Vyhovující aktivační čas je obvykle mezi 2 min až 5 min, ale jsou možné odchylky, pokud se dosáhne lepší linearity závislosti odpovědi na dávce.

      účinné od 1. 2. 1998Krok 2. Aktivace se ukončí přidáním předehřátého zkoumadla, které obsahuje chromogenní substrát. Kvantitativně se stanoví rychlost štěpení substrátu, která musí lineárně záviset na koncentraci vzniklého faktoru Xa. Stanovení se provádí měřením změny absorbance spektrofotometrem při vhodné vlnové délce. Buď se sleduje absorbance kontinuálně, což umožňuje výpočet počáteční rychlosti štěpení substrátu, nebo se ukončí hydrolytická reakce po odpovídajícím časovém intervalu tím, že se sníží pH přidáním vhodného zkoumadla, jako je kyselina octová (50 % V/V C2H4O2) nebo citronanový roztok (1 mol/l) o pH 3. Doba hydrolýzy se nastaví tak, aby se dosáhlo lineární tvorby chromoforu v závislosti na čase. Vhodná doba hydrolýzy je obvykle mezi 3 min a 15 min. Jsou ale možné odchylky, pokud se tím dosáhne lepší lineární závislosti odpovědi na dávce.

      účinné od 1. 2. 1998Ověří se validita stanovení a účinnost zkoušeného přípravku se vypočte obvyklými statistickými metodami pro stanovení poměru sklonů (např. Statistická analýza výsledků biologických zkoušek (5.3)).

    1. účinné od 1. 2. 19982.7.5 Stanovení účinností heparinu

      účinné od 1. 2. 1998Antikoagulační účinnost heparinu se stanoví in vitro porovnáním jeho schopnosti zpomalovat za daných podmínek srážení rekalcifikované citronanové ovčí plazmy se stejnou schopností referenčního přípravku heparinu, kalibrovaného v mezinárodních jednotkách.

      účinné od 1. 2. 1998Mezinárodní jednotka je účinnost obsažená v deklarovaném množství mezinárodního standardu, kterým je lyofilizovaná sodná sůl heparinu, připravená z vepřové střevní mukózy. Hodnotu účinnosti mezinárodního standardu v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Světová zdravotnická organizace.

      účinné od 1. 2. 1998Účinnost sodné soli heparinu BRP se kalibruje v mezinárodních jednotkách v porovnání s mezinárodním standardem za pomoci některého dále uvedeného postupu stanovení.

      účinné od 1. 2. 1998Provede se stanovení jednou z následujících metod pro určení počátku srážení s použitím zkumavek a dalšího, pro zvolenou metodu vhodného zařízení:

      1. účinné od 1. 2. 1998a) přímá vizuální detekce, nejlépe při nepřímém osvětlení proti matnému černému pozadí,
      2. účinné od 1. 2. 1998b) spektrofotometrický záznam změny optické hustoty při vlnové délce asi 600 nm,
      3. účinné od 1. 2. 1998c) vizuální detekce změny tekutosti při ručním překlápění zkumavek,
      4. účinné od 1. 2. 1998d) automatický záznam změny tekutosti při míchání; dbá se, aby se při začáteční fázi srážení co nejvíce předešlo narušení roztoku.

      účinné od 1. 2. 1998Postup stanovení. Objemy uvedené v dalším textu slouží jako příklady a mohou být přizpůsobeny zvolenému zařízení za předpokladu, že jejich poměry zůstanou zachovány.

      účinné od 1. 2. 1998Sodná sůl heparinu BRP se rozpustí v roztoku chloridu sodného R (9 g/l) tak, aby výsledný roztok obsahoval v mililitru přesně známý počet mezinárodních jednotek. Obdobně se připraví roztok zkoušeného přípravku o stejné předpokládané účinnosti. Pomocí roztoku chloridu sodného R (9 g/l) se z obou roztoků připraví geometrické řady ředění tak, aby čas srážení zaznamenaný pro nejnižší koncentraci byl nejméně 1,5násobek času potřebného ke srážení při slepé zkoušce a aby při nejvyšší koncentraci bylo dosaženo vyhovujícího průběhu závislosti log dávka-odezva, podle stanovení v předběžné zkoušce.

      účinné od 1. 2. 1998Do ledové vodní lázně se vloží dvanáct zkumavek po dvojicích označených T1, T2 a T3 pro dvojí měření tří ředění zkoušeného přípravku a S1, S2 a S3 pro dvojí měření tří ředění referenčního přípravku. Do každé zkumavky se odměří 1,0 ml rozmražené plazmy substrátu R1 a 1,0 ml vhodně zředěného zkoušeného přípravku nebo 1,0 ml vhodně zředěného referenčního přípravku. Po každém přídavku se obsah zkumavek opatrně promíchá tak, aby se netvořily bubliny. Zkumavky v pořadí S1, S2, S3, T1, T2 a T3 se přenesou do vodní lázně o teplotě 37 °C na dobu 15 min. Poté se do každé zkumavky odměří 1 ml zkoumadla cefalinového R ke kterému byl přidán vhodný aktivátor jako je kaolin, v takovém množství, aby srážení ve slepé zkoušce nastalo v čase kratším než 60 s. Při aktivaci kaolinem se bezprostředně před použitím připraví směs stejných objemů zkoumadla cefalinového R a suspenze kaolinu lehkého R (4 g/l) v roztoku chloridu sodného R (9 g/l). Přesně za 2 min se do každé zkumavky přidá 1 ml roztoku chloridu vápenatého R (3,7 g/l) a zvolenou metodou (a, b, c nebo d) se stanoví čas srážení v sekundách mezi tímto posledním přídavkem a začátkem srážení. Čas srážení ve slepé zkoušce se obdobně stanoví tak, že namísto roztoku heparinu se do zkumavky odměří 1 ml roztoku chloridu sodného R (9 g/l). Slepé zkoušky se zařadí na začátek a na konec postupu měření. Hodnoty stanovené pro dvojici slepých zkoušek se nemají významně lišit. Střední hodnoty časů srážení zaznamenaných pro jednotlivé dvojice se převedou do logaritmického tvaru. Postup se zopakuje za použití čerstvých roztoků, při dodržení pořadí pro inkubaci T1, T2, T3, S1, S2 a S3. Výsledky se vypočítají za použití obvyklých statistických metod.

      účinné od 1. 2. 1998Provedou se vždy nejméně tři nezávislá stanovení. Pro každé stanovení se připraví čerstvé roztoky referenčního přípravku, zkoušeného přípravku a jiné, čerstvě rozmražené plazmy.

      účinné od 1. 2. 1998Účinnost zkoušeného přípravku se stanoví z výsledků všech měření za použití obvyklých statistických metod. Jestliže rozptyl mezi jednotlivými stanoveními je významný na P = 0,01, může se stanovit výsledná účinnost výpočtem prostého průměru z jednotlivých stanovení.

    1. účinné od 1. 2. 19982.7.6 Stanovení účinností adsorbované vakcíny proti záškrtu

      účinné od 1. 2. 1998Podstata zkoušky. Účinnost adsorbované vakcíny proti záškrtu se stanoví porovnáním dávky potřebné k ochraně morčat před účinkem difterického toxinu s dávkou referenčního přípravku, vyjádřenou v mezinárodních jednotkách, která poskytuje stejnou ochranu. Toxin se vstřikuje buď intradermálně a sleduje se vznik specifického erytému, nebo subkutánně a sleduje se úhyn zvířat.

      účinné od 1. 2. 1998Mezinárodní jednotka je účinnost obsažená v deklarovaném množství mezinárodního standardu. Tento standard pozůstává z určitého množství difterického toxoidu adsorbovaného na hydroxid hlinitý. Hodnotu účinnosti mezinárodního standardu v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Světová zdravotnická organizace.

      účinné od 1. 2. 1998Metoda sledování erytému po intradermálním podání

      účinné od 1. 2. 1998Výběr a rozdělení pokusných zvířat. Ke zkoušce se použijí zdravá bílá morčata z jednoho chovu a takové velikosti, která umožní předepsaný počet injekčních podání. Rozdíl v hmotnosti mezi nejtěžším a nejlehčím zvířetem nepřesahuje 100 g. Zvířata se rozdělí do nejméně šesti stejně velkých skupin. Počet zvířat ve skupině postačuje k tomu, aby byly splněny dále předepsané požadavky na platnost zkoušky. Pokud není prokázána stabilita toxinu nebo tento toxin není dostatečně standardizován, přibere se pět morčat jako neimunizovaná kontrola. Morčata jsou stejného pohlaví nebo se samci a samice rovnoměrně rozdělí do skupin.

      účinné od 1. 2. 1998Výběr toxinu. Difterický toxin, který se použije ke zkoušce, obsahuje 67 až 133 Lr/100 v 1 Lf a 25 000 až 50 000 nejmenších dávek reagujících v kůži morčat v 1 Lf. Pokud je prokázána stabilita tohoto toxinu, není třeba ověřovat jeho účinnost při každém stanovení.

      účinné od 1. 2. 1998Příprava roztoku toxinu. Toxin se bezprostředně před použitím zředí vhodným rozpouštědlem tak, aby 0,2 ml obsahovalo asi 0,0512 Lf. Z něho se připraví řada pěti čtyřnásobných ředění obsahujících asi 0,0128, 0,0032, 0,0008, 0,0002 a 0,00005 Lf v 0,2 ml.

      účinné od 1. 2. 1998Stanovení účinnosti zkoušené vakcíny. Zkoušený přípravek a referenční přípravek se zředí roztokem chloridu sodného R (9 g/l) tak, aby jednotlivá ředění byla odstupňována nejvýše 2,5násobně a aby střední ředění při subkutánním podání (v dávce 1,0 ml na morče) dovolila po podání toxinu vznik intradermální reakce asi u tří ředění toxinu. Pro každé ředění se vybere jedna skupina morčat a všem morčatům ve skupině se subkutánně vstříkne po 1,0 ml příslušného ředění. Po 28 dnech se všem morčatům oholí oba boky a každému zvířeti se intradermálně vstříkne 0,2 ml každého z šesti ředění toxinu na šest různých míst tak, aby vzájemné působení sousedících míst bylo co nejmenší.

      účinné od 1. 2. 1998Stanovení účinnosti toxinu. Je-li třeba, vstříknou se neimunizovaným kontrolním zvířatům roztoky obsahující 80, 40, 20, 10 a 5 milióntin Lf toxinu.

      účinné od 1. 2. 1998Odečítání a hodnocení výsledků. 48 h po podání toxinu se vyšetří všechna místa podání a u každého zvířete se formou poměru zaznamená počet míst se specifickým difterickým erytémem a počet míst bez této reakce. Hodnoty těchto poměrů pro všechna zvířata, jimž bylo podáno stejné ředění očkovací látky, se spojí a zaznamenají do tabulky. Tyto údaje se vhodnou transformací, jako např. (hodnota poměru)2 nebo arcsin ((hodnota poměru/6)2), použijí na získání odhadu relativní účinnosti každé zkoušené vakcíny pomocí kvantitativního hodnocení rovnoběžných přímek.

      účinné od 1. 2. 1998Požadavky na platnost zkoušky. Zkouška je platná, jsou-li splněny tyto požadavky:

      1. účinné od 1. 2. 1998- zkoušená vakcína a referenční přípravek vykazují průměrný počet reakcí při nejnižší dávce nižší než tři a při nejvyšší dávce vyšší než tři,
      2. účinné od 1. 2. 1998- je-li třeba, ředění toxinu obsahující 40 milióntin Lf dávky vyvolá pozitivní erytémovou reakci nejméně u 80 % kontrolních morčat a ředění obsahující 20 milióntin Lf dávky nevyvolá u nejméně 80 % kontrolních zvířat žádnou reakci (nejsou-li splněna tato kritéria, vybere se jiný toxin),
      3. účinné od 1. 2. 1998- interval spolehlivosti stanovení (P = 0,95) je v rozmezí 50 % až 200 % stanovené účinnosti,
      4. účinné od 1. 2. 1998- statistické hodnocení neukazuje odchylku od linearity a rovnoběžnosti.

      účinné od 1. 2. 1998Zkouška se může opakovat, ale jestliže se provede více stanovení, výsledky všech platných stanovení se sloučí.

      účinné od 1. 2. 1998Metoda sledování úhynu

      účinné od 1. 2. 1998Výběr a rozdělení pokusných zvířat. Ke zkoušce se použijí zdravá morčata o hmotnosti 250 g až 350 g pocházející z jednoho chovu. Morčata se rozdělí do nejméně šesti stejně velkých skupin. Počet zvířat ve skupině postačuje k tomu, aby byly splněny dále předepsané požadavky na platnost zkoušky. Pokud není prokázána stabilita toxinu nebo není-li tento toxin dostatečně standardizován, přiberou se další čtyři skupiny po pěti morčatech jako neimunizovaná kontrola. Morčata jsou stejného pohlaví nebo se samci a samice rovnoměrně rozdělí do skupin.

      účinné od 1. 2. 1998Výběr toxinu. Vybere se takový difterický toxin, který v 1 ml obsahuje nejméně 100 LD50. Pokud je prokázána stabilita tohoto toxinu, není třeba ověřovat jeho střední smrtnou dávku při každém stanovení.

      účinné od 1. 2. 1998Příprava roztoku toxinu. Bezprostředně před použitím se toxin zředí vhodným rozpouštědlem tak, aby se získal roztok toxinu obsahující v 1 ml asi 100 LD50. Je-li třeba, zředí se dále část roztoku toxinu stejným rozpouštědlem v poměrech 1 : 32, 1 : 100 a 1 : 320.

      účinné od 1. 2. 1998Stanovení účinnosti vakcíny. Zkoušený přípravek a referenční přípravek se zředí roztokem chloridu sodného R (9 g/l) tak, aby jednotlivá ředění byla odstupňována nejvýše 2,5násobně a aby střední ředění po subkutánním podání (v dávce 1,0 ml na morče) ochránila přibližně 50 % zvířat před letálním účinkem předepsané dávky difterického toxinu podaného subkutánně. Pro každé ředění se vybere jedna skupina morčat a všem morčatům ve skupině se subkutánně vstříkne po 1,0 ml příslušného ředění. Po 28 dnech se všem zvířatům subkutánně vstříkne 1,0 ml roztoku toxinu (100 LD50).

      účinné od 1. 2. 1998Stanovení účinnosti toxinu. Je-li třeba, připraví se na podání roztoku toxinu a jeho tří ředění čtyři skupiny po pěti morčatech. Každému zvířeti ve skupině se subkutánně vstříkne 1,0 ml příslušného ředění toxinu.

      účinné od 1. 2. 1998Odečítání a hodnocení výsledků. Za 4 dny od podání toxinu se odečte počet přežívajících morčat. Účinnost zkoušené vakcíny se vyhodnotí porovnáním s účinností referenčního přípravku na základě poměru počtu přežívajících zvířat v každé skupině imunizovaných morčat, za použití obvyklých statistických metod.

      účinné od 1. 2. 1998Požadavky na platnost zkoušky. Zkouška je platná, jsou-li splněny tyto požadavky:

      1. účinné od 1. 2. 1998- 50% ochranná dávka zkoušeného a referenčního přípravku je mezi nejvyšší a nejnižší dávkou podanou morčatům,
      2. účinné od 1. 2. 1998- v případě, že čtyřem skupinám po pěti morčatech byl vstříknut roztok toxinu a jeho tři ředění, má počet uhynulých zvířat ukázat, že použitá dávka toxinu byla přibližně 100 LD 50,
      3. účinné od 1. 2. 1998- interval spolehlivosti stanovení (P = 0,95) je v rozmezí 50 % až 200 % stanovené účinnosti,
      4. účinné od 1. 2. 1998- statistické hodnocení neukazuje odchylku od linearity a rovnoběžnosti.

      účinné od 1. 2. 1998Zkouška se může opakovat, ale jestliže se provede více stanovení, výsledky všech platných stanovení se sloučí.

    1. účinné od 1. 2. 19982.7.7 Stanovení účinnosti vakcíny proti dávivému kašli

      účinné od 1. 2. 1998Podstata zkoušky. Účinnost vakcíny proti dávivému kašli se stanoví porovnáním dávky potřebné na ochranu myší před účinkem intracerebrálně podané letální dávky bakterie Bordetella pertussis s dávkou referenčního přípravku vyjádřenou v mezinárodních jednotkách, která poskytuje stejnou ochranu.

      účinné od 1. 2. 1998Mezinárodní jednotka je účinnost obsažená v deklarovaném množství mezinárodního standardu, který pozůstává z určitého množství sušené očkovací látky proti dávivému kašli. Hodnotu účinnosti mezinárodního standardu v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Světová zdravotnická organizace.

      účinné od 1. 2. 1998Výběr a rozdělení pokusných zvířat. Ke zkoušce se použijí zdravé myši, nejvýše 5 týdnů staré, vhodného kmene a pocházející z jednoho chovu. Rozdíl hmotnosti mezi nejtěžší a nejlehčí myší nepřesahuje 5 g. Vytvoří se šest skupin po nejméně šestnácti myších a čtyři skupiny po deseti myších. Myši jsou stejného pohlaví nebo se samci a samice rovnoměrně rozdělí do skupin.

      účinné od 1. 2. 1998Výběr infekčního kmene a příprava jeho suspenze k infekci. Vybere se vhodný kmen B. pertussis, který je schopen způsobit úhyn myší v průběhu 14 dní po intracerebrální infekci. Kmen není vhodný, jestliže za 48 h po aplikaci uhyne víc než 20 % myší. Připraví se subkultura kmene a získané bakterie B. pertussis se suspendují v roztoku obsahujícím kaseinový hydrolyzát (10 g/l) a chlorid sodný R (6 g/l) s hodnotou pH v rozmezí 7,0 až 7,2 nebo v jiném vhodném roztoku. Změří se zákal suspenze a ve stejném roztoku se připraví řada ředění. Na každé ředění se použije skupina deseti myší, kterým se intracerebrálně vstříkne po 0,02 ml nebo 0,03 ml příslušného ředění. Po 14 dnech se v každé skupině spočítají přežívající myši a z výsledků se vypočítá očekávaný zákal suspenze, která bude obsahovat 100 LD50 v každé infekční dávce.

      účinné od 1. 2. 1998Pro zkoušení očkovací látky se připraví čerstvá subkultura téhož kmene B. pertussis a z ní suspenze bakterií se zákalem odpovídajícím přibližně 100 LD 50 v každé infekční dávce. Z této suspenze se připraví tři ředění.

      účinné od 1. 2. 1998Stanovení účinnosti. Připraví se tři odstupňovaná ředění zkoušené vakcíny a tři podobná ředění referenčního přípravku tak, aby se mohlo očekávat, že střední ředění uchrání asi 50 % myší před letálním účinkem infekční dávky B. pertussis. Doporučené dávky jsou 1/8, 1/40 a 1/200 lidské dávky zkoušené vakcíny a 0,5, 0,1 a 0,02 mezinárodní jednotky referenčního přípravku, přičemž jsou tato množství obsažena v objemu nepřesahujícím 0,5 ml. Každým z těchto šesti ředění se imunizuje jedna skupina myší obsahující šestnáct zvířat; každé myši se vstříkne intraperitoneálně jedna dávka příslušného ředění. Za 14 až 17 dní se všechny myši infikují intracerebrálně jednou dávkou infekční suspenze. Stejnou dávkou infekční suspenze a z ní připravenými třemi ředěními se též intracerebrálně infikují čtyři skupiny po deseti myších. Z hodnocení se vyloučí všechny myši uhynulé v průběhu 48 h po infikování. Po 14 dnech se v každé skupině spočítají přežívající myši. Na základě počtů přežívajících zvířat v jednotlivých skupinách (po nejméně šestnácti zvířatech) se vyhodnotí účinnost zkoušené vakcíny v porovnání s účinností referenčního přípravku.

      účinné od 1. 2. 1998Požadavky na platnost zkoušky. Zkouška je platná, jsou-li splněny tyto požadavky:

      1. účinné od 1. 2. 1998- 50% ochranná dávka zkoušeného a referenčního přípravku je mezi nejvyšší a nejnižší dávkou podanou myším,
      2. účinné od 1. 2. 1998- počet myší uhynulých ve čtyřech skupinách po deseti zvířatech po podání infekční suspenze a jejích ředění udává, že infekční dávka byla přibližně 100 LD50,
      3. účinné od 1. 2. 1998- statistické hodnocení neukazuje odchylku od linearity nebo rovnoběžnosti.

      účinné od 1. 2. 1998Zkouška se může opakovat, ale jestliže se provede více stanovení, výsledky všech platných stanovení se sloučí.

    1. účinné od 1. 2. 19982.7.8 Stanovení účinnosti adsorbované vakcíny proti tetanu

      účinné od 1. 2. 1998Podstata zkoušky. Účinnost adsorbované vakcíny proti tetanu se stanoví porovnáním dávky potřebné k ochraně morčat nebo myší před účinkem subkutánní injekce paralyzující dávky tetanického toxinu s dávkou referenčního přípravku vyjádřenou v mezinárodních jednotkách, která poskytuje stejnou ochranu. V zemích, kde není povinná metoda s paralýzou, je možno použít metodu střední smrtné dávky (LD50). Pro ni je počet zvířat a postup totožný s popsanou metodou paralýzy, avšak zkouška se místo podle příznaků tetanické paralýzy hodnotí podle úhynu zvířat.

      účinné od 1. 2. 1998Mezinárodní jednotka je účinnost obsažená v deklarovaném množství mezinárodního standardu, který pozůstává z určitého množství tetanického toxoidu adsorbovaného na hydroxid hlinitý. Hodnotu účinnosti mezinárodního standardu v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Světová zdravotnická organizace.

      účinné od 1. 2. 1998Zkouška na morčatech

      účinné od 1. 2. 1998Výběr a rozdělení pokusných zvířat. Ke zkoušce se použijí zdravá morčata z jednoho chovu, jejichž hmotnost je v rozmezí 250 g až 350 g. Zvířata se rozdělí do nejméně šesti stejně velkých skupin. Počet zvířat ve skupině postačuje k tomu, aby byly splněny dále předepsané požadavky na platnost zkoušky. Pokud není prokázána stabilita toxinu nebo tento toxin není dostatečně standardizován, přiberou se další čtyři skupiny po pěti morčatech jako neimunizovaná kontrola. Morčata jsou stejného pohlaví nebo se samci a samice rovnoměrně rozdělí do skupin.

      účinné od 1. 2. 1998Výběr toxinu. Zvolí se tetanický toxin obsahující v 1 ml nejméně padesátinásobek 50% paralyzující dávky. Pokud je prokázána stabilita tohoto toxinu, není třeba ověřovat paralyzující dávku při každém stanovení.

      účinné od 1. 2. 1998Příprava roztoku toxinu. Toxin se bezprostředně před použitím zředí vhodným rozpouštědlem tak, aby 1 ml obsahoval asi padesátinásobek 50% paralyzující dávky. Je-li třeba, zředí se dále část roztoku toxinu stejným rozpouštědlem v poměrech 1 : 16, 1 : 50 a 1 : 160.

      účinné od 1. 2. 1998Stanovení účinnosti zkoušené vakcíny. Zkoušená vakcína a referenční přípravek se zředí roztokem chloridu sodného R (9 g/l) tak, aby jednotlivá ředění byla odstupňována nejvýše 2,5násobně a aby střední ředění při subkutánním podání (v dávce 1,0 ml na morče) ochránila přibližně 50 % zvířat před paralyzujícím účinkem předepsané dávky tetanického toxinu podaného subkutánně. Pro každé ředění se vybere jedna skupina morčat a všem morčatům ve skupině se subkutánně vstříkne po 1,0 ml příslušného ředění. Po 28 dnech se každému zvířeti subkutánně vstříkne 1,0 ml roztoku toxinu (padesátinásobek 50% paralyzující dávky).

      účinné od 1. 2. 1998Stanovení účinnosti toxinu. Je-li třeba, vstříkne se neimunizovaným kontrolním zvířatům (čtyři skupiny po pěti morčatech) subkutánně po 1,0 ml roztoku toxinu nebo jeho příslušného ředění tak, že každé skupině se podá jedna koncentrace.

      účinné od 1. 2. 1998Odečítání a hodnocení výsledků. Zvířata se kontrolují dvakrát denně, přičemž se vyřadí všechna zvířata se zřetelnými příznaky tetanické paralýzy a šetrně se utratí. Pět dní po podání roztoku toxinu se spočítají zvířata bez příznaků paralýzy. Účinnost zkoušené vakcíny se vyhodnotí za použití obvyklých statistických metod porovnáním s účinností referenčního přípravku na základě poměru počtu imunizovaných morčat bez příznaků paralýzy v každé skupině po podání roztoku toxinu.

      účinné od 1. 2. 1998Požadavky na platnost zkoušky. Zkouška je platná, jsou-li splněny tyto požadavky:

      1. účinné od 1. 2. 1998- 50% ochranná dávka zkoušeného a referenčnho přípravku je mezi nejvyšší a nejnižší dávkou podanou zvířatům,
      2. účinné od 1. 2. 1998- v případě, že byl čtyřem skupinám po pěti morčatech vstříknut roztok toxinu a jeho tři ředění, má počet paralyzovaných zvířat ukázat, že použitá dávka toxinu byla přibližně padesátinásobkem 50% paralyzující dávky,
      3. účinné od 1. 2. 1998- interval spolehlivosti stanovení (P = 0,95) je mezi 50 % až 200 % stanovené účinnosti,
      4. účinné od 1. 2. 1998- statistické hodnocení neukazuje odchylku od linearity a rovnoběžnosti.

      účinné od 1. 2. 1998Zkouška se může opakovat, ale jestliže se provede více stanovení, výsledky všech platných stanovení se sloučí.

      účinné od 1. 2. 1998Zkouška na myších

      účinné od 1. 2. 1998Výběr a rozdělení pokusných zvířat. Ke zkoušce se použijí zdravé myši z jednoho chovu, hmotnosti 14 g až 20 g. Myši se rozdělí do nejméně šesti stejně velkých skupin. Počet zvířat ve skupině postačuje k tomu, aby byly splněny dále předepsané požadavky na platnost zkoušky. Pokud není prokázána stabilita toxinu nebo tento toxin není dostatečně standardizován, přiberou se další čtyři skupiny po šesti myších jako neimunizovaná kontrola. Myši jsou stejného pohlaví nebo se samci a samice rovnoměrně rozdělí do skupin.

      účinné od 1. 2. 1998Výběr toxinu. Zvolí se tetanický toxin obsahující v 1 ml nejméně stonásobek 50% paralyzující dávky. Pokud je prokázána stabilita tohoto toxinu, není třeba ověřovat paralytickou dávku při každém stanovení.

      účinné od 1. 2. 1998Příprava roztoku toxinu. Toxin se bezprostředně před použitím zředí vhodným rozpouštědlem tak, aby v 0,5 ml byl obsažen asi padesátinásobek 50% paralyzující dávky. Je-li to třeba, zředí se dále část roztoku toxinu stejným rozpouštědlem v poměrech 1 : 16, 1 : 50 a 1 : 160.

      účinné od 1. 2. 1998Stanovení účinnosti zkoušené vakcíny. Zkoušená vakcína a referenční přípravek se naředí roztokem chloridu sodného R (9 g/l) tak, aby jednotlivá ředění byla odstupňována nejvýše 2,5násobně a aby střední ředění po subkutánním podání (v dávce 0,5 ml na myš) ochránila přibližně 50 % zvířat před paralyzujícím účinkem předepsané dávky tetanického toxinu podaného subkutánně. Pro každé ředění se vybere jedna skupina myší a všem myším ve skupině se subkutánně vstříkne po 0,5 ml příslušného ředění. Po 28 dnech se každému zvířeti subkutánně vstříkne 0,5 ml roztoku toxinu (padesátinásobek 50% paralyzující dávky).

      účinné od 1. 2. 1998Stanovení účinosti toxinu. Je-li třeba, vstříkne se neimunizovaným kontrolním zvířatům (čtyři skupiny po šesti myších) subkutánně po 0,5 ml roztoku toxinu nebo jeho příslušného ředění tak, že každé skupině se podá jedna koncentrace.

      účinné od 1. 2. 1998Odečítání a hodnocení výsledků. Zvířata se kontrolují dvakrát denně, přičemž se vyřadí všechna zvířata se zřetelnými příznaky tetanické paralýzy a šetrně se utratí. Čtyři dny po podání roztoku toxinu se spočítají zvířata bez příznaků paralýzy. Účinnost zkoušené vakcíny se vyhodnotí za použití obvyklých statistických metod porovnáním s účinností referenčního přípravku na základě poměru počtu imunizovaných zvířat bez příznaků paralýzy v každé skupině.

      účinné od 1. 2. 1998Požadavky na platnost zkoušky. Zkouška je platná, jsou-li splněny tyto požadavky:

      1. účinné od 1. 2. 1998- 50% ochranná dávka zkoušeného a referenčního přípravku je mezi nejvyšší a nejnižší dávkou přípravků podaných zvířatům,
      2. účinné od 1. 2. 1998- v případě, že byl čtyřem skupinám po šesti myších vstříknut roztok toxinu a jeho tři ředění, má počet paralyzovaných zvířat ukázat, že použitá dávka toxinu byla přibližně padesátinásobkem 50% paralyzující dávky,
      3. účinné od 1. 2. 1998- interval spolehlivosti stanovení (P = 0,95) je v rozmezí 50 % až 200 % stanovené účinnosti,
      4. účinné od 1. 2. 1998- statistické hodnocení neukazuje odchylku od linearity a rovnoběžnosti.

      účinné od 1. 2. 1998Zkouška se může opakovat, ale jestliže se provede více stanovení, výsledky všech platných stanovení se sloučí.

    1. účinné od 1. 2. 19982.7.9 Zkouška na Fc funkci imunoglobulinu

      účinné od 1. 2. 1998Podstata zkoušky. Srovnání průběhu hemolýzy senzibilizovaných lidských červených krvinek v přítomnosti zkoušeného přípravku s průběhem hemolýzy v přítomnosti porovnávacího lidského imunoglobulinu.

      účinné od 1. 2. 1998Příprava zkoumadel

      účinné od 1. 2. 1998Stabilizovaná lidská krev. Lidská krev skupiny 0 se odebere do antikoagulačního roztoku ACD. Stabilizovaná krev se uchovává při 4 °C nejdéle 3 týdny.

      účinné od 1. 2. 1998Tlumivý roztok fosforečnanový s chloridem sodným o pH 7,2. 1,022 g hydrofosforečnanu sodného bezvodého R, 0,336 g dihydrofosforečnanu sodného bezvodého R a 8,766 g chloridu sodného R se rozpustí v 800 ml vody R a zředí se jí na 1000 ml.

      účinné od 1. 2. 1998Zásobní roztok hořčíku a vápníku. 1,103 g chloridu vápenatého R a 5,083 g chloridu horečnatého R se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 25 ml.

      účinné od 1. 2. 1998Zásobní tlumivý roztok barbitalový. 207,5 g chloridu sodného R a 25,48 g barbitalu sodné soli R se rozpustí v 4000 ml vody R a pH se upraví kyselinou chlorovodíkovou 1 mol/l RS na 7,3. Přidá se 12,5 ml zásobního roztoku hořčíku a vápníku a zředí se vodou R na 5000 ml. Roztok se filtruje membránovým filtrem (0,22 μm) a uchovává při 4 °C ve skleněných obalech.

      účinné od 1. 2. 1998Tlumivý roztok barbitalu s albuminem. 0,150 g albuminu hovězího R se rozpustí v 20 ml zásobního tlumivého roztoku barbitalového a zředí se vodou R na 100 ml.

      účinné od 1. 2. 1998Roztok taninu. 10 mg taninu R se rozpustí ve 100 ml tlumivého roztoku fosforečnanového s chloridem sodným o pH 7,2. Připravuje se bezprostředně před použitím.