Český lékopis 1997

Pracovní buňky. Pracovní buňky jsou charakterizovány se zřetelem na totožnost a karyotyp (viz níže v odstavci Chromozomální monitorování). Zkouškami uvedenými dále se prokáže, že neobsahují bakteriální, plísňové ani mykoplazmatické kontaminace, a pomocí zkoušek na zvířatech, vejcích a v buněčných kulturách, že neobsahují cizorodá agens. Ve zvláštních případech mohou být nezbytné další vhodné testy.

Produkční buňky. Každá produkční buněčná kultura se skládá z pasáže na úrovni dvoutřetinové doby života daného buněčného kmene a zkouší se na totožnost pomocí markerů, jako např. izoenzymů, HLA nebo karyotyp od nejméně jedné metafáze rozvinutí chromozomů. Další zkoušky produčních buněk jsou popsány ve stati 2.6.16.

Zkoušky na čistotu

Zkoušky na zvířatech a vejcích. Intramuskulárně (nebo v případě sajících myší injekcí do hlubokého podkoží) se každé z následujících skupin zvířat vstříkne nejméně 107 živých buněk rozdělených rovnoměrně mezi zvířata ve skupině:

1. a) dvou vrhů novorozených myší mladších 24 h po nejméně 10 zvířatech,
2. b) 10 dospělých myší,
3. c) 5 morčat,
4. d) 5 králíků.

Zvířata se pozorují nejméně 4 týdny. U zvířat, která onemocní nebo vykazují jakoukoliv abnormalitu, se zjistí příčina nemoci. Neprokáže se žádné cizorodé agens. Zkoušku lze hodnotit pouze tehdy, když nejméně 80 % zvířat v každé skupině je zdravých a přežije do konce pozorovací doby.

Nejméně 10⁶ živých buněk se vstříkne do alantoidní dutiny deseti kuřecích embryí 9 až 11 dní starých. Inkubují se 3 dny a alantoidní tekutina se zkouší na přítomnost hemaglutininů na morčecích, kuřecích nebo jiných ptačích červených krvinkách. Neprokáže se žádné cizorodé agens. Zkoušku lze hodnotit pouze tehdy, když nejméně 80 % embryí je zdravých a přežije do konce pozorovací doby.

Tumorogenita. Vhodnými zkouškami se prokáže nepřítomnost tumorogenity u buněk v produkční úrovni nebo po ní. Buňky kmene MRC-5 a WI-38 jsou uznány na netumorogenní a další zkoušení není u nich nutné.

Chromozomální charakteristika. Zkoušejí se nejméně čtyři vzorky, každý sestávající z 1000 buněk v metafázi, v přibližně stejných intervalech během délky života buněčné linie při sériové kultivaci buněčných linií. Zkoumá se frekvence polyploidie, přesný počet chromozomů, frekvence zlomů, strukturální abnormality a ostatní abnormality, jako je despiralizace nebo patrné zúžení primární a sekundární konstrikce. Všechny buňky vykazující abnormality se podrobí detailnímu hodnocení a záznamy se uvádějí podle podrobných kritérií vztažených k určitým abnormalitám zjištěným při analýze karyotypu¹). Trvalé obarvené preparáty nebo jejich fotografie jsou uchovávány jako součást záznamů pro každou šarži vakcíny.

Chromozomální monitorování. Zkoumá se nejméně 500 buněk v metafázi v produkční úrovni nebo v následující pasáži. Provede se zkoušení pro tytéž ukazatele a stejným způsobem, jak bylo popsáno výše. Pouze buňky, které mají normální karyotypy, se mohou použít k výrobě vakcíny.

Bakterie a houby. 10 ml vzorku vyhovuje zkoušce na sterilitu (2.6.1).

Mykoplazmata (2.6.7) 10 ml vzorku vyhovuje zkoušce na mykoplazmata.

Mykobakterie (2.6.2). 5 ml vzorku se zkouší na nepřítomnost Mycobacterium spp. kultivační metodou citlivou pro detekci těchto organismů.

Zkouška na cizorodá agens v buněčných kulturách. Vzorek vyhovuje zkoušce na hemadsorbující viry a zkouškám na cizí antigeny v buněčných kulturách uvedeným v odstavci Kultura produkčních buněk (2.6.16 Důkaz cizích antigenů v humánních virových vakcínách).

1. 5.2.4 Buněčné kultury pro výrobu veterinárních vakcín

   Buněčné kultury pro výrobu veterinárních vakcín vyhovují požadavkům této části. Bude možná také nutné, aby buněčné kultury pro účely zkoušení veterinárních vakcín vyhověly některým nebo všem těmto požadavkům.

   Většina savčích virů může růst v buněčných liniích, a proto není užití primárních buněk přijatelné.

   Permanentně infikované buňky použité k výrobě veterinárních vakcín vyhovují vhodným požadavkům popsaným níže. Prokáže se, že buňky jsou infikovány pouze deklarovaným agens.

   Buněčné linie

   Buněčné linie se běžně kultivují systémem buněčného inokula. Každá banka základních buněk má přidělen specifický kód k identifikačním účelům. Buňky základní banky se skladují v dávkách při teplotě -70 °C nebo nižší. Výroba vakcín se obvykle provádí z buněk základní banky, které neprošly více než dvaceti pasážemi.

   Jsou-li použity suspenzní kultury, u kterých zvýšení počtu buněk odpovídá přibližně třem zdvojeným populacím, považuje se to za jednu pasáž. Jestliže se k výrobě mají použít buňky, které byly pasážovány více než dvacetkrát, mělo by se prokázat validací nebo dalšími zkouškami, že produkční buněčné kultury v podstatě jsou shodné s buňkami banky základních buněk, pokud se týká biologického charakteru a čistoty, a že použití těchto buněk nemá škodlivý vliv na výrobu vakcíny. Vývoj buněčných linií má být znám a podrobně zapsán (např. původ, počet pasáží, média užitá pro pomnožení, podmínky uchovávání).

   Zapisuje se metoda uchovávání a užití buněk, včetně podrobností, jak bylo zajištěno, že ve výrobě nebude překročen maximální povolený počet pasáží. Dostatečné množství buněk základní banky a buněk z každé pracovní banky se uchovává pro analytické účely.

   Zkoušky popsané dále se provádějí (jak je předepsáno v tabulce 5.2.4-1) na kulturách banky základních buněk a pracovních buněk nebo na buněčných kulturách z banky pracovních buněk v nejvyšší pasáži, která je použita ve výrobě a je odvozena z homogenního vzorku, o němž bylo prokázáno, že je reprezentativní.

   Charakteristika buněčných kultur. Popíše se vzhled buněčných monolayerů před a po histologickém obarvení. Podle možností se získají číselné údaje o rychlosti a úrovni růstu. Podobně se specifikuje přítomnost nebo nepřítomnost kontaktní inhibice, polynukleárních buněk a jakýchkoliv jiných buněčných abnormalit.

   Tab 5.2.4-1 Stadia buněčných kultur, na nichž se provádějí zkoušky

   Zkoušky na čistotu Buněčné linie Tab 5.2.4-1 Stadia buněčných kultur, na nichž se provádějí zkoušky

   	Banka základních buněk	Banka pracovních buněk	Buňky pracovní banky v nejvyšším stupni pasáže
   všeobecná mikroskopie	+	+	+
   bakterie a houby	+	+	-
   mykoplazmata	+	+	-
   viry	+	+	-
   identifikace druhu	+	-	+
   karyotyp	+	-	+
   tumorogenita	+	-	-

   Karyotyp. Vyšetření chromozomů se provede u nejméně padesáti buněk v probíhající mitóze u banky základních buněk a v minimálně takové úrovni pasáže, která bude použita ve výrobě. Jakýkoliv chromozomální znak přítomný u banky základních buněk se také najde ve vysoce pasážovaných buňkách. Způsobové číslo chromozomů těchto buněk není o více než o 15 % vyšší než hodnoty banky základních buněk. Karyotypy jsou totožné. Jestliže způsobové číslo překročí danou hodnotu nebo jestliže nejsou u banky pracovních buněk v nejvyšší pasáži užité pro výrobu nalezeny chromozomální znaky nebo se liší karyotyp, tyto buněčné Unie se nemohou použít ve výrobě.

   Identifikace druhu. Validovanou metodou se prokáže, že banka základních buněk a buňky pracovní banky v nejvyšším stupni pasáže užívané k výrobě patří k druhu specifikovaného původu. Jestliže se provede fluorescenční zkouška pomocí séra proti druhu, z něhož buňky pocházejí, a prokáže se, že všechny zkoušené buňky fluoreskují, není dále nutné provádět další zkoušky se zkoumadly, která mohou prokázat kontaminaci buňkami jiných druhů.

   Bakterie a houby. Buňky vyhovují zkoušce na sterilitu (2.6.1). Vzorek zkoušených buněk není menší než množství buněk v monolayeru o ploše 70 cm² nebo u buněk kultivovaných v suspenzích přibližně srovnatelný počet. Před zahájením zkoušky se buňky nejméně 15 dnů udržují v kultuře bez antibiotik.

   Mykoplazmata (2.6.7). Buňky vyhovují zkoušce na mykoplazmata. Před zahájením zkoušky se buňky nejméně 15 dnů udržují v kultuře bez antibiotik.

   Nepřítomnost kontaminujících virů. Zjišťuje se, zda buňky nejsou kontaminovány viry, a proto se provádějí vhodně citlivé zkoušky včetně těch, které jsou popsány dále.

   U monolayerů se zkouší plocha nejméně 70 cm². Monolayer se připraví a udržuje pomocí médií a aditiv v podmínkách podobných podmínkám při výrobě vakcín. Kultury monolayerů se udržují po dobu nejméně celkem 28 dnů. Subkultury se zakládají každých 7 dnů. Pokud buňky nejsou schopné přežít tuto dobu, subkultura se zakládá v nejzazším možném termínu. Z dostatečného počtu buněk, které jsou uloženy ve vhodných nádobách, se připraví konečná subkultura pro zkoušky popsané dále.

   Monolayery se po dobu inkubace pravidelně prohlížejí na možnou přítomnost cytopatických efektů. Na konci pozorovací doby na zjištění cytopatických efektů se zkouší na přítomnost hemadsorpčních virů a specifické viry se prokazují imunofluorescencí nebo jinými vhodnými zkouškami, které jsou popsány dále.

   Detekce cytopatických virů. Dva monolayery o plochách nejméně 6 cm² se obarví vhodným cytologickým barvivem. Celá oblast každého obarveného monolayeru se prohlédne a zjišťuje se přítomnost inkluzních tělísek, abnormálního počtu obřích buněk a dalších buněčných abnormalit, které mohou souviset s kontaminací.

   Detekce hemadsorpčních virů. Monolayery o ploše nejméně 70 cm² se několikrát promyjí vhodným tlumivým roztokem a přidá se dostatečný objem suspenze vhodných erytrocytů tak, aby povrch monolayerů byl rovnoměrně pokryt. Po různých dobách inkubace se buňky prohlížejí na přítomnost hemadsorpce.

   Detekce specifikovaných virů. Provedou se zkoušky na nepřítomnost specifických kontaminant druhu, z něhož pochází buněčná linie, a druhu, jemuž je výrobek určen. Na vhodných podkladech se připraví dostatečné množství buněk k provedení zkoušek na specifikované agens. Všechny zkoušky se doplní patřičnými pozitivními kontrolami. Buňky se podrobí vhodným zkouškám, jako např. užití fluorescenčně-konjugovaných protilátek nebo podobných zkoumadel.

   Zkouška na jiné buněčné kultury. Ke zkoušce se použijí monolayery o ploše nejméně 140 cm². Buňky se nejméně třikrát zmrazí a rozmrazí, potom se odstředí, aby se odstranily odumřelé buňky. Inokuluje se alikvotní podíl do kultur následujících buněk, dříve než dojde k 70% nárůstu:

   1. - primárních buněk druhu, který je zdrojem,
   2. - buněk citlivých na viry patogenní pro druh, pro který je vakcína určena,
   3. - buněk citlivých na pestiviry.

   Inokulované buňky se udržují v kultuře nejméně 7 dnů, potom se zmrazí a rozmrazí, připraví se výtažky, jak je uvedeno výše, a inokulují do patřičných čerstvých kultur stejných typů buněk, které umožňují zkoušení, jaké je popsané níže. Buňky se inkubují nejméně 7 dalších dnů. Kultury se pravidelně prohlížejí na přítomnost cytopatických změn indikujících živé organismy.

   Za 14 dní se inokulované buňky zkoušejí na:

   1. - nepřítomnost cytopatických a hemadsorpčních organismů, při použití metod popsaných v příslušném odstavci výše,
   2. - nepřítomnost pestivirů a jiných specifických kontaminant imunofluorescencí nebo jinou validovanou metodou, jak je uvedeno výše v odstavci Detekce specifikovaných virů.

   Tumorogenita. Zváží se riziko buněčných linií pro cílový druh, a je-li třeba, provedou se zkoušky.

   Primární buňky

   Pro většinu savčích vakcín není použití primárních buněk při výrobě vakcín přijatelné, neboť mohou být použity buněčné linie. Pokud není možná žádná jiná alternativa, mohou být použity primární buňky, které pocházejí ze stáda nebo hejna prostého specifikovaných patogenů s kompletní ochranou proti zavlečení chorob (např. bariéry zabraňující šíření chorob, filtrace vzduchu, vhodná karanténa před zavedením zvířat). Kuřecí chovy vyhovují požadavkům uvedeným ve stati Chovy kuřat prostých specifikovaných patogenů, která jsou určena pro výrobu a kontrolu jakosti vakcín (5.2.2). Pro všechny ostatní druhy se prokazuje, že ve stádě nebo hejnu není přítomen závažný specifikovaný patogen. Každý takový chov, který je určen pro výrobu primárních buněk určených k výrobě vakcín, je podroben vhodnému monitorování, které zahrnuje i pravidelné sérologické kontroly, které jsou prováděny nejméně dvakrát za rok, a dva dodatkové sérologické testy, které se provádí na 15 % chovu mezi dvěma kontrolami uvedenými výše.

   Všude, kde je možné, zvláště u savčích buněk, se používá systém jednotné inokulace, např: banka základních buněk je založena po méně než pěti pasážích, výrobní buněčné inokulum neobsahuje buňky, které jsou více než pětkrát pasážovány z původní připravené buněčné suspenze, která pochází z živočišné tkáně.

   Každá banka základních buněk, banka pracovních buněk a buňky v nejvyšší pasáži primárních buněk se kontrolují podle tabulky 5.2.4-2 dále popsanými metodami. Zkoušený vzorek zahrne všechny zdroje buněk použité pro výrobu šarže. Žádná šarže vakcíny vyrobené za pomoci buněk se neuvolní do oběhu, jestliže jedna ze zkoušek byla nevyhovující.

   Tab 5.2.4-2 Stadia buněčných kultur ve vztahu k prováděným zkouškám

   Zkoušky na čistotu Buněčné linie Tab 5.2.4-1 Stadia buněčných kultur, na nichž se provádějí zkoušky Primární buňky Tab 5.2.4-2 Stadia buněčných kultur ve vztahu k prováděným zkouškám

   	Matečné buněčné inokulum	Pracovní buněčné inokulum	Buňky v nejvyšším stupni pasážování
   všeobecná mikroskopie	+	+	+
   bakterie a houby	+	+	-
   mykoplazmata	+	+	-
   viry	+	+	-
   určení druhu	+	-	-

   Charakteristika buněčných kultur. Popíše se vzhled buněčných monolayerů před a po histologickém obarvení. Zaznamenají se informace, dle možností číselné údaje, zvláště o rychlosti a úrovni růstu. Podobně se specifikuje přítomnost nebo nepřítomnost kontaktní inhibice, polynukleárních buněk a jakýchkoliv jiných buněčných abnormalit.

   Určení druhu. Jednou validovanou zkouškou se prokáže, že banka základních buněk pochází ze specifikovaného původního druhu. Jestliže se provede fluorescenční zkouška pomocí séra proti druhu, z něhož buňky pocházejí, a prokáže se, že všechny zkoušené buňky fluoreskují, není dále nutné provádět další zkoušky se zkoumadly, které mohou prokázat kontaminaci buňkami jiných druhů.

   Bakterie a houby. Buňky vyhovují zkoušce na sterilitu (2.6.1). Vzorek zkoušených buněk je nejméně množství buněk v monolayerů o ploše 70 cm², nebo u buněk kultivovaných v suspenzích přibližně srovnatelný počet. Před zahájením zkoušky se buňky nejméně 15 dnů udržují v kultuře bez antibiotik.

   Mykoplazmata (2.6.7). Buňky vyhovují zkoušce na mykoplazmata. Před zahájením zkoušky se buňky nejméně 15 dnů udržují v kultuře bez antibiotik.

   Nepřítomnost kontaminujících virů. Zjišťuje se, zda buňky nejsou kontaminovány viry, a proto se provádějí vhodné citlivé zkoušky včetně těch, které jsou popsány dále.

   U monolayerů se zkouší plocha nejméně 70 cm². Monolayer se připraví a udržuje pomocí médií a aditiv v podmínkách podobných podmínkám při výrobě vakcíny. Kultury monolayerů se udržují po dobu nejméně celkem 28 dnů nebo se kultivují co nejdelší možnou dobu, pokud kulturu nelze 28 dnů udržet. Subkultury se zakládají každých 7 dnů. Pokud buňky nejsou schopné přežít tuto dobu, subkultura se zakládá v nejzazším možném termínu.

   Z dostatečného počtu buněk, které jsou uloženy ve vhodných nádobách, se připraví konečná subkultura pro zkoušky popsané dále.

   Monolayery se po dobu inkubace pravidelně prohlížejí na možnou přítomnost cytopatických efektů. Na konci pozorovací doby na zjištění cytopatických efektů se zkouší na přítomnost hemadsorpčních virů a specifické viry se prokazují imunofluorescencí nebo jinými vhodnými zkouškami, které jsou popsány dále.

   Detekce cytopatických virů. Dva monolayery o plochách nejméně 6 cm² se obarví vhodným cytologickým barvivem. Celá oblast každého obarveného monolayeru se prohlédne a zjišťuje se přítomnost inkluzních tělísek, abnormálního počtu obřích buněk a dalších buněčných abnormalit, které mohou souviset s kontaminací.

   Detekce hemadsorpčních virů. Monolayery o ploše nejméně 70 cm² se několikrát promyjí vhodným tlumivým roztokem a přidá se dostatečný objem suspenze vhodných erytrocytů tak, aby povrch monolayerů byl rovnoměrně pokryt. Po různých dobách inkubace se buňky prohlížejí na přítomnost hemadsorpce.

   Detekce specifikovaných virů. Provedou se zkoušky na nepřítomnost specifických kontaminant druhu, z něhož pochází buněčná linie, a druhu, jemuž je výrobek určen. Na vhodných podkladech se připraví dostatečné množství buněk k provedení zkoušek na specifikované agens. Všechny zkoušky se doplní patřičnými pozitivními kontrolami. Buňky se podrobí vhodným zkouškám, např. užití fluorescenčních-konjugovaných protilátek nebo podobných reagencií.

   Zkouška na jiné buněčné kultury. Ke zkoušce se použijí monolayery o ploše nejméně 140 cm². Buňky se nejméně třikrát zmrazí a rozmrazí, potom se odstředí, aby se odstranily odumřelé buňky. Inokuluje se alikvotní podíl do kultur následujících buněk, dříve než dojde k 70% nárůstu:

   1. - primárních buněk druhu, který je zdrojem,
   2. - buněk citlivých na viry patogenní pro druh, pro který je vakcína určena,
   3. - buněk citlivých na pestiviry.

   Inokulované buňky se udržují v kultuře nejméně 7 dnů, potom se zmrazí a rozmrazí, připraví se výtažky, jak je uvedeno výše, a inokulují na dostatečné čerstvé kultury stejných typů buněk, které umožňují zkoušení, jak je popsáno dále. Buňky se inkubují nejméně dalších 7 dnů. Kultury se pravidelně prohlížejí na přítomnost cytopatických změn indikujících živé organismy.

   Za 14 dní se inokulované buňky zkoušejí na:

   1. - nepřítomnost cytopatických a hemadsorpčních organismů, při použití metod popsaných v příslušném odstavci výše,
   2. - důležité substráty se zkoušejí na nepřítomnost pestivirů a jiných specifických kontaminant imunofluorescencí nebo jinou validovanou metodou, jak je uvedeno výše v odstavci Detekce specifikovaných virů.

1. 5.2.5 Látky živočišného původu pro výrobu veterinárních vakcín

   Látky živočišného původu (např. sérum, trypsin, sérový albumin) se mohou použít během výroby veterinárních imunologických přípravků jako součásti kultivačních médií ap. nebo jako části vakcín nebo rozpouštědel. Doporučuje se omezit dle možností užití těchto látek.

   K použití těchto látek se vážou určitá omezení, která snižují riziko spojené s možnou přítomností patogenů v těchto látkách.

   1. - Použití látek živočišného původu jako částí vakcín nebo rozpouštědel není všeobecně přijatelné s výjimku toho, kdy jsou tyto látky sterilizovány vhodnou validovanou metodou. Pokud je použití těchto látek prokazatelně podstatné a sterilizace není možná, platí kritéria popsaná pod Požadavky.
   2. - Látky živočišného původu používané ve výrobě jsou buďto vystaveny vhodnému a validovanému sterilizačnímu nebo inaktivačnímu postupu, nebo se látka zkouší na nepřítomnost cizích organismů v souladu s Požadavky dále uvedenými. U inaktivovaných vakcín je metoda inaktivace vakcinačního kmene také validována na inaktivaci případných kontaminant z látek živočišného původu.

   Kromě omezení dále popsaných zvažuje výrobce omezení při zacházení s látkami živočišného původu v budovách na výrobu vakcíny.

   Omezení uložená těmito odstavci mohou být změněna vzhledem ke změnám ve výskytu nemocí v zemi původu a v Evropě.

   Požadavky

   Látky živočišného původu vyhovují požadavkům lékopisu (pokud je vypracován odpovídající článek).

   Zdroj. Pečlivě se zváží riziko spojené s nemocemi zvířat vyskytujícími se v zemi původu látky a možný výskyt infekční nemoci u druhu, který je zdrojem, ve vztahu k zamýšlenému druhu příjemce. Použijí se nejpřísnější možná výběrová kritéria, zejména pro látky použité ve výrobku určeném pro stejný druh a pro látky hovězího, kozího, ovčího a prasečího původu.

   Příprava. Látky živočišného původu se připravují z homogenního celkového objemu označeného číslem šarže. Šarže může obsahovat látky z tolika zvířat, kolik je potřeba. K jednou definované a číslem označené šarži se však nic nepřidává a nijak se nekontaminuje.

   Prokáže se, že všechny šarže látek jsou prosty kontaminant, jak je popsáno níže, a případně se též provede validovaný inaktivační postup.

   Inaktivace. Vybraný inaktivační postup by měl být prokazatelně schopen snížit titr určitých případných kontaminant v uvažované látce o nejméně 10⁶. Jestliže se nemůže experimentálně prokázat toto snížení titru, provedou se studie kinetiky inaktivačního postupu a prokáže se, že je dostatečný vzhledem k možné úrovni kontaminace.

   Uvede se seznam možných kontaminujících organismů, které je tento postup schopen prokazatelně inaktivovat s přihlédnutím k jednotlivým druhům původu látky. Důkaz o účinnosti postupu, který se vztahuje na běžné okolnosti, může být vzat z údajů uveřejněných v literatuře nebo z experimentálních výsledků vytvořených výrobcem.

   Zkoušky na čistotu. Pro zkoušení látky na nepřítomnost kontaminant se pevná látka rozpustí nebo suspenduje ve vhodné tekutině tak, aby vznikl roztok nebo suspenze obsahující nejméně 300 g/l zkoušené látky. Je-li látka nerozpustná nebo když se zjistí cytotoxické reakce, může se použít nižší koncentrace.

   Je-li v šarži látky nalezen jakýkoliv živý organismus, je tato šarže nevyhovující, látka se vyřadí nebo se přepracuje a prokáže se, že je vyhovující.

   Nepřítomnost cizích virů. Roztok nebo suspenze pevné látky nebo neředěné tekuté látky se zkouší vhodnými citlivými metodami na přítomnost kontaminant. Tyto metody zahrnují zkoušky na vhodných citlivých buněčných kulturách, včetně primárních buněk z téhož druhu jako zkoušená látka. Část buněk se pasážuje nejméně dvakrát.

   Buňky se 21 dní pravidelně prohlížejí na cytopatické efekty. Na konci každých 7 dnů se část buněk z původní kultury fixuje, obarví a prohlíží na cytopatické efekty, část se zkouší na hemadsorpci a část se podrobí vhodným sérodiagnostickým zkouškám na specifická agens.

   Kontaminace bakteriemi a houbami. Před použitím se látky zkoušejí na sterilitu (2.6.1) a na nepřítomnost mykoplazmat (2.6.7) nebo se sterilizují, aby se inaktivovala jakákoliv kontaminace bakteriemi, houbami nebo mykoplazmaty.

1. 5.2.6 Hodnocení bezpečností veterinárních vakcín

   Při vývoji vakcíny se provádějí bezpečnostní zkoušky na cílovém druhu, aby se ukázalo riziko při používání vakcíny. Živé vakcíny se připravují jen z těch kmenů organismů, u nichž bylo prokázáno, že jsou bezpečné.

   V zkouškách znamená "dávka" množství látky doporučené pro použití a obsahující nejvyšší titr nebo účinnost obsaženou ve výrobní šarži. U živých vakcín se pro zkoušky použije jedna nebo více šarží vakcíny připravené z nejméně atenuovaných pasáží použitých k výrobě.

   U složených vakcín se prokáže bezpečnost jednotlivých složek i bezpečnost složeného výrobku. U inaktivovaných vakcín se zkoušky bezpečnosti provedené na složené vakcíně mohou považovat za dostatečné k prokázání bezpečnosti jednotlivých složek.

   Dále popsané zkoušky, modifikované nebo doplněné zkouškami popsanými v jednotlivých lékopisných článcích v odstavci o výrobě, se mohou provést k dokázání bezpečnosti vakcíny jako část zkoušek nutných při jejím vývoji.

   1. A. Laboratorní zkoušky

      Bezpečnost podání jedné dávky. Pro každý z doporučených způsobů podání se aplikuje jedna dávka vakcíny citlivému zvířeti každého druhu a kategorie, pro které se použití vakcíny doporučuje. Zahrnuje to zvířata nejnižšího doporučeného věku a případně i gravidní zvířata. Zvířata se pozorují a zjišťují se známky abnormálních místních a systémových reakcí. Kde je to vhodné, obsahují tyto studie podrobné postmortální makroskopické a mikroskopické vyšetření místa vpichu; tyto studie není nutno provádět u nepotravinových zvířat. Zapisují se další objektivní kritéria, jako rektální teploty (u savců) a další měření. Rektální teploty se zapisují nejméně den před vakcinací, v době vakcinace, 4 h po ní a následující 4 dny. Zvířata se pozorují a vyšetřují tak dlouho, dokud jsou očekávány vedlejší reakce, ale ve všech případech se tato zvířata pozorují a vyšetřují po dobu nejméně 14 dnů po podání vakcíny.

      Jako součást těchto studií je také zvážení kontroly reprodukční činnosti, když údaje naznačují, že výchozí materiál, ze kterého je vakcína vyrobena, může být rizikovým faktorem. Kde je to předepsáno v článku, vyšetří se schopnost reprodukce u samců, negravidních a gravidních samic, škodlivé vlivy na plod, včetně teratogenních a abortivních účinků.

      Bezpečnost při předávkování. Nadlimitní dávka přípravku se podá každým z doporučených způsobů podání nejcitlivějším kategoriím zvířat cílového druhu, včetně zvířat nejmladších nebo gravidních, pokud je to vhodné. Nadlimitní dávka obyčejně obsahuje 10 dávek živé vakcíny nebo 2 dávky inaktivovaného přípravku. Tato zvířata se pozorují a vyšetřují na příznaky místních a systémových reakcí. Zapisují se další objektivní kritéria, jako jsou rektální teploty (u savců) a výsledky dalších měření. Zvířata se pozorují a vyšetřují nejméně 14 dnů po podání vakcíny.

      Bezpečnost při opakovaném podání jedné dávky. Opakované podání jedné dávky se může požadovat k odhalení nežádoucích účinků vyvolaných tímto podáním. Zkoušení se provádí na nejvíce citlivých kategoriích cílového druhu, za použití doporučeného způsobu podání. Zvířata se pozorují a vyšetřují nejméně 14 dnů po posledním podání vakcíny na příznaky sytémových a místních reakcí. Zapisují se další objektivní kritéria, jako jsou rektální teploty (u savců) a výsledky dalších měření.

      Rezidua. Normálně není nutné provádět studie reziduí. Avšak, pokud byla ve výrobě použita adjuvancia nebo konzervační přípravky nebo obojí, měla by se zvážit možnost přetrvávání jejich reziduí v potravinách. Je-li třeba, vyšetří se účinek těchto reziduí. Mimo to, v případě živé vakcíny určené proti entzooticky se vyskytujícím zoonozám, se může požadovat určení reziduálního vakcinačního agens v místě podání spolu se studií rozsevu v organismu, která je popsána dále.

      Nežádoucí účinky na imunologické funkce. Jestliže podání vakcíny může nepříznivě ovlivnit imunitní systém očkovaného zvířete nebo jeho potomstva, provedou se vhodné zkoušky imunologických funkcí.

      Speciální požadavky na živé vakcíny. Živé vakcíny se podrobí následujícím laboratorním zkouškám.

      1. a) Šíření vakcinačního kmene. Šíření vakcinačního kmene z očkovaného na neočkované cílové zvíře se zkouší za použití doporučeného způsobu podání, který nejpravděpodobněji způsobuje toto šíření. Mimo to může být nutné vyšetřit bezpečnost šíření na necílové druhy, které mohou být vysoce citlivé na živý vakcinační kmen. Stanoví se možný pravděpodobný počet pasáží ze zvířete na zvíře za normálních podmínek a jejich pravděpodobné následky.
      2. b) Rozsev ve vakcinovaném zvířeti. Výkaly, moč, mléko, vejce, orální, nazální a jiné sekrety se zkouší na přítomnost vakcinačního organismu. Mimo to se může vyžadovat studie rozsevu vakcinačního kmene v těle se zaměřením na predilekční místa pro pomnožování organismu. U živých vakcín jsou tyto zkoušky povinné z důvodů možnosti uplatnění zoonóz u potravinových zvířat.
      3. c) Návrat nebo zvýšení virulence. Pro atenuované vakcíny se použije materiál z takové úrovně pasáže, která je pro cílový druh nejméně atenuovaná. Jedná se o materiál mezi matečným inokulem a konečným produktem. U ostatních živých vakcín se použije materiál z té pasáže, která má pravděpodobně největší virulenci pro cílový druh. Počáteční vakcinace se provede doporučeným způsobem, který nejpravděpodobněji vede k návratu virulence. Potom se provede nejméně pět dalších sériových pasáží na zvířatech cílového druhu. Kde je to technicky nemožné pro selhání organismu se vhodně pomnožovat, zkouška se opakuje a provede se největší počet pasáží, který je možný u cílového druhu. Je-li to nutné, může se mezi dvěma pasážemi in vivo provést jedna pasáž in vitro. Pasáž se provádí takovým způsobem, který nejpravděpodobněji povede k návratu virulence. Pro každou pasáž se použijí nejméně dvě plně vnímavá zvířata. Při každé pasáži se v použitém materiálu dokáže přítomnost živého vakcinačního organismu. Bezpečnost vysoce pasážovaného materiálu se porovná s nepasážovaným materiálem.

      Pro určité viry se může v článku požadovat více pasáží na více zvířatech, pokud tato indikace odpovídá dostupným odborným údajům. Nejméně konečná pasáž se dělá na nejvhodnějších zvířatech, u nichž bylo určeno možné riziko.

      1. d) Biologické vlastnosti vakcinačních kmenů. K co nejpřesnějšímu určení podstatných biologických vlastností vakcinačního kmene (např. neurotropismu) mohou být nutné další zkoušky. U vektorových vakcín se zkouší úroveň rizika změny tropismů nebo virulence kmene, a kde je třeba, provádějí se specifické zkoušky. Takové zkoušky se provádějí systematicky, jestliže je cizí gen inkorporován do kmene jako strukturální bílkovina.
      2. e) Rekombinace nebo genomové sestavení kmene. Mělo by se uvažovat o pravděpodobnosti rekombinace nebo genomového sestavení s terénním nebo jiným kmenem.
      1. B. Studie v terénu

         Výsledky získané v laboratoři by se měly normálně doplnit o výsledky studií v terénu.

         Pro savce produkující potraviny zahrnují tyto zkoušky měření rektální teploty u dostatečného počtu zvířat před a po očkování. Pro ostatní savce se takováto měření provádějí, pokud laboratorní studie ukazují, že zde může být problém. Velikost a přetrvávání místních reakcí, míry zvířat vykazujících lokální nebo systémové reakce se zaznamenávají. Kde je to vhodné, provádějí se měření.

      1. C. Ekotoxicita

         Provede se odhad možných nepříznivých vlivů vakcíny na prostředí a určí se nezbytná opatření na snížení tohoto rizika. Odhadne se pravděpodobný stupeň vystavení prostředí vlivu vakcíny vzhledem k cílovému druhu a způsobu podání vakcíny, vylučování přípravku a způsobu likvidace nepoužitých vakcín. Jestliže tyto faktory prokáží významný vliv vakcíny na prostředí, stanoví se její potenciální ekotoxicita vzhledem ke stanoveným vlastnostem vakcíny, např. pomocí zkoušek, které jsou popsány v této sekci.

1. 5.2.7 Hodnocení účinnosti veterinárních vakcín

   Při vývoji vakcín se provádějí zkoušky, jimiž se dokazuje účinnost vakcíny při jejím podání všemi doporučenými způsoby a metodami vakcinace na všech druzích a kategoriích zvířat, pro která je tato vakcína určena. Typy zkoušek účinnosti, jež se mají provést, se značně mění v závislosti na jednotlivém typu vakcíny.

   Jako část zkoušek nebo k jejich doplnění se mohou provést při vývoji vakcíny k prokázání účinnosti zkoušky popsané ve specifických lékopisných článcích v odstavci Výroba. Je vhodné zvážit následující skutečnosti.

   Podávaná dávka je množství přípravku doporučené k použití, obsahující nejnižší titr nebo účinnost očekávanou ještě na konci doby platnosti.

   U živých vakcín se použije vakcína připravená z nejvíce atenuované pasáže, která je použita ve výrobě.

   Zkouška účinnosti potvrdí všechny indikace. Např. požadavky na ochranu proti respirační chorobě se podpoří nejméně důkazem ochrany před klinickými příznaky respirační choroby. Kde je požadována ochrana před infekcí, dokáže se to užitím reizolačních technik. Má-li vakcína více indikací, její účinnost se prokáže pro každou z nich.

   Vliv pasivně získaných a mateřských protilátek na účinnost vakcíny se prokáže přiměřeným způsobem. Uvedené nebo vyplývající údaje o začátku a trvání ochrany jsou podloženy údaji ze zkoušek.

   Účinnost každé složky multivalentních a složených přípravků se prokazuje použitím složené vakcíny.

   Je-li doporučeno současné podání, nebo tam, kde takovéto podání je součástí běžného vakcinačního schématu, provede se studie imunologické vzájemné snášenlivosti.

   Všude, kde je přípravek doporučen jako součást vakcinačního schématu, se prokáže jeho plná účinnost při primovakcinaci nebo dodatkovém nebo přídatném očkování.

   Laboratorní zkoušky

   Zásadně se důkaz účinnosti provádí v plně kontrolovaných laboratorních podmínkách pomocí čelenže po podání vakcíny cílovému zvířeti v doporučených podmínkách použití. Čelenž se provádí kmenem odlišným od kmene, který byl použit při výrobě vakcíny. Podmínky, za kterých se provádí čelenž, se co nejvíce přizpůsobí přirozené infekci, např. způsobem podání a dávkou čelenžních organismů. Pokud je to možné, určí se imunitní mechanismus (imunita zprostředkovaná buňkami, humorální, lokální, celková, třídy imunoglobulinů), který se vytvoří po podání vakcíny cílovému zvířeti.

   Zkoušky v terénu

   Výsledky laboratorních zkoušek se obvykle doplní údaji získanými při zkouškách v terénu provedených na kontrolních neléčených zvířatech. Pokud laboratorní zkoušky nedovolují průkaz účinnosti, může se připustit, aby se provedl jen při zkouškách v terénu.

1. 5.3 Statistické analýzy výsledků biologických zkoušek