Český lékopis 1997

Na vrstvu se nanese odděleně 20 μl zkoušeného roztoku a 10 μl porovnávacího roztoku a vyvíjí se dvakrát dichlormethanem R po dráze 12 cm. Vrstva se usuší na vzduchu, postříká se anisaldehydem RS a suší se 5 min až 10 min při 100 °C až 105 °C. Skvrna odpovídající bomylacetatu na chromatogramu zkoušeného roztoku nepřevyšuje velikostí a intenzitou skvrnu bomylacetatu na chromatogramu porovnávacího roztoku; skvrna odpovídající bomeolu není na chromatogramu zkoušeného roztoku přítomna. V dolní polovině chromatogramu zkoušeného roztoku jsou tři až čtyři intenzivně modrofialové skvrny, ve střední části je patrna růžově červená skvrna, intenzita zbarvení této skvrny je závislá na stáří silice; v blízkosti čela chromatogramu je patrná intenzivně fialová skvrna.

Zkoušky na čistotu

Hustota (2.2.5). 0,855 až 0,866 g/ml.

Index lomu (2.2.6). 1,467 až 1,477.

Číslo kyselosti (2.5.1). Nejvýše 1,0; 5,0 g se rozpustí v předepsané směsi rozpouštědel.

Voda v silicích (2.8.5). Vyhovuje požadavkům zkoušky Voda v silicích.

Mastné oleje a zpryskyřičnatělé silice (2.8.7). Vyhovuje požadavkům zkoušky Mastné oleje a zpryskyřičnatělé silice.

Pach a chuť silic (2.8.8). Vyhovuje požadavkům zkoušky Pach a chuť silic.

Zbytek po odpaření silic (2.8.9). Nejvýše 0,5 % (0,01 g); stanoví se s 2,0 g zkoušené látky.

Rozpustnost v lihu (2.8.10). Je rozpustná v šesti objemových dílech lihu 96% (V/V).

Stanovení obsahu

Provede se plynová chromatografie (2.2.28).

Roztok vnitřního standardu. 0,250 g undekanu R se rozpustí v hexanu R a zředí se jím na 50,0 ml.

Zkoušený roztok. 0,250 g se rozpustí v hexanu R a zředí se jím na 50,0 ml. 2,0 ml se smíchají se 2,0 ml roztoku vnitřního standardu.

Porovnávací roztok. 125,0 mg α-pinenu R se rozpustí v hexanu R a zředí se jím na 25,0 ml. 2,0 ml se smíchají se 2,0 ml roztoku vnitřního standardu.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

1. - kapilární kolony délky 60 m, vnitřního průměru 0,53 mm a vnitřní stěnou pokrytou vrstvou poly[fenyl(5)methyl(95)]siloxanu R; tloušťka vrstvy je 1,5 μm,
2. - dusíku pro chromatografii R jako nosného plynu při průtokové rychlosti 1,5 ml/min,
3. - plamenoionizačního detektoru,
4. - programované teploty; teplota kolony se zvyšuje ze 60 °C rychlostí 3 °C/min až na 135 °C,
5. - teploty nástřikového prostoru a detektoru 220 °C.

Nastříkne se odděleně po 0,5 μl zkoušeného a porovnávacího roztoku. Nástřiky se opakují nejméně třikrát. Při zaznamenání chromatogramu za předepsaných podmínek jsou retenční časy: α-pinenu asi 13 min, β-pinenu asi 15 min a undekanu asi 21 min. Zkoušku lze hodnotit, jestliže symetrie píku je nejméně 0,8 a nejvýše 1,2, počítáno pro pík α-pinenu, a je-li rozlišení dvou po sobě následujících píků nejméně 1,5.

Obsah pinenů v procentech se vypočítá metodou vnitřního standardu.

Uchovávání

Ve zcela naplněných vzduchotěsných obalech, chráněna před světlem.

Terfenadinum

Terfenadin

Vlastnosti

Bílý krystalický prášek. Je velmi těžce rozpustný ve vodě a v kyselině chlorovodíkové zředěné, snadno rozpustný v dichlormethanu, dobře rozpustný v methanolu.

Vykazuje polymorfismus.

Zkoušky totožnosti

Základní sestava zkoušek: C.

Alternativní sestava zkoušek: A, B a D, viz Obecné zásady (1.2).

1. A. Teplota tání (2.2.14). 146 °C až 152 °C.
2. B. 50,0 mg se rozpustí v methanolu R a zředí se jím na 100,0 ml. Měří se absorbance roztoku (2.2.25) při 230 nm až 350 nm; roztok vykazuje absorpční maximum při 259 nm a prodlevy při 253 nm a 270 nm. Specifická absorbance v maximuje 13,5 až 14,9.
3. C. Infračervené absorpční spektrum (2.2.24) zkoušené látky se shoduje se spektrem terfenadinu CRL.
4. D. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití vrstvy silikagelu HF₂₅₄R.

   Zkoušený roztok. 50 mg se rozpustí v dichlormethanu R a zředí se jím na 10 ml.

   Porovnávací roztok. 50 mg terfenadinu CRL se rozpustí v dichlormethanu R a zředí se jím na 10 ml.

   Na vrstvu se nanese odděleně po 10 μl každého roztoku a vyvíjí se směsí objemových dílů methanolu R a dichlormethanu R (10 + 90) po dráze 15 cm. Vrstva se usuší na vzduchu a pozoruje se v ultrafialovém světle při 254 nm. Hlavní skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku se polohou a velikostí shoduje s hlavní skvrnou na chromatogramu porovnávacího roztoku.

Zkoušky na čistotu

Příbuzné látky. Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29).

Zkoušený roztok. 15 mg se rozpustí v mobilní fázi a zředí se jí na 10,0 ml.

Porovnávací roztok (a). 1,0 ml zkoušeného roztoku se zředí mobilní fází na 10,0 ml. 1,0 ml tohoto roztoku se zředí mobilní fází na 20,0 ml.

Porovnávací roztok (b). 15 mg terfenadinu nečistoty A CRL se rozpustí v mobilní fázi a zředí se jí na 10,0 ml. K 5,0 ml tohoto roztoku se přidá 5,0 ml zkoušeného roztoku a zředí se mobilní fází na 50,0 ml.

Porovnávací roztok (c). 10,0 ml porovnávacího roztoku (a) se zředí mobilní fází na 25,0 ml.

Porovnávací roztok (d). 0,1 g jodidu draselného R se rozpustí v mobilní fázi a zředí se jí na 100 ml.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

1. - nerezové ocelové kolony délky 0,25 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné silikagelem oktylsilanizovaným pro chromatografii R (5 μm),
2. - mobilní fáze, která je směsí připravenou takto: 600 ml acetonitrilu R se zředí tlumivým roztokem diethylamoniumfosforečnanovým o pH 6 na 100 ml. Průtoková rychlost je 1 ml/min,
3. - spektrofotometrického detektoru, 217 nm,
4. - injektorové smyčky.

Nastříkne se po 20 μl každého roztoku a chromatogramy se zaznamenávají po dobu odpovídající 5násobku retenčního času terfenadinu. Zkoušku lze hodnotit, jestliže na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) je rozlišení mezi píkem terfenadinu a píkem terfenadinu nečistoty A nejméně 5,0 a kapacitní poměr píku terfenadinu je větší než 2,0. Kapacitní poměr se stanoví za použití jodidu draselného A jako nezadržované složky. Na chromatogramu zkoušeného roztoku plocha žádného píku, kromě hlavního píku, není větší než plocha píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (c) (0,2 %) a součet ploch všech píků, kromě hlavního píku, není větší než plocha píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) (0,5 %). Nepřihlíží se k píkům, jejichž plocha je menší než 2,5 % plochy píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (c).

Ztráta sušením (2.2.32). Nejvýše 0,5 %; 1,000 g se suší při 60 °C pod tlakem nepřevyšujícím 0,5 kPa.

Síranový popel (2.4.14). Nejvýše 0,1 %; stanoví se s 1,00 g zkoušené látky.

Stanovení obsahu

0,400 g se rozpustí v 50 ml kyseliny octové bezvodé R a titruje se kyselinou chloristou 0,1 mol/l VS za potenciometrické indikace bodu ekvivalence (2.2.20).

1 ml kyseliny chloristé 0,1 mol/l VS odpovídá 47,17 mg C₃₂H₄₁NO₂.

Uchovávání

V dobře uzavřených obalech, chráněn před světlem.

Nečistoty

1. A. 1-(4-terc.butylfenyl)-4-[4-hydroxydifenylmethyl)piperidin-1-yl]-1-butanon,
2. B. 1-(4-terc.butylfenyl)-4-[4-difenylmethyl)piperidin-1-yl]-1-butanol,
3. C. N-oxid l-(4-terc.butylfenyl)-4-[4-(hydroxydifenylmethyl)piperidin-l-yl]-1-butanolu,
4. D. 1-(4-terc.butylfenyl)-4-[4-(difenylmethylen)piperidin-1-yl]-1-butanol,
5. E. kyselina 1-[4-(4-terc.butylfenyl)-4-hydroxybutyl]piperidin-4-karboxylová,
6. F. 1-[4-(4-terc.butylfenyl)-3-butenyl]-4-difenylmethylenpiperidin,
7. G. {1-[4-(4-terc.butylfenyl)-3-butenyl]piperidin-4-yl}-(difenyl)methanol,
8. H. {1-[4-(4-terc.butylfenyl)butyl]piperidin-4-yl}(difenyl)methanol,
9. I. difenyl(piperidin-4-yl)methanol,
10. J. ethyl-1-[4-(4-terc.butylfenyl)-4-hydroxybutyl]piperidin-4-karboxylat.

† Testosteroni enantas

Testosteronenantat

Vlastnosti

Bílý nebo žlutavě bílý krystalický prášek. Je prakticky nerozpustný ve vodě, velmi snadno rozpustný v ethanolu a v etheru, je dobře rozpustný v mastných olejích.

Zkoušky totožnosti

Základní sestava zkoušek: B.

Alternativní sestava zkoušek: A, C a D, viz Obecné zásady (1.2).

1. A. Teplota tání (2.2.14). 34 °C až 39 °C.
2. B. Infračervené absorpční spektrum (2.2.24) zkoušené látky se shoduje se spektrem testosteronenantatu CRL.
3. C. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití vrstvy vhodného silikagelu oktadecylsilanisovaného pro chromatografii s fluorescenčním indikátorem pro detekci při 254 nm.

Zkoušený roztok. 5 mg se rozpustí ve směsi objemových dílů methanolu R a dichlormethanu R (1 + 9) a zředí se stejnou směsí na 10 ml.

Porovnávací roztok (a). 5 mg testosteronenantatu CRL se rozpustí ve směsi objemových dílů methanolu R a dichlormethanu R (1 + 9) a zředí se stejnou směsí na 10 ml.

Porovnávací roztok (b). 5 mg testosteronenatatu CRL, 5 mg testosterondekanoatu CRL a 5 mg testorenisokapronatu CRL se rozpustí ve směsi objemových dílů methanolu R a dichlormethanu R (1 + 9) a zředí se stejnou směsí na 10 ml.

Na vrstvu se odděleně nanese po 5 μl každého roztoku a vyvíjí se směsí objemových dílů vody R, acetonitrilu R a 2-propanolu R (20 + 40 + 60) po dráze 15 cm. Vrstva se usuší na vzduchu a zahřívá se 10 min při 100 °C. Po vychladnutí se pozoruje v ultrafialovém světle při 254 nm. Hlavní skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku se shoduje polohou a velikostí s hlavní skvrnou na chromatogramu porovnávacího roztoku (a). Pak se vrstva postříká kyselinou sírovou v lihu RS a zahřívá se v sušárně 10 min při 120 °C. Po vychladnutí se vrstva pozoruje v denním světle. Hlavní skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku je zelená a shoduje se polohou a velikostí s hlavní skvrnou na chromatogramu porovnávacího roztoku (a). Zkoušku lze hodnotit, jestliže na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) jsou tři zřetelně oddělené hlavní skvrny, a to při obou uvedených způsobech detekce.

1. D. K asi 25 mg se přidají 2 ml hydroxidu sodného R (10 g/l) v methanolu R a vaří se 1 h pod zpětným chladičem. Pak se ochladí, přidá se 10 ml vody R a roztok se okyseluje kyselinou chlorovodíkovou zředěnou RS, dokud papír lakmusový modrý R není červený. Zfiltruje se, sraženina se promyje malým množstvím vody R a 3 h se suší při 60 °C a tlaku nepřevyšujícím 0,7 kPa. Teplota tání (2.2.14) vysušené sraženiny je 150 °C až 153 °C.

Zkoušky na čistotu

Specifická optická otáčivost (2.2.7) +77° až +82°, počítáno na bezvodou látku. Měří se roztok připravený rozpuštěním 0,250 g v dioxanu R a zředěním stejným rozpouštědlem na 25,0 ml.

Příbuzné látky. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití vrstvy silikagelu G R. Zkoušený roztok. 0,20 g se rozpustí ve směsi objemových dílů methanolu R a dichlormethanu R (1 + 9) a zředí se stejnou směsí na 10 ml.

Porovnávací roztok (a). 1 ml zkoušeného roztoku se zředí směsí objemových dílů methanolu R a dichlormethanu R (1 + 9) na 100 ml.

Porovnávací roztok (b). 20 mg testosteronpropionatu CRL se rozpustí ve směsi objemových dílů methanolu R a dichlormethanu R (1 + 9), přidá se 1 ml zkoušeného roztoku a zředí se stejnou směsí na 100 ml.

Na vrstvu se odděleně nanese po 5 μl každého roztoku a vyvíjí se směsí objemových dílů ethylacetatu R a toluenu R (20 + 80) po dráze 15 cm. Vrstva se usuší na vzduchu, pak se postříká kyselinou sírovou v lihu RS a zahřívá se 10 min při 120 °C.

Na chromatogramu zkoušeného roztoku žádná skvrna, kromě hlavní skvrny, není intenzivnější než hlavní skvrna na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) (1,0 %). Zkoušku lze hodnotit, jestliže na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) jsou dvě zřetelně oddělené hlavní skvrny.

Testosteronkapronat. Stanoví se kapalinovou chromatografií (2.2.29).

Zkoušený roztok. 50,0 mg se rozpustí v mobilní fázi a zředí se jí na 50,0 ml.

Porovnávací roztok (a). 10,0 mg testosteronkapronatu CRL se rozpustí v mobilní fázi a zředí se jí na 20,0 ml. 1 ml tohoto roztoku se zředí stejným rozpouštědlem na 50,0 ml.

Porovnávací roztok (b). 1,0 ml zkoušeného roztoku se zředí mobilní fází na 100,0 ml. K 1 ml tohoto roztoku se přidá 1 ml porovnávacího roztoku (a).

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

1. - nerezové ocelové kolony délky 0,12 m a vnitřního průměru 4 mm naplněné silikagelem oktadecylsilanizovaným pro chromatografií R (5 μm),
2. - mobilní fáze s průtokovou rychlostí 1,0 ml/min, která je směsí objemových dílů vody R a acetonitrilu R (30 + 70),
3. - spektrofotometrického detektoru, 240 nm.

Nastříkne se 20 μl porovnávacího roztoku (b) a nastaví se citlivost systému tak, aby výšky obou píků na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) nebyly menší než 50 % celé stupnice zapisovače. Zkoušku lze hodnotit, jestliže na získaném chromatogramu má pík odpovídající testosteronkapronatu relativní retenční čas vzhledem k druhému píku odpovídajícímu testosteronenantatu hodnotu asi 0,7.

Postupně se nastříkne po 20 μl zkoušeného roztoku a porovnávacího roztoku (a). Na chromatogramu zkoušeného roztoku plocha píku odpovídajícího testosteronkapronatu není větší než plocha píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (a).

Kyselina heptanová. 0,50 g se rozpustí v 10 ml lihu 96% R předem zneutralizovaného na modř bromthymolovou RS3. Ihned se titruje hydroxidem sodným 0,01 mol/l VS. Ke změně zbarvení indikátoru do modra se spotřebuje nejvýše 0,6 ml hydroxidu sodného 0,01 mol/l VS (0,16 %).

Ztráta sušením (2.2.32). Nejvýše 0,5 %; 1,000 g se suší v exsikátoru nad oxidem fosforečným R při tlaku nepřevyšujícím 0,7 kPa.

Stanovení obsahu

50,0 mg se rozpustí v ethanolu R a zředí se jím na 100,0 ml. 2,0 ml tohoto roztoku se zředí ethanolem R na 100,0 ml.

Měří se absorbance (2.2.25) v maximu při 241 nm.

Vypočítá se obsah C₂₆H₄₀O₃ za použití specifické absorbance, která má hodnotu 422.

Uchovávání

V dobře uzavřených obalech, chráněn před světlem, při teplotě 2 °C až 8 °C.

Separandum.

Nečistoty

1. A. kyselina heptanová,
2. B. 3-oxo-4-androsten-17β-yl-hexanoat (testosteronkapronat),
3. C. 3-oxo-5α-androstan-17β-yl-heptanoat,
4. D. 17β-hydroxy-4-androsten-3-on (testosteron).

† Testosteroni propionas

Testosteronpropionat

Synonymum. Testosteronum propionicum

Vlastnosti

Bílý nebo téměř bílý prášek nebo bezbarvé krystaly. Je prakticky nerozpustný ve vodě, snadno rozpustný v acetonu, v lihu 96% a v methanolu a je dobře rozpustný v mastných olejích.

Zkoušky totožnosti

Základní sestava zkoušek: B.

Alternativní sestava zkoušek: A a C, viz Obecné zásady (1.2).

1. A. Teplota tání (2.2.14). 119 °C až 123 °C.
2. B. Infračervené absorpční spektrum (2.2.24) zkoušené látky se shoduje se spektrem testosteronpropionatu CRL.
3. C. Hodnotí se chromatogramy získané ve zkoušce Příbuzné látky, viz Zkoušky na čistotu, v ultrafialovém světle při 254 nm. Hlavní skvrna na chromatogram zkoušeného roztoku (b) a hlavní skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku (c) se shodují polohou a velikostí s hlavní skvrnou na chromatogramu odpovídajícího porovnávacího roztoku. Vrstva se pak postříká kyselinou sírovou v lihu 96% RS, zahřívá se 15 min při 120 °C a nechá se ochladit. Vrstva se pozoruje v denním světle a v ultrafialovém světle při 365 nm. Hlavní skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku (b) a hlavní skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku (c) se shodují polohou, barvou v denním světle, fluorescencí v ultrafialovém světle při 365 nm a velikostí s hlavní skvrnou na chromatogramu odpovídajícího porovnávacího roztoku. Hlavní skvrny na chromatogramu zkoušeného roztoku (b) a chromatogramu porovnávacího roztoku (b) mají hodnotu R_F zřetelně nižší než hlavní skvrny na chromatogramu zkoušeného roztoku (c) a chromatogramu porovnávacího roztoku (c).

Zkoušky na čistotu

Specifická optická otáčivost (2.2.7). +83° až +90°, počítáno na vysušenou látku. Měří se roztok připravený rozpuštěním 0,250 g v ethanolu R a zředěním stejným rozpouštědlem na 25,0 ml.

Příbuzné látky. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití vrstvy vhodného silikagelu s fluorescenčním indikátorem pro detekci při 254 nm.

Zkoušený roztok (a). 0,25 g se rozpustí v chloroformu R a zředí se jím na 5 ml.

Zkoušený roztok (b). V 25ml odměrné baňce se rozpustí 50 mg v 6 ml methanolu R. Přidají se 2 ml hydroxidu sodného 1 mol/l RS, do hrdla odměrné baňky se vloží malá nálevka jako kondenzor a zahřívá se 5 min na vodní lázni. Pak se ochladí pod tekoucí vodou, přidají se 2,0 ml kyseliny chlorovodíkové 1 mol/l RS a zředí se methanolem R na 25,0 ml.

Zkoušený roztok (c). 1,0 ml zkoušeného roztoku (a) se zředí chloroformem R na 25,0 ml. Porovnávací roztok (a). 1,0 ml zkoušeného roztoku (a) se zředí chloroformem R na 10,0 ml. 1 ml tohoto roztoku se zředí chloroformem R na 10,0 ml.

Porovnávací roztok (b). V 25ml odměrné baňce se rozpustí 50 mg testosteronpropionatu CRL v 6 ml methanolu R Přidají se 2 ml hydroxidu sodného 1 mol/l RS, do hrdla odměrné baňky se vloží malá nálevka jako kondenzor a zahřívá se 5 min na vodní lázni. Pak se ochladí pod tekoucí vodou, přidají se 2,0 ml kyseliny chlorovodíkové 1 mol/l RS a zředí se methanolem R na 25,0 ml.

Porovnávací roztok (c). 20 mg testosteronpropionatu CRL se rozpustí v chloroformu R a zředí se jím na 10,0 ml.

Porovnávací roztok (d). 10 mg testosteronacetatu CRL se rozpustí v chloroformu R a zředí se jím na 10,0 ml.

Porovnávací roztok (e). K 5,0 ml porovnávacího roztoku (d) se přidá 1,0 ml zkoušeného roztoku (a) a zředí se chloroformem R na 15,0 ml.

Na vrstvu se odděleně nanese po 5 μl zkoušených roztoků (b), (c) a porovnávacích roztoků (b) a (c) a po 2 μl zkoušeného roztoku (a) a porovnávacích roztoků (a), (d) a (e) a vyvíjí se směsí objemových dílů kyseliny octové bezvodé R, etheru petrolejového R a butylacetatu R (1 + 30 + 70) po dráze 15 cm. Vrstva se vysuší na vzduchu a pozoruje se v ultrafialovém světle při 254 nm. Žádná skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku (a) odpovídající skvrně testosteronacetatu není intenzivnější než skvrna na chromatogramu porovnávacího roztoku (d) (2,0 %) a žádná skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku (a), kromě hlavní skvrny a skvrny odpovídající testosteronacetatu, není intenzivnější než skvrna na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) (1,0 %). Zkoušku lze hodnotit, jestliže na chromatogramu porovnávacího roztoku (e) jsou dvě zřetelně oddělené skvrny.

Ztráta sušením (2.2.32). Nejvýše 0,5 %; 0,500 g se suší 2 h v sušárně při 100 °C až 105 °C.

Stanovení obsahu

25,0 mg se rozpustí v ethanolu R a zředí se jím na 250,0 ml. 10,0 ml tohoto roztoku se zředí ethanolem R na 100,0 ml. Měří se absorbance (2.2.25) v maximu při 241 nm.

Vypočítá se obsah C₂₂H₃₂O₃ za použití specifické absorbance, která má hodnotu 490.

Uchovávání

V dobře uzavřených obalech, chráněn před světlem.

Separandum.

† Tetracaini hydrochloridum

Tetrakainiumchlorid

Synonymum. Tetracainium chloratum

Vlastnosti

Bílý krystalický slabě hygroskopický prášek. Je snadno rozpustný ve vodě, dobře rozpustný v lihu 96%, prakticky nerozpustný v etheru.

Taje při asi 148 °C nebo v případě dalších dvou krystalických forem při asi 134 °C a 139 °C. Směsi těchto forem tají při 134 °C až 147 °C.

Zkoušky totožnosti

Základní sestava zkoušek: A, B a D.

Alternativní sestava zkoušek: B, C a D, viz Obecné zásady (1.2).

1. A. Infračervené absorpční spektrum (2.2.24) zkoušené látky se shoduje se spektrem tetrakainiumchloridu CRL.
2. B. K 10,0 ml roztoku S, viz Zkoušky na čistotu, se přidá 1 ml thiokyanatanu amonného RS. Vzniká bílá krystalická sraženina, která se rekrystalizuje z vody R a suší se 2 h při 80 °C: teplota tání (2.2.14) je asi 131 °C.
3. C. K asi 5 mg se přidá 0,5 ml kyseliny dusičné dýmové R. Odpaří se do sucha na vodní lázni, nechá se ochladit, zbytek se rozpustí v 5,0 ml acetonu R a přidá se 0,2 ml hydroxidu draselného v lihu RS; vzniká fialové zbarvení.
4. D. Vyhovuje zkoušce (a) na chloridy (2.3.1).

Zkoušky na čistotu

Roztok S. 5,0 g se rozpustí ve vodě prosté oxidu uhličitého R a zředí se jí na 50 ml.

Vzhled roztoku. 2 ml roztoku S se zředí vodou R na 10 ml. Roztok je čirý (2.2.1) a bezbarvý (2.2.2, Metoda II).

Hodnota pH (2.2.3). 4,5 až 6,5; měří se roztok připravený zředěním 1 ml roztoku S vodou prostou oxidu uhličitého R na 10 ml.

Příbuzné látky. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití vrstvy silikagelu GF₂₅₄ R. Vrstva se předběžně vyvíjí směsí objemových dílů kyseliny octové ledové R, hexanu R a dibutyletheru R (4 + 16 + 80) po dráze 12 cm, pak se vyjme a několik minut se suší v proudu teplého vzduchu. Vrstva se před použitím nechá ochladit.

Zkoušený roztok. 1,0 g se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 10 ml.

Porovnávací roztok. 50,0 mg kyseliny 4-aminobenzoové R se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 100 ml. 1,0 ml tohoto roztoku se zředí vodou R na 10 ml.

Na vrstvu se nanese odděleně po 5 μl každého roztoku a vyvíjí se směsí objemových dílů kyseliny octové ledové R, hexanu R a dibutyletheru R (4 + 16 + 80) po dráze 10 cm. Vrstva se suší 10 min při 100 °C až 105 °C a pak se pozoruje v ultrafialovém světle při 254 nm. Na chromatogramu zkoušeného roztoku žádná skvrna, kromě hlavní skvrny, není intenzivnější než odpovídající skvrna na chromatogramu porovnávacího roztoku (0,05 %). Hlavní skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku zůstává na startu.

Těžké kovy (2.4.8). 12 ml roztoku S vyhovuje limitní zkoušce A na těžké kovy (10 μg/g). Porovnávací roztok se připraví za použití základního roztoku olova (1 μg Pb/ml).

Ztráta sušením (2.2.32). Nejvýše 1,0 %; 1,000 g se suší v sušárně při 100 °C až 105 °C.

Síranový popel (2.4.14). Nejvýše 0,1 %; stanoví se s 1,00 g zkoušené látky.

Stanovení obsahu

0,250 g se rozpustí ve směsi obsahující 5 ml acetanhydridu R a 25 ml kyseliny octové bezvodé R. Roztok se 2 min zahřívá pod zpětným chladičem a pak se přidá 6 ml octanu rtuťnatého RS. Titruje se kyselinou chloristou 0,1 mol/l VS za použití 0,05 ml violeti krystalové RS jako indikátoru.

1 ml kyseliny chloristé 0,1 mol/l VS odpovídá 30,08 mg C₁₅H₂₅ClN₂O₂.

Uchovávání

V dobře uzavřených obalech, chráněn před světlem.

Separandum.

† Tetracosactidum

Tetrakosaktid

Vlastnosti

Bílý nebo žlutý amorfní prášek. Je mírně rozpustný ve vodě.

Zkoušky totožnosti

1. A. V podmínkách popsaných ve Stanovení obsahu zvyšuje zkoušená látka množství kortikosteronu vytvářeného izolovanými buňkami nadledvin potkanů.
2. B. Provede se elektroforéza (2.2.31) a tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) k dosažení dvojrozměrného rozdělení. Použijí se dvě desky s vrstvou celulosy pro chromatografii R1.

   Zkoušený roztok. 1 mg se rozpustí v 0,2 ml roztoku octanu amonného R (15,4 g/l), jehož pH se upraví amoniakem zředěným RS2 na 8,2. Potom se přidá 10 μl roztoku trypsinu R (2 g/l). Směs se 40 min inkubuje při 37 °C až 38 °C a pak se 3 min vaří ve vodní lázni. Nakonec se přidá 5 μl kyseliny octové ledové R a odpaří se do sucha při 40 °C a tlaku, který nepřesáhne 3 kPa. Skelný odparek se suší 1 h při 40 °C a pak se rozpustí v 0,1 ml kyseliny octové ledové R. Roztok se lyofilizuje, zbytek se rozpustí v 0,1 ml vody R a znovu se lyofilizuje. Konečný zbytek se 1 h suší při 45 °C a tlaku, který nepřesáhne 3 kPa, a pak se rozpustí v 50 μl vody R.

   Porovnávací roztok. Připraví se současně a stejným způsobem jako zkoušený roztok; místo zkoušené látky se však použije tetrakosaktid CRL.

   Vrstvy se postříkají roztokem elektrolytu, který obsahuje 0,2 % (V/V) kyseliny octové ledové R a 0,2 % (V/V) pyridinu R. Pomocí filtračních pásků 1,5 cm širokých se spojí konce vrstev s příslušnou komůrkou každého chromatografického žlábku. Celá nádoba se uzavře a nechá 30 min stát. Pak se nanesou roztoky na anodovou stranu. Na první vrstvu se do rohu asi 2,5 cm od každé strany nanesou 4 μl zkoušeného roztoku. Na druhou vrstvu se ve stejném místě nanesou 4 μl porovnávacího roztoku. Obě vrstvy se vyvíjejí 90 min při napětí 280 V na 200 mm délky. Pak se suší 30 min na vzduchu a následovně 30 min v proudu vzduchu při 30 °C. Potom se na každé vrstvě provede druhé dělení chromatograficky. Vyvíjí se s pravém úhlu ke směru elektroforézy směsí objemových dílů kyseliny octové ledové R, pyridinu R, vody R a 1-butanolu R (8 + 24 + 30 + 38) po dráze 15 cm. Vrstvy se usuší v proudu vzduchu a postříkají ninhydrinem RS1. Hlavní skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku odpovídá svou polohou hlavní skvrně na chromatogramu porovnávacího roztoku. Intenzity obou skvrn se mohou lišit.

Zkoušky na čistotu

Specifická optická otáčivost (2.2.7). -99° až -109°, počítáno na bezvodou látku prostou kyseliny octové. Měří se roztok připravený rozpuštěním 10,0 mg v 1,0 ml směsi objemových dílů kyseliny octové ledové R a vody R (1 + 99).

Absorbance (2.2.25). 1,0 mg se rozpustí v kyselině chlorovodíkové 0,1 mol/l RS a zředí se jí na 5,0 ml. Měří se absorbance tohoto roztoku při 240 nm až 280 nm. Absorpční maximum je při 276 nm. Absorbance v maximuje 0,51 až 0,61, počítáno na bezvodou látku prostou kyseliny octové. Poměr absorbance naměřené v maximu při 276 nm k absorbanci při 248 nm je 2,4 až 2,9.

Aminokyseliny. Stanoví se pomocí aminokyselinového analyzátoru s použitím norleucinu R jako vnitřního standardu. Přístroj se kalibruje směsí obsahující ekvimolární množství amoniaku a následujících aminokyselin:

spolu s polovinou ekvimolárního množství cystinu.

Roztok vnitřního standardu. 30,0 mg norleucinu R se rozpustí ve směsi stejných objemových dílů kyseliny chlorovodíkové R a vody R a zředí se stejnou směsí na 100,0 ml.

Zkoušený roztok. 4,6 mg zkoušené látky se převede do pečlivě vyčištěné zkumavky z tvrzeného skla délky 100 mm a vnitřního průměru 6 mm. Přidá se přesně změřené množství roztoku vnitřního standardu obsahující takové množství DL-norleucinu R, které odpovídá asi polovině očekávaného molárního množství tetrakosaktidu. Zkumavka se ponoří do mrazicí směsi5 °C, evakuuje se na tlak, který není větší než 133 Pa, a zataví se. Pak se zahřívá 24 h při 110 °C až 115 °C. Po ochlazení se zkumavka otevře a obsah se přemístí do 10ml baňky tak, že se pětkrát přidá do zkumavky 0,2 ml vody R a přeleje do baňky. Roztok v baňce se za sníženého tlaku odpaří do sucha nad hydroxidem draselným R. Znovu se přidá ke zbytku voda R a odpaří se za sníženého tlaku do sucha nad hydroxidem draselným R. Tento postup se opakuje ještě jednou. Nakonec se zbytek rozpustí ve vhodném tlumivém roztoku o pH 2,2 a zředí se jím na vhodný objem. Do aminoanalyzátoru se použije takový přesně odměřený objem zkoušeného roztoku, aby píky aminokyselin přítomných v nejvyšších množstvích zaujímaly většinu stupnice zapisovače.

Obsah každé aminokyseliny se vyjádří v molech. Relativní poměr aminokyselin se vypočítá za předpokladu, že podíl valinu se rovná 3. Hodnoty se pak pohybují v následujících rozmezích: lysin 3,5 až 4,7, histidin 0,9 až 1,1, arginin 2,7 až 3,3, serin 1,1 až 2,2, kyselina glutamová 0,9 až 1,1, prolin 2,5 až 3,5, glycin 1,8 až 2,2, methionin 0,9 až 1,1, tyrosin 1,7 až 2,2, fenylalanin 0,9 až 1,1. V hydrolyzátu mohou být dále přítomny pouze stopy ostatních aminokyselin, kromě norleucinu.

Zkoušku lze hodnotit, jestliže výsledný počet molů norleucinu přepočtený na objem zkoušeného roztoku použitého ke zkoušce je v rozmezí ±5 % množství vzatého k hydrolýze.

Příbuzné peptidy.

1. a) Stanoví se kapalinovou chromatografií (2.2.29) za použiti odplyněných rozpouštědel.

   Zkoušený roztok. 1,0 mg zkoušené látky se rozpustí v 1 ml vody R.

   Porovnávací roztok (a). 1,0 mg zkoušené látky se rozpustí v 1 ml 1 % (V/V) roztoku kyseliny octové ledové R, přidá se 50 μl směsi objemových dílů peroxidu vodíku koncentrovaného R a vody R (1 + 999). Nechá se 2 h stát.

   Porovnávací roztok (b). 1,0 mg tetrakosaktidu CRL se rozpustí v 1 ml vody R.

   Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

   1. - nerezové ocelové kolony délky 0,25 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné silikagelem oktadecylsilanizovaným pro chromatografií R (10 μm),
   2. - mobilní fáze, která je směsí 365 ml acetonitrilu R, 10,0 ml kyseliny octové ledové R a 10,0 g síranu amonného R, zředěné vodou R na 2000 ml. Průtoková rychlost je 2,0 ml/min,
   3. - spektrofotometrického detektoru, 280 nm.

   Nastříknou se odděleně oba roztoky a zajistí se, aby stříkačka, kterou se nastřikuje zkoušený roztok, nebyla kontaminována peroxidem. Na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) je pík tetrakosaktidu odpovídající hlavnímu píku na chromatogramu zkoušeného roztoku a pík s menším retenčním časem odpovídající sulfoxidu tetrakosaktidu. Jeho plocha je významně větší než plocha příslušného píku na chromatogramu zkoušeného roztoku, ale není větší než 4 % součtu ploch všech píků, vyjímaje píky rozpouštědla a zkoumadel.

1. b) Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití vrstvy celulosy pro chromatografii R.

   Zkoušený roztok. 3,0 mg zkoušené látky se rozpustí v 1,5 ml směsi stejných objemových dílů kyseliny octové zředěné RS a vody R.

   Porovnávací roztok (a). 0,5 ml zkoušeného roztoku se zředí směsí stejných objemových dílů kyseliny octové zředěné RS a vody R na 10 ml.

   Porovnávací roztok (b). 5 ml porovnávacího roztoku (a) se zředí směsí stejných objemových dílů kyseliny octové zředěné RS a vody R na 10 ml.

   Porovnávací roztok (c). K 0,5 ml zkoušeného roztoku se přidá 50 μl směsi objemových dílů peroxidu vodíku koncentrovaného R a vody R (1 + 999) a nechá se 2 h stát.

   Na vrstvu se nanese odděleně po 10 μl každého roztoku do asi 1 cm pruhů a vyvíjí se směsí objemových dílů kyseliny octové ledové R, pyridinu R, vody R a 1-butanolu R (4 + 24 + 30 + 42) po dráze 15 cm. Vrstva se usuší v proudu vzduchu a postříká se ninhydrinem RS1. Na chromatogramu porovnávacího roztoku (c) je zóna odpovídající polohou základní zóně na chromatogramu zkoušeného roztoku, ale má menší intenzitu a navíc je přítomna výrazná zóna sulfoxidu tetrakosaktidu s nižším R_F. Na chromatogramu zkoušeného roztoku není, kromě základní zóny, žádná zóna ani zóna sulfoxidu tetrakosidu intenzivnější než zóna na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) (5,0 %) a nejvýš jedna zóna může být intenzivnější než zóna na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) (2,5 %).

   Peptidy. Nejméně 85,0 %, vztaženo na C₁₃₆H₂₁₀N₄₀O₃₁S, počítáno na bezvodou látku prostou kyseliny octové. Vyhodnotí se chromatogramy získané ve zkoušce (a) na příbuzné peptidy. Obsah C₁₃₆H₂₁₀N₄₀O₃₁S se vypočítá z výšek píků nebo jejich ploch na chromatogramu zkoušeného roztoku a porovnávacího roztoku (b) a známého množství C₁₃₆H₂₁₀N₄₀O₃₁S v tetrakosaktidu CRL. Zkoušku lze hodnotit, jestliže na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) není rozlišení mezi píky tetrakosaktidu a sulfoxidu tetrakosaktidu menší než 7.

   Kyselina octová. 8 % až 13 %. Stanoví se plynovou chromatografií (2.2.28) za použití dioxanu R jako vnitřního standardu.

   Roztok vnitřního standardu. 1 ml dioxanu R se zředí vodou R na 1000 ml.

   Zkoušený roztok (a). 10,0 mg zkoušené látky se rozpustí v 1 ml vody R.

   Zkoušený roztok (b). 10,0 mg zkoušené látky se rozpustí v 1 ml roztoku vnitřního standardu. Porovnávací roztok. 0,100 g kyseliny octové ledové R se rozpustí v roztoku vnitřního standardu a zředí jím na 100 ml.

   Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

   1. - skleněné kolony délky 2 m a vnitřního průměru 2 mm naplněné ethylvinylbenzendivinylbenzen kopolymerem R (125 μm až 180 μm),
   2. - dusíku pro chromatografii R jako nosného plynu,
   3. - plamenoionizačního detektoru.

   Teplota kolony se udržuje na 150 °C.

   Voda, semimikrostanovení (2.5.12). 5 % až 16 %; provede se s 80,0 mg zkoušené látky.

Stanovení účinnosti

Účinnost zkoušené látky se stanoví za daných podmínek porovnáním její schopnosti zvyšovat množství kortikosteronu produkovaného izolovanými buňkami z nadledvin potkanů s účinností mezinárodního referenčního přípravku tetrakosaktidu nebo porovnávací látky kalibrované v mezinárodních jednotkách.

Mezinárodní jednotka je účinnost obsažená v deklarovaném množství mezinárodního referenčního přípravku, který se skládá ze syntetického tetrakosaktidu a manitolu. Hodnotu účinnosti mezinárodního referenčního přípravku v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Světová zdravotnická organizace.

Nalezená hodnota účinnosti je v rozmezí 80 % až 125 % deklarované účinnosti. Interval spolehlivosti (P = 0,95) stanovené účinnosti je v rozmezí 64 % až 156 % deklarované účinnosti.

Použije se silikonované sklo dobře vymyté vodou. Čtyři potkani, samci vážící 200 g až 400 g, se usmrtí vykrvácením. Vyjmou se nadledviny, opatrně se očistí od okolní tukové tkáně a vloží se do roztoku B uchovávaného při 4 °C. Každá žláza se rozkrojí na čtyři stejné díly a přenese do vhodného míchacího zařízení z plastické hmoty (viz obrázek 1), ve kterém je 5 ml roztoku C udržovaného při 37 °C. Buňky nadledvin se dispergují mícháním směsi při 500 ot/min. Po 20 min se odstraní supernatantní tekutina, ochladí se na 4 °C, přidá se 5 ml roztoku C a znovu se míchá. Tento postup se opakuje ještě třikrát. Všech pět supernatantů se spojí a odstřeďuje 30 min v polyetylenových zkumavkách při 4 °C 30 min při postupném zvyšování rychlosti do 100 g_n. Sediment se suspenduje v 8 ml roztoku D a odstřeďuje se 30 min při 100 g_n. Získaný sediment se znovu suspenduje v 8 ml roztoku D, směs se filtruje přes nylonovou síťku s otvory 100 μm do polyetylenové kádinky a k filtrátu se přidá vhodný objem roztoku D (bylo zjištěno, že vhodný celkový objem filtrátu je mezi 65 ml až 105 ml). Výsledná buněčná suspenze se uchovává při 4 °C.