Platné znění

Vyhláška, kterou se u chemických látek a chemických přípravků stanoví základní metody pro zkoušení fyzikálně-chemických vlastností, výbušných vlastností a vlastností nebezpečných pro životní prostředí

  1. účinné od 1. 5. 20045. Kromě toho je při stanovování experimentálních podmínek při oddělování fází půda/roztok důležité počítat s možnou přítomností třetí „pseudofáze“, koloidu. Koloidní částice s velikostí menší než 0,2 µm mohou mít značný vliv na celý mechanismus adsorpce látky v půdní suspenzi. Při centrifugaci, jak je popsána výše, zůstanou koloidní částice ve vodné fázi a analyzují se společně s vodnou fází. Informace o jejich vlivu se tedy ztratí.

účinné od 1. 5. 2004Má-li laboratoř, která studii provádí, zařízení pro ultracentrifugaci nebo ultrafiltraci, mohla by být adsorpce/desorpce studována hlouběji včetně informací o adsorpci látky na koloidních částicích. V takovém případě se k oddělení tří fází – půdy, koloidních částic a roztoku, použije ultracentrifugace při 60 000 ot./min nebo ultrafiltrace na filtru zachycujícím částice o velikosti 100 000 daltonů. Protokol o zkoušce by měl být také odpovídajícím způsobem pozměněn, mají-li být analyzovány všechny tři fáze.

účinné od 1. 5. 2004Obrázek

účinné od 1. 5. 2004Obrázek 1a Změny centrifugační doby (t) v závislosti na centrifugační rychlosti (ot./min) pro různé hustoty půdy (ρp). Rt = 10 cm, Rb − Rt = 10 cm, η = 8,95 × 10-3 g·s-1 cm-1 a ρvod = 1,0 g·cm-3 při 25 °C.

účinné od 1. 5. 2004Obrázek

účinné od 1. 5. 2004Obrázek 1b Změna centrifugační doby (t) v závislosti na centrifugační rychlosti (ot./min) pro různé výšky sloupce směsi v centrifugační kyvetě (Rb − Rt) = L; Rt = 10 cm, η = 8,95 × 10-3 g·s-1·cm-1, ρvod = 1,0 g·cm-3 při 25 °C a ρp = 2,0 g·cm-3.

účinné od 1. 5. 2004DODATEK 5

účinné od 1. 5. 2004VÝPOČET ADSORPCE A (%) A DESORPCE D (%)

  1. účinné od 1. 5. 2004Časové schéma průběhu experimentu je následující:
    účinné od 1. 5. 2004Obrázek

účinné od 1. 5. 2004U všech výpočtů se předpokládá, že zkoušená látka je stálá a že se významně neadsorbuje na stěnách nádoby.

účinné od 1. 5. 2004ADSORPCE (A%)

  1. účinné od 1. 5. 2004a) Paralelní metoda
    1. účinné od 1. 5. 2004Procento adsorpce se vypočte pro každou zkušební nádobu (i) pro každý čas (ti) podle následující rovnice:
      účinné od 1. 5. 2004
      DODATEK 5 VÝPOČET ADSORPCE A (%) A DESORPCE D (%)
      (1) 3
    1. účinné od 1. 5. 2004Veličiny v této rovnici lze vyčíslit takto:
      účinné od 1. 5. 2004
      DODATEK 5 VÝPOČET ADSORPCE A (%) A DESORPCE D (%)
      (2)
      účinné od 1. 5. 2004
      DODATEK 5 VÝPOČET ADSORPCE A (%) A DESORPCE D (%)
      (3)
      1. účinné od 1. 5. 2004kde:
        1. účinné od 1. 5. 2004Ati = procento adsorpce (%) v čase ti
        2. účinné od 1. 5. 2004= množství zkoušené látky na půdě v čase ti, kdy je prováděna analýza (µg)
        3. účinné od 1. 5. 2004m0 = množství zkoušené látky v nádobě na začátku zkoušky (µg)
        4. účinné od 1. 5. 2004C0 = počáteční hmotnostní koncentrace zkušebního roztoku v kontaktu s půdou (µg·cm-3)
        5. účinné od 1. 5. 2004= hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi v čase ti, kdy je prováděna analýza, (µg·cm-3); Tato koncentrace se stanoví analyticky a koriguje se na hodnoty ze slepých pokusů
        6. účinné od 1. 5. 2004V0 = počáteční objem zkušebního roztoku v kontaktu s půdou (cm3).

    účinné od 1. 5. 2004Hodnoty adsorpčního procenta Ati nebo se vynesou proti času a zjistí se doba, po níž se ustavila sorpční rovnováha. Příklady takových křivek jsou uvedeny na obrázcích 1 a 2.

    účinné od 1. 5. 2004Obrázek 1 Křivka ustavování adsorpční rovnováhy

    účinné od 1. 5. 2004Obrázek

    účinné od 1. 5. 2004Obrázek 2. Závislost hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi (Cvod) na čase

    účinné od 1. 5. 2004Obrázek
  1. účinné od 1. 5. 2004b) Sériová metoda

    účinné od 1. 5. 2004V následujících rovnicích je zohledněno, že se při studii adsorpce provádějí měření zkoušené látky v malých podílech vodné fáze v určitých časových intervalech.

    1. účinné od 1. 5. 2004— Pro každý časový interval se množství látky adsorbované na půdě vypočte takto:
      1. účinné od 1. 5. 2004— pro první časový interval
        účinné od 1. 5. 2004
        DODATEK 5 VÝPOČET ADSORPCE A (%) A DESORPCE D (%) Obrázek 1 Křivka ustavování adsorpční rovnováhy Obrázek 2. Závislost hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi (Cvod) na čase
        (4)
      1. účinné od 1. 5. 2004— pro druhý časový interval
        účinné od 1. 5. 2004
        DODATEK 5 VÝPOČET ADSORPCE A (%) A DESORPCE D (%) Obrázek 1 Křivka ustavování adsorpční rovnováhy Obrázek 2. Závislost hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi (Cvod) na čase
        (5)
      1. účinné od 1. 5. 2004— pro třetí časový interval
        účinné od 1. 5. 2004
        DODATEK 5 VÝPOČET ADSORPCE A (%) A DESORPCE D (%) Obrázek 1 Křivka ustavování adsorpční rovnováhy Obrázek 2. Závislost hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi (Cvod) na čase
        (6)
      1. účinné od 1. 5. 2004— pro n-tý časový interval
        účinné od 1. 5. 2004
        DODATEK 5 VÝPOČET ADSORPCE A (%) A DESORPCE D (%) Obrázek 1 Křivka ustavování adsorpční rovnováhy Obrázek 2. Závislost hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi (Cvod) na čase
        (7)
    1. účinné od 1. 5. 2004— Procento adsorpce v každém časové intervalu A∆ti se vypočte z následující rovnice:
      účinné od 1. 5. 2004
      DODATEK 5 VÝPOČET ADSORPCE A (%) A DESORPCE D (%) Obrázek 1 Křivka ustavování adsorpční rovnováhy Obrázek 2. Závislost hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi (Cvod) na čase
      (8) 4
      1. účinné od 1. 5. 2004zatímco procento adsorpce (Ati) v čase ti je dáno rovnicí:
        účinné od 1. 5. 2004
        DODATEK 5 VÝPOČET ADSORPCE A (%) A DESORPCE D (%) Obrázek 1 Křivka ustavování adsorpční rovnováhy Obrázek 2. Závislost hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi (Cvod) na čase
        (9) 4

    účinné od 1. 5. 2004Hodnoty procenta adsorpce Ati nebo A∆ti (podle potřeb studie) se vynesou proti času a stanoví se doba, po níž se ustavila sorpční rovnováha.

    1. účinné od 1. 5. 2004— V čase ustavení rovnováhy teq:
      1. účinné od 1. 5. 2004— je množství zkoušené látky adsorbované na půdě:
        účinné od 1. 5. 2004
        DODATEK 5 VÝPOČET ADSORPCE A (%) A DESORPCE D (%) Obrázek 1 Křivka ustavování adsorpční rovnováhy Obrázek 2. Závislost hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi (Cvod) na čase
        (10) 4
      1. účinné od 1. 5. 2004— množství zkoušené látky v roztoku:
        účinné od 1. 5. 2004
        DODATEK 5 VÝPOČET ADSORPCE A (%) A DESORPCE D (%) Obrázek 1 Křivka ustavování adsorpční rovnováhy Obrázek 2. Závislost hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi (Cvod) na čase
        (11) 4
      1. účinné od 1. 5. 2004— a procento adsorpce v rovnováze:
        účinné od 1. 5. 2004
        DODATEK 5 VÝPOČET ADSORPCE A (%) A DESORPCE D (%) Obrázek 1 Křivka ustavování adsorpční rovnováhy Obrázek 2. Závislost hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi (Cvod) na čase
        (12) 4
    1. účinné od 1. 5. 2004Výše uvedené veličiny jsou definovány takto:
      1. účinné od 1. 5. 2004, ,..., = množství látky adsorbované na půdě za časový interval ∆t1, ∆t2,..., ∆tn, (µg)
      2. účinné od 1. 5. 2004, ,..., = množství látky naměřené v podílu (vaA) v okamžiku t1, t2, ...,tn, (µg)
      3. účinné od 1. 5. 2004 = množství zkoušené látky adsorbované na půdě v adsorpční rovnováze, (µg)
      4. účinné od 1. 5. 2004 = množství zkoušené látky v roztoku v adsorpční rovnováze, (µg)
      5. účinné od 1. 5. 2004 = objem podílu, ve kterém je látka stanovována, (cm3)
      6. účinné od 1. 5. 2004 = procento adsorpce odpovídající časovému intervalu ∆ti, (%)
      7. účinné od 1. 5. 2004= procento adsorpce v adsorpční rovnováze

účinné od 1. 5. 2004DESORPCE (%)

účinné od 1. 5. 2004Časem t0, v němž se zahájí experiment pro studium desorpční kinetiky, je okamžik, kdy je co největší objem roztoku zkoušené látky (po dosažení adsorpční rovnováhy) nahrazen stejným objemem 0,01M roztoku CaCl2.

  1. účinné od 1. 5. 2004a) Paralelní metoda
    1. účinné od 1. 5. 2004V čase ti se změří množství zkoušené látky ve vodné fázi odebrané ze zkušební nádoby i a desorbované množství se vypočte z rovnice:
      účinné od 1. 5. 2004
      DODATEK 5 VÝPOČET ADSORPCE A (%) A DESORPCE D (%) Obrázek 1 Křivka ustavování adsorpční rovnováhy Obrázek 2. Závislost hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi (Cvod) na čase
      (13)

    účinné od 1. 5. 2004V desorpční rovnováze platí, že ti = teq, a tedy = .

    1. účinné od 1. 5. 2004Množství zkušební látky desorbované během časového intervalu (∆ti) je dáno rovnicí:
      účinné od 1. 5. 2004
      DODATEK 5 VÝPOČET ADSORPCE A (%) A DESORPCE D (%) Obrázek 1 Křivka ustavování adsorpční rovnováhy Obrázek 2. Závislost hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi (Cvod) na čase
      (14)
    1. účinné od 1. 5. 2004Procento desorpce se vypočte takto:
      1. účinné od 1. 5. 2004— v čase ti z rovnice:
        účinné od 1. 5. 2004
        DODATEK 5 VÝPOČET ADSORPCE A (%) A DESORPCE D (%) Obrázek 1 Křivka ustavování adsorpční rovnováhy Obrázek 2. Závislost hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi (Cvod) na čase
        (15)
      1. účinné od 1. 5. 2004— a během časového intervalu (∆ti) z rovnice:
        účinné od 1. 5. 2004
        DODATEK 5 VÝPOČET ADSORPCE A (%) A DESORPCE D (%) Obrázek 1 Křivka ustavování adsorpční rovnováhy Obrázek 2. Závislost hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi (Cvod) na čase
        (16)
        1. účinné od 1. 5. 2004kde:
          1. účinné od 1. 5. 2004Dti = procento desorpce v čase ti, (%)
          2. účinné od 1. 5. 2004D∆ti = procento desorpce za časový interval ∆ti, (%)
          3. účinné od 1. 5. 2004 = množství zkoušené látky desorbované v čase ti, (µg)
          4. účinné od 1. 5. 2004= množství zkoušené látky desorbované během časového intervalu ∆ti, (µg)
          5. účinné od 1. 5. 2004= množství zkoušené látky analyticky změřené v čase ti v roztoku o objemu Vri, který byl odebrán k analýze, (µg)
          6. účinné od 1. 5. 2004 = množství látky, které zbylo (aniž se adsorbovalo) po ustavení adsorpční rovnováhy, a to v důsledku nekvantitativní výměny objemu vodné fáze, (µg)
          účinné od 1. 5. 2004
          DODATEK 5 VÝPOČET ADSORPCE A (%) A DESORPCE D (%) Obrázek 1 Křivka ustavování adsorpční rovnováhy Obrázek 2. Závislost hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi (Cvod) na čase
          (17)
          1. účinné od 1. 5. 2004= množství zkoušené látky v roztoku v adsorpční rovnováze, (µg)
          2. účinné od 1. 5. 2004VR = objem supernatantu odebraného ze zkušební nádoby po dosažení adsorpční rovnováhy a nahrazeného stejným objemem 0,01M roztoku CaCl2 (cm3)
          3. účinné od 1. 5. 2004= objem roztoku odebraného ze zkušební nádoby (i) ke stanovení zkoušené látky v experimentu pro studium desorpční kinetiky (cm3).

    účinné od 1. 5. 2004Hodnoty procenta desorpce Dti nebo D∆ti (podle potřeb studie) se vynesou proti času a stanoví se doba, po níž se ustavila desorpční rovnováha.

  1. účinné od 1. 5. 2004b) Sériová metoda
    1. účinné od 1. 5. 2004V následujících rovnicích je zohledněno, že byla při předcházející studii adsorpce prováděna měření zkoušené látky v malých podílech vodné fáze (sériová metoda v bodě 1.9 Provedení zkoušky) Předpokládá se, že a) objem supernatantu odebraného ze zkušební nádoby po experimentu pro studium adsorpční kinetiky byl nahrazen stejným objemem 0,01M roztoku CaCl2 (VR) a b) celkový objem vodné fáze v kontaktu s půdou (VT) během experimentu pro studium desorpční kinetiky zůstává konstantní a je dán rovnicí:
      účinné od 1. 5. 2004
      DODATEK 5 VÝPOČET ADSORPCE A (%) A DESORPCE D (%) Obrázek 1 Křivka ustavování adsorpční rovnováhy Obrázek 2. Závislost hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi (Cvod) na čase
      (18)
    1. účinné od 1. 5. 2004V čase ti:
      1. účinné od 1. 5. 2004— množství zkoušené látky se měří v malých podílech a desorbované množství se vypočte z následující rovnice:
        účinné od 1. 5. 2004
        DODATEK 5 VÝPOČET ADSORPCE A (%) A DESORPCE D (%) Obrázek 1 Křivka ustavování adsorpční rovnováhy Obrázek 2. Závislost hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi (Cvod) na čase
        (19)
      1. účinné od 1. 5. 2004— v desorpční rovnováze platí, že ti = teq, a tedy =
      2. účinné od 1. 5. 2004— procento desorpce Dti se vypočte z následující rovnice:
        účinné od 1. 5. 2004
        DODATEK 5 VÝPOČET ADSORPCE A (%) A DESORPCE D (%) Obrázek 1 Křivka ustavování adsorpční rovnováhy Obrázek 2. Závislost hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi (Cvod) na čase
        (20)
    1. účinné od 1. 5. 2004Za časový interval (∆ti):
      1. účinné od 1. 5. 2004Pro každý časový interval se. desorbované množství látky vypočte takto:
        1. účinné od 1. 5. 2004— pro první časový interval
          účinné od 1. 5. 2004
          DODATEK 5 VÝPOČET ADSORPCE A (%) A DESORPCE D (%) Obrázek 1 Křivka ustavování adsorpční rovnováhy Obrázek 2. Závislost hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi (Cvod) na čase
          (21)
        1. účinné od 1. 5. 2004— pro druhý časový interval

          účinné od 1. 5. 2004

          1. účinné od 1. 5. 2004a
          účinné od 1. 5. 2004
          DODATEK 5 VÝPOČET ADSORPCE A (%) A DESORPCE D (%) Obrázek 1 Křivka ustavování adsorpční rovnováhy Obrázek 2. Závislost hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi (Cvod) na čase
          (22)
          1. účinné od 1. 5. 2004pro n-tý časový interval

          účinné od 1. 5. 2004

          1. účinné od 1. 5. 2004a
          účinné od 1. 5. 2004
          DODATEK 5 VÝPOČET ADSORPCE A (%) A DESORPCE D (%) Obrázek 1 Křivka ustavování adsorpční rovnováhy Obrázek 2. Závislost hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi (Cvod) na čase
          (23)
    1. účinné od 1. 5. 2004Procento desorpce za každý časový interval D∆ti se nakonec vypočte z následující rovnice:
      účinné od 1. 5. 2004
      DODATEK 5 VÝPOČET ADSORPCE A (%) A DESORPCE D (%) Obrázek 1 Křivka ustavování adsorpční rovnováhy Obrázek 2. Závislost hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi (Cvod) na čase
      (24)
    1. účinné od 1. 5. 2004zatímco procento desorpce (Dti) v čase ti je dáno rovnicí:
      účinné od 1. 5. 2004
      DODATEK 5 VÝPOČET ADSORPCE A (%) A DESORPCE D (%) Obrázek 1 Křivka ustavování adsorpční rovnováhy Obrázek 2. Závislost hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi (Cvod) na čase
      (25)
    1. účinné od 1. 5. 2004přičemž jsou výše použité veličiny definovány takto:
      1. účinné od 1. 5. 2004,,..., = množství látky, která zůstala adsorbovaná na půdě po časových intervalech ∆t1, ∆t2,..., ∆tn, (µg)
      2. účinné od 1. 5. 2004, ,..., = množství látky desorbované za časové intervaly ∆t1, ∆t2,..., ∆tn, (µg)
      3. účinné od 1. 5. 2004, ,..., = množství látky naměřené v podílu vaD v okamžicích t1, t2, ...., tn (µg)
      4. účinné od 1. 5. 2004VT = celkový objem vodné fáze v kontaktu s půdou během experimentu pro studium desorpční kineticky provedeného sériovou metodou (cm3)
      5. účinné od 1. 5. 2004 = množství látky, které zbylo (aniž se adsorbovalo) po ustavení adsorpční rovnováhy, a to v důsledku nekvantitativní výměny objemu vodné fáze,(µg)
      účinné od 1. 5. 2004
      DODATEK 5 VÝPOČET ADSORPCE A (%) A DESORPCE D (%) Obrázek 1 Křivka ustavování adsorpční rovnováhy Obrázek 2. Závislost hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi (Cvod) na čase
      (26)
      1. účinné od 1. 5. 2004VR = objem supernatantu odebraného ze zkušební nádoby po dosažení adsorpční rovnováhy a nahrazeného stejným objemem 0;01M roztoku CaCl2 (cm3)
      2. účinné od 1. 5. 2004 = objem alikvotu odebraného k analýze ze zkušební nádoby (i) během experimentu pro studium desorpční kineticky provedeného sériovou metodou
      účinné od 1. 5. 2004
      DODATEK 5 VÝPOČET ADSORPCE A (%) A DESORPCE D (%) Obrázek 1 Křivka ustavování adsorpční rovnováhy Obrázek 2. Závislost hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi (Cvod) na čase
      (27)

účinné od 1. 5. 2004DODATEK 6

účinné od 1. 5. 2004ADSORPCE – DESORPCE V PŮDÁCH: FORMULÁŘE PRO PŘEDLOŽENÍ DAT

účinné od 1. 5. 2004Obrázek
  1. účinné od 1. 5. 2004XIX. METODA PRO STANOVENÍ ODHADU ADSORPČNÍHO KOEFICIENTU (KOU) PRO PŮDY A ČISTÍRENSKÉ KALY VYSOKOÚČINNOU KAPALINOVOU CHROMATOGRAFIÍ (HPLC) – metoda C.19 podle přílohy směrnice 2001/59/ES
    1. účinné od 1. 5. 2004XIX.1 METODA

      účinné od 1. 5. 2004Tato metoda je replikou metody OECD TG121 (2000).

      1. účinné od 1. 5. 2004XIX.1.1 ÚVOD

        účinné od 1. 5. 2004Sorpční chování látek v půdách a v čistírenských kalech může být popsáno parametry experimentálně stanovenými zkušební metodou C.18. Důležitým parametrem je adsorpční koeficient, který je definován jako poměr koncentrace látky v půdě nebo kalu a koncentrace látky ve vodné fázi v rovnováze. Adsorpční koeficient normalizovaný na obsah organického uhlíku v půdě Kou je užitečným ukazatelem schopnosti chemické látky vázat se na organické látky v půdě a v čistírenském kalu a umožňuje porovnat různé chemické látky. Tento parametr lze odhadnout z korelace s rozpustností ve vodě a s rozdělovacím koeficientem oktanol/voda (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7).

        účinné od 1. 5. 2004Experimentální metoda popsaná v této zkoušce používá k odhadu adsorpčního koeficientu Kou v půdě a v čistírenských kalech vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii (8). Tyto odhady jsou spolehlivější než odhady z výpočtů pomocí metodiky QSAR (Quantitative Structure Activity Relationship) (9). Jako metoda založená na odhadu nemůže plně nahradit násadové experimenty stanovení adsorpční/desorpční rovnováhy podle metody C.18. Odhady Kou však mohou být užitečné pro volbu vhodných parametrů pro adsorpční/desorpční studie podle zkušební metody C.18, a to vypočtením Kd (distribučního koeficientu) nebo KF (Freundlichova adsorpčního koeficientu) z rovnice 3 (viz bod 1.2).

      1. účinné od 1. 5. 2004XIX.1.2 DEFINICE

        účinné od 1. 5. 2004Kd: Distribuční koeficient je definován jako poměr rovnovážných koncentrací C rozpuštěné látky ve dvoufázovém systému skládajícím se ze sorbentu (půda nebo čistírenský kal) a vodné fáze; je bezrozměrný, jsou-li koncentrace v obou fázích vyjádřeny jako hmotnostní podíly. Je-li koncentrace ve vodné fázi vyjádřena v jednotce hmotnosti na jednotku objemu, je jednotkou ml·g-1. Kd se může měnit s vlastnostmi sorbentu a může záviset na koncentraci.

        účinné od 1. 5. 2004
        DODATEK 5 VÝPOČET ADSORPCE A (%) A DESORPCE D (%) Obrázek 1 Křivka ustavování adsorpční rovnováhy Obrázek 2. Závislost hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi (Cvod) na čase DODATEK 6 ADSORPCE – DESORPCE V PŮDÁCH: FORMULÁŘE PRO PŘEDLOŽENÍ DAT
        nebo(1)
        1. účinné od 1. 5. 2004kde:
          1. účinné od 1. 5. 2004Cpůda = koncentrace zkoušené látky v půdě v rovnováze (µg·g-1)
          2. účinné od 1. 5. 2004Ckal = koncentrace zkoušené látky v kalu v rovnováze (µg·g-1)
          3. účinné od 1. 5. 2004Cvod = koncentrace zkoušené látky ve vodné fázi v rovnováze (µg·g-1, µg·ml-1).

        účinné od 1. 5. 2004KF: Freundlichův adsorpční koeficient je definován jako koncentrace zkoušené látky v půdě nebo v čistírenském kalu (x/m), je-li rovnovážná koncentrace Cvod ve vodné fázi rovna jedné; vyjadřuje se v µg na gram sorbentu. Hodnota se může měnit s vlastnostmi sorbentu.

        účinné od 1. 5. 2004
        DODATEK 5 VÝPOČET ADSORPCE A (%) A DESORPCE D (%) Obrázek 1 Křivka ustavování adsorpční rovnováhy Obrázek 2. Závislost hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi (Cvod) na čase DODATEK 6 ADSORPCE – DESORPCE V PŮDÁCH: FORMULÁŘE PRO PŘEDLOŽENÍ DAT
        (2)
        1. účinné od 1. 5. 2004kde:
          1. účinné od 1. 5. 2004x/m = množství zkoušené látky x (µg) adsorbované v rovnováze na určitém množství sorbentu m (g)
          2. účinné od 1. 5. 20041/n = směrnice Freundlichovy adsorpční isothermy
          3. účinné od 1. 5. 2004Cvod = koncentrace zkoušené látky ve vodné fázi v rovnováze (µg·ml-1)

        účinné od 1. 5. 2004

        účinné od 1. 5. 2004Kou: Distribuční koeficient (Kd) nebo Freundlichův adsorpční koeficient (KF) normalizovaný na obsah organického uhlíku (fou) v sorbentu; zejména u nedisociujících chemických látek je přibližným ukazatelem míry adsorpce látky na sorbentu a umožňuje provést porovnání různých chemických látek. V závislosti na rozměru Kd a KF může být Kou bezrozměrný nebo může být jeho jednotkou ml . g-1 nebo µg . g-1 organického materiálu.

        účinné od 1. 5. 2004
        DODATEK 5 VÝPOČET ADSORPCE A (%) A DESORPCE D (%) Obrázek 1 Křivka ustavování adsorpční rovnováhy Obrázek 2. Závislost hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi (Cvod) na čase DODATEK 6 ADSORPCE – DESORPCE V PŮDÁCH: FORMULÁŘE PRO PŘEDLOŽENÍ DAT
        (3)

        účinné od 1. 5. 2004Vztah mezi Kou a Kd není vždy lineární, hodnoty Kou se mohou pro jednotlivé půdy měnit, avšak jejich kolísání je ve srovnání s hodnotami Kd nebo KF silně omezeno.

        účinné od 1. 5. 2004Adsorpční koeficient (Kou) lze odečíst pomocí kapacitního faktoru (k´) z kalibrační křivky log k´ versus log Kou pro vybrané referenční sloučeniny.

        účinné od 1. 5. 2004
        DODATEK 5 VÝPOČET ADSORPCE A (%) A DESORPCE D (%) Obrázek 1 Křivka ustavování adsorpční rovnováhy Obrázek 2. Závislost hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi (Cvod) na čase DODATEK 6 ADSORPCE – DESORPCE V PŮDÁCH: FORMULÁŘE PRO PŘEDLOŽENÍ DAT
        (4)
        1. účinné od 1. 5. 2004kde:
          1. účinné od 1. 5. 2004tR: retenční časy zkoušené a referenční látky pro HPLC (min)
          2. účinné od 1. 5. 2004t0: mrtvá doba HPLC (min) (viz bod 1.8.2).

        účinné od 1. 5. 2004Pov: Rozdělovací koeficient oktanol/voda je definován jako poměr koncentrací rozpuštěné látky v n-oktanolu a ve vodě; je bezrozměrný.

        účinné od 1. 5. 2004
        DODATEK 5 VÝPOČET ADSORPCE A (%) A DESORPCE D (%) Obrázek 1 Křivka ustavování adsorpční rovnováhy Obrázek 2. Závislost hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi (Cvod) na čase DODATEK 6 ADSORPCE – DESORPCE V PŮDÁCH: FORMULÁŘE PRO PŘEDLOŽENÍ DAT
        (5)
      1. účinné od 1. 5. 2004XIX.1.3 REFERENČNÍ LÁTKY

        účinné od 1. 5. 2004Pře použitím metody by měly být známy strukturní vzorec, čistota a disociační konstanta (podle potřeby). Užitečné jsou informace o rozpustnosti ve vodě a v organických rozpouštědlech, o rozdělovacím koeficientu oktanol-voda a o chování při hydrolýze.

        účinné od 1. 5. 2004Mají-li být uvedena do korelace naměřená retenční data z HPLC pro zkoušenou látku a její adsorpční koeficient, musí být vytvořen kalibrační graf log Kou versus log k´. Použije se minimálně šest referenční bodů, alespoň po jednom nad a pod očekávanou hodnotou pro zkoušenou látku. Správnost metody se významně zlepší, budou-li použity referenční látky strukturně příbuzné se zkoušenou látkou. Nejsou-li taková data známa, ponechává se na experimentátorovi, aby vybral vhodné kalibrační látky. V takovém případě by měla být vybrána obecnější sada strukturně heterogenních látek. Látky a hodnoty Kou, které mohou být použity, jsou uvedeny v dodatku, a to v tabulce 1 pro čistírenský kal a v tabulce 3 pro půdu. Volba jiných kalibračních látek by měla být zdůvodněna.

      1. účinné od 1. 5. 2004XIX.1.4 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY
        1. účinné od 1. 5. 2004HPLC se provádí na analytických kolonách plněných komerčně dostupným kyanopropylem jako pevnou fází, obsahujícím lipofilní a polární složky. Použije se mírně polární stacionární fáze na silikagelové matrici:
          účinné od 1. 5. 2004
          DODATEK 5 VÝPOČET ADSORPCE A (%) A DESORPCE D (%) Obrázek 1 Křivka ustavování adsorpční rovnováhy Obrázek 2. Závislost hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi (Cvod) na čase DODATEK 6 ADSORPCE – DESORPCE V PŮDÁCH: FORMULÁŘE PRO PŘEDLOŽENÍ DAT
          − O − Si − CH2 − CH2 − CH2 − CN
          silikagel nepolární spacer polární složka

        účinné od 1. 5. 2004Podstata zkušební metody je obdobná jako ve zkušební metodě A.8 (rozdělovací koeficient, metoda HPLC). Při průchodu kolonou v mobilní fázi zkoušená látka interaguje se stacionární fází. V důsledku rozdělování mezi mobilní a stacionární fází se postup zkoušené látky zpomaluje. Dvojí složení stacionární fáze s polárními a nepolárními skupinami umožňuje, aby polární a nepolární skupiny molekuly interagovaly podobným způsobem, jako je tomu u organického materiálu v půdě nebo čistírenském kalu. To umožňuje stanovit vztah mezi retenčním časem na koloně a adsorpčním koeficientem na organickém materiálu.

        účinné od 1. 5. 2004Na sorpční chování zejména u polárních látek má významný vliv pH. V případě zemědělských půd nebo nádrží s čistírenskými kaly se pH normálně pohybuje od pH 5,5 do 7,5. U disociujících látek se ve vhodném pufračním roztoku provedenou dvě zkoušky, a to jak s disociovanou formou, tak s nedisociovanou formou, avšak pouze v případě, že v rozmezí pH 5,5 až 7,5 disociuje alespoň 10 % zkoušené sloučeniny.

        účinné od 1. 5. 2004Vzhledem k tomu, že se k hodnocení použije pouze vztah mezi retencí na koloně HPLC a adsorpčním koeficientem, není nutná žádná kvantitativní metoda, nýbrž pouze stanovení retenčního času. Je-li k dispozici vhodná sada referenčních látek a lze-li realizovat standardní experimentální podmínky, je metoda rychlým a účinným způsobem odhadu adsorpčního koeficientu Kou.

      1. účinné od 1. 5. 2004XIX.1.5 POUŽITELNOST ZKOUŠKY

        účinné od 1. 5. 2004Metoda HPLC je použitelná pro chemické látky (radioizotopově značené i neznačené), pro něž je k dispozici vhodný detekční systém (např. spektrofotometr, detektor radioaktivního záření) a jež jsou po dobu experimentu dostatečně stabilní. Může být zvláště užitečná pro chemické látky, jejichž studium je v jiných experimentálních systémech obtížné (tj. pro těkavé látky, které nejsou rozpustné ve vodě v koncentraci, kterou lze analyticky měřit, pro látky s vysokou afinitou k povrchu inkubačních systémů). Metoda může být použita pro směsi, které dávají nerozlišitelný eluční pás. V takovém případě se stanoví horní a dolní meze hodnot log Kou pro sloučeniny přítomné ve směsi.

        účinné od 1. 5. 2004Při interpretaci výsledků HPLC mohou někdy působit problémy nečistoty. Jejich vliv je však malý, neboť zkoušené látky lze jasně analyticky identifikovat a od nečistot oddělit.

        1. účinné od 1. 5. 2004Metoda je validována pro látky uvedené v tabulce 1 v dodatku a byla rovněž použita u řady jiných chemických látek z následujících chemických tříd:
          1. účinné od 1. 5. 2004— aromatické aminy (např. trifluralin (1-(dipropylamino)-2,6-dinitro-4-(trifluormethyl)benzen), 4-chloranilin, 3,5-dinitroanilin, 4-methylanilin, N-methylanilin, 1-nafylamin),
          2. účinné od 1. 5. 2004— estery aromatických karoxylových kyselin (např. methyl-benzoát, ethyl-3,5-dinitrobenzoát),
          3. účinné od 1. 5. 2004— aromatické uhlovodíky (např. toluen, xylen, ethylbenzen, nitrobenzen),
          4. účinné od 1. 5. 2004— estery aryloxyfenoxypropanové kyseliny (např. diklofop-methyl, fenoxaprop-ethyl, fenoxaprop-P-ethyl),
          5. účinné od 1. 5. 2004— benzimidazolové a imidazolové fungicidy (např. karbendazim, fuberidazol, triazoxid),
          6. účinné od 1. 5. 2004— amidy karboxylových kyselin (např. 2-chlorbenzamid, N,N-dimethylbenzamid, 3,5-dinitrobenzamid, N-methylbenzamid, 2-nitrobenzamid, 3-nitrobenzamid),
          7. účinné od 1. 5. 2004— chlorované uhlovodíky (např. endosulfan, DDT, hexachlorbenzen, kvintozen, 1,2,3-trichlorbenzen),
          8. účinné od 1. 5. 2004— organofosforové insekticidy (např. azinfos-methyl, disulfoton, fenamifos, isofenfos, pyrazofos, sulprofos, triazofos),
          9. účinné od 1. 5. 2004— fenoly (např. fenol, 2-nitrofenol, 4-nitrofenol, pentachlorfenol, 2,4,6-trichlorfenol, 1-naftol),
          10. účinné od 1. 5. 2004— deriváty fenylmočoviny (např. isoproturon, monolinuron, pencykuron),
          11. účinné od 1. 5. 2004— pigmentová barviva (např. Acid Yellow 219, Basic Blue 41, Direct Red 81),
          12. účinné od 1. 5. 2004— polyaromatické uhlovodíky (např. acenaften, naftalen),
          13. účinné od 1. 5. 2004— 1,3,5-triazinové herbicidy (např. prometryn, propazin, simazin, terbutryn),
          14. účinné od 1. 5. 2004— triazolové deriváty (např. tebukonazol, triadimefon, tradimenol, triapenthenol).

        účinné od 1. 5. 2004Metoda není použitelná u látek, které reagují s eluentem nebo stacionární fází. Není rovněž použitelná u látek, které interagují specifickým způsobem s anorganickými složkami (např. tvoří klastrové komplexy s minerály jílu). Metoda nemusí být použitelná u povrchově aktivních látek, anorganických látek a mírných nebo silných organických kyselina a zásad. Lze stanovit Kou s hodnotami log Kou od 1,5 do 5,0. Disociující látky musí být měřeny s pufrovanou mobilní fázi, avšak je třeba dbát na to aby nedošlo ke srážení složek pufru nebo zkoušené látky.

      1. účinné od 1. 5. 2004XIX.1.6 KRITÉRIA JAKOSTI
        1. účinné od 1. 5. 2004XIX.1.6.1 Správnost

          účinné od 1. 5. 2004Obvykle lze adsorpční koeficient zkoušené látky stanovit v rozmezí ±0,5 řádu hodnoty stanovené násadovou rovnovážnou metodou (viz tabulka 1 v dodatku). Vyšší míry správnosti lze dosáhnout, jsou-li použité referenční látky strukturně příbuzné se zkoušenou látkou.

        1. účinné od 1. 5. 2004XIX.1.6.2 Opakovatelnost

          účinné od 1. 5. 2004Stanovení se provedou alespoň dvojmo. Hodnoty log Kou získané z jednotlivých měření by měly ležet v rozmezí ±0,1.

        1. účinné od 1. 5. 2004XIX.1.6.3 Reprodukovatelnost

          účinné od 1. 5. 2004Dosud získané zkušenosti s použitím metody svědčí o její validitě. Ověřování metody HPLC za použití 48 látek (převážně pesticidů), u nichž byla k dispozici spolehlivá data o Kou v půdě, vedlo ke korelačnímu koeficientu R = 0,95 (10, 11).

          účinné od 1. 5. 2004Pro zlepšení a validaci metody bylo proveden mezilaboratorní test za účasti 11 laboratoří (12). Výsledky jsou uvedeny v tabulce 2 v dodatku.

      1. účinné od 1. 5. 2004XIX.1.7 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY
        1. účinné od 1. 5. 2004XIX.1.7.1 Předběžný odhad adsorpčního koeficientu

          účinné od 1. 5. 2004Rozdělovací poměr oktanol-voda Pov (= Kow) a do určité míry i rozpustnost ve vodě mohou být použity jako indikátory rozsahu adsorpce zejména u nedisociujících látek a mohou tedy být použity pro jeho předběžné nalezení. Pro různé skupiny chemických látek byla publikována řada užitečných korelací (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7).

        1. účinné od 1. 5. 2004XIX.1.7.2 Přístroje a pomůcky

          účinné od 1. 5. 2004Nezbytným vybavením je kapalinový chromatograf vybavený bezpulsním čerpadlem a vhodným detekčním zařízením. Doporučuje se používat nástřikový ventil se vstřikovací smyčkou. Použije se komerční kyanopropylové chemicky vázané pryskyřice na silikagelu (např. Hypersil a Zorbax CN). Mezi nástřikem a analytickou kolonou může být umístěna ochranná předkolona ze stejného materiálu. Kolony od různých dodavatelů se mohou podstatně lišit, pokud jde o účinnost. Pro orientaci by měly být dosaženy následující kapacitní faktory: log k´ > 0,0 pro log Kou = 3,0 a log k´> 0,4 pro log Kou = 2,0 při použití směsi methanol/voda 55/45 % jako mobilní fáze.

        1. účinné od 1. 5. 2004XIX.1.7.3 Mobilní fáze
          1. účinné od 1. 5. 2004Bylo testováno několik mobilních fází a doporučují se následující dvě mobilní fáze:
            1. účinné od 1. 5. 2004— methanol/voda (55/45 % obj.),
            2. účinné od 1. 5. 2004— methanol/0,01M citrátový pufr pH 6,0 (55/45 % obj.).

          účinné od 1. 5. 2004K přípravě elučního rozpouštědla se použije methanol a voda nebo citrátový pufr čistoty pro HPLC. Směs se před použitím odplyní. Měla by být provedena isokratická eluce. Nevyhovuje-li směs methanol/voda, lze vyzkoušet směsi jiných organických rozpouštědel s vodou, např. ethanol/voda nebo acetonitril/voda. U disociujících sloučenin se doporučuje použití pufračního roztoku ke stabilizaci pH. Je nezbytné dbát na to, aby nedošlo ke srážení solí a narušení kolony, ke kterému dochází u některých směsí organické fáze s pufračním roztokem. Nesmí být použity žádné přísady, jako jsou iontově párová činidla, neboť mohou ovlivnit sorpční vlastnosti stacionární fáze. Takové změny stacionární fáze mohou být nevratné. Z tohoto důvodu musí být experimenty s použitím přísad prováděny na zvláštních kolonách.

        1. účinné od 1. 5. 2004XIX.1.7.4 Rozpouštěné látky

          účinné od 1. 5. 2004Zkušební a referenční látky se rozpustí v mobilní fázi.

      1. účinné od 1. 5. 2004XIX.1.8 PROVEDENÍ ZKOUŠKY
        1. účinné od 1. 5. 2004XIX.1.8.1 Zkušební podmínky

          účinné od 1. 5. 2004Během měření se zaznamenává teplota. Pro zajištění konstantních podmínek během kalibrace a předběžných měření a během měření zkoušené látky se velmi doporučuje použití kolony s regulací teploty.

        1. účinné od 1. 5. 2004XIX.1.8.2 Stanovení mrtvé doby t0

          účinné od 1. 5. 2004Pro stanovení mrtvé doby lze použít dvě různé metody (viz také bod 1.2).

          1. účinné od 1. 5. 2004XIX.1.8.2.1 Stanovení mrtvé doby t0 pomocí homologické řady

            účinné od 1. 5. 2004Je ověřeno, že tato metoda poskytuje spolehlivé a standardisované hodnoty t0. Podrobnosti viz zkušební metoda A.8: Rozdělovací koeficient (n-oktanol/voda) metodou za použití HPLC.

          1. účinné od 1. 5. 2004XIX.1.8.2.2 Stanovení mrtvé doby t0 pomocí inertních látek, které nejsou kolonou zadržovány

            účinné od 1. 5. 2004Tato technika je založena na nástřiku roztoků formamidu, močoviny nebo dusičnanu sodného. Měření se provedou alespoň dvojmo.

        1. účinné od 1. 5. 2004XIX.1.8.3 Stanovení retenčních časů tR

          účinné od 1. 5. 2004Referenční látky se vyberou tak, jak je uvedeno v bodě 1.3. Pro stanovení jejich retenčních časů mohou být nastříknuty jako směsný standard za předpokladu, že je ověřeno, že retenční čas žádného referenčního standardu není ovlivňován přítomností jiných referenčních standardů. Kalibrace by měla být prováděna pravidelně, alespoň dvakrát denně, aby se zachytily nečekané změny účinnosti kolony. Nástřiky pro kalibraci by měly být prováděny nejlépe před nástřikem zkoušené látky a po něm, aby se ověřilo, že nedošlo ke změně retenčních časů. Zkoušené látky se nastříknou odděleně v co nejmenších množstvích (aby se kolona nezahltila) a stanoví se jejich retenční časy.

          účinné od 1. 5. 2004S cílem zvýšit důvěryhodnost měření musí být provedena alespoň opakovaná stanovení. Hodnoty log Kou získané z jednotlivých měření by měly ležet v rozmezí ±0,25.

        1. účinné od 1. 5. 2004XIX.1.8.4 Hodnocení

          účinné od 1. 5. 2004Kapacitní faktory k´ se vypočtou z mrtvé doby t0 a retenčních časů tR vybraných referenčních látek podle rovnice 4 (viz bod 1.2). Hodnoty log k´referenčních látek se poté vynesou proti jejich hodnotám log Kou z násadových rovnovážných experimentů uvedených v tabulkách 1 a 3 v dodatku. Z této křivky se poté pomocí hodnoty log k´ zkoušené látky odečte její hodnota log Kou. Je-li z aktuálních výsledků zřejmé, že hodnota log Kou leží mimo obor kalibrační křivky, zkouška se opakuje s vhodnějšími referenčními látkami.

    1. účinné od 1. 5. 2004XIX.2 DATA A ZPRÁVY
      1. účinné od 1. 5. 2004Zpráva musí obsahovat následující informace:
        1. účinné od 1. 5. 2004— identita zkoušené látky a referenčních látek, jejich čistota a podle potřeby hodnoty pKa,
        2. účinné od 1. 5. 2004— popis zařízení a pracovních podmínek, např. typ a velikost analytické (a ochranné) kolony, detekční zařízení, mobilní fáze (poměr složek a pH), rozpětí teploty během měření,
        3. účinné od 1. 5. 2004— mrtvá doba a použité metody jejího stanovení,
        4. účinné od 1. 5. 2004— množství zkoušené látky a referenčních látek zavedených do kolony,
        5. účinné od 1. 5. 2004— retenční časy referenčních sloučenin použitých ke kalibraci,
        6. účinné od 1. 5. 2004— charakteristiky proložené regresní křivky (log k´ versus log Kou) a graf regresní křivky,
        7. účinné od 1. 5. 2004— průměrná retenční data a odhad hodnoty log Kou zkoušené sloučeniny.
        8. účinné od 1. 5. 2004— chromatogramy.
    1. účinné od 1. 5. 2004XIX.3 LITERATURA

      účinné od 1. 5. 2004(1) W. J. Lyman, W. F. Reehl, D. H. Rosenblatt (ed.). (1990). Handbook of chemical property estimation methods, kap. 4, McGraw-Hill, New York.

      účinné od 1. 5. 2004(2) J. Hodson, N. A. Williams (1988). The estimation of the adsorption coefficient (Kou) for soils by HPLC. Chemosphere, 17, 1 67.

      účinné od 1. 5. 2004(3) G. G. Briggs (1981). Theoretical and experimental relationships between soil adsorption, octanol-water partition coefficients, water solubilities, bioconcentration factors, and the parachor. J. Agric. Food Chem., 29, str. 1050 – 1059.

      účinné od 1. 5. 2004(4) C. T. Chiou, P. E. Porter, D.W. Schmedding (1983). Partition equilibria of nonionic organic compounds between soil organic matter and water. Environ. Sci. Technol., 17, str. 227 – 231.

      účinné od 1. 5. 2004(5) Z. Gerstl, U. Mingelgrin (1984). Sorption of organic substances by soils and sediment. J. Environm. Sci. Health, B19, str. 297 – 312.

      účinné od 1. 5. 2004(6) C. T. Chiou, L. J. Peters, V. H. Freed (1979). A physical concept of soil water equilibria for nonionic organic compounds, Science, 106, str. 831 – 832.

      účinné od 1. 5. 2004(7) S. W. Karickhoff (1981). Semi-empirical estimation of sorption of hydrophobic pollutants on natural sediments and soils. Chemosphere, 10, str. 833 – 846.

      účinné od 1. 5. 2004(8) W. Kördel, D. Hennecke, M. Herrmann (1997). Application of the HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient on sewage sludges. Chemosphere, 35(1/2), str. 121 – 128.

      účinné od 1. 5. 2004(9) M. Mueller, W. Kördel (1996). Comparison of screening methods for the estimation of adsorption coefficients on soil. Chemosphere, 32(12), str. 2493 – 2504.

      účinné od 1. 5. 2004(10) W. Kördel, J. Stutte, G. Kotthoff (1993). HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient in soil-comparison of different stationary phases, Chemosphere, 27(12), str. 2341 – 2352.

      účinné od 1. 5. 2004(11) B. von Oepen, W. Kördel, W. Klein (1991). Sorption of nonpolar and polar compounds to soils: Processes, measurements and experience with the applicability of the modified OECD Guideline 106, Chemosphere, 22, str. 285 – 304.

      účinné od 1. 5. 2004(12) W. Kördel, G. Kotthoff, J. Müller (1995). HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient on soil-results of a ring test. Chemosphere, 30(7), str. 1373 – 1384.

    účinné od 1. 5. 2004DODATEK

    účinné od 1. 5. 2004TABULKA 1

    účinné od 1. 5. 2004Porovnání hodnot Kou pro půdy a čistírenské kaly a hodnot vypočtených skreeningovou metodou s HPLC 1,2

    účinné od 1. 5. 2004
    DODATEK 5 VÝPOČET ADSORPCE A (%) A DESORPCE D (%) Obrázek 1 Křivka ustavování adsorpční rovnováhy Obrázek 2. Závislost hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi (Cvod) na čase DODATEK 6 ADSORPCE – DESORPCE V PŮDÁCH: FORMULÁŘE PRO PŘEDLOŽENÍ DAT DODATEK TABULKA 1 Porovnání hodnot Kou pro půdy a čistírenské kaly a hodnot vypočtených skreeningovou metodou s HPLC 1,2
    LátkaČíslo CASLog Kou pro
    čistírenské
    kaly    		Log Kou
    pomocí
    HPLC    		∆Log Kou pro půdyLog Kou
    pomocí HPLC    		∆
    Atrazin1912-24-91,662,140,481,812,200,39
    Linuron330-55-22,432,960,532,592,890,30
    Fenthion55-38-93,753,580,173,313,400,09
    Monuron150-68-51,462,210,751,992,260,27
    Fenanthren85-01-84,353,720,634,093,520,57
    Fenyl-benzoát93-99-23,263,030,232,872,940,07
    Benzamid55-21-01,601,000,601,261,250,01
    4-Nitrobenzamid619-80-71,521,490,031,931,660,27
    Acetanilid103-84-41,521,530,011,261,690,08
    Anilin62-53-31,741,470,272,071,640,43
    2,5-Dichloranilin95-82-92,452,590,142,552,580,03
  2. účinné od 1. 5. 20041 W. Kördel, D. Hennecke, M. Herrmann (1997). Application of the HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient on sewage sludges. Chemosphere, 35(1/2), str. 121-128.
  3. účinné od 1. 5. 20042 W. Kördel, D. Hennecke, C. Franke (1997). Determination of the adsorption-coefficients of organic substances on sewage sludges. Chemosphere, 35 (1/2), str. 107-119.

    4. účinné od 1. 5. 2004TABULKA 2

    účinné od 1. 5. 2004Výsledky mezilaboratorního porovnávacího testu provedeného za účelem zlepšení a validace metody s HPLC (11 zúčastněných laboratoří)1

    účinné od 1. 5. 2004
    DODATEK 5 VÝPOČET ADSORPCE A (%) A DESORPCE D (%) Obrázek 1 Křivka ustavování adsorpční rovnováhy Obrázek 2. Závislost hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi (Cvod) na čase DODATEK 6 ADSORPCE – DESORPCE V PŮDÁCH: FORMULÁŘE PRO PŘEDLOŽENÍ DAT DODATEK TABULKA 1 Porovnání hodnot Kou pro půdy a čistírenské kaly a hodnot vypočtených skreeningovou metodou s HPLC 1,2 TABULKA 2 Výsledky mezilaboratorního porovnávacího testu provedeného za účelem zlepšení a validace metody s HPLC (11 zúčastněných laboratoří)1
    LátkaČíslo CASLog Kou
    (OECD 106)    		KouLog Kou
    Metoda založená na HPLC
    Atrazin1912-24-91,8178 ± 161,89
    Monuron150-68-51,99100 ± 82,00
    Triapenthenol77608-88-32,37292 ± 582,47
    Linuron330-55-22,59465 ± 622,67
    Fenthion55-38-93,312062 ± 6483,31
  4. účinné od 1. 5. 20041 W. Kördel, G. Kotthoff, J. Müller (1995). HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient on soil-results of a ring test. Chemosphere, 30(7), str. 1373-1384.

    5. účinné od 1. 5. 2004TABULKA 3

    účinné od 1. 5. 2004Referenční látky doporučené pro skreeningovou metodu s HPLC na základě adsorpčních dat pro půdu

    účinné od 1. 5. 2004
    DODATEK 5 VÝPOČET ADSORPCE A (%) A DESORPCE D (%) Obrázek 1 Křivka ustavování adsorpční rovnováhy Obrázek 2. Závislost hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi (Cvod) na čase DODATEK 6 ADSORPCE – DESORPCE V PŮDÁCH: FORMULÁŘE PRO PŘEDLOŽENÍ DAT DODATEK TABULKA 1 Porovnání hodnot Kou pro půdy a čistírenské kaly a hodnot vypočtených skreeningovou metodou s HPLC 1,2 TABULKA 2 Výsledky mezilaboratorního porovnávacího testu provedeného za účelem zlepšení a validace metody s HPLC (11 zúčastněných laboratoří)1 TABULKA 3 Referenční látky doporučené pro skreeningovou metodu s HPLC na základě adsorpčních dat pro půdu
    Referenční látkaČíslo CASLogaritmy
    středních
    hodnot
    z násadové
    rovnovážné
    metody    		Počet
    hodnot Kou    		Logaritmus
    směrodatné
    odchylky    		Zdroj
    Acetanilid103-84-41,2540,48a)
    Fenol108-95-21,3240,70a)
    2-Nitrobenzamid610-15-11,4530,90b)
    N,N-Dimethylbenzamid611-74-51,5220,45a)
    4-Methylbenzamid619-55-61,7831,76a)
    Methylbenzoát93-58-31,8041,08a)
    Atrazin1912-24-91,8131,08c)
    Isoproturon34123-59-61,8651,53c)
    3-Nitrobenzamid645-09-01,9531,31b)
    Anilin62-53-32,0741,73a)
    3,5-Dinitrobenzamid121-81-32,3131,27b)
    Karbendazim10605-21-72,3531,37c)
    Triadimenol55219-65-32,4031,85c)
    Triazoxide72459-58-62,4431,66c)
    Triazofos24017-47-82,5531,78c)
    Linuron330-55-22,5931,97c)
    Naftalen91-20-32,7542,20a)
    Endosulfan-diol2157-19-93,0252,29c)
    Methiokarb2032-65-73,1042,39c)
    Acid Yellow 21963405-85-63,1642,83a)
    1,2,3-Trichlorbenzen87-61-63,1641,40a)
    γ-HCH (lindan)58-89-93,2352,94a)
    Fenthion55-38-93,3132,49c)
    Direct Red 812610-11-93,4342,68a)
    Pyrazofos13457-18-63,6532,70c)
    a-Endosulfan959-98-84,0953,74c)
    Diklofop-methyl51338-27-34,2033,77c)
    Fenanthren85-01-84,0943,83a)
    Basic Blue 41 (směs)26850-47-54,8944,46a)
    12270-13-2
    DDT50-29-35,631—b)
  5. účinné od 1. 5. 2004a) W. Kördel, J. Müller (1994). Bestimmung des Adsorptionskoeffizienten organischer Chemikalien mit der HPLC. UBA R&D Report No 106 01 044 (1994).
  6. účinné od 1. 5. 2004b) B.V. Oepen, W. Kördel, W. Klein (1991). Chemosphere, 22, str. 285-304.
  7. účinné od 1. 5. 2004c) Data poskytnutá průmyslem.
  1. účinné od 1. 5. 2004XX. METODA PRO STANOVENÍ TOXICITY PRO REPRODUKCI U DAPHNIA MAGNA – metoda C.20 podle přílohy směrnice 2001/59/ES
    1. účinné od 1. 5. 2004XX.1 METODA

      účinné od 1. 5. 2004Tato zkouška toxicity pro reprodukci je replikou metody OECD TG 211 (1998).

      1. účinné od 1. 5. 2004XX.1.1 ÚVOD

        účinné od 1. 5. 2004Hlavním cílem zkoušky je posoudit účinky chemických látek na reprodukční schopnost druhu Daphnia magna.

      1. účinné od 1. 5. 2004XX.1.2 DEFINICE A JEDNOTKY

        účinné od 1. 5. 2004Matečné organismy: dafnie samičího pohlaví, které jsou přítomné na začátku zkoušky a jejich reprodukční schopnost je předmětem studie.

        účinné od 1. 5. 2004Potomstvo: mladé dafnie pocházející z matečných organismů v průběhu zkoušky.

        účinné od 1. 5. 2004Nejnižší koncentrace s pozorovanými účinky (lowest observed effect concentration, LOEC): je nejnižší zkoušená koncentrace, při níž je pro danou expoziční dobu pozorován statisticky významný účinek látky na reprodukci a na mortalitu matečných organismů (na úrovni pravděpodobnosti falešně pozitivního hodnocení p < 0,05) ve srovnání s kontrolní skupinou, v průběhu stanovené expoziční doby. Všechny zkoušené koncentrace vyšší než LOEC musí mít stejné nebo vážnější škodlivé účinky, než účinky pozorované při koncentraci LOEC. Nelze-li tyto dvě podmínky splnit, musí podrobně vysvětleno jak byla LOEC (a tedy i NOEC) zvolena.

        účinné od 1. 5. 2004Koncentrace bez pozorovaných účinků (no observed effect concentration, NOEC): je zkušební koncentrace bezprostředně nižší než LOEC, která při srovnání s kontrolní skupinou nemá pro danou expoziční dobu statisticky významný účinek (p < 0,05).

        účinné od 1. 5. 2004ECx: je koncentrace zkoušené látky rozpuštěné ve vodě, která pro danou expoziční dobu vede k x% snížení reprodukce dafnií Daphnia magna.

        účinné od 1. 5. 2004Imanentní růst populace: je míra růstu populace, v níž je zahrnuta reprodukční schopnost a mortalita specifická z hlediska stáří (20, 21, 22). V ustáleném stavu bude nulový. Pro rostoucí populaci bude kladný a pro snižující se populaci bude záporný. Je zřejmé, že při záporném růstu nelze druh zachovat a nakonec dojde k jeho vyhynutí.

        účinné od 1. 5. 2004Mez detekovatelnosti: je nejnižší koncentrace, v níž lze látku detekovat, nikoli však stanovit.

        účinné od 1. 5. 2004Mez stanovitelnosti: je nejnižší koncentrace, v níž lze látku kvantitativně naměřit.

        účinné od 1. 5. 2004Mortalita: organismus se zaznamená jako mrtvý, je-li nepohyblivý, tj. není-li schopen plavat nebo není-li u končetin (přívěsků) nebo u postabdomen pozorován pohyb do 15 s po lehkém zatřepání zkušební nádobou. (Použije-li se jiná definice, musí být uvedena společně s literární odkazem.)

      1. účinné od 1. 5. 2004XX.1.3 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY

        účinné od 1. 5. 2004Mladé samičí dafnie (matečné organismy) na začátku zkoušky mladší než 24 h se exponují zkoušené látce přidané do vody v určitém rozsahu koncentrací. Zkouška trvá 21 dní. Na konci zkoušky se odhadne celkový počet vylíhnutých živých potomků pocházejících z jednoho matečného organismu, který přežil do konce zkoušky. To znamená, že nedospělé dafnie pocházející z dospělých dafnií, které v průběhu zkoušky uhynuly, se z odhadů vyloučí. Reprodukční schopnost matečných organismů lze vyjádřit jiným způsobem (např. jako počet živých potomků pocházejících z jednoho matečného organismu za den, a to od prvního dne, kdy bylo potomstvo pozorováno), který se však uvede doplňkově vedle celkového počtu nedospělých dafnií pocházejících z jedné matečné dafnie živé na konci zkoušky. Reprodukční schopnost organismů exponovaných zkoušené látce se porovná s reprodukční schopností kontrolní skupiny (kontrolních skupin) s cílem stanovit nejnižší koncentraci s pozorovanými účinky (LOEC) a tím i koncentraci bez pozorovaných účinků (NOEC). Kromě toho se data pokud možno analyzují pomocí regresního modelu s cílem odhadnout koncentraci, která vyvolává x% snížení reprodukční schopnosti, (tj. EC50, EC20 nebo EC10).

        účinné od 1. 5. 2004Musí být rovněž uvedeno přežití matečných organismů a okamžik narození vylíhnutí prvních potomků. Zkoumány mohou být také jiné účinky vyvolané látkou, které mají vliv na charakteristiky, jako jsou růst (např. vliv na délku) a případně imanentní růst populace.

      1. účinné od 1. 5. 2004XX.1.4 INFORMACE O ZKOUŠENÉ LÁTCE

        účinné od 1. 5. 2004Měly by být k dispozici výsledky zkoušky akutní toxicity (viz metoda C.2, část I) provedené u Daphnia magna. Výsledky mohou být užitečné pro volbu vhodného rozsahu zkušebních koncentrací ve zkouškách toxicity pro reprodukci. Měly by být známy rozpustnost zkoušené látky ve vodě a tlak jejích par a měla by být k dispozici spolehlivá analytická metoda kvantitativního stanovení látky ve zkušebních roztocích, a to s doloženým výtěžkem a mezí stanovitelnosti.

        účinné od 1. 5. 2004Užitečnými informacemi o zkoušené látce pro účely stanovení zkušebních podmínek mohou být strukturní vzorec, čistota látky, stálost na světle, pKa, Pov a výsledky zkoušky snadné biologické rozložitelnosti (viz metoda C.4).

      1. účinné od 1. 5. 2004XX.1.5 VALIDITA ZKOUŠKY
        1. účinné od 1. 5. 2004Má-li být zkouška platná, musí být u kontrolní skupiny (kontrolních skupin) splněna následující kriteria reprodukční schopnosti:
          1. účinné od 1. 5. 2004— mortalita matečných organismů (dafnií samičího pohlaví) nesmí na konci zkoušky překročit 20 %,
          2. účinné od 1. 5. 2004— střední hodnota počtu živých potomků pocházejících z jednoho matečného organismu živého na konci zkoušky je ≥ 60.
      1. účinné od 1. 5. 2004XX.1.6 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY
        1. účinné od 1. 5. 2004XX.1.6.1 Přístroje a pomůcky

          účinné od 1. 5. 2004Zkušební nádoby nebo jiné přístroje a pomůcky, které přijdou do styku se zkušebními roztoky, by měly být skleněné nebo z jiného chemicky inertního materiálu. Zkušebními nádobami jsou obvykle skleněné kádinky.

          1. účinné od 1. 5. 2004Kromě toho bude nezbytné některé nebo veškeré následující zařízení:
            1. účinné od 1. 5. 2004— přístroj pro měření koncentrace kyslíku (s mikroelektrodou, nebo jiný vhodný přístroj na měření koncentrace rozpuštěného kyslíku ve vzorcích malého objemu),
            2. účinné od 1. 5. 2004— vhodný přístroj pro regulaci teploty,
            3. účinné od 1. 5. 2004— pH-metr,
            4. účinné od 1. 5. 2004— vybavení pro stanovení tvrdosti vody,
            5. účinné od 1. 5. 2004— zařízení pro stanovení celkového organického uhlíku (TOC) ve vodě nebo zařízení pro stanovení chemické spotřeby kyslíku (CHSK),
            6. účinné od 1. 5. 2004— vhodné zařízení pro ovládání režimu osvětlení a pro měření intenzity světla.
        1. účinné od 1. 5. 2004XX.1.6.2 Testovací organismy

          účinné od 1. 5. 2004Ke zkoušce se použije druh Daphnia magna Straus. Jiné druhy dafnií mohou být použity, pokud splňují případná kritéria validity (kriterium validity týkající se reprodukční schopnosti kontrolních skupin by mělo být relevantní pro daný druh dafnií). Použijí-li se jiné druhy dafnií, musí být jasně identifikovány a jejich použití musí být zdůvodněno.

          účinné od 1. 5. 2004Klon by měl být identifikován nejlépe uvedením genotypu. Výzkum ukázal (1), že reprodukční schopnost klonu A (který pochází z institutu IRCHA ve Francii) (3) stabilně splňuje kriterium validity, jímž je ≥ 60 potomků na přeživší matečný organismus při kultivaci za podmínek popsaných v této metodě. Splňuje-li kultura dafnií prokazatelně kriteria validity pro tuto zkoušku jsou přijatelné i jiné klony.

          účinné od 1. 5. 2004Na začátku zkoušky musí být dafnie 24 h staré a nesmí být první generací. Musí pocházet ze zdravé kultury (tj. nesmí vykazovat známky stresu projevující se vysokou mortalitou, přítomnost jedinců samčího pohlaví a epifií, zpoždění produkce prvních potomků, přítomnost jinak zbarvených jedinců atd.). Organismy ze zásobní kultury musí být chovány v podmínkách podobných těm, které mají být použity při zkoušce (osvětlení, teplota, médium, krmení a počet dafnií na jednotku objemu). Liší-li se kultivační médium pro dafnie, které má být použito při zkoušce, od média používaného k rutinní kultivaci dafnií, doporučuje se zařadit před zkouškou obvykle třítýdenní aklimatizační období (tj. v délce odpovídající jedné generaci), aby nedošlo u matečných organismů ke stresu.

        1. účinné od 1. 5. 2004XX.1.6.3 Zkušební médium

          účinné od 1. 5. 2004Doporučuje se, aby bylo v této zkoušce použito přesně definované médium. Tím se lze vyhnout použití přísad, které je obtížné charakterizovat (např. mořských řas, půdy, extraktu atd.) a zvýšit vyhlídky mezilaboratorní standardizace. Jako vyhovující pro tento účel byla shledána Elendtova média M4 (4) a M7. Přijatelná jsou však i jiná média (např. (5, 6)), splňuje-li při jejich použití reprodukční schopnost kultury dafnií prokazatelně kriteria validity pro tuto zkoušku.

          účinné od 1. 5. 2004Použije-li se médium, které obsahuje nedostatečně charakterizovatelné přísady, měly by být tyto přísady jasně specifikovány a v protokolu o zkoušce se uvedou informace o jejich složení, to zejména o obsahu organického uhlíku, neboť může přispívat k dodávané stravě. Doporučuje se, aby byl stanoven celkový organický uhlík (TOC) a/nebo chemická spotřeba kyslíku (CHSK) výchozí formy organické přísady a aby byl odhadnut výsledný příspěvek k TOC nebo CHSK ve zkušebním médiu. Doporučuje se, aby byly úrovně TOC v médiu (tj. před přidáním řas) nižší než 2 mg·l-1 (7).

          účinné od 1. 5. 2004Při zkoušení látek obsahujících kovy je důležité si uvědomit, že vlastnosti zkušebního média (např. tvrdost, chelatační schopnosti) mohou mít vliv na toxicitu látky. Z tohoto důvodu je žádoucí, aby bylo médium přesně definováno. V současnosti jsou však jedinými přesně definovanými médii, o nichž je známo, že jsou vhodná pro dlouhodobou kultivaci kultury druhu Daphnia magna, Elendtova média M4 a M7. Obě média obsahují chelatační činidlo EDTA. Práce (2) ukázala, že provádí-li se zkouška v médiích M4 a M7, je „zdánlivá toxicita“ kadmia zpravidla nižší než v médiu, které neobsahuje EDTA. Média M4 a M7 se tedy nedoporučují pro zkoušení látek obsahujících kovy a neměla by se používat ani jiná média obsahující činidla známá svojí chelatační schopností. V případě látek obsahujících kovy se doporučuje používat jiné médium, například rekonstituovanou tvrdou sladkou vodu podle ASTM (7), která neobsahuje EDTA a do níž je přidán extrakt z řas (8). Tato kombinace rekonstituované tvrdé sladké vody podle ASTM a extraktu z řas je také vhodná pro dlouhodobou kultivaci druhu Daphnia magna (2) a pro zkoušení na tomto druhu, přestože vykazuje slabé chelatační účinky způsobené organickými složkami přidaného extraktu z řas.

          účinné od 1. 5. 2004Na začátku zkoušky a v jejím průběhu by měla být koncentrace rozpuštěného kyslíku vyšší než 3 mg·l-1. pH by mělo být v rozmezí 6 až 9 a zpravidla by se nemělo v žádné zkoušce měnit o více než 1,5. Doporučuje se tvrdost nad 140 mg·l-1 (jako CaCO3). Ve zkouškách při této a vyšší tvrdosti reprodukční schopnost prokazatelně vyhovovala kritériím validity (9, 10).

        1. účinné od 1. 5. 2004XX.1.6.4 Zkušební roztoky

          účinné od 1. 5. 2004Zkušební roztoky o zvolených koncentracích se obvykle připraví ředěním zásobního roztoku. Zásobní roztoky se připraví nejlépe rozpuštěním látky ve zkušebním médiu.

          účinné od 1. 5. 2004Pro přípravu vhodně koncentrovaného zásobního roztoku může být někdy nezbytné použití organických rozpouštědel nebo dispergátorů, měla by však být vynaložena maximální snaha takové látky nepoužívat. Ke vhodným rozpouštědlům patří aceton, ethanol, methanol, dimethylformamid a triethylenglykol. Ke vhodným dispergátorům patří Cremophor RH40, 0,01% methylcellulosa a HCO-40. V žádném případě by však neměl být obsah zkušební látky ve zkušebních roztocích vyšší než je její rozpustnost ve zkušebním médiu.

          účinné od 1. 5. 2004K přípravě zásobního roztoku, který lze přesně dávkovat do vody, se použijí rozpouštědla. Při doporučené koncentraci rozpouštědla v konečném zkušebním médiu (tj. ≤ 0,1 ml·l-1) nejsou výše uvedená rozpouštědla toxická a nezvyšují rozpustnost látky ve vodě.

          účinné od 1. 5. 2004Dispersanty mohou usnadnit přesné dávkování a dispergaci. Při doporučené koncentraci v konečném zkušebním médiu (tj. ≤ 0,1 ml·l-1) nejsou výše uvedené dispergátory toxické a nezvyšují rozpustnost látky ve vodě.

      1. účinné od 1. 5. 2004XX.1.7 USPOŘÁDÁNÍ ZKOUŠKY

        účinné od 1. 5. 2004Expozice se rozvrhne pro jednotlivé zkušební nádoby a veškeré další obsluhování zkušebních nádob se provádí náhodně. Nedodržení této zásady může vést k jednostrannému vychýlení, které může být považováno za účinek koncentrace. Jsou-li například experimentální jednotky obsluhovány v pořadí zahájení expozice nebo v pořadí koncentrací, mohl by nějaký časově podmíněný efekt, např. únava obsluhy nebo jiné pochybení, vést k vyšším účinkům při vyšších koncentracích. Mohou-li být dále výsledky ovlivněny počátečními podmínkami zkoušky nebo okolními podmínkami, jako je např. umístění v laboratoři, mělo by být zváženo blokové uspořádání zkoušky.

      1. účinné od 1. 5. 2004XX.1.8 POSTUP
        1. účinné od 1. 5. 2004XX.1.8.1 Podmínky expozice
          1. účinné od 1. 5. 2004XX.1.8.1.1 Délka expozice

            účinné od 1. 5. 2004Zkouška trvá 21 dní.

          1. účinné od 1. 5. 2004XX.1.8.1.2 Nasazování

            účinné od 1. 5. 2004Matečné organismy se umístí po jednom do zkušebních nádob s 50 až 100 ml média.

            účinné od 1. 5. 2004Aby bylo možné splnit požadavky analytické metody použité pro stanovení koncentrace zkoušené látky, může být v některých případech nezbytné použít větší objemy, přípustné je rovněž sdružování paralelních vzorků k chemické analýze. Jsou-li použity objemy větší než 100 ml, může být nezbytné zvýšit krmné dávky podávané dafniím, aby se zajistila odpovídající dostupnost stravy a splnila kritéria validity. U průtokových zkoušek mohou být z technických důvodů zvážena jiná uspořádání (např. čtyři skupiny po 10 organismech ve větším zkušebním objemu), avšak jakékoli změny uspořádání zkoušky musí být ale uvedeny v závěrečné zprávě.

          1. účinné od 1. 5. 2004XX.1.8.1.3 Počet organismů

            účinné od 1. 5. 2004U semistatických zkoušek se nasadí jednotlivě alespoň 10 organismů pro každou zkušební koncentraci a alespoň 10 organismů jednotlivě do zkušebních skupin.

            účinné od 1. 5. 2004U průtokových zkoušek se ukázalo vhodným rozdělit pro každou koncentraci 40 organismů do čtyř skupin po 10 organismech (1). Může být použit menší počet zkušebních organismů, přičemž se doporučuje na jednu koncentraci rozdělit minimálně 20 organismů do dvou nebo více paralelních skupin o stejném počtu organismů (např. čtyři paralelní skupiny po pěti dafniích). Je třeba poznamenat, že u zkoušek, při níž se organismy nasazují jako skupiny, nebude možné vyjádřit reprodukční schopnost jako počet živých potomků pocházejících z jednoho matečného organismu, který přežil do konce zkoušky v případě, že matečný organismus uhyne. V takovém případě se reprodukční schopnost vyjádří jako „celkový počet živých potomků pocházejících z jednoho matečného organismu přítomného na začátku zkoušky“.

          1. účinné od 1. 5. 2004XX.1.8.1.4 Krmení

            účinné od 1. 5. 2004U semistatických zkoušek se dafnie krmí nejlépe denně, alespoň však třikrát týdně (tj. s výměnou média). Odchylky od této praxe (např. u průtokových zkoušek) se uvedou ve zprávě.

            účinné od 1. 5. 2004Strava matečných organismů během zkoušky by měla sestávat nejlépe z živých buněk řas jednoho nebo více následujících druhů: Chlorella sp., Selenastrum capricornutum (nyní Pseudokirchneriella subcapitata (11)) a Scenedesmus subspicatus. Množství dodávané stravy by mělo vycházet z množství organického uhlíku (C) dodávaného na jeden matečný organismus. Výzkum (12) ukázal, že u druhu Daphnia magna je postačující pro dosažení dostatečného potomstva nezbytného pro splnění kritérií validity množství stravy od 0,1 do 0,2 mg C na dafnii za den. Strava může být dodávána buď ve stejných dávkách po celou dobu zkoušky, nebo podle požadavku v nižších dávkách na začátku zkoušky a poté ve zvyšujících se dávkách s ohledem na růst matečných organismů. V takovém případě by mělo množství stravy po celou dobu zůstat v doporučeném rozmezí 0,1 až 0,2 mg C na dafnii za den.

            účinné od 1. 5. 2004Použije-li se k určení potřebného množství stravy zástupný ukazatel, jako je počet buněk řas nebo absorbance ve viditelném světle, musí každá laboratoř vytvořit vlastní nomogram vztahu zástupného ukazatele a obsahu uhlíku v kultuře řas (viz dodatek 2 s návodem na vytvoření nomogramu). Nomogramy by měly být ověřovány jednou ročně a častěji v případě, že se změní podmínky kultivace řas. Absorbance ve viditelném světle byla shledána lepším zástupným ukazatelem celkového obsahu uhlíku, než počet buněk (13).

            účinné od 1. 5. 2004Dafniím by měla být dodávána koncentrovaná suspenze řas, aby se minimalizoval objem kultivačního média řas uváděný do zkušební nádoby. Zkoncentrování řas lze dosáhnout centrifugací a následnou resuspenzí v destilované vodě, v deionisované vodě nebo v kultivačním médiu dafnií.

          1. účinné od 1. 5. 2004XX.1.8.1.5 Osvětlení

            účinné od 1. 5. 200416 hodin světla při intenzitě nepřekračující 15 až 20 µE m-2·s-1.

          1. účinné od 1. 5. 2004XX.1.8.1.6 Teplota

            účinné od 1. 5. 2004Teplota zkušebního média by se měla pohybovat v rozmezí 18 až 22 °C. V žádné zkoušce by však teplota neměla v těchto mezích kolísat o více než 2 °C (např. 18 až 20, 19 až 21 nebo 20 až 22 °C). Pro účely sledování teploty může být vhodné použít další zkušební nádobu.

          1. účinné od 1. 5. 2004XX.1.8.1.7 Provzdušňování

            účinné od 1. 5. 2004Zkušební nádoby nesmí být v průběhu zkoušky provzdušňovány.

        1. účinné od 1. 5. 2004XX.1.8.2 Zkušební koncentrace

          účinné od 1. 5. 2004Zpravidla se použije alespoň pět zkušebních koncentrací tvořících geometrickou řadu s faktorem nepřekračujícím 3,2 a přiměřený počet paralelních zkušebních skupin v rámci každé zkušební koncentrace (viz bod 1.8.1.3). Použití méně než pěti koncentrací by mělo být zdůvodněno. Látky by neměly být zkoušeny pro koncentrace vyšší, než je jejich rozpustnost ve zkušebním médiu.

          1. účinné od 1. 5. 2004Při volbě rozsahu koncentrací by měly být zohledněny následující zásady:
            1. účinné od 1. 5. 2004i) je-li cílem získat LOEC/NOEC, musí být nejnižší zkušební koncentrace dostatečně nízká, aby nebyla plodnost při této koncentraci významně nižší, než plodnost v kontrolní skupině. V opačném případě bude muset být zkouška opakována se sníženou nejnižší koncentrací;
            2. účinné od 1. 5. 2004ii) je-li cílem získat LOEC/NOEC, musí být nejvyšší zkušební koncentrace dostatečně vysoká, aby byla plodnost při této koncentraci významně nižší, než plodnost v kontrolní skupině. V opačném případě bude muset být zkouška opakována se zvýšenou nejvyšší koncentrací;
            3. účinné od 1. 5. 2004iii) má-li být pro účinky na reprodukci odhadnuta ECx, doporučuje se, aby byl použit dostatečný počet koncentrací s cílem zjistit ECx s přijatelným intervalem spolehlivosti. Je-li znám odhad EC50 pro účinky na reprodukci, doporučuje se, aby byla nejvyšší zkušební koncentrace vyšší než tato EC50. Jinak sice bude stále možné odhadnout EC50, interval spolehlivosti však bude velmi široký a nemusí být možné uspokojivé posouzení přiměřenosti navrženého modelu;
            4. účinné od 1. 5. 2004iv) do rozsahu zkušebních koncentrací by nejlépe neměly spadat koncentrace, které mají statisticky významný účinek na přežití dospělců, neboť by mohl být změněn charakter zkoušky z pouhé zkoušky toxicity pro reprodukci na kombinovanou zkoušku toxicity pro reprodukci a mortality, která vyžaduje daleko složitější statistickou analýzu.

          účinné od 1. 5. 2004Předcházející znalost toxicity zkoušené látky (např. ze zkoušek akutní toxicity nebo z orientačních studií) by měla pomoci při volbě vhodných zkušebních koncentrací.

          účinné od 1. 5. 2004Použije-li se k usnadnění přípravy zásobního roztoku rozpouštědlo nebo dispergátor (viz bod 1.6.4), neměla by být jeho konečná koncentrace ve zkušební nádobě vyšší než 0,1 ml·l-1 a měla by být ve všech zkušebních nádobách stejná.

        1. účinné od 1. 5. 2004XX.1.8.3 Kontrolní skupiny

          účinné od 1. 5. 2004Kromě zkušební série se nasadí jedna série kontrolních skupin pro kontrolu zkušebního média a podle potřeby jedna série kontrolních skupin obsahujících rozpouštědlo nebo dispergátor. Použije-li se rozpouštědlo nebo dispergátor, měla by být jejich koncentrace stejná jako koncentrace v nádobách se zkoušenou látkou. Použije se vhodný počet paralelních skupin (viz oddíl 1.8.1.3).

          účinné od 1. 5. 2004V dobře vedených zkouškách by měl být variační koeficient středního počtu živých potomků narozených každému matečnému organismu v kontrolní skupině (kontrolních skupinách) zpravidla ≤ 25 %, a to by mělo být uvedeno v plánu zkoušek s oddělenými jedinci.

        1. účinné od 1. 5. 2004XX.1.8.4 Obnovování zkušebního média

          účinné od 1. 5. 2004Častost obnovování média bude záviset na stálosti zkoušené látky, médium se však obnovuje alespoň třikrát týdně. Není-li podle předběžných zkoušek stálosti (viz bod 1.4) koncentrace zkoušené látky po maximální dobu mezi obnoveními média (tj. po tři dny) stálá (tj. nepohybuje se v intervalu 80 – 120 % nominální koncentrace nebo klesá pod 80 % naměřené počáteční koncentrace), měl by být zváženo častější obnovování média nebo průtoková zkouška.

          účinné od 1. 5. 2004Při obnovování média v semistatických zkouškách se připraví druhá série zkušebních nádob a matečné organismy se do nich přenesou např. skleněnou pipetou o vhodném průměru. Objem média přeneseného s dafniemi by měl být co nejmenší.

        1. účinné od 1. 5. 2004XX.1.8.5 Pozorování