Platné znění

Vyhláška, kterou se u chemických látek a chemických přípravků stanoví základní metody pro zkoušení fyzikálně-chemických vlastností, výbušných vlastností a vlastností nebezpečných pro životní prostředí

účinné od 1. 5. 2004Vzhledem k tomu, že GPC je relativní metoda, musí být provedena kalibrace. K tomuto účelu se obvykle používá lineární polystyrenový standard s úzkou distribucí se známými středními molekulovými hmotnostmi Mn a Mw a se známým rozdělením molekulové hmotnosti. Kalibrační křivka může být pro stanovení molekulové hmotnosti neznámého vzorku použita pouze tehdy, byly-li podmínky separace vzorku a standardů identické. Pevný vztah mezi molekulovou hmotností a elučním objemem je platný pouze za specifických podmínek určitého experimentu. Podmínky zahrnují především teplotu, rozpouštědlo (nebo směs rozpouštědel), chromatografické podmínky a separační kolonu nebo systém separačních kolon.

účinné od 1. 5. 2004Molekulové hmotnosti stanovené tímto způsobem jsou relativními hodnotami a označují se jako „molekulární hmotnosti polystyrenového ekvivalentu“. To znamená, že se molekulová hmotnost bude v závislosti na strukturních a chemických rozdílech mezi vzorkem a standardem od absolutní hodnoty více či méně lišit. Použijí-li se jiné standardy, např. polyethylenglykol, polyethylenoxid, polymethylmethakrylát, polyakrylová kyselina, musí být použití zdůvodněno.

  1. účinné od 1. 5. 2004IX.1.4 Princip zkušební metody

    účinné od 1. 5. 2004Rozdělení molekulové hmotnosti vzorku i střední molekulové hmotnosti (Mn, Mw) lze stanovit metodou GPC. GPC je speciální typ kapalinové chromatografie, při němž je vzorek rozdělen podle hydrodynamických objemů jeho jednotlivých složek (2).

    účinné od 1. 5. 2004Separace probíhá při průchodu vzorku kolonou naplněnou porézním materiálem, obvykle organickým gelem. Malé molekuly proniknou póry, zatímco velké molekuly jsou zadrženy. Průchod velkých molekul je tedy kratší a jsou eluovány nejdříve. Středně velké molekuly pronikají některými póry a jsou eluovány později. Nejmenší molekuly se středním hydrodynamickým poloměrem menším než velikost pórů gelu pronikají všemi póry. Tyto molekuly jsou eluovány nakonec.

    účinné od 1. 5. 2004V ideálním případě závisí separace pouze na velkosti molekul, ale v praxi je obtížné vyhnout se alespoň některým rušivým absorpčním jevům. Nestejnoměrná náplň kolony a mrtvé objemy mohou situaci zhoršit (2).

    účinné od 1. 5. 2004Detekce se provádí například prostřednictvím měření indexu lomu nebo absorpce UV a dává jednoduchou distribuční křivku. Má-li být však křivce přiřazena skutečná molekulová hmotnost, je nezbytné kalibrovat kolonu průchodem polymerů o známé molekulové hmotnosti a v ideálním případě s v podstatě podobnou strukturou, např. různé polystyrenové standardy. Křivka má zpravidla gaussovský tvar, někdy deformovaný prodloužením na straně nízké molekulové hmotnosti, přičemž svislá osa udává hmotnostní podíl různých molekulových hmotnostní a na vodorovné ose jsou vynesen logaritmus molekulové hmotnosti.

  1. účinné od 1. 5. 2004IX.1.5 Kritéria kvality

    účinné od 1. 5. 2004Opakovatelnost (relativní směrodatná odchylka: RSD) elučního objemu by měla být lepší než 0,3 %. Požadovaná opakovatelnost musí být zajištěna korekcí prostřednictvím standardů, je-li chromatogram hodnocen jako funkce času a neodpovídá výše uvedenému kritériu (1).

    účinné od 1. 5. 2004Polydisperzity jsou závislé na molekulových hmotnostech standardů. V případě polystyrenových standardů jsou typickými hodnotami

    účinné od 1. 5. 2004
    Mp < 2 000 Mw/Mn < 1,20
    2000 = MP =106 Mw/Mn < 1,05
    Mp > 106 Mw/Mn < 1,20

    účinné od 1. 5. 2004(Mp je molekulová hmotnost standardu v maximu píku)

  1. účinné od 1. 5. 2004IX.1.6 Popis zkušební metody
    1. účinné od 1. 5. 2004IX.1.6.1 Příprava standardních roztoků polystyrénu

      účinné od 1. 5. 2004Polystyrenové standardy se rozpustí opatrným smícháním se zvoleným elučním činidlem. Při přípravě roztoků se musí zohlednit doporučení výrobce.

      účinné od 1. 5. 2004Koncentrace zvolených standardů závisí na různých faktorech, např. na vstřikovaném objemu, viskozitě roztoku a citlivosti analytického detektoru. Maximální vstřikovaný objem musí být přizpůsoben délce kolony, aby nedošlo k přesycení. Typické vstřikované objemy pro analytickou separaci pomocí GPC s kolonou o rozměrech 30x7,8 mm jsou obvykle 40 až 100 μl. Větší objemy jsou možné, ale neměly by překročit 250 μl. Optimální poměr mezi vstřikovaným objemem a koncentrací musí být stanoven před vlastní kalibrací kolony.

    1. účinné od 1. 5. 2004IX.1.6.2 Příprava roztoku vzorku

      účinné od 1. 5. 2004Stejné požadavky platí v zásadě pro přípravu roztoků vzorku. Vzorek se opatrným protřepáním rozpustí ve vhodném rozpouštědle, např. v tetrahydrofuranu (THF). V žádném případě by neměl být rozpuštěn pomocí ultrazvukové lázně. Je-li to nezbytné, přečistí se roztok vzorku filtrací přes membránový filtr o velikosti pórů 0,2 až 2 μm.

      účinné od 1. 5. 2004Přítomnost nerozpuštěných částic musí být zaznamenána v konečném protokolu, neboť mohou pocházet z frakcí s vysokou molekulovou hmotností. Pro stanovení hmotnostního podílu nerozpuštěných částic vyjádřeného v procentech by měla být použita vhodná metoda. Roztoky by měly být použity do 24 hodin.

    1. účinné od 1. 5. 2004IX.1.6.3 Přístroje a pomůcky
      1. účinné od 1. 5. 2004— zásobník rozpouštědla,
      2. účinné od 1. 5. 2004— odplynovací zařízení (podle potřeby),
      3. účinné od 1. 5. 2004— čerpadlo,
      4. účinné od 1. 5. 2004— tlumič rázů (podle potřeby),
      5. účinné od 1. 5. 2004— vstřikovací systém,
      6. účinné od 1. 5. 2004— chromatografické kolony,
      7. účinné od 1. 5. 2004— detektor,
      8. účinné od 1. 5. 2004— průtokoměr (podle potřeby),
      9. účinné od 1. 5. 2004— zapisovač,
      10. účinné od 1. 5. 2004— nádoba na odpad.

      účinné od 1. 5. 2004Musí být zajištěno, aby byl GPC systém inertní k použitým rozpouštědlům (např. použitím ocelových kapilár pro THF).

    1. účinné od 1. 5. 2004IX.1.6.4 Vstřikování a systém dávkování rozpouštědla

      účinné od 1. 5. 2004Definovaný objem roztoku vzorku se nanáší na kolonu buď ručně, nebo dávkovačem do ostře ohraničené zóny. Příliš rychlý pohyb pístu vzad nebo vpřed (při ručním nanášení) může způsobit změny v pozorovaném rozdělení molekulové hmotnosti. Dávkovač rozpouštědla by pokud možno neměl působit rázy a v ideálním případě by měl být osazen tlumičem rázů. Průtok je řádově 1 ml/min.

    1. účinné od 1. 5. 2004IX.1.6.5 Kolona

      účinné od 1. 5. 2004Podle typu vzorku se polymer charakterizuje použitím jednoduché kolony nebo několika za sebou řazenými kolonami. Komerčně je dostupná řada porézních materiálů definovaných vlastností (např. velikost pórů, meze zadržení).Výběr separačního gelu nebo délky kolony závisí jak na vlastnostech vzorku (hydrodynamický objem, distribuce molekulové hmotnosti), tak na specifických podmínkách separace, jako jsou rozpouštědlo, teplota a průtok (1), (2), (3).

    1. účinné od 1. 5. 2004IX.1.6.6 Teoretická patra

      účinné od 1. 5. 2004Použitá kolona nebo kombinace kolon musí být charakterizována počtem teoretických pater. V případě použití THF jako elučního činidla to znamená nanesení roztoku ethylbenzenu nebo jiného vhodného nepolárního roztoku na kolonu známé délky. Počet teoretických pater je dán následující rovnicí

      účinné od 1. 5. 2004

      1. účinné od 1. 5. 2004kde
        1. účinné od 1. 5. 2004N je počet teoretických pater,
        2. účinné od 1. 5. 2004Ve je eluční objem v maximu píku,
        3. účinné od 1. 5. 2004W šířka základny píku,
        4. účinné od 1. 5. 2004W½ šířka píku v polovině výšky.
    1. účinné od 1. 5. 2004IX.1.6.7 Separační účinnost
      1. účinné od 1. 5. 2004Vedle počtu teoretických pater, který je veličinou určující šířku pásu, hraje roli také separační účinnost, která se stanoví ze strmosti kalibrační křivky. Separační účinnost kolony se získá z následujícího vztahu:

        účinné od 1. 5. 2004

        1. účinné od 1. 5. 2004kde
          1. účinné od 1. 5. 2004Ve,Mx je eluční objem pro polystyren s molekulovou hmotností Mx,
          2. účinné od 1. 5. 2004Ve(10Mx) je eluční objem pro polystyren s 10krát větší molekulovou hmotností.
      1. účinné od 1. 5. 2004Rozlišení systému je obecně definováno tímto vztahem:

        účinné od 1. 5. 2004

        1. účinné od 1. 5. 2004kde
          1. účinné od 1. 5. 2004Ve1,Ve2 jsou eluční objemy dvou standardů polystyrénu v maximu píku,
          2. účinné od 1. 5. 2004W1, W2 jsou šířky základen píků,
          3. účinné od 1. 5. 2004M1, M2 molekulové hmotnosti odpovídající maximu píků (měly by se lišit faktorem 10).

        účinné od 1. 5. 2004Hodnota R pro kolonový systém by měla být větší než 1,7 (4).

    1. účinné od 1. 5. 2004IX.1.6.8 Rozpouštědla

      účinné od 1. 5. 2004Všechna rozpouštědla musí mít vysokou čistotu (v případě THF 95% čistoty). Zásobník rozpouštědla (v případě potřeby pod inertní atmosférou) musí být dostatečně velký pro kalibraci kolony a pro několik analýz vzorku. Z rozpouštědla musí být před jeho nanesením čerpadlem na kolonu odstraněny plyny.

    1. účinné od 1. 5. 2004IX.1.6.9 Kontrola teploty

      účinné od 1. 5. 2004Teplota kritických vnitřních součástí (vstřikovací smyčky, kolon, detektoru a potrubí) by měla být konstantní a měla by být sladěna s volbou rozpouštědla.

    1. účinné od 1. 5. 2004IX.1.6.10 Detektor

      účinné od 1. 5. 2004Detektor slouží ke kvantitativnímu zaznamenávání koncentrace vzorku eluovaného z kolony. Nemá-li dojít ke zbytečnému rozšíření píků, musí být objem kyvety detekční cely co nejmenší. Neměl by být větší než 10 μl, s výjimkou detektorů k měření rozptylu světla a viskozity. K detekci se obvykle používají diferenciální refraktometry. Vyžadují-li si to však specifické vlastnosti vzorku nebo elučního rozpouštědla, lze použít jiné typy detektorů, např. UV/VIS, IR detektory a detektory viskozity atd.

  1. účinné od 1. 5. 2004IX.2 DATA A ZPRÁVY
    1. účinné od 1. 5. 2004IX.2.1 Data

      účinné od 1. 5. 2004Pokud jde o podrobná kritéria hodnocení a o požadavky týkající se registrace a zpracování dat, měla by být použita norma DIN (1).

      účinné od 1. 5. 2004Pro každý vzorek musí být provedeny dva nezávislé experimenty. Analýzy musí být provedeny samostatně.

      účinné od 1. 5. 2004Pro každé měření musí být uvedeny hodnoty Mn, Mw, Mw/Mn a Mp. Je nezbytné výslovně uvést, že naměřené hodnoty jsou relativními hodnotami odpovídajícími molekulové hmotnosti použitého standardu.

      účinné od 1. 5. 2004Po stanovení retenčních objemů nebo retenčních časů (případně korigovaných za použití vnitřního standardu) se proti těmto veličinám vynesou do grafu hodnoty log Mp (přičemž Mp je výška maxima píku kalibračního standardu). Na jednu dekádu hodnot molekulární hmotnosti jsou nezbytné alespoň dva kalibrační body a pro celou křivku, která by měla pokrýt odhadovanou molekulovou hmotnost vzorku, se požaduje alespoň pět naměřených bodů. Poslední bod kalibrační křivky na straně nízkých molekulových hmotností se definuje n-hexylbenzenem nebo jiným vhodným nepolárním rozpouštědlem. Číselně střední a hmotnostně střední molekulová hmotnost se obecně stanoví elektronickým zpracováním dat založeným na vzorcích v bodě 1.2. V případě manuálního hodnocení lze použít metodu ASTM D 3536-91 (3).

      účinné od 1. 5. 2004Distribuční křivka musí být vyvedena ve formě tabulky nebo graficky (diferenciální četnost nebo kumulativní četnost v procentech proti log M). V případě grafické prezentace by měla mít jedna dekáda molekulární hmotnosti délku 4 cm a výška maxima píku by měla být asi 8 cm. V případě integrálních distribučních křivek by měla být vzdálenost mezi 0 a 100 % na ordinátě přibližně 10 cm.

    1. účinné od 1. 5. 2004IX.2.2 Protokol o zkoušce

      účinné od 1. 5. 2004Protokol o zkoušce musí obsahovat následující informace:

      1. účinné od 1. 5. 2004IX.2.2.1 Zkušební látka
        1. účinné od 1. 5. 2004— dostupné informace o zkušební látce (identita, přísady, nečistoty),
        2. účinné od 1. 5. 2004— popis zpracování vzorku, pozorované skutečnosti, problémy.
      1. účinné od 1. 5. 2004IX.2.2.2 Vybavení
        1. účinné od 1. 5. 2004— zásobník elučního činidla, inertní plyn, odstranění plynu z elučního činidla, složení elučního činidla, nečistoty,
        2. účinné od 1. 5. 2004— čerpadlo, tlumič rázů, vstřikovací systém,
        3. účinné od 1. 5. 2004— separační kolony (výrobce, všechny informace o charakteristikách kolon, jako jsou velikost pórů, druh separačního materiálu atd., počet, délka a pořadí použitých kolon),
        4. účinné od 1. 5. 2004— počet teoretických pater kolony (nebo kombinace kolon), separační účinnost (rozlišení systému),
        5. účinné od 1. 5. 2004— informace o symetrii píků,
        6. účinné od 1. 5. 2004— teplota kolony, způsob kontroly teploty,
        7. účinné od 1. 5. 2004— detektor (princip měření, typ, objem kyvety),
        8. účinné od 1. 5. 2004— průtokoměr, je-li použit (výrobce, princip měření),
        9. účinné od 1. 5. 2004— systém pro zaznamenávání a zpracování dat (hardware a software).
      1. účinné od 1. 5. 2004IX.2.2.3 Kalibrace systému
        1. účinné od 1. 5. 2004— podrobný popis metody použité pro sestrojení kalibrační křivky,
        2. účinné od 1. 5. 2004— informace o kritériích kvality této metody (např. korelační koeficient, chyba součtu čtverců atd.),
        3. účinné od 1. 5. 2004— informace o všech extrapolacích, předpokladech a aproximacích provedených během experimentálního postupu a při hodnocení a zpracování dat,
        4. účinné od 1. 5. 2004— všechny naměřené hodnoty použité při konstrukci kalibrační křivky musí být dokumentovány v tabulce, která musí pro každý kalibrační bod obsahovat následující informace:
        5. účinné od 1. 5. 2004— název vzorku,
        6. účinné od 1. 5. 2004— výrobce vzorku,
        7. účinné od 1. 5. 2004— charakteristické hodnoty standardů Mp, Mn, Mw a Mw/Mn, jak jsou poskytnuty výrobcem nebo jak jsou zjištěny z následných měření, společně s podrobnostmi o metodě stanovení,
        8. účinné od 1. 5. 2004— vstříknutý objem a vstříknutá koncentrace,
        9. účinné od 1. 5. 2004— hodnota Mp použitá po kalibraci,
        10. účinné od 1. 5. 2004— eluční objem nebo korigovaný retenční čas měřený v maximu píku,
        11. účinné od 1. 5. 2004— hodnota Mp vypočtená pro maximum píku,
        12. účinné od 1. 5. 2004— chyba vypočtené hodnoty Mp a kalibrační hodnoty Mp vyjádřená v procentech.
      1. účinné od 1. 5. 2004IX.2.2.4 Hodnocení
        1. účinné od 1. 5. 2004— hodnocení na základě časové závislosti: metody použité pro zajištění požadované reprodukovatelnosti (metoda korekce, vnitřní standard atd.),
        2. účinné od 1. 5. 2004— informace o tom, zda hodnocení bylo provedeno na základě elučního objemu nebo retenčního času,
        3. účinné od 1. 5. 2004— informace o omezeních hodnocení v případě, že pík nebyl kompletně analyzován,
        4. účinné od 1. 5. 2004— popis metody hlazení, bylo-li použito,
        5. účinné od 1. 5. 2004— příprava a postupy předběžné úpravy vzorku,
        6. účinné od 1. 5. 2004— popřípadě přítomnost nerozpuštěných částic,
        7. účinné od 1. 5. 2004— vstříknutý objem (μl) a vstříknutá koncentrace (mg/ml),
        8. účinné od 1. 5. 2004— pozorované skutečnosti, které vedou k odchylkám od ideálních charakteristik metody GPC,
        9. účinné od 1. 5. 2004— podrobný popis všech změn zkušebních postupů,
        10. účinné od 1. 5. 2004— podrobnosti o rozsahu chyb,
        11. účinné od 1. 5. 2004— jakékoliv další informace a pozorování relevantní pro interpretaci výsledků.
  1. účinné od 1. 5. 2004IX.3 LITERATURA

    účinné od 1. 5. 2004(1) DIN 55672 (1995). Gelpermeationschromatographie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1.

    účinné od 1. 5. 2004(2) Yau, W. W., Kirkland, J. J., Bly, D. D. eds, (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons.

    účinné od 1. 5. 2004(3) ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

    účinné od 1. 5. 2004(4) ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

účinné od 1. 5. 2004PŘÍLOHA

účinné od 1. 5. 2004Příklady jiných metod stanovení číselně střední molekulové hmotnosti (Mn) polymerů

  1. účinné od 1. 5. 2004Gelová permeační chromatografie (GPC) je přednostní metodou stanovení Mn, zejména tehdy, je-li k dispozici sada standardů, jejichž struktura je srovnatelná se strukturou polymeru. Vyskytnou-li se praktické obtíže při použití GPC nebo očekává-li se, že látka nevyhoví regulačním kritériím na Mn (což je třeba potvrdit), jsou k dispozici alternativní metody, jako jsou:
    1. účinné od 1. 5. 20041. Použití koligativních vlastností
      1. účinné od 1. 5. 20041.1 Ebulioskopie/kryoskopie: spočívá v měření zvýšení bodu varu (ebulioskopie) nebo snížení bodu tuhnutí (kryoskopie) rozpouštědla po přidání polymeru. Metoda je založena na skutečnosti, že vliv rozpuštěného polymeru na bod varu/bod tuhnutí závisí na molekulové hmotnosti polymeru (1), (2).

        účinné od 1. 5. 2004Použitelnost: Mn < 20 000.

      1. účinné od 1. 5. 20041.2 Snížení tlaku par: spočívá v měření tlaku par zvolené referenční kapaliny před přidáním a po přidání známého množství polymeru (1), (2).

        účinné od 1. 5. 2004Použitelnost: Mn < 20 000 (teoretická; v praxi však má omezený význam).

      1. účinné od 1. 5. 20041.3 Membránová osmometrie: spočívá na principu osmózy, tj. přirozené snahy molekul rozpouštědla proniknout polopropustnou membránou ze zředěného do koncentrovaného roztoku a ustavit rovnováhu. Při zkoušce je koncentrace zředěného roztoku nulová, zatímco koncentrovaný roztok obsahuje polymer. Pronikáním rozpouštědla membránou dochází ke tlakovému rozdílu, který závisí na koncentraci a molekulové hmotnosti polymeru (1), (3), (4).

        účinné od 1. 5. 2004Použitelnost: Mn od 20 000 do 200 000.

      1. účinné od 1. 5. 20041.4 Osmometrie - tlak páry: spočívá ve srovnání rychlosti vypařování čistého rozpouštědla s alespoň třemi aerosoly obsahujícími polymer v různých koncentracích (1), (5), (6).

        účinné od 1. 5. 2004Použitelnost: Mn < 20 000.

    1. účinné od 1. 5. 20042. Analýza koncových skupin

      účinné od 1. 5. 2004Použití této metody vyžaduje znalost jak celkové struktury polymeru, tak povahy koncových skupin řetězce (které musí být odlišitelné od hlavního řetězce například metodou NMR nebo titrací/derivatizací). Stanovení počtu koncových skupin polymeru může vést k hodnotě molekulové hmotnosti (7), (8), (9).

      účinné od 1. 5. 2004Použitelnost: Mn až do 50 000 (s klesající spolehlivostí).

účinné od 1. 5. 2004LITERATURA

účinné od 1. 5. 2004(1) Billmeyer, F.W. Jr., (1984). Textbook of Polymer Science, 3rd Edn, John Wiley, New York.

účinné od 1. 5. 2004(2) Glover C.A., (1975). Absolute Colligative Property Methods. Chapter 4. In: Polymer Molecular Weights, Part I, P.E Slade, Jr. ed., Marcel Dekker, New York.

účinné od 1. 5. 2004(3) ASTM D 3750-79, (1979). Standard Practice for Determination of Number-Average Molecular Weight of Polymers by Membrane Osmometry. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

účinné od 1. 5. 2004(4) Coll, H. (1989). Membrane Osmometry. In: Determination of Molecular Weight, A.R.Cooper ed., J. Wiley and Sons, pp. 25 to 52.

účinné od 1. 5. 2004(5) ASTM 3592-77, (1977). Standard Recomended Practice for Determination of Molecular Weight by Vapour Pressure, American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

účinné od 1. 5. 2004(6) Morris, C.E.M., (1989). Vapour Pressure Osmometry. In: Determination of Molecular Weight, A.R.Cooper ed., J. Wiley and Sons.

účinné od 1. 5. 2004(7) Schröder, E., Müller, G., Arndt, K-F., (1989). Polymer Characterisation, Carl Hanser Verlag, Munich.

účinné od 1. 5. 2004(8) Garmon, R.G., (1975). End-Group Determinations, Chapter 3. In: Polymer Molecular Weights, Part I, P.E. Slade, Jr. ed. Marcel Dekker, New York.

účinné od 1. 5. 2004(9) Amiya, S., et al. (1990). Pure and Applied Chemistry, 62, 2139-2146.

  1. účinné od 1. 5. 2004X. METODA PRO STANOVENÍ OBSAHU MOLEKUL O NÍZKÉ HMOTNOSTI V POLYMERECH – metoda A.19 podle přílohy směrnice 98/73/ES
    1. účinné od 1. 5. 2004X.1 METODA

      účinné od 1. 5. 2004Tato metoda gelové permeační chromatografie je replikou metody OECD TG 119 (1996). Základní principy a další technické informace jsou uvedeny v odkazech.

      1. účinné od 1. 5. 2004X.1.1 Úvod

        účinné od 1. 5. 2004Vlastnosti polymerů jsou tak rozdílné, že je nemožné popsat jedinou metodu a stanovit přesně podmínky separace a hodnocení, které by pokryly všechny eventuality a specifika vyskytující se při separaci polymerů. Zejména pro komplexní polymerní systémy není gelová permeační chromatografie (GPC) vždy vhodná. Není-li GPC použitelná, může být molekulová hmotnost stanovena jinými metodami (viz příloha). V takových případech by měly být uvedeny veškeré podrobnosti a zdůvodnění použité metody.

        účinné od 1. 5. 2004Popsaná metoda je založena na normě DIN 55672 (1). Podrobné informace o provádění experimentů a o hodnocení dat lze nalézt v uvedené normě DIN. V případě, že jsou nezbytné úpravy experimentálních podmínek, musí být změny zdůvodněny. Mohou být použity jiné normy, jsou-li uvedeny kompletní odkazy na ně. V popsané metodě jsou ke kalibraci použity vzorky polystyrenu o známé polydisperzitě a metoda může být upravena tak, aby byla vhodná pro určité polymery, např. vodorozpustné větvené polymery s dlouhým řetězcem.

      1. účinné od 1. 5. 2004X.1.2 Definice a jednotky

        účinné od 1. 5. 2004Nízká molekulová hmotnost je účelově definována jako molekulová hmotnost pod 1 000 daltonů.

        1. účinné od 1. 5. 2004Číselně střední molekulová hmotnost Mn a hmotnostně střední molekulová hmotnost Mw se stanoví pomocí následujících rovnic:
          účinné od 1. 5. 2004
          Příklady jiných metod stanovení číselně střední molekulové hmotnosti (Mn) polymerů LITERATURA
          1. účinné od 1. 5. 2004kde
            1. účinné od 1. 5. 2004Hi je výška signálu detektoru nad základnou pro retenční objem Vi,
            2. účinné od 1. 5. 2004Mi je molekulová hmotnost frakce polymeru pro retenční objem Vi, a
            3. účinné od 1. 5. 2004n je počet dat.

        účinné od 1. 5. 2004Šířka distribuce molekulové hmotnosti, která je mírou disperzity systému, je dána poměrem Mw/Mn.

      1. účinné od 1. 5. 2004X.1.3 Referenční látky

        účinné od 1. 5. 2004Vzhledem k tomu, že GPC je relativní metoda, musí být provedena kalibrace. K tomuto účelu se obvykle používá lineární polystyrenový standard s úzkou distribucí se známými středními molekulovými hmotnostmi Mn a Mw a se známým rozdělením molekulové hmotnosti. Kalibrační křivka může být pro stanovení molekulové hmotnosti neznámého vzorku použita pouze tehdy, byly-li podmínky separace vzorku a standardů identické. Pevný vztah mezi molekulovou hmotností a elučním objemem je platný pouze za specifických podmínek určitého experimentu. Podmínky zahrnují především teplotu, rozpouštědlo (nebo směs rozpouštědel), chromatografické podmínky a separační kolonu nebo systém separačních kolon.

        účinné od 1. 5. 2004Molekulové hmotnosti stanovené tímto způsobem jsou relativními hodnotami a označují se jako „molekulární hmotnosti polystyrenového ekvivalentu“. To znamená, že se molekulová hmotnost bude v závislosti na strukturních a chemických rozdílech mezi vzorkem a standardem od absolutní hodnoty více či méně lišit. Použijí-li se jiné standardy, např. polyethylenglykol, polyethylenoxid, polymethylmethakrylát, polyakrylová kyselina, musí být použití zdůvodněno.

      1. účinné od 1. 5. 2004X.1.4 Princip zkušební metody

        účinné od 1. 5. 2004Rozdělení molekulové hmotnosti vzorku i střední molekulové hmotnosti (Mn, Mw) lze stanovit metodou GPC. GPC je speciální typ kapalinové chromatografie, při němž je vzorek rozdělen podle hydrodynamických objemů jeho jednotlivých složek (2).

        účinné od 1. 5. 2004Separace probíhá při průchodu vzorku kolonou naplněnou porézním materiálem, obvykle organickým gelem. Malé molekuly proniknou póry, zatímco velké molekuly jsou zadrženy. Průchod velkých molekul je tedy kratší a jsou eluovány nejdříve. Středně velké molekuly pronikají některými póry a jsou eluovány později. Nejmenší molekuly se středním hydrodynamickým poloměrem menším než velikost pórů gelu pronikají všemi póry. Tyto molekuly jsou eluovány nakonec.

        účinné od 1. 5. 2004V ideálním případě závisí separace pouze na velkosti molekul, ale v praxi je obtížné vyhnout se alespoň některým rušivým absorpčním jevům. Nestejnoměrná náplň kolony a mrtvé objemy mohou situaci zhoršit (2).

        účinné od 1. 5. 2004Detekce se provádí například prostřednictvím měření indexu lomu nebo absorpce UV a dává jednoduchou distribuční křivku. Má-li být však křivce přiřazena skutečná molekulová hmotnost, je nezbytné kalibrovat kolonu průchodem polymerů o známé molekulové hmotnosti a v ideálním případě s v podstatě podobnou strukturou, např. různé polystyrenové standardy. Křivka má zpravidla gaussovský tvar, někdy deformovaný prodloužením na straně nízké molekulové hmotnosti, přičemž svislá osa udává hmotnostní podíl různých molekulových hmotnostní a na vodorovné ose jsou vynesen logaritmus molekulové hmotnosti.

      1. účinné od 1. 5. 2004X.1.5 Kritéria kvality

        účinné od 1. 5. 2004Opakovatelnost (relativní směrodatná odchylka: RSD) elučního objemu by měla být lepší než 0,3 %. Požadovaná opakovatelnost musí být zajištěna korekcí prostřednictvím standardů, je-li chromatogram hodnocen jako funkce času a neodpovídá výše uvedenému kritériu (1). Polydisperzity jsou závislé na molekulových hmotnostech standardů. V případě polystyrenových standardů jsou typickými hodnotami

        účinné od 1. 5. 2004
        Příklady jiných metod stanovení číselně střední molekulové hmotnosti (Mn) polymerů LITERATURA
        Mp < 2 000 Mw/Mn < 1,20
        2 000 = MP = 106 Mw/Mn < 1,05
        Mp > 106 Mw/Mn < 1,20

        účinné od 1. 5. 2004(Mp je molekulová hmotnost standardu v maximu píku)

      1. účinné od 1. 5. 2004X.1.6 Popis zkušební metody
        1. účinné od 1. 5. 2004X.1.6.1 Příprava standardních roztoků polystyrénu

          účinné od 1. 5. 2004Polystyrenové standardy se rozpustí opatrným smícháním se zvoleným elučním činidlem. Při přípravě roztoků se musí zohlednit doporučení výrobce.

          účinné od 1. 5. 2004Koncentrace zvolených standardů závisí na různých faktorech, např. na vstřikovaném objemu, viskozitě roztoku a citlivosti analytického detektoru. Maximální vstřikovaný objem musí být přizpůsoben délce kolony, aby nedošlo k přesycení. Typické vstřikované objemy pro analytickou separaci pomocí GPC s kolonou o rozměrech 30×7,8 mm jsou obvykle 40 až 100 μl. Větší objemy jsou možné, ale neměly by překročit 250 μl. Optimální poměr mezi vstřikovaným objemem a koncentrací musí být stanoven před vlastní kalibrací kolony.

        1. účinné od 1. 5. 2004X.1.6.2 Příprava roztoku vzorku

          účinné od 1. 5. 2004Stejné požadavky platí v zásadě pro přípravu roztoků vzorku. Vzorek se opatrným protřepáním rozpustí ve vhodném rozpouštědle, např. v tetrahydrofuranu (THF). V žádném případě by neměl být rozpuštěn pomocí ultrazvukové lázně. Je-li to nezbytné, přečistí se roztok vzorku filtrací přes membránový filtr o velikosti pórů 0,2 až 2 μm.

          účinné od 1. 5. 2004Přítomnost nerozpuštěných částic musí být zaznamenána v konečném protokolu, neboť mohou pocházet z frakcí s vysokou molekulovou hmotností. Pro stanovení hmotnostního podílu nerozpuštěných částic vyjádřeného v procentech by měla být použita vhodná metoda. Roztoky by měly být použity do 24 hodin.

        1. účinné od 1. 5. 2004X.1.6.3 Korekce na obsah nečistot a přísad

          účinné od 1. 5. 2004Korekce obsahu frakce s M < 1 000 v důsledku příspěvku od přítomných nepolymerních specifických složek (např. nečistot a/nebo přísad) je obvykle nezbytná, není-li naměřený obsah < 1 %. Dosáhne se toho přímou analýzou roztoku polymeru nebo eluátu GPC.

          účinné od 1. 5. 2004V případech, kdy je eluát po průchodu kolonou pro další analýzu příliš zředěný, musí být zkoncentrován. Může být nezbytné odpařit eluát do sucha a opět jej rozpustit. Zkoncentrování eluátu musí být provedena za podmínek, při nichž je zajištěno, že nedojde ke změnám v eluátu. Zpracování eluátu po GPC závisí na analytické metodě použité ke kvantitativnímu stanovení.

        1. účinné od 1. 5. 2004X.1.6.4 Přístroje a pomůcky
          1. účinné od 1. 5. 2004Aparatura pro GPC sestává z následujících součástí:
            1. účinné od 1. 5. 2004— zásobník rozpouštědla,
            2. účinné od 1. 5. 2004— odplynovací zařízení (podle potřeby),
            3. účinné od 1. 5. 2004— čerpadlo,
            4. účinné od 1. 5. 2004— tlumič rázů (podle potřeby),
            5. účinné od 1. 5. 2004— vstřikovací systém,
            6. účinné od 1. 5. 2004— chromatografické kolony,
            7. účinné od 1. 5. 2004— detektor,
            8. účinné od 1. 5. 2004— průtokoměr (podle potřeby),
            9. účinné od 1. 5. 2004— zapisovač,
            10. účinné od 1. 5. 2004— nádoba na odpad.

          účinné od 1. 5. 2004Musí být zajištěno, aby byl GPC systém inertní k použitým rozpouštědlům (např. použitím ocelových kapilár pro THF).

        1. účinné od 1. 5. 2004X.1.6.5 Vstřikování a systém dávkování rozpouštědla

          účinné od 1. 5. 2004Definovaný objem roztoku vzorku se nanáší na kolonu buď ručně, nebo dávkovačem do ostře ohraničené zóny. Příliš rychlý pohyb pístu vzad nebo vpřed (při ručním nanášení) může způsobit změny v pozorovaném rozdělení molekulové hmotnosti. Dávkovač rozpouštědla by pokud možno neměl působit rázy a v ideálním případě by měl být osazen tlumičem rázů. Průtok je řádově 1 ml/min.

        1. účinné od 1. 5. 2004X.1.6.6 Kolona

          účinné od 1. 5. 2004Podle typu vzorku se polymer charakterizuje použitím jednoduché kolony nebo několika za sebou řazenými kolonami. Komerčně je dostupná řada porézních materiálů definovaných vlastností (např. velikost pórů, meze zadržení).Výběr separačního gelu nebo délky kolony závisí jak na vlastnostech vzorku (hydrodynamický objem, distribuce molekulové hmotnosti), tak na specifických podmínkách separace, jako jsou rozpouštědlo, teplota a průtok (1), (2), (3).

        1. účinné od 1. 5. 2004X.1.6.7 Teoretická patra

          účinné od 1. 5. 2004Použitá kolona nebo kombinace kolon musí být charakterizována počtem teoretických pater. V případě použití THF jako elučního činidla to znamená nanesení roztoku ethylbenzenu nebo jiného vhodného nepolárního roztoku na kolonu známé délky. Počet teoretických pater je dán následující rovnicí

          účinné od 1. 5. 2004

          1. účinné od 1. 5. 2004kde
            1. účinné od 1. 5. 2004N je počet teoretických pater,
            2. účinné od 1. 5. 2004Ve je eluční objem v maximu píku,
            3. účinné od 1. 5. 2004W šířka základny píku,
            4. účinné od 1. 5. 2004W½ šířka píku v polovině výšky.
        1. účinné od 1. 5. 2004X.1.6.8 Separační účinnost
          1. účinné od 1. 5. 2004Vedle počtu teoretických pater, který je veličinou určující šířku pásu, hraje roli také separační účinnost, která se stanoví ze strmosti kalibrační křivky. Separační účinnost kolony se získá z následujícího vztahu:

            účinné od 1. 5. 2004

            1. účinné od 1. 5. 2004kde
              1. účinné od 1. 5. 2004Ve,Mx je eluční objem pro polystyren s molekulovou hmotností Mx,
              2. účinné od 1. 5. 2004Ve,(10Mx) je eluční objem pro polystyren s 10krát větší molekulovou hmotností.

          účinné od 1. 5. 2004Rozlišení systému je obecně definováno tímto vztahem:

          účinné od 1. 5. 2004

          1. účinné od 1. 5. 2004kde
            1. účinné od 1. 5. 2004Ve1, Ve2 jsou eluční objemy dvou standardů polystyrénu v maximu píku,
            2. účinné od 1. 5. 2004W1, W2 jsou šířky základen píků,
            3. účinné od 1. 5. 2004M1, M2 molekulové hmotnosti odpovídající maximu píků (měly by se lišit faktorem 10).
            4. účinné od 1. 5. 2004Hodnota R pro kolonový systém by měla být větší než 1,7 (4).
        1. účinné od 1. 5. 2004X.1.6.9 Rozpouštědla

          účinné od 1. 5. 2004Všechna rozpouštědla musí mít vysokou čistotu (v případě THF 95% čistoty). Zásobník rozpouštědla (v případě potřeby pod inertní atmosférou) musí být dostatečně velký pro kalibraci kolony a pro několik analýz vzorku. Z rozpouštědla musí být před jeho nanesením čerpadlem na kolonu odstraněny plyny.

        1. účinné od 1. 5. 2004X.1.6.10 Kontrola teploty

          účinné od 1. 5. 2004Teplota kritických vnitřních součástí (vstřikovací smyčky, kolon, detektoru a potrubí) by měla být konstantní a měla by být sladěna s volbou rozpouštědla.

        1. účinné od 1. 5. 2004X.1.6.11 Detektor

          účinné od 1. 5. 2004Detektor slouží ke kvantitativnímu zaznamenávání koncentrace vzorku eluovaného z kolony. Nemá-li dojít ke zbytečnému rozšíření píků, musí být objem kyvety detekční cely co nejmenší. Neměl by být větší než 10 μl, s výjimkou detektorů k měření rozptylu světla a viskozity. K detekci se obvykle používají diferenciální refraktometry. Vyžadují-li si to však specifické vlastnosti vzorku nebo elučního rozpouštědla, lze použít jiné typy detektorů, např. UV/VIS, IR detektory a detektory viskozity atd.

    1. účinné od 1. 5. 2004X.2 DATA A ZPRÁVY
      1. účinné od 1. 5. 2004X.2.1 Data

        účinné od 1. 5. 2004Pokud jde o podrobná kritéria hodnocení a o požadavky týkající se registrace a zpracování dat, měla by být použita norma DIN (1).

        účinné od 1. 5. 2004Pro každý vzorek musí být provedeny dva nezávislé experimenty. Analýzy musí být provedeny samostatně. Ve všech případech je důležité stanovit také data ze slepých pokusů zpracovaných za stejných podmínek jako vzorek.

        účinné od 1. 5. 2004Je nezbytné výslovně uvést, že naměřené hodnoty jsou relativními hodnotami odpovídajícími molekulové hmotnosti použitého standardu.

        účinné od 1. 5. 2004Po stanovení retenčních objemů nebo retenčních časů (případně korigovaných za použití vnitřního standardu) se proti těmto veličinám vynesou do grafu hodnoty log Mp (přičemž Mp je výška maxima píku kalibračního standardu). Na jednu dekádu hodnot molekulární hmotnosti jsou nezbytné alespoň dva kalibrační body a pro celou křivku, která by měla pokrýt odhadovanou molekulovou hmotnost vzorku, se požaduje alespoň pět naměřených bodů. Poslední bod kalibrační křivky na straně nízkých molekulových hmotností se definuje n-hexylbenzenem nebo jiným vhodným nepolárním rozpouštědlem. Při stanovení se část křivky odpovídající molekulovým hmotnostem nižším než 1 000 podle potřeby koriguje na nečistoty a přísady. Eluční křivky se obvykle hodnotí pomocí elektronického zpracování dat. V případě manuálního hodnocení lze použít metodu ASTM D 3536-91 (3).

        účinné od 1. 5. 2004Jestliže je v koloně zachycen nerozpustný polymer, je jeho molekulová hmotnost pravděpodobně vyšší než molekulová hmotnost rozpuštěné frakce a pokud by to nebylo zohledněno, vedlo by to k nadhodnocení obsahu molekul o nízké hmotnosti. Návod na korigování obsahu molekul o nízké hmotnosti na obsah nerozpuštěného polymeru je uveden v příloze.

        účinné od 1. 5. 2004Distribuční křivka musí být vyvedena ve formě tabulky nebo graficky (diferenciální četnost nebo kumulativní četnost v procentech proti log M). V případě grafické prezentace by měla mít jedna dekáda molekulární hmotnosti délku 4 cm a výška maxima píku by měla být asi 8 cm. V případě integrálních distribučních křivek by měla být vzdálenost mezi 0 a 100 % na ordinátě přibližně 10 cm.

      1. účinné od 1. 5. 2004X.2.2 Protokol o zkoušce

        účinné od 1. 5. 2004Protokol o zkoušce musí obsahovat následující informace:

        1. účinné od 1. 5. 2004X.2.2.1 Zkušební látka
          1. účinné od 1. 5. 2004— dostupné informace o zkušební látce (identita, přísady, nečistoty),
          2. účinné od 1. 5. 2004— popis zpracování vzorku, pozorované skutečnosti, problémy.
        1. účinné od 1. 5. 2004X.2.2.2 Vybavení
          1. účinné od 1. 5. 2004— zásobník elučního činidla, inertní plyn, odstranění plynu z elučního činidla, složení elučního činidla, nečistoty,
          2. účinné od 1. 5. 2004— čerpadlo, tlumič rázů, vstřikovací systém,
          3. účinné od 1. 5. 2004— separační kolony (výrobce, všechny informace o charakteristikách kolon, jako jsou velikost pórů, druh separačního materiálu atd., počet, délka a pořadí použitých kolon),
          4. účinné od 1. 5. 2004— počet teoretických pater kolony (nebo kombinace kolon), separační účinnost (rozlišení systému),
          5. účinné od 1. 5. 2004— informace o symetrii píků,
          6. účinné od 1. 5. 2004— teplota kolony, způsob kontroly teploty,
          7. účinné od 1. 5. 2004— detektor (princip měření, typ, objem kyvety),
          8. účinné od 1. 5. 2004— průtokoměr, je-li použit (výrobce, princip měření),
          9. účinné od 1. 5. 2004— systém pro zaznamenávání a zpracování dat (hardware a software).
        1. účinné od 1. 5. 2004X.2.2.3 Kalibrace systému
          1. účinné od 1. 5. 2004— podrobný popis metody použité pro sestrojení kalibrační křivky,
          2. účinné od 1. 5. 2004— informace o kritériích kvality této metody (např. korelační koeficient, chyba součtu čtverců atd.),
          3. účinné od 1. 5. 2004— informace o všech extrapolacích, předpokladech a aproximacích provedených během experimentálního postupu a při hodnocení a zpracování dat,
          4. účinné od 1. 5. 2004— všechny naměřené hodnoty použité při konstrukci kalibrační křivky musí být dokumentovány v tabulce, která musí pro každý kalibrační bod obsahovat následující informace:
          5. účinné od 1. 5. 2004— název vzorku,
          6. účinné od 1. 5. 2004— výrobce vzorku,
          7. účinné od 1. 5. 2004— charakteristické hodnoty standardů Mp, Mn, Mw a Mw/Mn, jak jsou poskytnuty výrobcem nebo jak jsou zjištěny z následných měření, společně s podrobnostmi o metodě stanovení,
          8. účinné od 1. 5. 2004— vstříknutý objem a vstříknutá koncentrace,
          9. účinné od 1. 5. 2004— hodnota Mp použitá po kalibraci,
          10. účinné od 1. 5. 2004— eluční objem nebo korigovaný retenční čas měřený v maximu píku,
          11. účinné od 1. 5. 2004— hodnota Mp vypočtená pro maximum píku,
          12. účinné od 1. 5. 2004— chyba vypočtené hodnoty Mp a kalibrační hodnoty Mp vyjádřená v procentech.
        1. účinné od 1. 5. 2004X.2.2.4 Informace o obsahu podílu s nízkou molekulovou hmotností v polymeru
          1. účinné od 1. 5. 2004— popis metod použitých v analýze a způsobu, jakým byly experimenty provedeny,
          2. účinné od 1. 5. 2004— informace o obsahu podílu s nízkou molekulovou hmotností vyjádřeném v procentech celkového vzorku (m/m),
          3. účinné od 1. 5. 2004— informace o nečistotách, přísadách a jiných nepolymerních podílech vyjádřených v procentech celkového vzorku (m/m).
        1. účinné od 1. 5. 2004X.2.2.5 Hodnocení
          1. účinné od 1. 5. 2004— hodnocení na základě časové závislosti: metody použité pro zajištění požadované reprodukovatelnosti (metoda korekce, vnitřní standard atd.),
          2. účinné od 1. 5. 2004— informace o tom, zda hodnocení bylo provedeno na základě elučního objemu nebo retenčního času,
          3. účinné od 1. 5. 2004— informace o omezeních hodnocení v případě, že pík nebyl kompletně analyzován,
          4. účinné od 1. 5. 2004— popis metody hlazení, bylo-li použito,
          5. účinné od 1. 5. 2004— příprava a postupy předběžné úpravy vzorku,
          6. účinné od 1. 5. 2004— popřípadě přítomnost nerozpuštěných částic,
          7. účinné od 1. 5. 2004— vstříknutý objem (μl) a vstříknutá koncentrace (mg/ml),
          8. účinné od 1. 5. 2004— pozorované skutečnosti, které vedou k odchylkám od ideálních charakteristik metody GPC,
          9. účinné od 1. 5. 2004— podrobný popis všech změn zkušebních postupů,
          10. účinné od 1. 5. 2004— podrobnosti o rozsahu chyb,
          11. účinné od 1. 5. 2004— jakékoliv další informace a pozorování relevantní pro interpretaci výsledků.
    1. účinné od 1. 5. 2004X.3 LITERATURA

      účinné od 1. 5. 2004(1) DIN 55672 (1995). Gelpermeationschromatographie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1.

      účinné od 1. 5. 2004(2) Yau, W. W., Kirkland, J. J., Bly, D. D. eds, (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons.

      účinné od 1. 5. 2004(3) ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

      účinné od 1. 5. 2004(4) ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

    účinné od 1. 5. 2004PŘÍLOHA

    účinné od 1. 5. 2004Návod na korigování obsahu molekul o nízké hmotnosti na obsah nerozpuštěného polymeru

    účinné od 1. 5. 2004Je-li ve vzorku přítomen nerozpuštěný polymer, vede to ke ztrátě hmotnosti během analýzy GPC. Nerozpuštěné polymery jsou nevratně zachyceny v koloně nebo na filtru při filtrování vzorku, zatímco rozpustný podíl vzorku kolonou projde. V případě, že lze odhadnout nebo změřit přírůstek indexu lomu (dn/dc) polymeru, lze odhadnou ztrátu hmotnosti vzorku na koloně. V takovém případě se korekce provede pomocí externí kalibrace standardním materiálem o známé koncentraci a známé hodnotě dn/dc, čímž se provede kalibrace refraktometru. V příkladě uvedeném dále je jako standard použit polymethylmethakrylát (pMMA).

    1. účinné od 1. 5. 2004Při externí kalibraci pro analýzu polyakrylátů se analyzuje metodou GPC standard pMMA známé koncentrace v tetrahydrofuranu a výsledná data se použijí pro nalezení konstanty refraktometru podle rovnice:

      účinné od 1. 5. 2004

      1. účinné od 1. 5. 2004kde
        1. účinné od 1. 5. 2004K je konstanta refraktometru (μVs/ml),
        2. účinné od 1. 5. 2004R je odečet pro standard pMMA (μVs),
        3. účinné od 1. 5. 2004C je koncentrace standardu pMMA (mg/ml),
        4. účinné od 1. 5. 2004V je nastříknutý objem (ml) a
        5. účinné od 1. 5. 2004dn/dc je přírůstek indexu lomu pro pMMA v tetrahydrofuranu (ml/mg).
    1. účinné od 1. 5. 2004Pro standard pMMA jsou typická následující data:
      1. účinné od 1. 5. 2004R = 2 937 891
      2. účinné od 1. 5. 2004C = 1,07 mg/ml
      3. účinné od 1. 5. 2004V = 0,1 ml
      4. účinné od 1. 5. 2004dn/dc = 9 × 10-5 ml/mg.

    účinné od 1. 5. 2004Výsledná hodnota K, 3,05×1011 se =poté použije pro výpočet teoretické odezvy detektoru v případě, že detektorem prošlo 100 % vstřiknutého polymeru.

  1. účinné od 1. 5. 2004XI. METODA PRO STANOVENÍ CHOVÁNÍ POLYMERŮ PŘI ROZPOUŠTĚNÍ / EXTRAKCI VE VODĚ – metoda A.20 podle přílohy směrnice 98/73/ES
    1. účinné od 1. 5. 2004XI.1. METODA

      účinné od 1. 5. 2004Popsaná metoda je replikou revidované verze metody OECD TG 120 (1997). Další technické informace jsou uvedeny v odkaze (1).

      1. účinné od 1. 5. 2004XI.1.1 Úvod

        účinné od 1. 5. 2004V případě určitých polymerů, např. emulzních polymerů, může být před použitím dále popsané metody nezbytná předběžná úprava. Tato metoda není použitelná pro kapalné polymery a pro polymery, které za zkušebních podmínek reagují s vodou.

        účinné od 1. 5. 2004Není-li metoda použitelná nebo proveditelná, je možné zkoumat chování polymerů při rozpouštění a extrakci jinými metodami. V takových případech by měly být uvedeny všechny podrobnosti použité metody a její zdůvodnění.

      1. účinné od 1. 5. 2004XI.1.2 Referenční látky

        účinné od 1. 5. 2004Nejsou.

      1. účinné od 1. 5. 2004XI.1.3 Princip zkušební metody

        účinné od 1. 5. 2004Chování polymerů při rozpouštění/extrakci ve vodném prostředí se zjišťuje baňkovou metodou (viz A.6, rozpustnost ve vodě, baňková metoda) s úpravou uvedeno dále.

      1. účinné od 1. 5. 2004XI.1.4 Kritéria kvality

        účinné od 1. 5. 2004Nejsou.

      1. účinné od 1. 5. 2004XI.1.5 Popis zkušební metody
        1. účinné od 1. 5. 2004XI.1.5.1 Zařízení
          1. účinné od 1. 5. 2004Pro provedení metody je nezbytné následující zařízení:
            1. účinné od 1. 5. 2004— drticí zařízení, např. mlýnek pro přípravu částic o známé velikosti,
            2. účinné od 1. 5. 2004— třepačka s možností kontroly teploty,
            3. účinné od 1. 5. 2004— membránový filtrační systém,
            4. účinné od 1. 5. 2004— vhodné analytické vybavení,
            5. účinné od 1. 5. 2004— normalizovaná síta.
        1. účinné od 1. 5. 2004XI.1.5.2 Příprava vzorku

          účinné od 1. 5. 2004Reprezentativní vzorek musí být nejdříve omezen za použití vhodného síta na velikost částic 0,125 až 0,25 mm. Kvůli stálosti vzorku nebo kvůli procesu drcení může být nezbytné chlazení. Gumovité materiály mohou být drceny při teplotě kapalného dusíku (1).

          účinné od 1. 5. 2004Nelze-li požadované velikosti částic dosáhnout, mělo by se postupovat tak, aby byla velikost částic zmenšena co nejvíce, a výsledky by měly být uvedeny. Ve zprávě je nezbytné uvést, jak byl nadrcený vzorek uchován do provedení zkoušky.

        1. účinné od 1. 5. 2004XI.1.5.3 Postup

          účinné od 1. 5. 2004Do každé ze tří nádob opatřených skleněnými zátkami se naváží po 10 gramech zkušební látky a přidá se po 1 000 ml vody. Ukáže-li se zpracování 10 g polymeru neschůdným, mělo by být použito nejbližší vyšší množství, které lze zpracovat, a objem vody by měl být odpovídajícím způsobem upraven. Nádoby se těsně zazátkují a poté se třepou při 20 °C. Měly by být použita třepačka nebo míchačka schopná pracovat při konstantní teplotě. Po 24 hodinách se obsah každé nádoby odstředí nebo zfiltruje a v čiré vodné fázi se vhodnou analytickou metodou stanoví koncentrace polymeru. Nejsou-li k dispozici vhodné analytické metody pro vodnou fázi, lze celkovou rozpustnost/extrahovatelnost zhodnotit z hmotnosti suchého zbytku na filtru nebo ze usazeniny po odstředění.

          účinné od 1. 5. 2004Obvykle je nezbytné kvantitativně rozlišit nečistoty a přísady na jedné straně, a podíl o nízké molekulové hmotnosti na druhé straně. V případě vážkového stanovení je také důležité provést slepý pokus bez použití zkušební látky, s cílem zohlednit zbytky pocházející z experimentálního postupu.

          účinné od 1. 5. 2004Chování při rozpouštění/extrakci polymerů ve vodě při 37 °C a pH 2 a 9 může být stanoveno způsobem popsaným v případě provádění experimentu při 20 °C. Hodnot pH lze dosáhnout přidáním buď vhodných tlumivých roztoků, nebo vhodných kyselin nebo zásad, např. kyseliny chlorovodíkové, kyseliny octové, hydroxidu sodného nebo draselného analytické čistoty nebo NH3.

          účinné od 1. 5. 2004V závislosti na použité metodě by měla být provedena jedna nebo dvě zkoušky, jsou-li k dispozici dostatečně specifické metody pro přímou analýzu vodné fáze na obsah polymeru, měla by stačit jedna zkouška, jak je uvedena výše. Nejsou-li však takové metody k dispozici a zjištění chování polymeru při rozpouštění/extrakci je omezeno na přímou analýzu stanovením celkového obsahu organického uhlíku (TOC) ve vodném extraktu, měla by být provedena dodatečná zkouška. Zkouška by měla být rovněž provedena třikrát, přičemž se použije 10krát menší množství vzorků polymeru a stejné množství vody jako v první zkoušce.

        1. účinné od 1. 5. 2004XI.1.5.4 Analýza
          1. účinné od 1. 5. 2004XI.1.5.4.1 Zkouška s jednou velikostí vzorku

            účinné od 1. 5. 2004Je možné, že jsou k dispozici metody pro přímou analýzu složek polymeru ve vodné fázi. V opačném případě lze také zvážit nepřímou analýzu rozpuštěných/extrahovaných složek polymeru stanovením celkového obsahu rozpustných složek a provedením korekce na obsah složek, které nejsou specifické pro polymer.

            1. účinné od 1. 5. 2004Analýza vodné fáze na obsah celkového polymerního podílu je možná buď dostatečně citlivou metodou, např.
              1. účinné od 1. 5. 2004— stanovením celkového obsahu organického uhlíku (TOC) rozkladem peroxodisíranem nebo dichromanem za účelem uvolnění CO2 a následnou IR analýzou nebo chemickou analýzou,
              2. účinné od 1. 5. 2004— atomovou absorpční spektrometrií (AAS) nebo jejím protějškem spektrometrií s indukčně vázanou plazmou (ICP) v případě silikonu nebo polymerů obsahujících kov,
              3. účinné od 1. 5. 2004— UV absorpcí nebo spektrofluorimetrií v případě arylových polymerů,
              4. účinné od 1. 5. 2004— kapalinovou chromatografií s hmotovým spektrometrem (LC-MS) v případě vzorků s nízkou molekulovou hmotností,

            účinné od 1. 5. 2004nebo vakuovým odpařením vodného extraktu do sucha a spektroskopickou (IR nebo UV atd.) nebo AAS/ICP analýzou zbytku.

            účinné od 1. 5. 2004Není-li analýza vodné fáze jako takové možná, měl by být vodný extrakt extrahován s vodou nemísitelným organickým rozpouštědlem, např. chlorovaným uhlovodíkem. Rozpouštědlo se poté odpaří a zbytek se analyzuje způsobem popsaným výše pro obsah polymeru. Jakékoliv složky, které jsou identifikovány jako nečistoty nebo přísady se odečtou, aby byl stanoven stupeň rozpustnosti samotného polymeru.

            účinné od 1. 5. 2004Jsou-li přítomny relativně velká množství takových materiálů, může být nezbytné analyzovat zbytek například HPLC nebo GC, aby se odlišily nečistoty od přítomného monomeru nebo derivátů monomeru a aby tak mohl být stanoven skutečný obsah monomeru nebo jeho derivátů.

            účinné od 1. 5. 2004V některých případech může být dostačující pouhé odpaření organického rozpouštědla do sucha a zvážení suchého zbytku.

          1. účinné od 1. 5. 2004XI.1.5.4.2 Zkouška se dvěma různými velikostmi vzorku

            účinné od 1. 5. 2004Všechny vodné extrakty se analyzují na celkový obsah organického uhlíku.

            účinné od 1. 5. 2004Provede se vážkové stanovení nerozpuštěného/neextrahovaného podílu vzorku. Zůstávají-li po odstředění nebo filtraci obsahu každé nádoby usazeny na stěnách nádoby zbytky polymeru, měla by být nádoba oplachována filtrátem, dokud není vyčištěna od všech viditelných zbytků. Poté se filtrát opět odstředí nebo zfiltruje. Zbytky, které zůstanou na filtru nebo v centrifugační kyvetě se vysuší za vakua při 40 °C a zváží. Sušení se provádí do konstantní hmotnosti.

    1. účinné od 1. 5. 2004XI.2 DATA
      1. účinné od 1. 5. 2004XI.2.1 Zkouška s jednou velikostí vzorku

        účinné od 1. 5. 2004Po každou ze tří baněk by měly být uvedeny jednotlivé výsledky a průměrné hodnoty vyjádřené v jednotkách hmotnosti vztažené na objem roztoku (obvykle mg/l) nebo v jednotkách hmotnosti vztažené na hmotnost vzorku polymeru (obvykle mg/g). Kromě toho by měla být uvedena ztráta hmotnosti vzorku (vypočtená jako hmotnost rozpuštěné látky dělená hmotností výchozího vzorku). Měly by být vypočteny relativní směrodatné odchylky (RSD). Měla by být uvedena jednotlivá čísla pro celkovou látku (polymer + hlavní přísady atd.) a pro samotný polymer (tj. po odečtení příspěvku od těchto přísad).

      1. účinné od 1. 5. 2004XI.2.2 Zkouška se dvěma různými velikostmi vzorku

        účinné od 1. 5. 2004Pro každý experiment by měly být uvedeny jednotlivé hodnoty TOC ve vodných extraktech obou trojitých experimentů a průměrné hodnoty vyjádřené v jednotkách hmotnosti vztažené na objem roztoku (obvykle mg C/l) a rovněž v jednotkách hmotnosti vztažené na hmotnost výchozího vzorku (obvykle mg C/g).

        účinné od 1. 5. 2004Není-li mezi výsledky pro vysoké a nízké poměry vzorek/voda rozdíl, může to znamenat, že všechny extrahovatelné složky byly skutečně vyextrahovány. V takovém případě nebývá přímá analýza obvykle nezbytná.

        účinné od 1. 5. 2004Měly by být uvedeny jednotlivé hmotnosti zbytků vyjádřené v procentech výchozích hmotností vzorků. Měly by být vypočteny průměrné hodnoty za celý experiment Rozdíly mezi 100 % a zjištěnými hodnotami v procentech představují množství rozpustného a extrahovatelného materiálu v původním vzorku vyjádřené v procentech.

    1. účinné od 1. 5. 2004XI.3 ZPRÁVY
      1. účinné od 1. 5. 2004XI.3.1 Protokol o zkoušce
        1. účinné od 1. 5. 2004Protokol o zkoušce musí obsahovat následující informace:
          1. účinné od 1. 5. 2004XI.3.1.1 Zkušební látka
            1. účinné od 1. 5. 2004— dostupné informace o zkušební látce (identita, přísady, nečistoty, obsah podílu o nízké molekulové hmotnosti).
          1. účinné od 1. 5. 2004XI.3.1.2 Experimentální podmínky
            1. účinné od 1. 5. 2004— popis použitých postupů a experimentálních podmínek,
            2. účinné od 1. 5. 2004— popis analytických a detekčních metod.
          1. účinné od 1. 5. 2004XI.3.1.3 Výsledky
            1. účinné od 1. 5. 2004— výsledky rozpustnosti/extrahovatelnosti v mg/l; jednotlivé a střední hodnoty pro extrakční zkoušky v různých rozpouštědlech, rozepsané podle obsahu polymeru, nečistot, přísad atd.,
            2. účinné od 1. 5. 2004— výsledky rozpustnosti/extrahovatelnosti v mg/g polymeru,
            3. účinné od 1. 5. 2004— hodnoty TOC ve vodných extraktech, hmotnost rozpuštěné látky a vypočtené procentuální hodnoty (byla-li stanovena),
            4. účinné od 1. 5. 2004— hodnota pH každého vzorku,
            5. účinné od 1. 5. 2004— informace o hodnotách pro slepý pokus,
            6. účinné od 1. 5. 2004— podle potřeby upozornění na chemickou nestabilitu zkušební látky během zkušebních postupů a analytických postupů,
            7. účinné od 1. 5. 2004— všechny informace, které jsou důležité pro interpretaci výsledků.
    1. účinné od 1. 5. 2004XI.4 LITERATURA

      účinné od 1. 5. 2004(1) DIN 53733 (1976) Zerkleinerung von Kunststofferzeugnissen für Prüfzwecke.

účinné od 1. 5. 2004

Příloha č. 2

účinné od 1. 5. 2004 k vyhlášce č. 222/2004 Sb.

účinné od 1. 5. 2004METODY PRO ZKOUŠENÍ VLASTNOSTÍ NEBEZPEČNÝCH PRO ŽIVOTNÍ PROSTŘEDÍúčinné od 1. 5. 2004ČÁST I

  1. účinné od 1. 5. 2004I. METODA PRO STANOVENÍ AKUTNÍ TOXICITY PRO RYBY – metoda C.1 podle přílohy směrnice Komise 92/69/EHS ze dne 31. července 1992, kterou se po sedmnácté přizpůsobuje technickému pokroku směrnice Rady 67/548/EHS o sbližování správních a právních púředpúsů týkajících se klasifikace, balení a označování nebezpečných látek (dále jen „směrnice 92/69/EHS“)
    1. účinné od 1. 5. 2004I.1. METODA
      1. účinné od 1. 5. 2004I.1.1 ÚVOD

        účinné od 1. 5. 2004Účelem této zkoušky je stanovit akutní letální toxicitu látek pro sladkovodní ryby. Pro usnadnění výběru nejvhodnější zkušební metody (statické, semistatické nebo průtokové) s cílem zajistit dostatečně konstantní koncentrace zkušební látky po celou dobu experimentu je žádoucí mít pokud možno k dispozici údaje o rozpustnosti látky ve vodě, o tenzi par, chemické stabilitě, disociačních konstantách a o biologické rozložitelnosti látky.

        účinné od 1. 5. 2004Další informace (např. strukturní vzorec, stupeň čistoty, povaha a podíl významných nečistot v procentech, přítomnost a množství přísad a rozdělovací koeficient n-oktanol/voda) je třeba vzít v úvahu při plánování zkoušky i při interpretaci výsledků.

      1. účinné od 1. 5. 2004I.1.2 DEFINICE A JEDNOTKY

        účinné od 1. 5. 2004Akutní toxicitou se rozumí zřetelný nepříznivý účinek, který je v krátké době (řádově ve dnech) v organismu vyvolán expozicí látce. V této zkoušce se akutní toxicita vyjadřuje prostřednictvím střední letální koncentrace (LC50), tj. takové koncentrace látky ve vodě, která během nepřetržité expozice po určitou dobu způsobí úhyn 50 % jedinců ve zkušební skupině ryb.

        účinné od 1. 5. 2004Všechny koncentrace zkušební látky se udávají v hmotnosti na jednotku objemu (mg·l-1). Mohou se také vyjádřit v hmotnostních podílech (mg·kg-1).

      1. účinné od 1. 5. 2004I.1.3 REFERENČNÍ LÁTKY

        účinné od 1. 5. 2004Zkoušky s referenčními látkami mohou být provedeny s cílem prokázat, že se reakce zkušebních druhů za laboratorních zkušebních podmínek podstatně nezměnila.

        účinné od 1. 5. 2004Referenční látky nejsou pro tuto zkoušku stanoveny.

      1. účinné od 1. 5. 2004I.1.4 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY

        účinné od 1. 5. 2004Může být provedena limitní zkouška s koncentrací 100 mg·l-1, s cílem prokázat, že LC50 je vyšší než tato koncentrace.

        účinné od 1. 5. 2004Ryby se vystaví účinku různým koncentracím zkušební látky přidané do vody po dobu 96 h. Úhyn se zaznamenává nejméně každých 24 h a je-li to možné, vypočtou se při každém pozorování koncentrace, které způsobí úhyn 50 % ryb (LC50).

      1. účinné od 1. 5. 2004I.1.5 KRITÉRIA JAKOSTI

        účinné od 1. 5. 2004Kritéria jakosti se vztahují jak na limitní zkoušku, tak na úplný zkušební postup.

        účinné od 1. 5. 2004Mortalita v kontrolních skupinách nesmí být na konci zkoušky větší než 10 % (nebo jednu rybu, pokud se použije méně než deset ryb).

        účinné od 1. 5. 2004Koncentrace rozpuštěného kyslíku musí být po celou dobu zkoušky vyšší než 60 % hodnoty nasycení vzduchem.

        účinné od 1. 5. 2004Koncentrace zkušební látky nesmí po celou zkoušky klesnout pod 80 % původních hodnot koncentrací.

        účinné od 1. 5. 2004U látek, které se ve zkušebním médiu lehce rozpouštějí a dávají stabilní roztoky, tj. v podstatné míře netěkají, nerozkládají se, nehydrolyzují nebo se neadsorbují, lze počáteční koncentraci pokládat za ekvivalentní s nominální koncentrací. Musí být potvrzeno, že byly koncentrace po celou zkoušku udrženy a že kritéria jakosti byla dodržena.

        účinné od 1. 5. 2004U látek, které

        1. účinné od 1. 5. 2004i) jsou ve zkušebním médiu špatně rozpustné, nebo
        2. účinné od 1. 5. 2004ii) mohou vytvářet stabilní emulze nebo disperse, nebo
        3. účinné od 1. 5. 2004iii) jsou ve vodných roztocích nestabilní,
        4. účinné od 1. 5. 2004musí být počáteční koncentrace brána jako koncentrace naměřená v roztoku (nebo, není-li to technicky možné, ve vodním sloupci) na začátku zkoušky. Koncentrace se stanoví po určité době jejího ustálení, avšak před nasazením testovacích ryb.

        účinné od 1. 5. 2004Ve všech uvedených případech musí být během zkoušky provedena další měření s cílem potvrdit skutečné expoziční koncentrace nebo dodržení kritérií jakosti.

        účinné od 1. 5. 2004pH by se nemá změnit o více než 1.

      1. účinné od 1. 5. 2004I.1.6 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY
        1. účinné od 1. 5. 2004Mohou být použity tři postupy:
          1. účinné od 1. 5. 2004Statická zkouška:

            účinné od 1. 5. 2004Zkouška, při níž zkušební roztok neprotéká. (Roztoky se během celé zkoušky nemění.)

          1. účinné od 1. 5. 2004Semistatická metoda:

            účinné od 1. 5. 2004Zkouška, při níž zkušební roztok neprotéká, ale je pravidelně po delších časových úsecích (např. po 24 h) zcela vyměňován.

          1. účinné od 1. 5. 2004Průtoková metoda:

            účinné od 1. 5. 2004Zkouška toxicity, při níž se voda ve zkušebních nádržích neustále obměňuje, přičemž se zkušební látka přivádí s vodou, kterou se zkušební médium obnovuje.

          1. účinné od 1. 5. 2004I.1.6.1 Činidla
            1. účinné od 1. 5. 2004I.1.6.1.1 Roztoky zkušebních látek

              účinné od 1. 5. 2004Zásobní roztoky o požadované koncentraci se připraví rozpuštěním látky v deionizované vodě nebo ve vodě podle bodu 1.6.1.2.

              účinné od 1. 5. 2004Zvolené zkušební koncentrace se připraví ředěním zásobního roztoku. Jsou-li zkoušeny vysoké koncentrace látky, lze látku rozpustit přímo v ředicí vodě.

              účinné od 1. 5. 2004Látky se obvykle zkouší až do meze jejich rozpustnosti. U některých látek (např. u látek s nízkou rozpustností ve vodě nebo vysokou hodnotou Po/v, nebo u látek, které ve vodě vytvářejí spíše stabilní disperse než pravé roztoky) je možné provést zkoušku při koncentraci vyšší, než je mez rozpustnosti, aby bylo zajištěno, že je dosaženo maximální koncentrace odpovídající maximální rozpustnosti/stabilitě. Je ovšem nutné, aby tato koncentrace jinak nenarušovala zkušební systém (např. vytvořením filmu na hladině bránícímu okysličení vody atd.).

              účinné od 1. 5. 2004Pro přípravu zásobních roztoků látek s nízkou rozpustností ve vodě nebo pro usnadnění rozptýlení látky ve zkušebním médiu lze použít ultrazvukovou dispergaci, organická rozpouštědla či emulgátory nebo dispergátory. Použijí-li se takové pomocné látky, měly by všechny zkušební koncentrace obsahovat stejné množství těchto pomocných látek a stejné koncentraci pomocné látky jako ve zkušebních sériích by měly být exponovány další kontrolní ryby. Koncentrace pomocných látek by měla být minimální a v žádném případě by neměla překročit 100 mg na l zkušebního média.

              účinné od 1. 5. 2004Zkouška se provede bez úpravy pH. Existují-li známky toho, že dochází k výrazné změně pH, doporučuje se zkoušku opakovat s úpravou pH a výsledky zaznamenat. V takovém případě se upraví pH zásobního roztoku na pH vody k ředění, pokud proti tomu neexistuji specifické důvody. Při úpravě pH se dává přednost HCl a NaOH. Úprava pH se provede tak, aby nebyla koncentrace zkušební látky v zásobním roztoku v podstatné míře změněna. Dojde-li úpravou ve zkušebním médiu k chemické reakci nebo ke srážení, skutečnosti se zaznamenají.

            1. účinné od 1. 5. 2004I.1.6.1.2 Voda pro chov ryb a ředění

              účinné od 1. 5. 2004Může být použita pitná voda (nekontaminovaná potenciálně škodlivými koncentracemi chloru, těžkých kovů nebo jiných látek), kvalitní přírodní voda nebo upravená voda (viz doplněk 1). Upřednostňuje se voda o celkové tvrdosti od 10 do 250 mg·l-1 (vztaženo na CaCO3) a pH od 6,0 do 8,5.

          1. účinné od 1. 5. 2004I.1.6.2 Přístroje

            účinné od 1. 5. 2004Veškeré přístroje musí být vyrobeny z chemicky inertního materiálu:

            1. účinné od 1. 5. 2004— systém pro automatické ředění (pro průtokovou metodu),
            2. účinné od 1. 5. 2004— přístroj pro měření koncentrace kyslíku,
            3. účinné od 1. 5. 2004— vybavení pro stanovení tvrdosti vody,
            4. účinné od 1. 5. 2004— vhodný přístroj pro měření teploty,
            5. účinné od 1. 5. 2004— pH-metr.
          1. účinné od 1. 5. 2004I.1.6.3 Testovací ryby

            účinné od 1. 5. 2004Ryby by měly být zdravé a bez zjevných malformací.

            účinné od 1. 5. 2004Použitý druh by měl být zvolen podle praktických kritérií, jako je jejich dostupnost po celý rok, snadný chov, vhodnost pro zkoušení, relativní citlivost k chemickým látkám a jakékoli další významné ekonomické a biologické faktory. Při výběru druhu ryb by měla být také zohledněna potřeba srovnatelnosti získaných dat a mezinárodní harmonizace (1).

            účinné od 1. 5. 2004Seznam doporučených druhů ryb pro provedení této zkoušky je uveden v doplňku 2; dává se přednost druhům danio pruhované a pstruh duhový.

            1. účinné od 1. 5. 2004I.1.6.3.1 Chov
              1. účinné od 1. 5. 2004Ryby by měly pocházet pokud možno z jednoho chovu a měly by být stejné délky a stejného stáří. Ryby musí být chovány nejméně 12 dní v následujících podmínkách:
                1. účinné od 1. 5. 2004Obsádka:

                  účinné od 1. 5. 2004Vhodná vzhledem k metodě (metoda s recirkulací nebo průtoková metoda) a druhu ryb.

                1. účinné od 1. 5. 2004Voda:

                  účinné od 1. 5. 2004Viz 1.6.1.2.

                1. účinné od 1. 5. 2004Osvětlení:

                  účinné od 1. 5. 2004Osvětlení 12 až 16 h denně.

                1. účinné od 1. 5. 2004Koncentrace rozpuštěného kyslíku:

                  účinné od 1. 5. 2004Nejméně 80 % hodnoty nasycení vzdušným kyslíkem.

                1. účinné od 1. 5. 2004Krmení:

                  účinné od 1. 5. 2004Třikrát týdně nebo jednou za den; vysazení krmení 24 h před začátkem zkoušky.

            1. účinné od 1. 5. 2004I.1.6.3.2 Mortalita
              1. účinné od 1. 5. 2004Po 48hodinové aklimatizaci se zaznamená mortalita a použijí se následující kritéria:
                1. účinné od 1. 5. 2004— mortalita vyšší než 10 % populace za 7 dní: celá obsádka ryb se vyřadí,
                2. účinné od 1. 5. 2004— mortalita 5 až 10 % populace: v chovu se pokračuje dalších 7 dní. Nedojde-li k dalším případům úhynu, obsádka se použije, v opačném případě musí být vyřazena,
                3. účinné od 1. 5. 2004— mortalita menší než 5 % populace: obsádka je pro zkoušku použitelná.
          1. účinné od 1. 5. 2004I.1.6.4 Aklimatizace

            účinné od 1. 5. 2004Všechny ryby musí být nejméně na 7 dnů před použitím ve zkoušce nasazeny do vody stejné kvality a stejné teploty, jaká se použije při zkoušce.

          1. účinné od 1. 5. 2004I.1.6.5 Zkušební postup

            účinné od 1. 5. 2004Před vlastní zkouškou může být provedena předběžná zkouška s cílem získat informace o rozsahu koncentrací, které mají být použity v hlavní zkoušce.

            účinné od 1. 5. 2004Kromě sérií zkoušek se provede kontrolní zkouška bez zkušební látky a podle potřeby kontrolní zkouška s pomocnou látkou.

            účinné od 1. 5. 2004V závislosti na fyzikálních a chemických vlastnostech zkušební látky se zvolí statická, semistatická nebo průtoková zkouška, aby byla splněna kritéria jakosti.

            1. účinné od 1. 5. 2004Ryby se exponují zkušební látce za níže uvedených podmínek:
              1. účinné od 1. 5. 2004— délka expozice: 96 h;
              2. účinné od 1. 5. 2004— počet ryb: nejméně 7 na každou koncentraci;
              3. účinné od 1. 5. 2004— nádrže: vhodný objem vzhledem k doporučené obsádce;
              4. účinné od 1. 5. 2004— obsádka: pro statickou a semistatickou zkoušku se doporučuje 1,0 g na litr; v průtokovém systému je přijatelná vyšší obsádka;
              5. účinné od 1. 5. 2004— zkušební koncentrace: nejméně pět koncentrací, které jsou odstupňovány faktorem nepřevyšujícím 2,2 a které pokrývají rozsah mortality od 0 % do 100 %;
              6. účinné od 1. 5. 2004— voda: viz 1.6.1.2;
              7. účinné od 1. 5. 2004— osvětlení: osvětlení 12 až 16 h denně;
              8. účinné od 1. 5. 2004— teplota: podle druhu ryb (doplněk 2), avšak v rámci dané zkoušky kolísající v toleranci ±1 °C;
              9. účinné od 1. 5. 2004— koncentrace rozpuštěného kyslíku: ne nižší než 60 % hodnoty nasycení vzdušným kyslíkem při dané teplotě;
              10. účinné od 1. 5. 2004— krmení: žádné.

            účinné od 1. 5. 2004Ryby se kontrolují po prvních 2 až 4 h a dále nejméně každých 24 h. Ryby se považují za mrtvé, jestliže při dotyku ocasní ploutve nedochází k žádné reakci a nejsou-li patrné žádné dýchací pohyby. Mrtvé ryby se odstraní, jakmile jsou zpozorovány, a úhyn se zaznamená.

            účinné od 1. 5. 2004Zaznamenají se všechny zjevné abnormality (např. ztráta rovnováhy, změny v plavání, chování, v dýchací funkci, v pigmentaci atd.).

            účinné od 1. 5. 2004Měření pH, obsahu rozpuštěného kyslíku a teploty se provádí denně.

            účinné od 1. 5. 2004Limitní zkouška

            účinné od 1. 5. 2004S využitím postupů popsaných v této metodě může být provedena limitní zkouška s koncentrací 100 mg·l-1 s cílem prokázat, že LC50 je vyšší než tato koncentrace.

            účinné od 1. 5. 2004Je-li povaha zkušební látky taková, že ve vodě nelze dosáhnout koncentrace 100 mg·l-1, provede se limitní zkouška při koncentraci odpovídající rozpustnosti této látky v použitém médiu (nebo při maximální koncentraci, kdy látka vytváří stabilní disperzi) (viz také bod 1.6.1.1).

            účinné od 1. 5. 2004Limitní zkouška se provede se 7 až 10 rybami a se stejným počtem ryb v kontrole (kontrolách). (Podle teorie binomického rozdělení je při použití 10 ryb a při nulové mortalitě 99,9% pravděpodobnost, že je LC50 větší než 100 mg·l-1. Při 7, 8 nebo 9 rybách znamená nulová mortalita nejméně 99% pravděpodobnost, že je LC50 větší než koncentrace použitá v limitní zkoušce.)

            účinné od 1. 5. 2004Dojde-li k úhynům, musí se provést celá studie. Jsou-li pozorovány subletální účinky, zaznamenají se.

    1. účinné od 1. 5. 2004I.2 DATA A HODNOCENÍ

      účinné od 1. 5. 2004Na pravděpodobnostní logaritmický papír se pro každé období, kdy byla prováděna pozorování (24, 48, 72 a 96 h), vynese pro každou expoziční dobu mortalita v procentech proti koncentraci.

      účinné od 1. 5. 2004Pokud je to možné, odhadnou se standardními postupy pro každou délku expozice hodnoty LC50 a meze spolehlivosti (p = 0,05); tyto hodnoty se zaokrouhlí na jednu, nebo nejvýše na dvě platné číslice (příklad zaokrouhlení na dvě platné číslice: 173,5 se zaokrouhlí na 170, 0,127 na 0,13, 1,21 na 1,2).

      účinné od 1. 5. 2004V případech, kdy je sklon křivky závislosti mortality v procentech na koncentraci látky příliš strmý, aby umožnil výpočet hodnoty LC50, postačuje grafický odhad této hodnoty.

      účinné od 1. 5. 2004Jestliže dvě po sobě jdoucí koncentrace lišící se faktorem 2,2 vyvolají mortalitu 0 a 100 %, jsou dostatečnou informací o tom, že se LC50 nachází mezi těmito hodnotami.

      účinné od 1. 5. 2004Zjistí-li se, že není možné udržet stabilitu nebo homogenitu zkušební látky, uvede se to ve zprávě a výsledky se interpretují s opatrností.

    1. účinné od 1. 5. 2004I.3 ZPRÁVY
      1. účinné od 1. 5. 2004Protokol o zkoušce má pokud možno obsahovat následující údaje:
        1. účinné od 1. 5. 2004— údaje o testovacích rybách (vědecký název, kmen, dodavatel, veškerá předchozí ošetření, velikost a počet ryb použitých při každé zkušební koncentraci);
        2. účinné od 1. 5. 2004— zdroj ředicí vody a hlavní chemické charakteristiky (pH, tvrdost, teplota);
        3. účinné od 1. 5. 2004— u látek s malou rozpustností ve vodě údaj o metodě přípravy zásobních a zkušebních roztoků;
        4. účinné od 1. 5. 2004— koncentrace všech pomocných látek;
        5. účinné od 1. 5. 2004— přehled použitých koncentrací a veškeré dostupné informace o stabilitě zkušební látky ve zkušebním roztoku při použitých koncentracích;
        6. účinné od 1. 5. 2004— jestliže byly provedeny chemické analýzy, údaje o použitých metodách a získané výsledky;
        7. účinné od 1. 5. 2004— výsledek limitní zkoušky, pokud byla provedena;
        8. účinné od 1. 5. 2004— důvody pro volbu použitého zkušebního postupu a podrobnosti o něm (např. statický, semistatický, dávkování, průtoková rychlost, zda byla voda provzdušňována obsádka ryb atd.);
        9. účinné od 1. 5. 2004— popis zkušebního zařízení;
        10. účinné od 1. 5. 2004— světelný režim;
        11. účinné od 1. 5. 2004— koncentrace rozpuštěného kyslíku, hodnoty pH, teplota zkušebních roztoků každých 24 h;
        12. účinné od 1. 5. 2004— důkaz, že byla splněna kritéria jakosti;
        13. účinné od 1. 5. 2004— tabulka kumulativních hodnot mortality při každé koncentraci a při kontrolní zkoušce (a popřípadě při kontrolní zkoušce s pomocnou látkou) při každé z doporučených dob pozorování;
        14. účinné od 1. 5. 2004— graf křivky závislosti účinku, vyjádřeného v procentech, na koncentraci na konci zkoušky;
        15. účinné od 1. 5. 2004— podle možnosti hodnoty LC50 při každé z doporučených dob pozorování (při 95% intervalu spolehlivosti);
        16. účinné od 1. 5. 2004— použité statistické metody stanovení hodnot LC50;
        17. účinné od 1. 5. 2004— při použití referenční látky a údaj o získaných výsledcích;
        18. účinné od 1. 5. 2004— nejvyšší zkušební koncentrace, která nevyvolala za dobu zkoušky úhyn ryb;
        19. účinné od 1. 5. 2004— nejnižší zkušební koncentrace, která vyvolala za dobu zkoušky 100 % mortalitu.
    1. účinné od 1. 5. 2004I.4 LITERATURA

      účinné od 1. 5. 2004(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 203, Decision of the Council C(81) 30 final and updates.

      účinné od 1. 5. 2004(2) AFNOR – Determination of the acute toxicity of a substance to Brachydanio rerio - Static and Flow Through methods – NFT 90-303, June 1985.

      účinné od 1. 5. 2004(3) AFNOR – Determination of the acute toxicity of a substance to Salmo gairdneri – Static and Flow–Through methods – NFT 90-305, June 1985.

      účinné od 1. 5. 2004(4) ISO 7346/1, /2, /3 – Water Quality – Determination of the acute lethal toxicity of substances to a fresh water fish (Brachydanio rerio Hamilton –Buchanan – Teleostei, Cyprinidae). Part 1: Static method. Part: Semi-static method. Part 3: Flow-through method.

      účinné od 1. 5. 2004(5) Eidgenössisches Department des Innern, Schweiz: Richtlinien für Probenahme und Normung von Wasseruntersuchungsmethoden – Part II 1974.

      účinné od 1. 5. 2004(6) DIN Testverfahren mit Wasserorganismen, 38 412 (L1) und L (15).

      účinné od 1. 5. 2004(7) JIS K 0102, Acute toxicity test for fish.

      účinné od 1. 5. 2004(8) NEN 6506 – Water – Bepaling van de akute toxiciteit met behulp van Poecilia reticulata, 1980.

      účinné od 1. 5. 2004(9) Environmental Protection Agency, Methods for the acute toxicity tests with fish, macroinvertebrates and amphibians. The Committee on Methods for Toxicity Tests with Aquatic Organisms, Ecological Research Series EPA-660-75-009, 1975.

      účinné od 1. 5. 2004(10) Environmental Protection Agency, Environmental monitoring and support laboratory, Office of Research and Development, EPA-600/4-78-012, January 1978.

      účinné od 1. 5. 2004(11) Environmental Protection Agency, Toxic Substance Control, Part IV, 16 March 1979.

      účinné od 1. 5. 2004(12) Standard methods for the examination of water and wastewater, 14th ed., APHA-AWWA-WPCF, 1975.

      účinné od 1. 5. 2004(13) Commission of the European Communities, Inter-laboratory test programme concerning the study of the ecotoxicity of a chemical substance with respect to the fish. EEC Study D.8368, 22 March 1979.

      účinné od 1. 5. 2004(14) Verfahrensvorschlag des Umweltbundesamtes zum akuten Fisch-Test. Rudolph, P., Boje, R. Ökotoxikologie, Grundlagen für die ökotoxikologische Bewertung von Umweltchemikalien nach dem Chemikaliengesetz, ecomed 1986.

      účinné od 1. 5. 2004(15) Litchfield, J. T., Wilcoxon, F. A simplified method for evaluating dose effects experiments. J. Pharm, Exp. Therap., 1949, 96, 99.

      účinné od 1. 5. 2004(16) Finney, D. J. Statistical Methods in Biological Assay. Griffin, Weycombe, U.K., 1978.

      účinné od 1. 5. 2004(17) Sprague, J. B. Measurement of pollutant toxicity to fish. Bioassay methods for acute toxicity. Water Res., 1969, 3, 793-821.