Platné znění

Vyhláška, kterou se u chemických látek a chemických přípravků stanoví základní metody pro zkoušení fyzikálně-chemických vlastností, výbušných vlastností a vlastností nebezpečných pro životní prostředí

účinné od 1. 5. 2004(18) Sprague, J. B. Measurement of pollutant toxicity to fish. II Utilising and applying bioassay results. Water Res. 1970, 4, 3-32.

účinné od 1. 5. 2004(19) Stephan, C. E. Methods for calculating an LC50. In Aquatic Toxicology and Hazard Evaluation (F. I. Mayer, J. L. Hamelink (eds.)). American Society for Testing and Materials, ASTM STP 634, 1977, 65-84.

účinné od 1. 5. 2004(20) Stephan, C. E., Busch, K. A., Smith, R., Burke, J., Andrews, R. W. A computer program for calculating an LC50. US EPA.

účinné od 1. 5. 2004DODATEK 1

účinné od 1. 5. 2004Upravená voda

účinné od 1. 5. 2004Příklad vhodné ředicí vody

účinné od 1. 5. 2004Všechny chemikálie musí být čistoty p.a.

účinné od 1. 5. 2004Voda musí být kvalitní destilovaná nebo deionizovaná s vodivostí menší než 5 μS·cm–1.

účinné od 1. 5. 2004Destilační přístroj nesmí obsahovat žádné měděné části.

účinné od 1. 5. 2004Zásobní roztoky:

účinné od 1. 5. 2004
DODATEK 1 Upravená voda
CaCl2·2H2O (chlorid vápenatý dihydrát) se rozpustí ve vodě a doplní vodou na 1 litr.11,76 g
MgSO4·7H2O (síran hořečnatý heptahydrát) se rozpustí ve vodě a doplní vodou na 1 litr.4,93 g
NaHCO3 (hydrogenuhličitan sodný) se rozpustí ve vodě a doplní vodou na 1 litr.2,59 g
KCl (chlorid draselný) se rozpustí ve vodě a doplní vodou na 1 litr.0,23 g

účinné od 1. 5. 2004Upravená ředicí voda

účinné od 1. 5. 2004Smísí se po 25 ml všech čtyř zásobních roztoků a doplní vodou na 1 litr.

účinné od 1. 5. 2004Provzdušňuje se, dokud koncentrace rozpuštěného kyslíku neodpovídá koncentraci nasycení vzdušným kyslíkem.

účinné od 1. 5. 2004pH musí být 7,8 ± 0,2.

účinné od 1. 5. 2004Podle potřeby se pH upraví pomocí NaOH (hydroxid sodný) nebo HCl (kyselina chlorovodíková).

účinné od 1. 5. 2004Tato ředicí voda se nechá 12 h stát a nesmí být dále provzdušňována.

účinné od 1. 5. 2004Koncentrace úhrnu iontů Ca a Mg v tomto roztoku je 2,5 mmol·l–1. Poměr množství iontů Ca : Mg je 4 : 1 a poměr množství iontů Na : K je 10 : 1. Celková koncentrace alkalických kovů v tomto roztoku je 0,8 mmol·l–1.

  1. účinné od 1. 5. 2004Jakákoli odchylka v přípravě vody k ředění nesmí změnit složení ani vlastnosti vody.

účinné od 1. 5. 2004DODATEK 2

účinné od 1. 5. 2004Druhy ryb doporučené pro zkoušení

účinné od 1. 5. 2004
DODATEK 1 Upravená voda DODATEK 2 Druhy ryb doporučené pro zkoušení
Doporučený druhDoporučený rozsah
teplot při zkoušce
(°C)		Doporučená
celková délka ryb
(cm)
Brachydanio rerio (Teleostei, Cyprinidae)
 (Hamilton - Buchanan), danio pruhované		20 až 243,0 ± 0,5
Pimephales promelas (Teleostei, Cyprinidae)
 (Rafinesque), střevle		20 až 245,0 ± 2,0
Cyprinus carpio (Teleostei Cyprinidae)
 (Linneanus 1758), kapr obecný		20 až 246,0 ± 2,0
Oryzias latipes (Teleostei, Poeciliidae)
 (Tomminck a Schlegel 1850), halančík japonský		20 až 243,0 ± 1,0
Poecilia reticulata (Teleostei, Poeciliidae)
 (Peters 1859), živorodka duhová		20 až 243,0 ± 1,0
Lepomis macrochirus (Teleostei, Centrarchidae)
(Rafinesque, Linneanus 1758), slunečnice modrá		20 až 245,0 ± 2,0
Onchorhynchus mykiss (Teleostei, Salmonidae)
 (Walbaum 1988), pstruh duhový		12 až 176,0 ± 2,0
Leuciscus idus (Teleostei, Cyprinidae)
(Linneanus 1758), jelec jesen		20 až 246,0 ± 2,0
  1. účinné od 1. 5. 2004Opatřování ryb
    1. účinné od 1. 5. 2004Ryby uvedené v seznamu se snadno chovají nebo jsou dobře dostupné po celý rok. Lze je množit a chovat buď v rybích farmách, nebo v laboratoři za kontrolovaných zdravotních a parazitologických podmínek tak, aby ryby byly zdravé a byly známého původu. Tyto ryby jsou dostupné v mnoha částech světa.

účinné od 1. 5. 2004DODATEK 3

účinné od 1. 5. 2004Příklad křivky závislosti úmrtnosti, vyjádřené v procentech, na koncentraci

  1. účinné od 1. 5. 2004Příklad stanovení LC50 na pravděpodobnostním logaritmickém papíru
    účinné od 1. 5. 2004Obrázek
  1. účinné od 1. 5. 2004II. METODA PRO STANOVENÍ AKUTNÍ TOXICITY PRO DAFNIE – metoda C.2 podle přílohy směrnice 92/69/EHS
    1. účinné od 1. 5. 2004II.1 METODA
      1. účinné od 1. 5. 2004II.1.1 ÚVOD

        účinné od 1. 5. 2004Účelem této zkoušky je stanovit střední účinnou koncentraci látky pro imobilizaci (EC50) dafnií ve sladkovodním prostředí. Před započetím zkoušky je žádoucí mít pokud možno k dispozici údaje o rozpustnosti látky ve vodě, o tenzi par, chemické stabilitě, disociačních konstantách a o biologické rozložitelnosti látky.

        účinné od 1. 5. 2004Další informace (např. strukturní vzorec, stupeň čistoty, povaha a podíl významných nečistot v procentech, přítomnost a množství přísad a rozdělovací koeficient n-oktanol/voda) je třeba vzít v úvahu při plánování zkoušky i při interpretaci výsledků.

      1. účinné od 1. 5. 2004II.1.2 DEFINICE A JEDNOTKY

        účinné od 1. 5. 2004Požadavek směrnice stanovit LC50 pro dafnie se považuje za splněný stanovením EC50, jak je popsáno v této zkušební metodě.

        účinné od 1. 5. 2004Akutní toxicita se v této zkoušce vyjadřuje střední účinnou koncentrací látky pro imobilizaci (EC50) dafnií. Je to koncentrace (rozumí se výchozí koncentrace), která během nepřetržité expozice po určitou stanovenou dobu imobilizuje 50 % dafnií ve zkušební skupině během doby působení (doby expozice).

        účinné od 1. 5. 2004Imobilizace:

        účinné od 1. 5. 2004Dafnie, které nejsou schopné do 15 s po lehkém zatřepání zkušební nádrží začít plavat, se považují za imobilizované.

        účinné od 1. 5. 2004Všechny koncentrace zkušební látky se udávají v hmotnosti na jednotku objemu (mg·l-1). Mohou se také vyjádřit v hmotnostních podílech (mg·kg-1).

      1. účinné od 1. 5. 2004II.1.3 REFERENČNÍ LÁTKY

        účinné od 1. 5. 2004Zkoušky s referenčními látkami mohou být provedeny s cílem prokázat, že se reakce zkušebních druhů za laboratorních zkušebních podmínek podstatně nezměnila.

        účinné od 1. 5. 2004Souhrn výsledků okružního testu laboratoří EHS s použitím čtyř různých látek je uveden v doplňku 2.

      1. účinné od 1. 5. 2004II.1.4 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY

        účinné od 1. 5. 2004Může být provedena limitní zkouška s koncentrací 100 mg·l-1, s cílem prokázat, že EC50 je vyšší než tato koncentrace.

        účinné od 1. 5. 2004Dafnie se 48 h exponují zkušební látce přidané v různých koncentracích do vody. Použije-li se kratší doba, zdůvodní se ve zprávě.

        účinné od 1. 5. 2004Za jinak stejných experimentálních podmínek a v přiměřeném rozmezí koncentrací zkušební látky působí různé koncentrace zkušební látky na schopnost plavání dafnií rozdílně. Různé koncentrace mají za následek skutečnost, že na konci zkoušky ztrácí různý procentuální podíl dafnií schopnost plavat. Koncentrace, které nezpůsobují žádnou imobilizaci nebo způsobují 100% imobilizaci, se zjistí přímo pozorováním, zatímco hodnota 48hodinová EC50 se stanoví podle možnosti výpočtem.

        účinné od 1. 5. 2004Při této metodě se používá statický systém, zkušební roztoky se tedy během doby expozice neobnovují.

      1. účinné od 1. 5. 2004II.1.5. KRITÉRIA JAKOSTI

        účinné od 1. 5. 2004Kritéria jakosti se vztahují jak na limitní zkoušku, tak na úplný zkušební postup.

        účinné od 1. 5. 2004Imobilizace v kontrolních zkouškách nesmí být na konci zkoušky větší než 10 %.

        účinné od 1. 5. 2004Dafnie se v kontrolních zkouškách nesmí trvale zdržovat u hladiny.

        účinné od 1. 5. 2004Koncentrace rozpuštěného kyslíku ve zkušební nádrži musí být po celou dobu zkoušky vyšší než 3 mg·l-1. Koncentrace kyslíku však nesmí v žádném případě klesnout pod 2 mg·l-1.

        účinné od 1. 5. 2004Koncentrace zkušební látky nesmí po celou zkoušky klesnout pod 80 % původní hodnoty koncentrace.

        účinné od 1. 5. 2004U látek, které se ve zkušebním médiu lehce rozpouštějí a dávají stabilní roztoky, tj. v podstatné míře netěkají, nerozkládají se, nehydrolyzují nebo se neadsorbují, lze počáteční koncentraci pokládat za ekvivalentní s nominální koncentrací. Musí být potvrzeno, že byly koncentrace po celou zkoušku udrženy a že kritéria jakosti byla dodržena.

        1. účinné od 1. 5. 2004U látek, které
          1. účinné od 1. 5. 2004i) jsou ve zkušebním médiu špatně rozpustné, nebo
          2. účinné od 1. 5. 2004ii) mohou vytvářet stabilní emulze nebo disperse, nebo
          3. účinné od 1. 5. 2004iii) jsou ve vodných roztocích nestabilní,
          4. účinné od 1. 5. 2004musí být počáteční koncentrace brána jako koncentrace naměřená v roztoku (nebo, není-li to technicky možné, ve vodním sloupci) na začátku zkoušky. Koncentrace se stanoví po určité době jejího ustálení, avšak před nasazením testovacích organismů.

        účinné od 1. 5. 2004Ve všech uvedených případech musí být během zkoušky provedena další měření s cílem potvrdit skutečné expoziční koncentrace nebo dodržení kritérií jakosti.

        účinné od 1. 5. 2004pH by se nemělo změnit o více než 1.

      1. účinné od 1. 5. 2004II.1.6 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY
        1. účinné od 1. 5. 2004II.1.6.1 Činidla
          1. účinné od 1. 5. 2004II.1.6.1.1 Roztoky zkušebních látek

            účinné od 1. 5. 2004Zásobní roztoky o požadované koncentraci se připraví rozpuštěním látky v deionizované vodě nebo ve vodě podle bodu 1.6.1.2.

            účinné od 1. 5. 2004Zvolené zkušební koncentrace se připraví ředěním zásobního roztoku. Jsou-li zkoušeny vysoké koncentrace látky, lze látku rozpustit přímo v ředicí vodě.

            účinné od 1. 5. 2004Látky se obvykle zkoušejí až do meze jejich rozpustnosti. U některých látek (např. u látek s nízkou rozpustností ve vodě nebo vysokou hodnotou Po/v, nebo u látek, které ve vodě vytvářejí spíše stabilní disperse než pravé roztoky) je možné provést zkoušku při koncentraci vyšší, než je mez rozpustnosti, aby bylo zajištěno, že je dosaženo maximální koncentrace odpovídající maximální rozpustnosti/stabilitě. Je ovšem nutné, aby tato koncentrace jinak nenarušovala zkušební systém (např. vytvořením filmu na hladině bránícímu okysličení vody atd.).

            účinné od 1. 5. 2004Pro přípravu zásobních roztoků látek s nízkou rozpustností ve vodě nebo pro usnadnění rozptýlení látky ve zkušebním médiu lze použít ultrazvukovou dispergaci, organická rozpouštědla či emulgátory nebo dispergátory. Použijí-li se takové pomocné látky, měly by všechny zkušební koncentrace obsahovat stejné množství těchto pomocných látek a stejné koncentraci pomocné látky jako ve zkušebních sériích by měly být exponovány další kontrolní dafnie. Koncentrace pomocných látek by měly být minimální a v žádném případě by neměla překročit 100 mg/l zkušebního média.

            účinné od 1. 5. 2004Zkouška se provede bez úpravy pH. Existují-li známky toho, že dochází k výrazné změně pH, doporučuje se zkoušku opakovat s úpravou pH a výsledky zaznamenat. V takovém případě se upraví pH zásobního roztoku na pH vody k ředění, pokud proti tomu neexistuji specifické důvody. Při úpravě pH se dává přednost HCl a NaOH. Úprava pH se provede tak, aby nebyla koncentrace zkušební látky v zásobním roztoku v podstatné míře změněna. Dojde-li úpravou ve zkušebním médiu k chemické reakci nebo ke srážení, skutečnosti se zaznamenají ve zprávě.

          1. účinné od 1. 5. 2004II.1.6.1.2 Zkušební voda

            účinné od 1. 5. 2004Pro tuto zkoušku se použije upravená voda (viz doplněk 1 a odkaz (2): ISO 6341).

            účinné od 1. 5. 2004Aby nebylo nutné aklimatizovat dafnie před zkouškou, doporučuje se, aby byla voda pro kultivaci podobné jakosti (pH, tvrdost), jako voda pro zkoušku.

        1. účinné od 1. 5. 2004II.1.6.2 Přístroje
          1. účinné od 1. 5. 2004Použijí se běžné laboratorní přístroje a zařízení. Zařízení, které přijde do styku se zkušebními roztoky, by mělo být nejlépe skleněné:
            1. účinné od 1. 5. 2004— přístroj pro měření koncentrace kyslíku (s mikroelektrodou, nebo jiný vhodný přístroj na měření koncentrace rozpuštěného kyslíku ve vzorcích malého objemu),
            2. účinné od 1. 5. 2004— vhodný přístroj pro měření teploty,
            3. účinné od 1. 5. 2004— pH-metr,
            4. účinné od 1. 5. 2004— vybavení pro stanovení tvrdosti vody.
        1. účinné od 1. 5. 2004II.1.6.3 Testovací organismy

          účinné od 1. 5. 2004Přednost se dává druhu Daphnia magna, ačkoliv se připouští také druh Daphnia pulex. Testovací dafnie musí být na začátku zkoušky mladší než 24 h, musí být laboratorně odchované, bez zjevných nemocí a musí být známého původu (např. chov, předchozí ošetření, atd.).

        1. účinné od 1. 5. 2004II.1.6.4 Zkušební postup

          účinné od 1. 5. 2004Před vlastní zkouškou může být provedena předběžná zkouška s cílem získat informace o rozsahu koncentrací, které mají být použity v hlavní zkoušce.

          účinné od 1. 5. 2004Kromě sérií zkoušek se provede kontrolní zkouška bez zkušební látky a podle potřeby kontrolní zkouška s pomocnou látkou.

          1. účinné od 1. 5. 2004Dafnie se exponují zkušební látce následujícím způsobem:
            1. účinné od 1. 5. 2004— délka expozice: 48 h,
            2. účinné od 1. 5. 2004— počet dafnií: nejméně 20 na každou zkušební koncentraci, nejlépe rozdělených na čtyři skupiny po pěti dafniích nebo na dvě skupiny po 10 dafniích,
            3. účinné od 1. 5. 2004— obsádka: na každou dafnii by měly připadat 2 ml zkušebního roztoku,
            4. účinné od 1. 5. 2004— zkušební koncentrace: zkušební roztok se připraví bezprostředně před nasazením dafnií, nejlépe bez použití jiného rozpouštědla než vody. Připraví se koncentrace tvořící geometrickou řadu, přičemž poměr mezi koncentracemi nesmí být vyšší než 2,2. Zároveň s kontrolami se zkoušejí koncentrace dostatečné pro to, aby po 48 h vyvolaly nulovou nebo a 100% imobilizaci, a dále mezilehlé koncentrace umožňující výpočet 48hodinové EC50,
            5. účinné od 1. 5. 2004— voda: viz 1.6.1.2,
            6. účinné od 1. 5. 2004— osvětlení: střídání světla a tmy je libovolné,
            7. účinné od 1. 5. 2004— teplota: zkušební teplota by měla být 18 až 22 °C, avšak v rámci dané zkoušky kolísající v tomto rozmezí maximálně o ±1 °C,
            8. účinné od 1. 5. 2004— provzdušňování: zkušební roztok nesmí být provzdušňován probubláváním,
            9. účinné od 1. 5. 2004— krmení: žádné.

          účinné od 1. 5. 2004Měření pH a obsahu rozpuštěného kyslíku v kontrolních skupinách a u všech zkušebních koncentrací se provede na konci zkoušky; pH zkušebního roztoku nesmí být měněno.

          účinné od 1. 5. 2004Těkavé sloučeniny se zkoušejí v hermeticky uzavřených nádobách naplněných po okraj, dostatečně velkých, aby nedošlo k nedostatku kyslíku.

          účinné od 1. 5. 2004Prohlídka dafnií se provede nejpozději po 24 h a znovu po 48 h.

          1. účinné od 1. 5. 2004Limitní zkouška
            1. účinné od 1. 5. 2004S využitím postupů popsaných v této metodě může být provedena limitní zkouška s koncentrací 100 mg·l-1 s cílem prokázat, že EC50 je vyšší než tato koncentrace.
            2. účinné od 1. 5. 2004Je-li povaha zkušební látky taková, že ve vodě nelze dosáhnout koncentrace 100 mg·l-1, provede se limitní zkouška při koncentraci odpovídající rozpustnosti této látky v použitém médiu (nebo při maximální koncentraci, kdy látka vytváří stabilní disperzi) (viz také bod 1.6.1.1).
            3. účinné od 1. 5. 2004Limitní zkouška se provede s 20 dafniemi rozdělenými do dvou nebo čtyř skupin a se stejným počtem v kontrolní skupině (v kontrolních skupinách). Dojde-li k imobilizaci, musí se provést celá studie.
    1. účinné od 1. 5. 2004II.2 DATA A HODNOCENÍ

      účinné od 1. 5. 2004Na pravděpodobnostní logaritmický papír se pro každé období, kdy byla prováděna pozorování (24 a 48 h), vynese mortalita v procentech proti koncentraci.

      účinné od 1. 5. 2004Pokud je to možné, odhadnou se pro každé pozorovací období EC50 a meze spolehlivosti (p = 0,05); tyto hodnoty se zaokrouhlí na jednu, nebo nejvýše na dvě platné číslice (příklad zaokrouhlení na dvě platné číslice: 173,5 se zaokrouhlí na 170, 0,127 na 0,13, 1,21 na 1,2).

      účinné od 1. 5. 2004V případech, kdy je sklon křivky závislosti mortality v procentech na koncentraci látky příliš strmý, aby umožnil výpočet hodnoty EC50, postačuje grafický odhad této hodnoty.

      účinné od 1. 5. 2004Jestliže dvě po sobě jdoucí koncentrace lišící se faktorem 2,2 vyvolají nulovou a 100% imobilizaci, jsou dostatečnou informací o rozpětí, ve kterém EC50 leží.

      účinné od 1. 5. 2004Zjistí-li se, že není možné udržet stabilitu nebo homogenitu zkušební látky, uvede se to ve zprávě a výsledky se interpretují s opatrností.

    1. účinné od 1. 5. 2004II.3 ZPRÁVY
      1. účinné od 1. 5. 2004Protokol o zkoušce má pokud možno obsahovat následující údaje:
        1. účinné od 1. 5. 2004— údaje o testovacím organismu (vědecký název, kmen, dodavatel nebo původ, veškerá předchozí ošetření, metoda chovu – včetně původu, druhu a množství potravy, frekvence krmení);
        2. účinné od 1. 5. 2004— zdroj ředicí vody a hlavní chemické charakteristiky (pH, teplota, tvrdost);
        3. účinné od 1. 5. 2004— u látek s malou rozpustností ve vodě údaj o metodě přípravy zásobních a zkušebních roztoků;
        4. účinné od 1. 5. 2004— koncentrace všech pomocných látek;
        5. účinné od 1. 5. 2004— přehled použitých koncentrací a veškeré dostupné informace o stabilitě zkušební látky ve zkušebním roztoku při použitých koncentracích;
        6. účinné od 1. 5. 2004— jestliže byly provedeny chemické analýzy, údaje o použitých metodách a získané výsledky;
        7. účinné od 1. 5. 2004— výsledek limitní zkoušky, pokud byla provedena;
        8. účinné od 1. 5. 2004— popis zkušebního zařízení;
        9. účinné od 1. 5. 2004— světelný režim;
        10. účinné od 1. 5. 2004— koncentrace rozpuštěného kyslíku, hodnoty pH, teplota zkušebních roztoků;
        11. účinné od 1. 5. 2004— důkaz, že byla splněna kritéria jakosti;
        12. účinné od 1. 5. 2004— tabulka kumulativních hodnot imobility při každé koncentraci a při kontrolní zkoušce (a popřípadě při kontrolní zkoušce s pomocnou látkou) při každé z doporučených dob pozorování (24 a 48 h);
        13. účinné od 1. 5. 2004— graf křivky závislosti účinku, vyjádřeného v procentech, na koncentraci na konci zkoušky;
        14. účinné od 1. 5. 2004— podle možnosti hodnoty EC50 při každé z doporučených dob pozorování (při 95% intervalu spolehlivosti)
        15. účinné od 1. 5. 2004— použité statistické metody stanovení hodnot EC50;
        16. účinné od 1. 5. 2004— při použití referenční látky údaj o získaných výsledcích;
        17. účinné od 1. 5. 2004— nejvyšší zkušební koncentrace, která nevyvolala za dobu zkoušky imobilizaci;
        18. účinné od 1. 5. 2004— nejnižší zkušební koncentrace, která vyvolala za dobu zkoušky 100% imobilizaci.
    1. účinné od 1. 5. 2004II.4 LITERATURA

      účinné od 1. 5. 2004(1) OECD, Paris, 1981, Test Guidelines 202, Decision of the Council C(81) 30 final and updates.

      účinné od 1. 5. 2004(2) International Standard ISO, Water Quality – Determination of inhibition of mobility of Daphnia magna Straus, ISO 6341-1989.

      účinné od 1. 5. 2004(3) AFNOR Inhibition of mobility of Daphnia magna Straus (Cladocera – crustacea) NFT 90 301 (January 1983).

      účinné od 1. 5. 2004(4) Verfahrensvorschlag des Umweltbundesamtes zum akuten Daphnien-Test. Rudolph, P., Boje, R. Ökotoxikologie, Grundlagen für die ökotoxikologische Bewertung von Umweltchemikalien nach dem Chemikaliengesetz, ecomed 1986.

      účinné od 1. 5. 2004(5) DIN Testverfahren mit Wasserorganismen 38412 (L1) und (L11).

      účinné od 1. 5. 2004(6) Finney, D. J. Statistical Methods in Biological Assay. Griffin, Weycombe, U.K., 1978.

      účinné od 1. 5. 2004(7) Litchfield, J. T., Wilcoxon, F. A simplified method of evaluating dose-effect experiments. J. Pharmacol. Exper. Ther., 1949, 96, 99-113.

      účinné od 1. 5. 2004(8) Sprague, J. B. Measurement of pollutant toxicity to fish. I Bioassay methods for acute toxicity. Water Res., 1969, 3, 793-821.

      účinné od 1. 5. 2004(9) Sprague, J. B. Measurement of pollutant toxicity to fish. II Utilising and applying bioassay results. Water Res. 1970, 4, 3-32.

      účinné od 1. 5. 2004(10) Stephan, C. E. Methods for calculating an LC50. In Aquatic Toxicology and Hazard Evaluation (F. I. Mayer, J. L. Hamelink (eds.)). American Society for Testing and Materials. ASTM, 1977, STP 634, 65-84.

      účinné od 1. 5. 2004(11) Stephan, C. E., Busch, K. A., Smith, R., Burke, J., Andrews, R. W. A computer program for calculating an LC50. US EPA.

    účinné od 1. 5. 2004DODATEK 1

    účinné od 1. 5. 2004Upravená voda

    účinné od 1. 5. 2004Příklad vhodné ředicí vody (podle ISO 6341)

    účinné od 1. 5. 2004Všechny chemikálie musí být čistoty p.a.

    účinné od 1. 5. 2004Voda musí být kvalitní destilovaná nebo deionizovaná s vodivostí menší než 5 μS·cm-1.

    účinné od 1. 5. 2004Destilační přístroj nesmí obsahovat žádné měděné části.

    1. účinné od 1. 5. 2004Zásobní roztoky:
      účinné od 1. 5. 2004
      DODATEK 1 Upravená voda DODATEK 2 Druhy ryb doporučené pro zkoušení DODATEK 3 Příklad křivky závislosti úmrtnosti, vyjádřené v procentech, na koncentraci DODATEK 1 Upravená voda
      CaCl2·2H2O (chlorid vápenatý dihydrát)
      se rozpustí ve vodě a doplní vodou na 1 litr.      		11,76 g
      MgSO4·7H2O (síran hořečnatý heptahydrát)
      se rozpustí ve vodě a doplní vodou na 1 litr.      		4,93 g
      NaHCO3 (hydrogenuhličitan sodný)
      se rozpustí ve vodě a doplní vodou na 1 litr.      		2,59 g
      KCl (chlorid draselný)
      se rozpustí ve vodě a doplní vodou na 1 litr.      		0,23 g

    účinné od 1. 5. 2004Upravená ředicí voda

    účinné od 1. 5. 2004Smísí se po 25 ml všech čtyř zásobních roztoků a doplní vodou na 1 litr.

    účinné od 1. 5. 2004Provzdušňuje se, dokud koncentrace rozpuštěného kyslíku neodpovídá koncentraci nasycení vzdušným kyslíkem.

    účinné od 1. 5. 2004pH musí být 7,8 ± 0,2.

    účinné od 1. 5. 2004Podle potřeby se pH upraví pomocí NaOH (hydroxid sodný) nebo HCl (kyselina chlorovodíková).

    účinné od 1. 5. 2004Tato ředicí voda se nechá 12 h stát a nemusí být dále provzdušňována.

    účinné od 1. 5. 2004Koncentrace úhrnu iontů Ca a Mg v tomto roztoku je 2,5 mmol·l-1. Poměr množství iontů Ca : Mg je 4 : 1 a poměr množství iontů Na : K je 10 : 1. Celková koncentrace alkalických kovů v tomto roztoku je 0,8 mmol·l-1.

    účinné od 1. 5. 2004Jakákoli odchylka v přípravě vody k ředění nesmí změnit složení ani vlastnosti vody.

    účinné od 1. 5. 2004DODATEK 2

    účinné od 1. 5. 2004Souhrn výsledků kruhového testu EHS provedeného v roce 1978 (citovaného také v (2)).

    účinné od 1. 5. 2004Upozornění: účelem tohoto kruhového testu bylo stanovení 24hodinové hodnoty EC50.

    1. účinné od 1. 5. 2004Použité látky:
      1. účinné od 1. 5. 20041) Dichroman draselný
      2. účinné od 1. 5. 20042) Kyselina tetrapropylbenzensulfonová
      3. účinné od 1. 5. 20043) Kyselina tetrapropylbenzensulfonová, sodná sůl
      4. účinné od 1. 5. 20044) Kyselina 2,4,5-trichlorfenoxyoctová, draselná sůl
        účinné od 1. 5. 2004
        DODATEK 1 Upravená voda DODATEK 2 Druhy ryb doporučené pro zkoušení DODATEK 3 Příklad křivky závislosti úmrtnosti, vyjádřené v procentech, na koncentraci DODATEK 1 Upravená voda DODATEK 2
        LátkaPočet zúčastněných
        laboratoří        		Počet výsledků pro
        výpočet        		Střední hodnota
        24hodinové EC50
        mg/l
        1461291,5
        23610827
        3318427
        43272770

    účinné od 1. 5. 2004DODATEK 3

    účinné od 1. 5. 2004Příklad závislosti imobilizace, vyjádřené v procentech, na koncentraci

    1. účinné od 1. 5. 2004Příklad stanovení EC50 s použitím pravděpodobnostního logaritmického papíru
      účinné od 1. 5. 2004Obrázek
  1. účinné od 1. 5. 2004III. METODA PRO STANOVENÍ INHIBICE RŮSTU ŘAS – metoda C.3 podle přílohy směrnice 92/69/EHS
    1. účinné od 1. 5. 2004III.1 METODA
      1. účinné od 1. 5. 2004III.1.1 ÚVOD

        účinné od 1. 5. 2004Účelem této zkoušky je stanovit účinky látky na růst jednobuněčných zelených řas. Relativně krátkodobými zkouškami (72 h) lze posoudit účinky na několik generací řas. Tato metoda může být upravena pro použití s několika druhy řas, přičemž musí být v protokolu o zkoušce uveden popis metody.

        účinné od 1. 5. 2004Použití metody je nejsnadnější v případě látek rozpustných ve vodě, které za podmínek zkoušky pravděpodobně zůstávají ve vodě.

        účinné od 1. 5. 2004Metodu lze použít pro látky, které přímo neovlivňují měření růstu řas.

        účinné od 1. 5. 2004Je žádoucí mít před započetím zkoušky k dispozici co nejúplnější údaje o rozpustnosti látky ve vodě, o tenzi par, chemické stabilitě, disociačních konstantách a o biologické rozložitelnosti látky.

        účinné od 1. 5. 2004Další informace (např. strukturní vzorec, stupeň čistoty, druh a podíl významných nečistot v procentech, přítomnost a množství přísad a rozdělovací koeficient n-oktanol/voda) je třeba vzít v úvahu při plánování zkoušky i při interpretaci výsledků.

      1. účinné od 1. 5. 2004III.1.2 DEFINICE A JEDNOTKY

        účinné od 1. 5. 2004Hustota buněk: počet buněk na jeden mililitr.

        účinné od 1. 5. 2004Růst: zvyšování hustoty buněk během doby trvání zkoušky.

        účinné od 1. 5. 2004Růstová rychlost: nárůst hustoty buněk za jednotku času.

        účinné od 1. 5. 2004EC50: v této metodě jde o koncentraci zkušební látky, která má za následek 50% snížení růstu (EbC50) nebo růstové rychlosti (ErC50) vzhledem ke kontrole.

        účinné od 1. 5. 2004NOEC (no observed effect concentration): v této metodě jde o je nejvyšší zkoušenou koncentraci, při níž není pozorováno žádné významné snížení růstu nebo růstové rychlosti ve srovnání s kontrolou.

        účinné od 1. 5. 2004Všechny koncentrace zkušební látky se udávají v hmotnosti na jednotku objemu (mg·l-1). Mohou se také vyjádřit v hmotnostních podílech (mg·kg-1).

      1. účinné od 1. 5. 2004III.1.3 REFERENČNÍ LÁTKY

        účinné od 1. 5. 2004Zkoušky s referenčními látkami mohou být provedeny s cílem prokázat, že se reakce zkušebních druhů za laboratorních zkušebních podmínek podstatně nezměnila.

        účinné od 1. 5. 2004Při použití referenční látky musí být výsledky uvedeny do protokolu o zkoušce. Jako referenční látka může být použit dichroman draselný, ale jeho barva může ovlivnit kvalitu a intenzitu světla dostupného buňkám a také spektrofotometrická měření, pokud se použijí. Dichroman draselný byl použit v mezinárodních mezilaboratorních testech (viz (3) a doplněk 2).

      1. účinné od 1. 5. 2004III.1.4 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY

        účinné od 1. 5. 2004Může být provedena limitní zkouška s koncentrací 100 mg·l-1, s cílem prokázat, že EC50 je vyšší než tato koncentrace.

        účinné od 1. 5. 2004Exponenciálně rostoucí kultury vybraných zelených řas jsou po několik generací vystaveny za definovaných podmínek různým koncentracím zkušební látky.

        účinné od 1. 5. 2004Zkušební roztoky se kultivují 72 h, během nichž se alespoň každých 24 h měří hustota buněk v každém roztoku. Stanoví se snížení růstu ve srovnání s kontrolní kulturou.

      1. účinné od 1. 5. 2004III.1.5. KRITÉRIA JAKOSTI

        účinné od 1. 5. 2004Kritéria jakosti se vztahují jak na limitní zkoušku, tak na celý zkušební postup.

        účinné od 1. 5. 2004Hustota buněk v kontrolních kulturách by se měla za 3 dny zvýšit alespoň šestnáctkrát.

        účinné od 1. 5. 2004Koncentrace zkušební látky nesmí po celou zkoušky klesnout pod 80 % původní hodnoty koncentrace.

        účinné od 1. 5. 2004U látek, které se ve zkušebním médiu lehce rozpouštějí a dávají stabilní roztoky, tj. v podstatné míře netěkají, nerozkládají se, nehydrolyzují nebo se neadsorbují, lze počáteční koncentraci pokládat za ekvivalentní s nominální koncentrací. Musí být potvrzeno, že byly koncentrace po celou zkoušku udrženy a že kritéria jakosti byla dodržena.

        1. účinné od 1. 5. 2004U látek, které
          1. účinné od 1. 5. 2004i) jsou ve zkušebním médiu špatně rozpustné, nebo
          2. účinné od 1. 5. 2004ii) mohou vytvářet stabilní emulze nebo disperse, nebo
          3. účinné od 1. 5. 2004iii) jsou ve vodných roztocích nestabilní,
          4. účinné od 1. 5. 2004musí být počáteční koncentrace brána jako koncentrace naměřená v roztoku na začátku zkoušky. Koncentrace se stanoví po určité době jejího ustálení.

        účinné od 1. 5. 2004Ve všech uvedených případech musí být během zkoušky provedena další měření s cílem potvrdit skutečné expoziční koncentrace nebo dodržení kritérií jakosti.

        účinné od 1. 5. 2004Je známo, že podstatná část zkušební látky může být během zkoušky zabudována do biomasy řas. Proto by se za účelem prokázání dodržení kritérií jakosti mělo brát v úvahu jak množství látky zabudované do biomasy řas, tak látka v roztoku (nebo, není-li to technicky možné, ve vodním sloupci). Protože však stanovení koncentrace látky v biomase řas může představovat technické obtíže, může být dodržení kritérií jakosti prokázáno zkouškou s nejvyšší koncentrací látky, ale bez řas, a měřením koncentrací v roztoku (nebo, není-li to technicky možné, ve vodním sloupci) na začátku a na konci zkoušky.

      1. účinné od 1. 5. 2004III.1.6 POPIS ZKUŠEBNÍHO POSTUPU
        1. účinné od 1. 5. 2004III.1.6.1 Činidla
          1. účinné od 1. 5. 2004III.1.6.1.1 Roztoky zkušebních látek

            účinné od 1. 5. 2004Zásobní roztoky o požadované koncentraci se připraví rozpuštěním látky v deionizované vodě nebo ve vodě podle bodu 1.6.1.2.

            účinné od 1. 5. 2004Zvolené zkušební koncentrace se připraví přidáním vhodného alikvotního podílu k předkulturám řas (viz doplněk 1).

            účinné od 1. 5. 2004Látky se obvykle zkoušejí až do meze jejich rozpustnosti. U některých látek (např. u látek s nízkou rozpustností ve vodě nebo vysokou hodnotou Po/v nebo u látek, které ve vodě vytvářejí spíše stabilní disperse než pravé roztoky) je možné provést zkoušku při koncentraci vyšší, než je mez rozpustnosti, aby bylo zajištěno, že je dosaženo maximální koncentrace odpovídající maximální rozpustnosti/stabilitě. Je ovšem nutné, aby tato koncentrace jinak nenarušovala zkušební systém (např. vytvořením filmu na hladině bránícímu okysličení vody atd.).

            účinné od 1. 5. 2004Pro přípravu zásobních roztoků látek s nízkou rozpustností ve vodě nebo pro usnadnění rozptýlení látky ve zkušebním médiu lze použít ultrazvukovou dispergaci, organická rozpouštědla či emulgátory nebo dispergátory. Použijí-li se takové pomocné látky, měly by všechny zkušební koncentrace obsahovat stejné množství těchto pomocných látek a stejné koncentraci pomocné látky jako ve zkušebních sériích by měly být exponovány další kontroly. Koncentrace pomocných látek by měla být minimální a v žádném případě by neměla překročit 100 mg na l zkušebního média.

            účinné od 1. 5. 2004Zkouška se provede bez úpravy pH. Existují-li známky toho, že dochází k výrazné změně pH, doporučuje se zkoušku opakovat s úpravou pH a výsledky zaznamenat. V takovém případě se upraví pH zásobního roztoku na pH vody k ředění, pokud proti tomu neexistuji specifické důvody. Při úpravě pH se dává přednost HCl a NaOH. Úprava pH se provede tak, aby nebyla koncentrace zkušební látky v zásobním roztoku v podstatné míře změněna. Dojde-li úpravou ve zkušebním médiu k chemické reakci nebo ke srážení, skutečnosti se zaznamenají.

          1. účinné od 1. 5. 2004III.1.6.1.2 Zkušební médium

            účinné od 1. 5. 2004Voda musí být kvalitní destilovaná nebo deionizovaná s vodivostí menší než 5 μS·cm-1. Destilační přístroj nesmí obsahovat žádné měděné části.

            účinné od 1. 5. 2004Je doporučeno následující médium:

            účinné od 1. 5. 2004Podle následující tabulky se připraví čtyři zásobní roztoky. Tyto roztoky se sterilizují membránovou filtrací nebo v autoklávu a skladují se v temnu při 4 °C. Zásobní roztok č. 4 by se měl sterilizovat pouze membránovou filtrací. Ředěním těchto roztoků se získají konečné živné koncentrace zkušebních roztoků.

            účinné od 1. 5. 2004
            DODATEK 1 Upravená voda DODATEK 2 Druhy ryb doporučené pro zkoušení DODATEK 3 Příklad křivky závislosti úmrtnosti, vyjádřené v procentech, na koncentraci DODATEK 1 Upravená voda DODATEK 2 DODATEK 3 Příklad závislosti imobilizace, vyjádřené v procentech, na koncentraci
            ŽivinaKoncentrace
            v zásobním roztoku            		Konečná koncentrace
            ve zkušebním roztoku
            Zásobní roztok č. 1: makroživiny
            NH4Cl1,515 mg·l-1
            MgCl2·6H2O1,212 mg·l-1
            CaCl2·2H2O1,818 mg·l-1
            MgSO4·7H2O1,515 mg·l-1
            KH2PO40,161,6 mg·l-1
            Zásobní roztok č. 2: Fe - EDTA
            FeCl3·6H2O800,08 mg·l-1
            Na2EDTA·2H2O1000,1 mg·l-1
            Zásobní roztok č. 3: stopové prvky
            H3BO31850,18 mg·l-1
            MnCl2·4H2O4150,415 mg·l-1
            ZnCl23310-3 mg·l-1
            CoCl2·6H2O1,51,510-3 mg·l-1
            CuCl2·2H2O0,01110-5 mg·l-1
            Na2MoO4·2H2O7710-3 mg·l-1
            Zásobní roztok č. 4: NaHCO3
            NaHCO35050 mg·l-1

            účinné od 1. 5. 2004Po ustálení a po provzdušnění by mělo mít médium hodnotu pH přibližně 8.

        1. účinné od 1. 5. 2004III.1.6.2 Přístroje a pomůcky
          1. účinné od 1. 5. 2004— Běžné laboratorní vybavení.
          2. účinné od 1. 5. 2004— Kultivační baňky o vhodném objemu (např. Erlenmeyerovy baňky na 250 ml jsou vhodné v případě zkušebního roztoku o objemu 100 ml). Všechny zkušební baňky by měly být identické, pokud jde o materiál a rozměry.
          3. účinné od 1. 5. 2004— Kultivační zařízení: místnost nebo komora, v nichž lze udržovat teplotu 21 – 25 °C ± 2 °C a stálé rovnoměrné osvětlení v rozsahu vlnových délek od 400 do 700 nm. Jestliže všechny řasy v kontrolních kulturách dosáhly doporučené růstové rychlosti, lze předpokládat, že podmínky pro jejich růst, včetně intenzity světla, jsou vyhovující.

          účinné od 1. 5. 2004U zkušebních roztoků s průměrnými koncentracemi se doporučuje použít světelnou intenzitu od 60 do 120 μE·m-2·s-1 (35 – 70·1018 fotonů m-2·s-1) při měření v rozsahu 400 – 700 nm vhodným detektorem. Při měření intenzity luxmetry je přijatelný rozsah odpovídající 6000 – 10 000 lx.

          účinné od 1. 5. 2004Této světelné intenzity lze dosáhnout umístěním čtyř až sedmi univerzálních bílých 30W zářivek (teplota chromatičnosti přibližně 4 300 K) ve vzdálenosti 0,35 m od kultury řas.

          1. účinné od 1. 5. 2004— Měření hustoty buněk by se mělo provádět přímým počítáním živých buněk, např. pod mikroskopem s počítacími komůrkami. Za předpokladu dostatečné citlivosti a prokázané dobré korelace s buněčnou hustotou mohou být použity i jiné postupy (fotometrie, turbidimetrie,...).
        1. účinné od 1. 5. 2004III.1.6.3 Testovací organismy
          1. účinné od 1. 5. 2004Je doporučeno použít rychle rostoucí druhy zelených řas vhodné pro kultivaci a zkoušení. Dává se přednost následujícím druhům:
            1. účinné od 1. 5. 2004— Selenastrum capricornutum, např. ATCC 22662 nebo CCAP 278/4,
            2. účinné od 1. 5. 2004— Scenedesmus subspicatus, např. 86.81 SAG.
            3. účinné od 1. 5. 2004Poznámka:
              1. účinné od 1. 5. 2004ATCC = American Type Culture Collection (USA)
              2. účinné od 1. 5. 2004CCAP = Culture Centre of Algae and Protozoa (VB)
              3. účinné od 1. 5. 2004SAG = Collection of algal culture (Göttingen, SRN)

          účinné od 1. 5. 2004Použití jiného druhu řas musí být uvedeno ve zprávě.

        1. účinné od 1. 5. 2004III.1.6.4 Zkušební postup

          účinné od 1. 5. 2004Koncentrační rozmezí, ve kterém lze očekávat účinky, se určí na základě výsledků orientačních zkoušek.

          účinné od 1. 5. 2004Dva parametry, jež jsou mírou růstu (biomasa a růstová rychlost), mohou poskytovat zcela rozdílné hodnoty snížení růstu; v orientační zkoušce by měly být použity oba parametry, aby mohlo zajištěno, že geometrická řada koncentrací umožní odhadnout jak EbC50, tak ErC50.

          účinné od 1. 5. 2004Počáteční hustota buněk

          účinné od 1. 5. 2004Doporučuje se, aby byla počáteční hustota buněk řasy Selenastrum capricornutum a řasy Scenedesmus subspicatus ve zkušebních roztocích přibližně 104 buněk na ml. Použije-li se jiný druh řasy, měla by být biomasa srovnatelná.

          účinné od 1. 5. 2004Koncentrace zkušební látky

          účinné od 1. 5. 2004Pro zkoušku se připraví geometrická řada nejméně pěti koncentrací lišících se od sebe vždy faktorem nepřekračujícím 2,2. Nejnižší zkoušená koncentrace by neměla vykazovat žádný pozorovatelný účinek na růst řas. Nejvyšší zkoušená koncentrace by měla omezit růst ve srovnání s kontrolní zkouškou nejméně o 50 %, nejlépe by měla růst zcela zastavit.

          účinné od 1. 5. 2004Opakování a kontroly

          účinné od 1. 5. 2004Plán zkoušky by měl zahrnovat tři opakování s každou zkušební koncentrací. Dále se provedou tři kontroly bez zkušební látky, a je-li použita pomocná látka, též tři kontroly s touto látkou. Je-li pro to důvod, může být plán zkoušky upraven tak, že se použije více koncentračních úrovní a sníží se počet opakování zkoušky s každou koncentrací.

          účinné od 1. 5. 2004Provedení zkoušky

          účinné od 1. 5. 2004Zkušební roztoky o požadované koncentraci zkušební látky a požadovaném množství inokula řas se připraví přidáním alikvotních podílů zásobního roztoku zkušební látky k vhodnému množství prekultury řas (viz doplněk 1).

          účinné od 1. 5. 2004Kultivační baňky se protřepou a umístí se do kultivačního zařízení. Buňky řas se udržují v suspensi třepáním, mícháním nebo probubláváním vzduchem, aby se zlepšila výměna plynů a zmenšilo se kolísání pH ve zkušebních roztocích. Kultury se udržují při teplotě 21 – 25 °C udržované s přesností na ± 2 °C.

          účinné od 1. 5. 2004Hustota buněk v každé baňce se stanoví nejméně po 24, 48 a 72 h po zahájení zkoušky. Používá-li se měření hustoty buněk jiná metoda, než je jejich přímé počítání, použije se ke stanovení pozadí filtrované médium pro kultivaci řas obsahující odpovídající koncentraci zkušební chemické látky.

          účinné od 1. 5. 2004pH se měří na začátku zkoušky a po 72 h.

          účinné od 1. 5. 2004Hodnota pH by se neměla během zkoušky změnit víc než o 1,5.

          účinné od 1. 5. 2004Zkoušení těkavých látek

          účinné od 1. 5. 2004V současné době neexistuje obecně přijatý způsob zkoušení těkavých látek. Je-li o látce známo, že se snadno vypařuje, mohou být použity uzavřené kultivační nádoby se zvětšeným mrtvým objemem. Při plánování objemu horní části kultivačních baněk se musí zohlednit eventuální nedostatek CO2. Byly navrženy varianty této metody (4).

          účinné od 1. 5. 2004Měl by být učiněn pokus stanovit množství zkušební látky, které v roztoku zůstalo; při interpretaci výsledků zkoušek s těkavými látkami v uzavřených systémech je doporučeno postupovat mimořádně opatrně.

          účinné od 1. 5. 2004Limitní zkouška

          účinné od 1. 5. 2004S využitím postupů popsaných v této metodě může být provedena limitní zkouška s koncentrací 100 mg·l-1 s cílem prokázat, že EC50 je vyšší než tato koncentrace.

          účinné od 1. 5. 2004Je-li povaha zkušební látky taková, že nelze ve vodě dosáhnout koncentrace 100 mg·l-1, provede se limitní zkouška při koncentraci odpovídající rozpustnosti této látky v použitém médiu (nebo při maximální koncentraci, kdy látka vytváří stabilní disperzi) (viz také bod 1.6.1.1).

          účinné od 1. 5. 2004Limitní zkouška se provede alespoň třikrát, se stejným počtem kontrol. V limitní zkoušce se stanoví oba parametry, jež jsou mírou růstu (biomasa a růstová rychlost).

          účinné od 1. 5. 2004Zjistí-li se v limitní zkoušce pokles růstu biomasy nebo růstové rychlosti ve srovnání s kontrolami o 25 % nebo více, provede se úplná zkouška.

    1. účinné od 1. 5. 2004III.2 DATA A HODNOCENÍ

      účinné od 1. 5. 2004Naměřené hustoty buněk ve zkušební kultuře a v kontrolách se spolu s koncentracemi zkušební látky a dobami měření shrnou do tabulky. Střední hodnota hustoty buněk pro každou zkušební koncentraci a pro kontroly se vynese proti času (0 – 72 h) a sestrojí se růstová křivka.

      účinné od 1. 5. 2004Vztah koncentrace/účinek se stanoví dvěma následujícími postupy. Některé látky mohou růst při nízkých koncentracích stimulovat. V úvahu by měla být vzata pouze data udávající potlačení růstu mezi 0 a 100 %.

      1. účinné od 1. 5. 2004III.2.1 POROVNÁNÍ PLOCH POD RŮSTOVÝMI KŘIVKAMI
        1. účinné od 1. 5. 2004Plocha mezi růstovou křivkou a vodorovnou linií N = N0 se vypočte podle následujícího vzorce:

          účinné od 1. 5. 2004

          1. účinné od 1. 5. 2004kde
            1. účinné od 1. 5. 2004A = plocha,
            2. účinné od 1. 5. 2004N0 = počet buněk v ml v čase t0 (na počátku zkoušky),
            3. účinné od 1. 5. 2004N1 = naměřený počet buněk v 1 ml v čase t1,
            4. účinné od 1. 5. 2004Nn = naměřený počet buněk v 1 ml v čase tn,
            5. účinné od 1. 5. 2004t1 = doba prvního měření od počátku zkoušky,
            6. účinné od 1. 5. 2004tn = doba n-tého měření od počátku zkoušky,
            7. účinné od 1. 5. 2004n = počet měření od počátku zkoušky.
        1. účinné od 1. 5. 2004Potlačení růstu vyjádřené v % (IA) se pro každou koncentraci zkušební látky vypočte podle vzorce:

          účinné od 1. 5. 2004

          1. účinné od 1. 5. 2004kde
            1. účinné od 1. 5. 2004Ac = plocha mezi růstovou křivkou kontrolní zkoušky a horizontální linií N = N0,
            2. účinné od 1. 5. 2004At = plocha mezi růstovou křivkou při koncentraci t a horizontální linií N = N0.

        účinné od 1. 5. 2004Hodnoty IA se nanesou na semilogaritmický nebo na pravděpodobnostní semilogaritmický papír proti odpovídajícím koncentracím. Vynesou-li se body na pravděpodobnostní papír, proloží se body přímka, a to ručně nebo regresním výpočtem.

        účinné od 1. 5. 2004Hodnota EC50 se odhadne odečtením z regresní přímky jako koncentrace odpovídající 50% snížení růstu (IA = 50 %). Pro jednoznačné označení této hodnoty v rámci této metody výpočtu se doporučuje použít symbol EbC50. Je důležité, aby byla s hodnotou EbC50 uvedena příslušná expoziční doba, např. EbC50 (0 − 72 h).

      1. účinné od 1. 5. 2004III.2.2 POROVNÁNÍ RŮSTOVÝCH RYCHLOSTÍ
        1. účinné od 1. 5. 2004Průměrnou specifickou růstovou rychlost (μ) pro exponenciálně rostoucí kultury lze vypočítat jako:

          účinné od 1. 5. 2004

          1. účinné od 1. 5. 2004kde t0 je čas začátku zkoušky.

        účinné od 1. 5. 2004Průměrnou specifickou růstovou rychlost lze také odvodit ze sklonu regresní přímky v závislosti ln N na čase.

        1. účinné od 1. 5. 2004Snížení specifické růstové rychlosti vyjádřené v procentech pro každou koncentraci zkušební látky (Iμt) se vypočte podle vzorce:

          účinné od 1. 5. 2004

          1. účinné od 1. 5. 2004kde
            1. účinné od 1. 5. 2004μc = střední specifická růstová rychlost v kontrole,
            2. účinné od 1. 5. 2004μt = střední specifická růstová rychlost pro zkušební koncentraci t.

        účinné od 1. 5. 2004Snížení střední specifické růstové rychlosti v procentech při všech koncentracích zkušební látky ve srovnání s kontrolní hodnotou se vynese proti logaritmu koncentrace. Hodnotu EC50 lze odečíst z výsledného grafu. Pro jednoznačné označení EC50 odvozené touto metodou se doporučuje použít symbol ErC50. Musí být uvedeny okamžiky měření, např. vztahuje-li se hodnota k času 0 a k 72 h, označí se symbolem ErC50 (0 – 72 h):

      2. účinné od 1. 5. 2004Poznámka: Ve výrazu pro specifickou růstovou rychlost vystupují logaritmy, tzn. malé změny růstové rychlosti mohou odpovídat velkým změnám biomasy. Hodnoty EbC a ErC tedy nejsou číselně srovnatelné.
      1. účinné od 1. 5. 2004III.2.3 VÝPOČET NOEC

        účinné od 1. 5. 2004Hodnota koncentrace nezpůsobující žádné pozorovatelné účinky (NOEC) se stanoví vhodnou statistickou metodou pro srovnávání více vzorků (např. analýza rozptylu a Dunnettův test) s využitím jednotlivých hodnot ploch pod růstovými křivkami A (viz bod 2.1) nebo specifických růstových rychlostí μ (viz bod 2.2).

    1. účinné od 1. 5. 2004III.3 ZPRÁVY
      1. účinné od 1. 5. 2004Protokol o zkoušce má pokud možno obsahovat následující údaje:
        1. účinné od 1. 5. 2004— zkušební látka: údaje o chemické identitě;
        2. účinné od 1. 5. 2004— testovací organismus: původ, laboratorní kultura, číslo kmene, metoda kultivace;
        3. účinné od 1. 5. 2004— zkušební podmínky:
          1. účinné od 1. 5. 2004— datum zahájení a ukončení zkoušky a délka zkoušení,
          2. účinné od 1. 5. 2004— teplota,
          3. účinné od 1. 5. 2004— složení média,
          4. účinné od 1. 5. 2004— kultivační zařízení,
          5. účinné od 1. 5. 2004— hodnoty pH roztoku na počátku a na konci zkoušky (je-li pozorováno kolísání pH o více než 1,5, uvede se vysvětlení),
          6. účinné od 1. 5. 2004— nosič a metoda použitá pro rozpouštění zkušební látky, koncentrace nosiče ve zkušebních roztocích,
          7. účinné od 1. 5. 2004— intenzita a kvalita světla,
          8. účinné od 1. 5. 2004— zkoušené koncentrace (naměřené nebo nominální);
        1. účinné od 1. 5. 2004— výsledky:
          1. účinné od 1. 5. 2004— koncentrace buněk v jednotlivých baňkách v každé době měření a metoda měření koncentrace buněk,
          2. účinné od 1. 5. 2004— průměrné hodnoty koncentrace buněk,
          3. účinné od 1. 5. 2004— růstové křivky,
          4. účinné od 1. 5. 2004— grafické znázornění vztahu koncentrace – účinek,
          5. účinné od 1. 5. 2004— hodnoty EC a metoda výpočtu,
          6. účinné od 1. 5. 2004— NOEC,
          7. účinné od 1. 5. 2004— další pozorované účinky.
    1. účinné od 1. 5. 2004III.4 LITERATURA

      účinné od 1. 5. 2004(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 201, Decision of the Council C(81) 30 Final.

      účinné od 1. 5. 2004(2) Umweltbundesamt, Berlin, 1984, Verfahrensvorschlag „Hemmung der Zellvermehrung bei der Grünalge Scenedesmus subspicatus“, In: Rudolph / Boje: Ökotoxikologie, ecomed, Landsberg,1986.

      účinné od 1. 5. 2004(3) ISO 8692 – Water quality – Fresh water algal growth inhibition test with Scenedesmus subspicatus and Selenastrum capricornutum.

      účinné od 1. 5. 2004(4) S. Galassi, M. Vighi. Chemosphere, 1981, 10, 1123-1126.

    účinné od 1. 5. 2004DODATEK 1

    účinné od 1. 5. 2004Příklad postupu kultivace řas

    účinné od 1. 5. 2004Obecné poznámky

    účinné od 1. 5. 2004Účelem kultivace následujícím postupem je získání kultur řas pro zkoušky toxicity.

    účinné od 1. 5. 2004Měly by být použity vhodné metody k tomu, aby bylo zajištěno, že kultury řas nebudou infikovány bakteriemi (ISO 4833). Vhodné mohou být axenické kultury, avšak základem jsou jednodruhové kultury.

    účinné od 1. 5. 2004Všechny operace se provádějí za sterilních podmínek, aby nedošlo ke kontaminaci bakteriemi a jinými řasami. Kontaminované kultury se vyřadí.

    účinné od 1. 5. 2004Postupy při získání kultur řas

    účinné od 1. 5. 2004Příprava živných roztoků (média):

    účinné od 1. 5. 2004Médium lze připravit zředěním koncentrovaných základních roztoků živin. K získání pevného média se přidává 0,8 % agaru. Použité médium by mělo být sterilní. Sterilizace v autoklávu může vést ke ztrátě NH3.

    účinné od 1. 5. 2004Kmenová kultura:

    účinné od 1. 5. 2004Kmenové kultury jsou malé kultury řas, které se pravidelně přenášejí do čerstvého média, kde slouží jako výchozí testovací materiál. Nejsou-li kultury pravidelně používány, vyočkovávají se na šikmý agar. Poté se nejméně jednou za dva měsíce přenášejí do čerstvého média.

    účinné od 1. 5. 2004Kmenové kultury se pěstují v Erlenmeyerových baňkách obsahujících vhodné medium (objem přibližně 100 ml). Jsou-li řasy kultivovány při teplotě 20 °C a stálém osvětlení, musí se přenášet každý týden.

    účinné od 1. 5. 2004Při přeočkování se přenese sterilní pipetou do baňky s čerstvým mediem takové množství „staré“ kultury, aby byla výchozí koncentrace u rychle rostoucího druhu řas asi stokrát menší než koncentrace kultury staré.

    účinné od 1. 5. 2004Růstovou rychlost druhu řas lze odečíst z růstové křivky. Je-li známa, lze z ní odhadnout hustotu, při níž musí být kultura přenesena do čerstvého média. K tomu musí dojít před fází odumírání kultury.

    účinné od 1. 5. 2004Předkultura:

    účinné od 1. 5. 2004Účelem předkultur je poskytnout dostatečné množství řas potřebných pro naočkování testovacích kultur. Předkultura se kultivuje za zkušebních podmínek a použije se ještě během exponenciálního růstu, to znamená obvykle po třídenní inkubační lhůtě. Obsahují-li kultury řas deformované nebo abnormální buňky, musí se odstranit.

    účinné od 1. 5. 2004DODATEK 2

    účinné od 1. 5. 2004V normě ISO 8692 - Jakost vody - Růstová inhibiční zkouška na sladkovodních řasách Scenedesmus subspicatus a Selenastrum capricornutum jsou uvedeny výsledky mezilaboratorních zkoušek dichromanu draselného provedených 16 laboratořemi.

    účinné od 1. 5. 2004
    DODATEK 1 Upravená voda DODATEK 2 Druhy ryb doporučené pro zkoušení DODATEK 3 Příklad křivky závislosti úmrtnosti, vyjádřené v procentech, na koncentraci DODATEK 1 Upravená voda DODATEK 2 DODATEK 3 Příklad závislosti imobilizace, vyjádřené v procentech, na koncentraci DODATEK 1 Příklad postupu kultivace řas Obecné poznámky Postupy při získání kultur řas DODATEK 2
    Střední hodnota (mg·l-1)Rozpětí (mg·l-1)
    ErC50 (0 - 72 h)0,840,60 až 1,03
    EbC50 (0 - 72 h)0,530,20 až 0,75
  1. účinné od 1. 5. 2004IV. METODY PRO STANOVENÍ „SNADNÉ“ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI – metody C.4 podle přílohy směrnice 92/69/EHS
    1. účinné od 1. 5. 2004IV.I.1 ÚVOD
      1. účinné od 1. 5. 2004Je popsáno šest metod, které umožňují screeningové posouzení snadné biologické rozložitelnosti chemických látek v aerobním vodním prostředí:
        1. účinné od 1. 5. 2004a) Zkouška na úbytek rozpuštěného organického uhlíku (DOC) (metoda C.4-A)
        2. účinné od 1. 5. 2004b) Modifikovaná screeningová zkouška OECD - na úbytek DOC (metoda C.4-B)
        3. účinné od 1. 5. 2004c) Zkouška na uvolňování oxidu uhličitého (CO2) (modifikovaná Sturmova zkouška) (metoda C.4-C)
        4. účinné od 1. 5. 2004d) Zkouška manometrickou respirometrií (metoda C.4-D)
        5. účinné od 1. 5. 2004e) Zkouška v uzavřených lahvičkách (metoda C.4-E)
        6. účinné od 1. 5. 2004f) Zkouška MITI (Ministerstvo zahraničního obchodu a průmyslu – Japonsko) (metoda C.4-F)

      účinné od 1. 5. 2004Obecné a společné úvahy pro všech šest zkoušek jsou uvedeny v části I metody. Specifické body jednotlivých metod jsou uvedeny v částech II až VII. Přílohy obsahují definice, vzorce a návody.

      účinné od 1. 5. 2004Mezilaboratorní srovnávací test OECD provedený v roce 1988 ukázal, že metody poskytují shodné výsledky. V závislosti na fyzikálním charakteru látky, která má být zkoušena, se však může dávat přednost určité metodě.

    1. účinné od 1. 5. 2004IV.I.2 VÝBĚR VHODNÉ METODY

      účinné od 1. 5. 2004Pro volbu nejvhodnější metody jsou nezbytné informace o rozpustnosti, tenzi par a o adsorpčních vlastnostech chemické látky. Pro výpočet teoretických hodnot a/nebo ověření naměřených hodnot parametrů, např. TSK, TCO2, DOC, TOC, CHSK (viz přílohy I a II) je nutné znát chemickou strukturu nebo vzorec.

      účinné od 1. 5. 2004Zkušební chemické látky, jejichž rozpustnost ve vodě je alespoň 100 mg·l-1, lze zkoušet všemi metodami za předpokladu, že netěkají a neadsorbují se. Pro látky špatně rozpustné ve vodě, které těkají nebo se adsorbují, jsou vhodné metody uvedené v tabulce 1. Způsob, jakým je třeba zacházet s látkami špatně rozpustnými ve vodě a s látkami těkavými, je popsán v příloze III. Mírně těkavé látky je možno zkoušet metodou úbytku DOC, pokud je ve zkušebních nádobách (které musí být vhodně uzavřeny) dostatečně velký prostor pro plyn. V tomto případě musí být provedena abiotická kontrola pro zohlednění případné fyzikální ztráty.

      účinné od 1. 5. 2004Tabulka 1: Použitelnost zkušebních metod

      účinné od 1. 5. 2004
      DODATEK 1 Upravená voda DODATEK 2 Druhy ryb doporučené pro zkoušení DODATEK 3 Příklad křivky závislosti úmrtnosti, vyjádřené v procentech, na koncentraci DODATEK 1 Upravená voda DODATEK 2 DODATEK 3 Příklad závislosti imobilizace, vyjádřené v procentech, na koncentraci DODATEK 1 Příklad postupu kultivace řas Obecné poznámky Postupy při získání kultur řas DODATEK 2 Tabulka 1: Použitelnost zkušebních metod
      ZkouškaAnalytická metodaVhodnost pro látky
      špatně r
      ozpustné      		těkavéadsorbující
      se
      na úbytek DOCrozpuštěný organický uhlík——+ /−
      modif. zkouška OECD
      – na úbytek DOC      		rozpuštěný organický uhlík——+ /−
      na uvolňování CO2respirometrie: uvolňování CO2+—+
      manometrická respirometriemanometrická respirometrie: spotřeba kyslíku++ /−+
      zkouška v uzavřených lahvičkáchrespirometrie: rozpuštěný kyslík+ /−++
      MITIrespirometrie: spotřeba kyslíku++/−+

      účinné od 1. 5. 2004Pro interpretaci získaných výsledků, zejména pokud jsou výsledky nízké nebo marginální, se vyžadují informace o čistotě nebo relativních podílech hlavních složek zkušebního materiálu.

      účinné od 1. 5. 2004Pro volbu vhodných zkušebních koncentrací mohou být velmi užitečné informace o toxicitě zkušební chemické látky pro bakterie (příloha IV); tyto informace mohou být důležité pro správnou interpretaci nízkých hodnot biologického rozkladu.

    1. účinné od 1. 5. 2004IV.I.3 REFERENČNÍ LÁTKY

      účinné od 1. 5. 2004Pro ověření postupu se souběžně se zkouškou a ve vlastní baňce zkoušejí referenční chemické látky, které splňují kritéria snadné biologické rozložitelnosti.

      účinné od 1. 5. 2004Vhodnými chemickými látkami jsou anilin (čerstvě předestilovaný), natrium-acetát, natrium-benzoát. Všechny tyto referenční chemické látky se za podmínek v uvedených metodách rozkládají, i když se záměrně nepřidá žádné inokulum.

      účinné od 1. 5. 2004Byl podán návrh hledat referenční chemickou látku, která by byla snadno rozložitelná, avšak vyžadovala by přidání inokula. Navržen byl kalium-hydrogen-ftalát. O této látce je třeba ještě získat více údajů, než ji bude možné přijmout jako referenční látku.

      účinné od 1. 5. 2004V respirometrických zkouškách mohou v důsledku nitrifikace ovlivnit spotřebu kyslíku látky obsahující dusík (viz přílohy II a V).

    1. účinné od 1. 5. 2004IV.I.4 PODSTATA ZKUŠEBNÍCH METOD

      účinné od 1. 5. 2004Roztok nebo suspense zkušební látky v minerálním prostředí se inokuluje a kultivuje v aerobních podmínkách v temnu nebo v difuzním světle. Množství DOC ve zkušebním roztoku pocházející z inokula se musí udržovat ve srovnání s DOC pocházejícího ze zkušební látky co nejnižší. Endogenní aktivita inokula se zohlední na základě souběžné slepé zkoušky s inokulem, avšak bez zkoušené látky, třebaže endogenní aktivita buněk v přítomnosti látky přesně neodpovídá aktivitě v endogenní kontrolní zkoušce. Za účelem kontroly postupu se souběžně provádí zkouška s referenční látkou.

      účinné od 1. 5. 2004Obecně se rozklad sleduje stanovením parametrů jako DOC, tvorba CO2 nebo spotřeba kyslíku a měření se provádějí v dostatečně krátkých intervalech, aby bylo možné identifikovat začátek a konec biologického rozkladu. Měření automatickými respirometry je kontinuální. Někdy se doplňkově k jinému parametru měří DOC, avšak obvykle pouze na začátku a na konci zkoušky. Lze rovněž použít specifickou chemickou analýzu, kterou se vyhodnotí primární rozklad zkušební látky nebo kterou se stanoví koncentrace kteréhokoli vzniklého meziproduktu (ve zkoušce MITI povinné).

      účinné od 1. 5. 2004Zkouška obvykle trvá 28 dnů. Je však možné ukončit měření před uplynutím 28 dní, tj. jakmile vykazuje křivka biologického rozkladu plató po tři po sobě následující měření. Je také možné měření po 28 dnech prodloužit, jestliže z křivky vyplývá, že biologický rozklad začal, avšak 28. dne ještě nebylo ještě dosaženo plató.

    1. účinné od 1. 5. 2004IV.I.5 KRITÉRIA JAKOSTI
      1. účinné od 1. 5. 2004IV.I.5.1 Reprodukovatelnost

        účinné od 1. 5. 2004Vzhledem k charakteru biologického rozkladu a směsných populací bakterií používaných jako inokula se stanovení provádějí nejméně duplicitně.

        účinné od 1. 5. 2004Je obecně známo, že čím vyšší je koncentrace mikroorganismů přidaných na počátku do zkušebního média, tím menší jsou rozdíly mezi vícenásobnými měřeními. Okružní testy rovněž ukázaly, že mezi výsledky získanými různými laboratořemi mohou být velké rozdíly, avšak u snadno biologicky rozložitelných sloučenin se obvykle dosahuje dobré shody.

      1. účinné od 1. 5. 2004IV.I.5.2 Platnost zkoušky

        účinné od 1. 5. 2004Zkouška se považuje za platnou, je-li na konci zkoušky nebo popřípadě na konci 10denního období rozkladu rozdíl hodnot krajních výsledků vícenásobných měření rozkladu zkušební chemické látky v oblasti plató křivky menší než 20 % a dosáhl-li stupeň rozkladu referenční látky vyjádřený v procentech úrovně snadné biologické rozložitelnosti do 14 dní. Není-li splněna kterákoli z těchto podmínek, měření se opakuje. Vzhledem k náročnosti metod neznamenají nízké hodnoty nutně skutečnost, že zkušební látka není v podmínkách životního prostředí biologicky rozložitelná, ale znamenají, že k prokázání biologické rozložitelnosti jsou třeba další studie.

        účinné od 1. 5. 2004Jestliže ve zkoušce toxicity zahrnující jak zkušební látku, tak referenční chemickou látku došlo během 14 dnů k méně než 35% rozkladu (stanoveného podle DOC) nebo k méně než 25% rozkladu (stanoveného podle TSK nebo TCO2), lze zkušební chemické látky považovat za inhibující (viz také příloha IV). Série zkoušek by měla být opakována, pokud možno s nižší koncentrací zkušební chemické látky a/nebo s vyšší koncentrací inokula, avšak ne s koncentrací vyšší než 30 mg tuhých látek v litru.

    1. účinné od 1. 5. 2004IV.I.6 OBECNÉ POSTUPY A PŘÍPRAVA