Platné znění

Vyhláška, kterou se u chemických látek a chemických přípravků stanoví základní metody pro zkoušení fyzikálně-chemických vlastností, výbušných vlastností a vlastností nebezpečných pro životní prostředí

účinné od 1. 5. 2004U zkoušek, u nichž se (na základě dat o stálosti látky) předpokládá, že se bude koncentrace zkoušené látky pohybovat v rozmezí větším než ± 20 % nominální hodnoty, je nezbytné analyzovat všechny zkoušené koncentrace ihned po jejich přípravě a před jejich výměnou, a to stejně často (tj. alespoň ve třech okamžicích rovnoměrně rozložených přes celkovou dobu zkoušky). Stanovení koncentrací zkoušené látky před obnovením je třeba provést pro každou koncentraci pouze u jedné paralelní nádrže. Stanovení se provádějí v odstupu ne více než 7 dnů. Doporučuje se zakládat výsledky na naměřených koncentracích. Lze-li však prokázat, že po celou dobu zkoušky byla koncentrace uspokojivě udržována v rozmezí ± 20 % nominální hodnoty, mohou být výsledky založeny na nominálních nebo naměřených počátečních hodnotách.

účinné od 1. 5. 2004Pro průtokové zkoušky je vhodný podobný vzorkovací režim, jako je popsán u semistatických zkoušek (v tomto případě se však neprovádí měření „starých“ roztoků). Je-li zkouška delší než sedm dnů, doporučuje se zvýšit počet odběrů v prvním týdnu (např. tři sady měření) pro ujištění, že jsou zkušební koncentrace stálé.

účinné od 1. 5. 2004Může být nezbytné vzorky odstředit nebo filtrovat (např. přes filtr s velikostí pórů 0,45 µm). Vzhledem k tomu, že však odstředění ani filtrace vždy neoddělí od sebe biologicky dostupný a biologicky nedostupný podíl zkušební látky, nemusí být vzorky takto zpracovány.

účinné od 1. 5. 2004V průběhu zkoušky se měří v každé zkušební nádrži množství rozpuštěného kyslíku, pH a teplota. Celková tvrdost a solnost se měří v kontrolních nádržích a v jedné nádrži s nejvyšší koncentrací. Množství rozpuštěného kyslíku a solnost (podle potřeby) se měří alespoň třikrát (na začátku, uprostřed a na konci zkoušky). U semistatických zkoušek se doporučuje měřit množství rozpuštěného kyslíku častěji, nejlépe před každým obnovením média a po něm, nebo alespoň jednou týdně. pH se měří na začátku a na konci každé výměny vody u semistatických zkoušek a alespoň týdně u průtokových zkoušek. Tvrdost vody se měří v každé zkoušce jednou. Teplota se měří denně, nejlépe nepřetržitě alespoň v jedné zkušební nádrži.

  1. účinné od 1. 5. 2004XV.1.7.5 Pozorování
    1. účinné od 1. 5. 2004XV.1.7.5.1 Stádia vývoje embrya

      účinné od 1. 5. 2004Embryonální stádium (tj. stadium gastruly) na začátku expozice zkoušené látce by mělo být identifikováno co nejpřesněji. Lze to provést za použití reprezentativního vzorku vhodně uchovávaných a očištěných jiker. Popis a vyobrazení embryonálních stádií lze také nalézt v literatuře (2, 5, 10, 11).

    1. účinné od 1. 5. 2004XV.1.7.5.2 Líhnutí a přežívání
      1. účinné od 1. 5. 2004Líhnutí a přežívání se pozoruje alespoň jednou denně a zaznamenávají se počty. Může být žádoucí provádět na začátku zkoušky častější pozorování (např. každých 30 min během prvních tří hodin), neboť v některých případech mohou být důležitější doby přežití než pouhé počty úhynů (např. dochází-li k akutním toxickým účinkům). Uhynulá embrya a plůdky se odstraní ihned po nalezení, neboť se rychle rozkládají. Při odstraňování uhynulých jedinců se postupuje s mimořádnou opatrností, aby se nezasáhlo do sousedních jiker/plůdků nebo aby se tyto fyzicky nepoškodily, neboť jsou mimořádně subtilní a citlivé. Kritéria uhynutí se u životních stádií liší:
        1. účinné od 1. 5. 2004— u jiker: zejména v časných stádiích zřetelná ztráta průsvitnosti a změna ve zbarvení vyvolané koagulací a/nebo sražením bílkovin vedoucími k bílému zakalení,
        2. účinné od 1. 5. 2004— u embryí: absence pohybu nebo tepu srdce nebo neprůsvitné zbarvení u druhů, jejichž embrya jsou za normálních okolností průsvitná,
        3. účinné od 1. 5. 2004— u plůdků: nepohyblivost nebo absence dýchacích pohybů nebo tepu srdce nebo bílé neprůsvitné zbarvení centrálního nervového systému a nedostatečná reakce na mechanické podněty.
    1. účinné od 1. 5. 2004XV.1.7.5.3 Neobvyklý vzhled

      účinné od 1. 5. 2004Počet plůdků vykazujících neobvyklý tělesný vzhled nebo pigmentaci a stav absorpce žloutkového váčku se zaznamenávají v přiměřených intervalech závisejících na délce zkoušky a na povaze popisované odchylky. Je třeba si uvědomit, že neobvyklá embrya a plůdky se přirozeně vyskytují a u některých druhů jich může být v kontrolních skupinách řádově několik procent. Neobvyklí jedinci by měli být ze zkušební nádrže odstranění pouze v případě uhynutí.

    1. účinné od 1. 5. 2004XV.1.7.5.4 Neobvyklé chování

      účinné od 1. 5. 2004Odchylky, např. hyperventilace, nekoordinované plavání a netypická nečinnost se zaznamenávají v přiměřených intervalech závisejících na délce zkoušky. Tyto účinky, přestože je obtížné je kvantifikovat, mohou – jsou-li pozorovány – napomoci interpretovat data o mortalitě, tj. mohou poskytnout informace o mechanismu toxického působení látky.

    1. účinné od 1. 5. 2004XV.1.7.5.5 Tělesná délka

      účinné od 1. 5. 2004Na konci zkoušky se doporučuje změřit individuální délku: může být změřena standardní délka, délka těla (the fork lenght) nebo celková délka. Došlo-li však k uhnití ocasní ploutve nebo k erozi ploutví, použije se standardní délka. Obecně by měl být v dobře provedených zkouškách variační koeficient pro délku mezi jednotlivými kontrolními skupinami ≤ 20 %.

    1. účinné od 1. 5. 2004XV.1.7.5.6 Hmotnost

      účinné od 1. 5. 2004Na konci se zkoušky lze stanovit jednotlivé hmotnosti; hmotnost za sucha (24 h při 60 °C) se upřednostňuje před živou váhou (po osušení do sucha). Obecně by měl být v dobře provedených zkouškách variační koeficient pro hmotnost mezi jednotlivými kontrolními skupinami ≤ 20 %.

      1. účinné od 1. 5. 2004Tato pozorování povedou k některým nebo ke všem následujícím údajům, které budou k dispozici pro statistickou analýzu:
        1. účinné od 1. 5. 2004— kumulativní mortalita,
        2. účinné od 1. 5. 2004— počet zdravých plůdků na konci zkoušky,
        3. účinné od 1. 5. 2004— čas začátku líhnutí a konce líhnutí (tj. 90% vylíhnutí v každé paralelní skupině),
        4. účinné od 1. 5. 2004— počet plůdků vylíhnutých každý den,
        5. účinné od 1. 5. 2004— délka (a hmotnost) ryb, které přežily do konce zkoušky,
        6. účinné od 1. 5. 2004— počet plůdků, které jsou deformované nebo mají neobvyklý vzhled,
        7. účinné od 1. 5. 2004— počet plůdků vykazujících neobvyklé chování.
  1. účinné od 1. 5. 2004XV.2 DATA A ZPRÁVY
    1. účinné od 1. 5. 2004XV.2.1 ZPRACOVÁNÍ VÝSLEDKŮ

      účinné od 1. 5. 2004Doporučuje se, aby se návrhu zkoušky i analýzy výsledků zkoušky účastnil statistik, neboť tato zkušební metoda umožňuje značné variace v experimentálním uspořádání, například v počtu zkušebních nádrží, v počtu zkušebních koncentrací, ve výchozím počtu oplodněných jiker v měřených parametrech. Pokud jde o možnosti uspořádání zkoušky, nejsou zde uvedeny žádné pokyny.

      účinné od 1. 5. 2004Mají-li být odhadnuty hodnoty LOEC/NOEC, bude nezbytné analyzovat odchylky pro každou sadu paralelních skupin pomocí analýzy variance (ANOVA) nebo pomocí kontingenční tabulky. K vícenásobnému porovnání výsledků pro jednotlivé koncentrace a pro kontrolní skupiny může být užitečný Dunnettův test (12, 13). K dispozici jsou další užitečné příklady (14, 15). Vypočte se a uvede stupeň účinku, který lze prokázat pomocí ANOVA nebo jiných metod (tj. vypovídací schopnost zkoušky). Je třeba si uvědomit, že ne všechna pozorování uvedená v bodě 1.7.5.6 jsou vhodná pro statistickou analýzu pomocí ANOVA. Například kumulativní mortalita a počet zdravých plůdků na konci zkoušky by mohly být analyzovány probitovými metodami.

      účinné od 1. 5. 2004Mají-li být odhadnuty LC nebo ECx, proloží se daty vhodná křivka (vhodné křivky), jako např. logaritmická křivka, a to statistickou metodou, např. metodou nejmenších čtverců nebo nelineární metodou nejmenších čtverců. Křivka nebo křivky by měly být tak parametrizovány, aby bylo možné přímo odhadnout požadované hodnoty LC nebo ECx a jejich směrodatné odchylky. To značně usnadňuje výpočet intervalů spolehlivosti pro hodnoty LC nebo ECx. Pokud nejsou dobré důvody pro upřednostnění jiných intervalů spolehlivosti, uvede se oboustranný 95% interval spolehlivosti. Metoda proložení by měla pokud možno umožnit posouzení závažnosti nedostatků proložení. Proložení lze provést graficky. Regresní analýza je vhodná pro všechna pozorování uvedená v bodě 1.7.5.6.

    1. účinné od 1. 5. 2004XV.2.2 INTERPRETACE VÝSLEDKŮ

      účinné od 1. 5. 2004Výsledky by měly být interpretovány opatrně v případě, že se naměřené koncentrace toxické látky ve zkušebních roztocích pohybují na úrovních blízkých mezi stanovitelnosti analytické metody. Interpretace výsledků pro koncentrace vyšší než je rozpustnost látky ve vodě by měla být rovněž opatrná.

    1. účinné od 1. 5. 2004XV.2.3 PROTOKOL O ZKOUŠCE

      účinné od 1. 5. 2004Protokol o zkoušce musí obsahovat následující informace:

      1. účinné od 1. 5. 2004XV.2.3.1 Zkoušená látka
        1. účinné od 1. 5. 2004— fyzikální stav a relevantní fyzikálně-chemické vlastnosti,
        2. účinné od 1. 5. 2004— údaje o chemické identitě včetně údajů o čistotě a podle potřeby o metodě kvantitativního stanovení zkoušené látky.
      1. účinné od 1. 5. 2004XV.2.3.2 Testovací druh
        1. účinné od 1. 5. 2004— vědecký název, kmen, počet matečných ryb (tj. kolik samiček bylo ve zkoušce použito pro opatření požadovaného počtu jiker), zdroj a metoda sběru oplodněných jiker a následné zpracování.
      1. účinné od 1. 5. 2004XV.2.3.3 Zkušební podmínky
        1. účinné od 1. 5. 2004— použitá zkušební metoda (např. semistatická nebo průtoková metoda, doba od oplodnění do začátku zkoušky, nasazování atd.),
        2. účinné od 1. 5. 2004— fotoperioda (fotoperiody),
        3. účinné od 1. 5. 2004— uspořádání zkoušky (např. počet zkušebních nádrží a jejich znásobení, počet embryí v nádrži),
        4. účinné od 1. 5. 2004— metoda přípravy zásobních roztoků a častost obnovení (je-li použito, uvede se solubilizační činidlo a jeho koncentrace),
        5. účinné od 1. 5. 2004— nominální zkušební koncentrace, naměřené hodnoty ve zkušebních nádržích, jejich střední hodnoty a směrodatné odchylky a metody jejich stanovení a je-li zkoušená látka rozpustná ve vodě v koncentracích nižších, než jsou vyšetřované koncentrace, uvede se důkaz toho, že naměřené koncentrace odpovídají koncentraci zkoušené látky v roztoku,
        6. účinné od 1. 5. 2004— charakteristiky ředicí vody: hodnota pH, tvrdost, teplota, koncentrace rozpuštěného kyslíku, koncentrace zbytkového chloru (je-li měřena), obsah celkového organického uhlíku, obsah suspendovaných látek, popřípadě salinita zkušebního média a výsledky jakýchkoli jiných provedených měření,
        7. účinné od 1. 5. 2004— kvalita vody ve zkušebních nádržích: pH, tvrdost, teplota a koncentrace rozpuštěného kyslíku.
      1. účinné od 1. 5. 2004XV.2.3.4 Výsledky
        1. účinné od 1. 5. 2004— výsledky případných předběžných studií stálosti zkoušené látky,
        2. účinné od 1. 5. 2004— doklady o tom, že kontrolní skupiny splnily obecné požadavky na přijatelnost přežití pro testovací druh (dodatky 2 a 3,),
        3. účinné od 1. 5. 2004— údaje o mortalitě nebo přežití v embryonálním stádiu a ve stádiu plůdku a údaje o celkové mortalitě nebo přežití,
        4. účinné od 1. 5. 2004— doba do vylíhnutí, počet vylíhnutých jedinců,
        5. účinné od 1. 5. 2004— údaje o délce (a hmotnosti),
        6. účinné od 1. 5. 2004— výskyt a popis morfologických odchylek, pokud se vyskytly,
        7. účinné od 1. 5. 2004— výskyt a popis účinků na chování, pokud se vyskytly,
        8. účinné od 1. 5. 2004— statistická analýza a zpracování dat,
        9. účinné od 1. 5. 2004— u zkoušek analyzovaných pomocí ANOVA nejnižší koncentrace s pozorovanými účinky (LOEC) na úrovni pravděpodobnosti falešně pozitivního hodnocení p = 0,05 a koncentrace bez pozorovaných účinků (NOEC) pro každou posuzovanou reakci, včetně popisu použité statistické metody a údaje o tom, jak velký účinek bylo možné odhalit,
        10. účinné od 1. 5. 2004— u zkoušek analyzovaných pomocí regresních metod, hodnoty LC a ECx a intervaly spolehlivosti a graf proloženého modelu použitého pro jejich výpočet,
        11. účinné od 1. 5. 2004— vysvětlení jakékoli odchylky od této zkušební metody.
  1. účinné od 1. 5. 2004XV.3 LITERATURA

    účinné od 1. 5. 2004(1) Kristensen P. (1990). Evaluation of the Sensitivity of Short Term Fish Early Life Stage Tests in Relation to other FELS Test Methods. Final report to the Commission of the European Communities, 60 str., červen 1990.

    účinné od 1. 5. 2004(2) ASTM (1988). Standard Guide for Conducting Early Life-Stage Toxicity Tests with Fishes. American Society for Testing and Materials. E 1241-88. 26 str.

    účinné od 1. 5. 2004(3) Brauhn J. L., Schoettger R. A. (1975). Acquisition and Culture of Research Fish: Rainbow trout, Fathead minnows, Channel Catfish and Bluegills. str. 54, Ecological Research Series, EPA-660/3-75-011, Duluth, Minnesota.

    účinné od 1. 5. 2004(4) Brungs W. A., Jones B. R. (1977). Temperature Criteria for Freshwater Fish: Protocol and Procedures. str. 128, Ecological Research Series EPA-600/3-77-061, Duluth, Minnesota.

    účinné od 1. 5. 2004(5) Laale H. W. (1977). The Biology and Use of the Zebrafish (Brachydanio rerio) in Fisheries Research. A Literature Review. J. Biol. 10, 121-173.

    účinné od 1. 5. 2004(6) Legault R. (1958). A Technique for Controlling the Time of Daily Spawning and Collecting Eggs of the Zebrafish, Brachydanio rerio (Hamilton-Buchanan) Copeia, 4, 328-330.

    účinné od 1. 5. 2004(7) Dave G., Damgaard B., Grande M., Martelin J. E., Rosander B., Viktor T. (1987). Ring Test of an Embryo-larval Toxicity Test with Zebrafish (Brachydanio rerio) Using Chromium and Zinc as Toxicants. Environ. Toxicol. Chem., 6, 61-71.

    účinné od 1. 5. 2004(8) Birge J. W., Black J. A., Westerman A. G. (1985). Short-term Fish and Amphibian Embryo-larval Tests for Determining the Effects of Toxicant Stress on Early Life Stages and Estimating Chronic Values for Single Compounds and Complex Effluents. Environ. Toxicol. Chem., 4, 807-821.

    účinné od 1. 5. 2004(9) Van Leeuwen C. J., Espeldoorn A., Mol F. (1986). Aquatic Toxicological Aspects of Dithiocarbamates and Related Compounds. III. Embryolarval Studies with Rainbow Trout (Salmo gairdneri). J. Aquatic Toxicology, 9, 129-145.

    účinné od 1. 5. 2004(10) Kirchen R. V., W. R. West (1969). Teleostean Development. Carolina Tips 32(4): 1-4. Carolina Biological Supply Company.

    účinné od 1. 5. 2004(11) Kirchen R. V., W. R. West (1976). The Japanese Medaka. Its care and Development. Carolina Biological Supply Company, North Carolina. 36 str.

    účinné od 1. 5. 2004(12) Dunnett C. W. (1955). A Multiple Comparisons Procedure for Comparing Several Treatments with Control. J. Amer. Statist. Assoc., 50, 1096-1121.

    účinné od 1. 5. 2004(13) Dunnett C. W. (1964). New Tables for Multiple Comparisons with a Control. J. Amer. Statist. Assoc, 20, 482-491.

    účinné od 1. 5. 2004(14) Mc Clave J. T., Sullivan J. H., Pearson J.G. (1980). Statistical Analysis of Fish Chronic Toxicity Test Data. Proceedings of 4th Aquatic Toxicology Symposium, ASTM, Filadelfie.

    účinné od 1. 5. 2004(15) Van Leeuwen C. J., Adema D. M. M., Hermes J. (1990). Quantitative Structure-Activity Relationships for Fish Early Life Stage Toxicity. Aquatic Toxicology, 16, 321-334.

    účinné od 1. 5. 2004(16) Environment Canada. (1992). Toxicity Tests Using Early Life Stages of Salmonid Fish (Rainbow Trout, Coho Salmon or Atlantic Salmon). Biological Test Method Series. Report EPS 1/RM/28, prosinec 1992, 81 str.

    účinné od 1. 5. 2004(17) Dave G., Xiu R. (1991). Toxicity of Mercury, Nickel, Lead and Cobalt to Embryos and Larvae of Zebrafish, Brachydanio rerio. Arch. Environ. Contam. Toxicol., 21, 126-134.

    účinné od 1. 5. 2004(18) Meyer A., Bierman C. H., Orti G. (1993). The phylogenetic position of the Zebrafish (Danio rerio), a model system in developmental biology – an invitation to the comperative methods. Proc. Royal Society of London, Series B, 252: 231-236.

    účinné od 1. 5. 2004(19) Ghillebaert F., Chaillou C., Deschamps F., Roubaud P. (1995). Toxic Effects, at Three pH Levels, of Two Reference Molecules on Common Carp Embryo. Ecotoxicol. Environ. Safety, 32, 19-28.

    účinné od 1. 5. 2004(20) US EPA, (1991). Guidelines for Culturing the Japanese Medaka, Oryzias latipes. EPA report EPA/600/3-91/064, Dec. 1991, EPA, Duluth.

    účinné od 1. 5. 2004(21) US EPA, (1991). Guidelines for Conducting Early Life Stage Toxicity Tests with Japanese Medaka, (Oryzias latipes). EPA report EPA/600/3-91/063, prosinec. 1991, EPA, Duluth.

    účinné od 1. 5. 2004(22) De Graeve G. M., Cooney J. D., McIntyre D. O., Poccocic T. L., Reichenbach N. G., Dean J. H., Marcus M. D. (1991). Validity in the performance of the seven-day Fathead minnow (Pimephales promelas) larval survival and growth test: an intra- and interlaboratory study. Environ. Toxicol. Chem. 10, 1189-1203.

    účinné od 1. 5. 2004(23) Calow P. (1993). Handbook of Ecotoxicology, Blackwells, Oxford. Vol. 1, Chapter 10: Methods for spawning, culturing and conducting toxicity tests with Early Life stages of Estuarine and Marine fish.

    účinné od 1. 5. 2004(24) Balon E. K. (1985). Early life history of fishes: New developmental, ecological and evolutionary perspectives, Junk Publ., Dordrecht, 280 str.

    účinné od 1. 5. 2004(25) Blaxter J. H. S. (1988). Pattern and variety in development, v: W. S. Hoar, D. J. Randall eds., Fish Physiology, Vol. XIA, Academic press, 1-58.

účinné od 1. 5. 2004TABULKA 1A: Druhy ryb doporučené pro zkoušku

účinné od 1. 5. 2004
TABULKA 1A: Druhy ryb doporučené pro zkoušku
Sladkovodní
Oncorhynchus mykiss
pstruh duhový (9, 16)
Danio rerio
 danio pruhované (7, 17, 18)
Cyprinus caprio
 kapr obecný (8, 19)
Oryzias latipes
 halančík japonský (20, 21)
Pimephales promelas
 střevle (8, 22)

účinné od 1. 5. 2004TABULKA 1B: Příklady dalších dobře popsaných druhů, které byly také použity

účinné od 1. 5. 2004
TABULKA 1A: Druhy ryb doporučené pro zkoušku TABULKA 1B: Příklady dalších dobře popsaných druhů, které byly také použity
SladkovodníMořské
Carassius auratus
 karas zlatý (8)		Menidia peninsulae
 (23, 24, 25)
Lepomis macrochirus
 slunečnice modrá (8)		Clupea harengus
 sleď (24, 25)
Gadus morhua
 treska (24, 25)
Cyprinodon variegatus
 (23, 24, 25)

účinné od 1. 5. 2004DODATEK 1

účinné od 1. 5. 2004NÁVOD K PROVEDENÍ ZKOUŠKY TOXICITY NA EMBRYÍCH A VÁČKOVÝCH PLŮDCÍCH DANIA PRUHOVANÉHO (BRACHYDANIO RERIO)

účinné od 1. 5. 2004ÚVOD

účinné od 1. 5. 2004Danio pruhované pochází z indického pobřeží Coromandel, kde žije v bystřinách. Je běžnou akvarijní rybou z čeledi kaprovitých. Informace o péči o něj a o jeho chovu jsou uvedeny v standardních příručkách o tropických rybách. Přehled jeho biologie a použití ve výzkumu ryb podává Laale (1).

účinné od 1. 5. 2004Ryba zřídka dorůstá délky více než 45 mm. Má válcové tělo se 7 – 9 horizontálními tmavě modrými stříbřitými pruhy. Pruhy pokračují přes ocasní a řitní ploutve. Hřbet má olivově zelený. Samečci jsou štíhlejší než samičky. Samičky jsou stříbrnější a mají rozšířené břicho, zejména před třením.

účinné od 1. 5. 2004Dospělé ryby dokáží snášet velké kolísání teploty, pH a tvrdosti vody. Mají-li se získat zdravé ryby poskytující jikry dobré kvality, měly by být zajištěny optimální podmínky.

účinné od 1. 5. 2004Při tření sameček sleduje samičku, doráží na ni a při vypuzení jiker je oplodní. Jikry, které jsou průsvitné a nejsou přilnavé, dopadají na dno, kde mohou být pozřeny rodiči. Na tření má vliv světlo. Při odpovídajícím ranním světle se ryby třou v prvních hodinách po rozednění.

účinné od 1. 5. 2004Samička může klást v odstupu jednoho týdne dávky o několika tisících jiker.

účinné od 1. 5. 2004PODMÍNKY PRO MATEČNÉ RYBY, REPRODUKCE A ČASNÁ VÝVOJOVÁ STÁDIA

účinné od 1. 5. 2004Vybere se vhodný počet zdravých ryb, které se alespoň dva týdny před předpokládaným třením udržují ve vhodné vodě (např. dodatek 4). Skupiny ryb by měly mít možnost se před kladením jiker pro zkoušku alespoň jednou vytřít. Hustota obsádky ryb by v tomto období neměla přesáhnout 1 gram ryb na litr. Pravidelná výměna vody nebo použití přečišťovacího systému umožní obsádku zvýšit. Teplota v chovných nádržích se má udržovat na 25 ± 2 °C. Ryby by měly dostávat rozmanitou stravu, která může obsahovat například komerční suché krmivo, čerstvě vylíhnuté Arthemia, chironomidy, dafnie, bílé červy (Enchytraeids).

  1. účinné od 1. 5. 2004Dále jsou uvedeny dvě metody, které v praxi vedly k získání dostatečného množství zdravých oplodněných jiker pro provedení zkoušky:
    1. účinné od 1. 5. 2004i) Osm samiček a 16 samečků se umístí do nádrže obsahující 50 litrů ředicí vody, chráněné před přímým světlem a ponechají se alespoň 48 h co nejvíce v klidu. Na dno nádrže se odpoledne v den před započetím zkoušky umístí podložka pro tření. Podložka pro tření se skládá z 5 – 7 mm vysokého rámu (z plexiskla nebo jiného vhodného materiálu) s 2 – 5mm hrubým roštem nahoře a s 10 – 30µm jemným roštem vespod. Na hrubém roštu je připevněn třecí substrát vyrobený z nylonových vláken. Poté co byly ryby drženy 12 h v temnu se slabě nasvítí, čímž se vyvolá tření. Dvě až čtyři hodiny po vytření se podložka pro tření vyjme a jikry se seberou. Podložka pro tření zabrání rybám v požírání jiker a zároveň umožní snadný sběr jiker. Skupiny ryb by se měly před třením určeným k produkci jiker pro zkoušku vytřít alespoň jednou.
    2. účinné od 1. 5. 2004ii) Pět až deset samečků a samiček se alespoň dva týdny před zamýšleným třením chová odděleně. Po 5 až 10 dnech se břicha samiček rozšíří a zviditelní se jejich pohlavní papily. Samečci papily nemají. Tření se provede v třecích nádržích opatřených falešným dnem z pletiva (jako výše). Nádrž se naplní ředicí vodou tak, aby voda sahala 5 – 10 cm nad rošt. Jedna samička a dva samečci se umístí do nádrže den před zamýšleným třením. Teplota vody se postupně zvýší jeden stupeň nad aklimatizační teplotu. Vypne se osvětlení a nádrž se ponechá co nejvíce v klidu. Ráno se slabě nasvítí, čímž se vyvolá tření. Po 2 – 4 h se ryby vyjmou a jikry se seberou. Je-li potřeba více dávek jiker, než lze získat od jedné samičky, nasadí se paralelně dostatečný počet třecích nádrží. Zaznamenáním reprodukční úspěšnosti (množství a kvality) jednotlivých samiček před zkouškou, lze vybrat pro chov samičky s nejvyšší úspěšností.

účinné od 1. 5. 2004Jikry se přenesou do zkušebních nádrží skleněnou trubičkou (o vnitřním průměru ne menším než 4 mm) opatřenou pružným nasávacím balónkem. Množství vody, které se přenáší s jikrami, by mělo být co nejmenší. Jikry jsou těžší než voda a z trubičky vypadnou do vody. Je třeba zabránit tomu, aby jikry (a plůdky) přišly do kontaktu se vzduchem. Mikroskopickým vyšetřením vzorku (vzorků) jiker se ověří, že v prvních stádiích vývoje nedošlo k nepravidelnostem. Desinfekce jiker není přípustná.

účinné od 1. 5. 2004Mortalita jiker je nejvyšší během prvních 24 h po oplodnění. V této době je často pozorována mortalita 5 – 40 %. Jikry degenerují v důsledku neúspěšného oplodnění nebo vývojových vad. Zdá se, že kvalita dávek jiker závisí na samičce, neboť některé samičky soustavně kladou jikry dobré kvality, jakou jiné samičky neposkytují. Rovněž rychlost vývoje a líhnutí se mezi snůškami liší. Úspěšně oplodněné jikry a plůdky se žloutkovým váčkem přežívají dobře, obvykle jich přežívá více než 90 %. Při 25 °C se z jiker líhnou jedinci po 3 – 5 dnech po oplodnění a žloutkový váček je absorbován přibližně po 13 dnech po oplodnění.

účinné od 1. 5. 2004Embryonální vývoj byl dobře popsán Hisaokou a Battlem (2). Díky průsvitnosti jiker a plůdků čerstvě po vylíhnutí lze vývoj ryb dobře sledovat a lze pozorovat malformace. Přibližně čtyři hodiny po vytření lze rozlišit neoplodněné jikry od oplodněných (3). K tomuto vyšetření se jikry a plůdky umístí do nádobky o malém objemu a prohlížejí se pod mikroskopem.

účinné od 1. 5. 2004Zkušební podmínky požadované pro časná vývojová stádia jsou uvedena v dodatku 2. Optimální hodnoty pH a tvrdosti vody jsou 7,8 a 250 mg/l, vyjádřeno jako CaCO3.

účinné od 1. 5. 2004VÝPOČTY A STATISTIKA

účinné od 1. 5. 2004Navrhuje se dvoufázový přístup. V první fázi se statisticky analyzují data o mortalitě, nenormálním vývoji a době líhnutí. Poté se pro ty koncentrace, při nichž nebyly pozorovány žádné nepříznivé účinky na tyto parametry, statisticky vyhodnotí tělesná délka. Tento přístup se doporučuje, neboť toxická látka může selektivně usmrcovat menší ryby, prodlužovat dobu líhnutí a indukovat makroskopické malformace a tedy zkreslovat délku. Kromě toho tak bude pro každou expozici měřen zhruba stejný počet ryb, čímž se zajistí validita statistiky zkoušky.

účinné od 1. 5. 2004STANOVENÍ LC50 a EC50

  1. účinné od 1. 5. 2004Procento přežití jiker a čerstvých plůdků se vypočte a zkoriguje na mortalitu v kontrolních skupinách podle Abbottovy rovnice (4):

    účinné od 1. 5. 2004

    1. účinné od 1. 5. 2004kde:
      1. účinné od 1. 5. 2004P = korigované procento přežití
      2. účinné od 1. 5. 2004P´ = procento přežití pozorované ve zkušební koncentraci
      3. účinné od 1. 5. 2004C = procento přežití v kontrolní skupině

účinné od 1. 5. 2004Podle možnosti se vhodnou metodou stanoví hodnota LC50 na konci zkoušky.

účinné od 1. 5. 2004Požaduje-li se, aby byly do statistiky pro EC50 zahrnuty morfologické odchylky, lze k tomu nalézt návod v práci Stephana (5).

účinné od 1. 5. 2004ODHAD LOEC A NOEC

účinné od 1. 5. 2004Cílem zkoušky na jikrách a váčkových plůdcích je porovnat koncentrace, u nichž byl pozorovatelný účinek, s kontrolními skupinami, tj. stanovit LOEC. Použije se tedy metoda vícenásobného srovnání (6, 7, 8, 9, 10).

účinné od 1. 5. 2004LITERATURA

účinné od 1. 5. 2004(1) Laale H. W. (1977). The Biology and Use of the Zebrafish (Brachydanio rerio) in Fisheries Research. A Literature Review. J. Fish Biol. 10, 121-173.

účinné od 1. 5. 2004(2) Hisaoka K. K., Battle H. I. (1958). The Normal Development Stages of the Zebrafish Brachydanio rerio (Hamilton-Buchanan), J. Morph., 102, 311 str.

účinné od 1. 5. 2004(3) Nagel R. (1986). Untersuchungen zur Eiproduktion beim Zebrab‰rbling (Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan). J. Appl. Ichthyol., 2, 173-181.

účinné od 1. 5. 2004(4) Finney D. J. (1971). Probit Analysis, 3rd ed., Cambridge University Press, Great Britain, 1-333.

účinné od 1. 5. 2004(5) Stephan C. E. (1982). Increasing the Usefulness of Acute Toxicity Tests. Aquatic Toxicology and Hazard Assessment: Fifth Conference, ASTM STP 766, J. G. Pearson, R. B. Foster, W. E. Bishop, Eds., American Society for Testing and Materials, 69-81.

účinné od 1. 5. 2004(6) Dunnett C. W. (1955). A Multiple Comparisons Procedure for Comparing Several Treatments with a Control. J. Amer. Statist. Assoc., 50, 1096-1121.

účinné od 1. 5. 2004(7) Dunnett C. W. (1964). New Tables for Multiple Comparisons with a Control. J. Amer. Statist. Assoc, 20, 482-491.

účinné od 1. 5. 2004(8) Williams D. A. (1971). A Test for Differences Between Treatment Means when Several Dose Levels are Compared with a Zero Dose Control. J. Amer. Statist. Assoc, 27, 103-117.

účinné od 1. 5. 2004(9) Williams D. A. (1972). The Comparison of Several Dose Levels with a Zero Dose Control. J. Amer. Statist. Assoc 28, 519-531.

účinné od 1. 5. 2004(10) Sokal R. R., Rohlf F. J. (1981). Biometry, the Principles and Practice of Statistics in Biological Research, W. H. Freeman, Co., San Francisco.

účinné od 1. 5. 2004DODATEK 2

účinné od 1. 5. 2004ZKUŠEBNÍ PODMÍNKY, DÉLKA ZKOUŠKY A KRITÉRIA PŘEŽITÍ PRO DOPORUČENÉ DRUHY

účinné od 1. 5. 2004
TABULKA 1A: Druhy ryb doporučené pro zkoušku TABULKA 1B: Příklady dalších dobře popsaných druhů, které byly také použity DODATEK 1 NÁVOD K PROVEDENÍ ZKOUŠKY TOXICITY NA EMBRYÍCH A VÁČKOVÝCH PLŮDCÍCH DANIA PRUHOVANÉHO (BRACHYDANIO RERIO) ÚVOD PODMÍNKY PRO MATEČNÉ RYBY, REPRODUKCE A ČASNÁ VÝVOJOVÁ STÁDIA VÝPOČTY A STATISTIKA STANOVENÍ LC50 a EC50 ODHAD LOEC A NOEC LITERATURA DODATEK 2 ZKUŠEBNÍ PODMÍNKY, DÉLKA ZKOUŠKY A KRITÉRIA PŘEŽITÍ PRO DOPORUČENÉ DRUHY
DruhTeplota
(°C)		Salinita (‰)Fotoperioda (h)Délka stádií (d)Typická délka zkouškyPřežití v kontrolních skupinách
(minimální hodnota v %)
EmbryoVáčkový plůdekÚspěšnost líhnutíPo vylíhnutí
SLADKOVODNÍ
Brachydanio rerio Danio
 pruhované		25 ± 1—12-163-58-10Pokud možno ihned od oplodnění
(od časného stádia gastruly) do
5 dnů po vylíhnutí (8 - 10 dnů)		8090
Oncorhynchus mykiss
Pstruh duhový		10 ± 1 (1)
12 ± 1 (2)		—0(3)30-3525-30Pokud možno ihned od oplodnění
(od časného stádia gastruly) do
20 dnů po vylíhnutí (50 - 55 dnů)		6670
Cyprinus carpio
 Kapr obecný		21-25—12-165> 4Pokud možno ihned od oplodnění
(od časného stádia gastruly) do
4 dnů po vylíhnutí (8 - 9 dnů)		8075
Oryzias latipes
Halančík japonský		24 ± 1 (1)
23 ± 1 (2)		—12-168-114-8Pokud možno ihned od oplodnění
(od časného stádia gastruly ) do
5 dnů po vylíhnutí (13 - 16 dnů)		8080
Pimephales promelas
 Střevle		25 ± 2—164-55Pokud možno ihned od oplodnění
(od časného stádia gastruly) do
4 dnů po vylíhnutí (8 - 9 dnů)		6070
  • účinné od 1. 5. 20041 Pro embrya.
  • účinné od 1. 5. 20042 Pro plůdky.
  • účinné od 1. 5. 20043 Temno pro embrya a plůdky do jednoho týdne po vylíhnutí, s výjimkou okamžiků prohlídky. Poté po dobu zkoušky tlumené světlo.

    • účinné od 1. 5. 2004DODATEK 3

    účinné od 1. 5. 2004ZKUŠEBNÍ PODMÍNKY, DÉLKA ZKOUŠKY A KRITÉRIA PŘEŽITÍ PRO JINÉ DOBŘE POPSANÉ DRUHY

    účinné od 1. 5. 2004
    TABULKA 1A: Druhy ryb doporučené pro zkoušku TABULKA 1B: Příklady dalších dobře popsaných druhů, které byly také použity DODATEK 1 NÁVOD K PROVEDENÍ ZKOUŠKY TOXICITY NA EMBRYÍCH A VÁČKOVÝCH PLŮDCÍCH DANIA PRUHOVANÉHO (BRACHYDANIO RERIO) ÚVOD PODMÍNKY PRO MATEČNÉ RYBY, REPRODUKCE A ČASNÁ VÝVOJOVÁ STÁDIA VÝPOČTY A STATISTIKA STANOVENÍ LC50 a EC50 ODHAD LOEC A NOEC LITERATURA DODATEK 2 ZKUŠEBNÍ PODMÍNKY, DÉLKA ZKOUŠKY A KRITÉRIA PŘEŽITÍ PRO DOPORUČENÉ DRUHY DODATEK 3 ZKUŠEBNÍ PODMÍNKY, DÉLKA ZKOUŠKY A KRITÉRIA PŘEŽITÍ PRO JINÉ DOBŘE POPSANÉ DRUHY
    DruhTeplota
    (°C)    		Salinita
    (‰)    		Fotoperioda
    (h)    		Délka stádií
    (d)    		Typická délka zkouškyPřežití v kontrolních
    skupinách
    (minimální hodnota v %)
    EmbryoVáčkový plůdekÚspěšnost líhnutíPo vylíhnutí
    SLADKOVODNÍ
    Carassius auratus
    karas zlatý    		24 ± 1——3-4> 4Pokud možno ihned od oplodnění
    (od časného stádia gastruly) do
    4 dnů po vylíhnutí (7 dnů)    		—80
    Leopomis macrochirus
     slunečnice modrá    		21 ± 1—163> 4Pokud možno ihned od oplodnění
    (od časného stádia gastruly) do
    4 dnů po vylíhnutí (7 dnů)    		—75
    MOŘSKÝ
    Menidia peninsulae22-2515-22121,510Pokud možno ihned od oplodnění
    (od časného stádia gastruly) do
    5 dnů po vylíhnutí (6 - 7 dnů)    		8060
    Clupea harengus
     Sleď    		10± 18-151220-253-5Pokud možno ihned od oplodnění
    (od časného stádia gastruly) do 3 dnů po vylíhnutí (23 - 27 dnů)    		6080
    Gadus morhua
     Treska    		5± 15-301214-163-5Pokud možno ihned od oplodnění
    (od časného stádia gastruly) do
    3 dnů po vylíhnutí (18 dnů)    		6080
    Cyprinodon variegatus25 ± 115-3012——Pokud možno ihned od oplodnění
    (od časného stádia gastruly) do
    4/7 dnů po vylíhnutí (28 dnů)    		> 7580

    účinné od 1. 5. 2004DODATEK 4

    účinné od 1. 5. 2004NĚKTERÉ CHEMICKÉ CHARAKTERISTIKY PŘIJATELNÉ ŘEDICÍ VODY

    účinné od 1. 5. 2004
    TABULKA 1A: Druhy ryb doporučené pro zkoušku TABULKA 1B: Příklady dalších dobře popsaných druhů, které byly také použity DODATEK 1 NÁVOD K PROVEDENÍ ZKOUŠKY TOXICITY NA EMBRYÍCH A VÁČKOVÝCH PLŮDCÍCH DANIA PRUHOVANÉHO (BRACHYDANIO RERIO) ÚVOD PODMÍNKY PRO MATEČNÉ RYBY, REPRODUKCE A ČASNÁ VÝVOJOVÁ STÁDIA VÝPOČTY A STATISTIKA STANOVENÍ LC50 a EC50 ODHAD LOEC A NOEC LITERATURA DODATEK 2 ZKUŠEBNÍ PODMÍNKY, DÉLKA ZKOUŠKY A KRITÉRIA PŘEŽITÍ PRO DOPORUČENÉ DRUHY DODATEK 3 ZKUŠEBNÍ PODMÍNKY, DÉLKA ZKOUŠKY A KRITÉRIA PŘEŽITÍ PRO JINÉ DOBŘE POPSANÉ DRUHY DODATEK 4 NĚKTERÉ CHEMICKÉ CHARAKTERISTIKY PŘIJATELNÉ ŘEDICÍ VODY
    LátkaKoncentrace
    Nerozpuštěné látky< 20 mg/l
    Celkový organický uhlík< 2 mg/l
    Nedisociovaný amoniak< 1 µg/l
    Zbytkový chlor< 10 µg/l
    Celkové organofosforové pesticidy< 50 ng/l
    Celkové organochlorové pesticidy a polychlorované bifenyly< 50 ng/l
    Celkový organický chlor< 25 ng/l
    1. účinné od 1. 5. 2004XVI. METODA PRO STANOVENÍ AKUTNÍ ORÁLNÍ TOXICITY PRO VČELU MEDONOSNOU – metoda C.16 podle přílohy směrnice 2001/59/ES
      1. účinné od 1. 5. 2004XVI.1 METODA

        účinné od 1. 5. 2004Tato zkouška akutní toxicity je replikou metody OECD TG 213 (1998).

        1. účinné od 1. 5. 2004XVI.1.1 ÚVOD

          účinné od 1. 5. 2004Tato zkouška toxicity je laboratorní metodou určenou k posouzení orální akutní toxicity přípravků na ochranu rostlin a jiných chemických látek pro dospělou dělnici včely medonosné.

          účinné od 1. 5. 2004Při posuzování a hodnocení toxických charakteristik látek může být nezbytné stanovení akutní orální toxicity pro včelu medonosnou, např. může-li dojít k expozici včel dané chemické látce. Zkouška akutní orální toxicity se provádí s cílem stanovit vlastní toxicitu pesticidů a jiných chemických látek pro včely. Výsledky této zkoušky by měly být použity pro formulování potřeby dalšího posuzování. Tato metoda může být použita zejména ve stupňovaných programech hodnocení nebezpečnosti pesticidů pro včely založených na postupném přechodu od laboratorních zkoušek k semi-polním experimentům (1). Pesticidy mohou být zkoušeny ve formě účinné látky (ú. l.) nebo ve formě formulovaných přípravků.

          účinné od 1. 5. 2004K ověření citlivosti včel a přesnosti zkušebního postupu se použije referenční látka.

        1. účinné od 1. 5. 2004XVI.1.2 DEFINICE

          účinné od 1. 5. 2004Akutní orální toxicita: je nepříznivý účinek, ke kterému dojde nejpozději do 96 h od orálního podání jedné dávky zkoušené látky.

          účinné od 1. 5. 2004Dávka: je množství požité zkoušené látky. Dávka se vyjadřuje hmotností (µg) zkoušené látky na jeden testovací organismus (µg na včelu). Skutečnou dávku u každé včely nelze vypočítat, neboť se včely krmí kolektivně. Lze však odhadnout průměrnou dávku (celkové požité množství zkoušené látky dělené počtem včel v klícce).

          účinné od 1. 5. 2004LD50 (střední letální dávka) orálně: je statisticky vypočtená jednotlivá dávka látky, která může po orálním podáním způsobit úhyn 50 % jedinců. Hodnota LD50 se vyjadřuje v µg zkoušenou látky na jednu včelu. U pesticidů muže být zkoušenou látkou buď účinná látka (ú. l) nebo formulovaný přípravek obsahující jednu nebo více účinných látek.

          účinné od 1. 5. 2004Mortalita: jedinec se považuje za uhynulý, jeli zcela nepohyblivý.

        1. účinné od 1. 5. 2004XVI.1.3 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY

          účinné od 1. 5. 2004Dospělé dělnice včely medonosné (Apis mellifera) se exponují řadě dávek zkoušené látky rozptýlené do cukerného roztoku. Včely jsou poté krmeny stejným roztokem neobsahujícím zkoušenou látku. Mortalita se zaznamenává denně během alespoň 48 hodin a porovnává se s kontrolními hodnotami. Jestliže mortalita v průběhu 24 a 48 h roste, zatímco kontrolní mortalita zůstává na přijatelné úrovni, tj. ≤ 10 %, je vhodné zkoušku prodloužit na maximálně 96 h. Výsledky zkoušky se analyzují s cílem vypočítat LD50 pro 24 h a 48 h a v případě prodloužené studie pro 72 h a 96 h.

        1. účinné od 1. 5. 2004XVI.1.4 VALIDITA ZKOUŠKY
          1. účinné od 1. 5. 2004Má-li být zkouška platná, musí být splněny následující podmínky:
            1. účinné od 1. 5. 2004— průměrná mortalita u všech kontrolních skupin nesmí na konci zkoušky překročit 10 %,
            2. účinné od 1. 5. 2004— LD50 pro referenční látku odpovídá předpokládané hodnotě.
        1. účinné od 1. 5. 2004XVI.1.5 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY
          1. účinné od 1. 5. 2004XVI.1.5.1 Včelstvo

            účinné od 1. 5. 2004Použijí se mladé dospělé včely dělnice z téhož plemena, tj. včely stejného stáří, stejně krmené, stejného druhu atd. Včely by měly být získány z přiměřeně krmeného, zdravého včelstva s matkou, pokud možno bez nemocí a se známou anamnézou a fyziologickým stavem. Měly by být vybrány ráno v den zkoušky nebo by měly být vybrány večer před zkouškou a drženy v podmínkách zkoušky do příštího dne. Vhodné jsou včely z plástů bez plůdků. Včely by neměly být vybírány brzy na jaře nebo pozdě na podzim, neboť se během těchto období fyziologicky mění. Musí-li být zkoušky provedeny brzy na jaře nebo pozdě na podzim, měly by se včely vylíhnout v inkubátoru a měly by být živeny plástovým pylem (pyl sebraný z plástu) a cukrovým roztokem. Včely ošetřované chemickými látkami, jako jsou antibiotika a prostředky proti varoáze, by neměly být použity pro zkoušky toxicity po čtyři týdny od konce posledního ošetření.

          1. účinné od 1. 5. 2004XVI.1.5.2 Podmínky chovu a krmení

            účinné od 1. 5. 2004Použijí se snadno čistitelné a dobře větrané klícky. Lze použít jakýkoli vhodný materiál, např. klícky z korozivzdorné oceli, pletiva, plastu nebo jednorázové dřevěné klícky atd. Nasazují se pokud možno skupiny po 10 včelách. Velikost zkušebních klícek by měla vyhovovat počtu včel, tj. měla by poskytovat dostatek prostoru.

            účinné od 1. 5. 2004Včely by měly být drženy v temnu v experimentální místnosti při teplotě 25 ± 2 °C. Po dobu zkoušky se zaznamenává relativní vlhkost, která je obvykle 50 – 70 %. Obsluha, včetně exponování a pozorování, může být prováděna za (denního) světla. Jako potrava se používá vodný roztok cukru o konečné koncentraci 500 g∙l-1 (50% (m/V)). Po podání zkušební dávky se podává potrava podle libosti. Systém krmení by měl umožňovat zaznamenání příjmu potravy pro každou klícku (viz bod 1.6.3.1). Lze použít skleněnou trubičku (přibližně 50 mm dlouhou, s průměrem 10 mm, zúženou na otevřeném konci na průměr asi 2 mm).

          1. účinné od 1. 5. 2004XVI.1.5.3 Příprava včel

            účinné od 1. 5. 2004Shromážděné včely se náhodně rozdělí do klícek, které se náhodně umístí v experimentální místnosti.

            účinné od 1. 5. 2004Před začátkem zkoušky mohou včely až 2 h hladovět. Doporučuje se, aby nebyla včelám před expozicí podávána potrava, aby byly na začátku zkoušky rovnocenné, pokud jde o obsah zažívacího ústrojí. Včely v agónii se před zahájením zkoušky nahradí zdravými včelami.

          1. účinné od 1. 5. 2004XVI.1.5.4 Příprava dávek

            účinné od 1. 5. 2004Je-li zkoušená látka mísitelná s vodou, může být rozptýlena přímo v 50% cukerném roztoku. U technických přípravků a látek s nízkou rozpustností ve vodě mohou být použita vehikula, jakou jsou organická rozpouštědla, emulgátory nebo dispergátory s nízkou toxicitou pro včely (např. aceton, dimethylformamid, dimethylsulfoxid). Koncentrace vehikula závisí na rozpustnosti zkoušené látky a měla by být stejná pro všechny zkoušené koncentrace. Obecně je přiměřená 1% koncentrace vehikula a neměla by být překračována.

            účinné od 1. 5. 2004Připraví se vhodné kontrolní roztoky, tzn. Použijí-li se k rozpuštění zkoušené látky rozpouštědlo nebo dispergátor, použijí se dvě samostatné kontrolní skupiny: roztok ve vodě a cukerný roztok s rozpouštědlem/nosičem v koncentraci použité v dávkách.

        1. účinné od 1. 5. 2004XVI.1.6 POSTUP
          1. účinné od 1. 5. 2004XVI.1.6.1 Zkušební a kontrolní skupiny

            účinné od 1. 5. 2004Počet zkoušených dávek a jejich opakování by měl splňovat statistické požadavky na stanovení LD50 na úrovni spolehlivosti 95 %. Zpravidla se pro zkoušku požaduje alespoň pět zkušebních koncentrací tvořících geometrickou řadu s faktorem nepřekračujícím 2,2 a pokrývajících rozsah pro LD50. Ředicí faktor a počet koncentrací pro dávkování se však stanoví s ohledem na směrnici křivky toxicity (dávka versus mortalita) a s ohledem na statistickou metodu zvolenou pro analýzu výsledků. Vhodné koncentrace pro dávky je možné zvolit pomocí orientační zkoušky.

            účinné od 1. 5. 2004Každá zkušební koncentrace se podá alespoň třem paralelním zkušební skupinám o 10 včelách. Vedle zkušebních skupin se nasadí alespoň tři kontrolní skupiny, každá o 10 včelách. Nasadí se také zkušební skupiny pro použité rozpouštědlo nebo nosič (viz bod 1.5.4).

          1. účinné od 1. 5. 2004XVI.1.6.2 Referenční látka

            účinné od 1. 5. 2004V rámci zkušebních skupin se použije referenční látka. Vyberou se alespoň tři dávky pokrývající očekávanou hodnotu LD50. Pro každou zkušební dávku se nasadí alespoň tři paralelní klícky po deseti včelách. Přednostní referenční látkou je dimethoát, pro nějž se uvádí LD50, 24 h, orálně v rozmezí 0,10 – 0,35 µg účinné látky na včelu (2). Jsou však přijatelné i jiné referenční látky, pokud lze předložit dostatek údajů pro ověření očekávané reakce na dávku (např. parathion).

          1. účinné od 1. 5. 2004XVI.1.6.3 Expozice
            1. účinné od 1. 5. 2004XVI.1.6.3.1 Podávání dávek

              účinné od 1. 5. 2004Každé zkušební skupině včel se podá 100 – 200 µl 50% vodného cukerného roztoku obsahujícího zkoušenou látku ve vhodné koncentraci. Větší objem je nezbytný u látek s nízkou rozpustností, nízkou toxicitou nebo nízkou koncentrací ve formulaci, neboť v cukerném roztoku musí být použit větší podíl. Sleduje se množství spotřebované potravy se zkoušenou látkou. Po spotřebování potravy (obvykle do 3 – 4 h) se z klícky odebere krmicí zařízení a nahradí se krmicím zařízením obsahujícím pouze cukerný roztok. Cukerný roztok se poté podává podle libosti. U některých sloučenin může vést odmítnutí potravy s vysokými koncentracemi k tomu, že je spotřebováno málo potravy nebo že se nespotřebuje žádná potrava. Po maximálně 6 h se nespotřebovaná potrava se zkoušenou látkou nahradí samotným cukerným roztokem. Stanoví se množství spotřebované potravy se zkoušenou látkou (např. měřením objemu nebo zvážení nespotřebované stravy).

            1. účinné od 1. 5. 2004XVI.1.6.3.2 Délka zkoušky

              účinné od 1. 5. 2004Zkouška trvá 48 h od okamžiku, kdy byl zkušební roztok nahrazen samotným cukerným roztokem. Vzroste-li mortalita během prvních 24 h o 10 %, zkouška se prodlouží na 96 h, pokud mortalita v kontrolních skupinách nepřekročí 10 %.

          1. účinné od 1. 5. 2004XVI.1.6.4 Pozorování

            účinné od 1. 5. 2004Mortalita se zaznamená po 4 h od zahájení zkoušky a poté po 24 h a 48 h (rozumí se po podání dávky). Jeli nezbytné pozorování prodloužit, provedou se další vyhodnocení v 24hodinových intervalech až do maximálně 96 hodin, pokud mortalita v kontrolních skupinách nepřekračuje 10 %.

            účinné od 1. 5. 2004Odhadne se množství spotřebované potravy. Porovnáním rychlostí spotřebování potravy se zkoušenou látkou a bez ní lze získat informaci o přijatelnosti potravy se zkoušenou látkou. Zaznamená se neobvyklé chování pozorované během doby zkoušky.

          1. účinné od 1. 5. 2004XVI.1.6.5 Limitní zkouška

            účinné od 1. 5. 2004V některých případech (např. očekává-li se u látky nízká toxicita) může být provedena limitní zkouška za použití 100 µg účinné látky na včelu s cílem prokázat, že LD50 je vyšší než tato hodnota. Při ní se postupuje stejným způsobem, tj. nasadí se tři paralelní zkušební skupiny pro každou zkušební koncentraci, odpovídající kontrolní skupiny, stanoví se množství spotřebované potravy s účinnou látkou a použije se referenční látka. Dojde-li k úhynům, musí se provést úplná studie. Jsou-li pozorovány subletální účinky (viz bod 1.6.4), zaznamenají se.

      1. účinné od 1. 5. 2004XVI.2 DATA A ZPRÁVY
        1. účinné od 1. 5. 2004XVI.2.1 DATA

          účinné od 1. 5. 2004Data se shrnou do tabulky, přičemž se pro každou zkušební skupinu, kontrolní skupiny a skupiny s referenční látkou uvede počet použitých včel, mortalita v každém pozorovacím čase a počet včel s nepříznivě ovlivněným chováním. Údaje o mortalitě se analyzují vhodnými statistickými metodami (např. probitovou analýzou, klouzavým průměrem, proložením binomického rozdělení) (3, 4). Sestrojí se křivky závislosti dávka-odezva pro každý čas pozorování a vypočtou se směrnice křivek a střední letální dávky (LD50) s 95% intervalem spolehlivosti. Korekce na mortalitu ve kontrolních skupinách lze provést Abbottovou korekcí (4, 5). Pokud nebyla potrava zcela spotřebována, stanoví se spotřebovaná dávka zkoušené látky na skupinu. LD50 se vyjádří v µg zkoušené látky na včelu.

        1. účinné od 1. 5. 2004XVI.2.2 PROTOKOL O ZKOUŠCE
          1. účinné od 1. 5. 2004Protokol o zkoušce musí obsahovat následující informace:
            1. účinné od 1. 5. 2004XVI.2.2.1 Zkoušená látka
              1. účinné od 1. 5. 2004— fyzikální stav a relevantní fyzikálněchemické vlastnosti (např. stálost ve vodě, tlak par),
              2. účinné od 1. 5. 2004— údaje o chemické identitě včetně strukturního vzorce, čistota, (tj. u pesticidů identita a koncentrace účinné látky (účinných látek)).
            1. účinné od 1. 5. 2004XVI.2.2.2 Testovací druh
              1. účinné od 1. 5. 2004— vědecký název, plemeno, přibližné stáří (v týdnech), metoda výběru včel, datum výběru,
              2. účinné od 1. 5. 2004— informace o včelstvech použitých pro výběr testovacích včel, včetně informací o zdravotním stavu, nemocech dospělců, o případné přípravě atd.
            1. účinné od 1. 5. 2004XVI.2.2.3 Zkušební podmínky
              1. účinné od 1. 5. 2004— teplota a relativní vlhkost v experimentální místnosti,
              2. účinné od 1. 5. 2004— podmínky chovu včetně typu, velikosti a materiálu klícek,
              3. účinné od 1. 5. 2004— metody přípravy zásobních a zkušebních roztoků (jeli použito, uvede se rozpouštědlo a jeho koncentrace),
              4. účinné od 1. 5. 2004— metoda přípravy zásobních roztoků a častost obnovení (jeli použito, uvede se solubilizační činidlo a jeho koncentrace),
              5. účinné od 1. 5. 2004— uspořádání zkoušky, např. použité zkušební koncentrace a jejich počet, počet kontrolních skupin, pro každou koncentraci a kontrolu počet paralelních klícek a počet včel na klícku,
              6. účinné od 1. 5. 2004— datum zkoušky.
            1. účinné od 1. 5. 2004XVI.2.2.4 Výsledky
              1. účinné od 1. 5. 2004— výsledky předběžné orientační zkoušky, byla-li provedena,
              2. účinné od 1. 5. 2004— primární údaje: mortalita pro každou zkoušenou koncentraci v každém čase pozorování,
              3. účinné od 1. 5. 2004— graf křivek závislosti dávka-odezva na konci zkoušky,
              4. účinné od 1. 5. 2004— hodnoty LD50 s 95% intervaly spolehlivosti pro každý doporučený čas pozorování a to pro zkoušenou látku a pro referenční látku,
              5. účinné od 1. 5. 2004— statistické metody použité pro stanovení LD50,
              6. účinné od 1. 5. 2004— mortalita v kontrolních skupinách,
              7. účinné od 1. 5. 2004— jiné pozorované nebo naměřené biologické účinky, např. neobvyklé chování včel (včetně odmítnutí zkušební dávky), rychlost spotřebování potravy v exponovaných a neexponovaných skupinách,
              8. účinné od 1. 5. 2004— jakákoli odchylka od zde popsaného zkušebního postupu a jiné důležité informace.
      1. účinné od 1. 5. 2004XVI.3 LITERATURA

        účinné od 1. 5. 2004(1) EPPO/Council of Europe (1993). Decision-Making Scheme for the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Products – Honeybees. EPPO bulletin, Vol. 23, N.1, str. 151 – 165. březen 1993.

        účinné od 1. 5. 2004(2) Gough, H. J., McIndoe, E. C., Lewis, G. B. (1994). The use of dimethoate as a reference compound in laboratory acute toxicity tests on honeybees (Apis mellifera L.), 1981 – 1992. J. Apicultur. Res. 22, str. 119 – 125.

        účinné od 1. 5. 2004(3) Litchfield, J. T., Wilcoxon, F. (1949). A simplified method of evaluating dose-effect experiments. J. Pharm. Exper. Ther., 96, str. 99 – 113.

        účinné od 1. 5. 2004(4) Finney, D. J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, London and New York.

        účinné od 1. 5. 2004(5) Abbott, W. S. (1925). A method for computing the effectiveness of an insecticide. J. Econ. Entomol. 18, str. 265 – 267.

    1. účinné od 1. 5. 2004XVII. METODA PRO STANOVENÍ AKUTNÍ KONTAKTNÍ TOXICITY PRO VČELU MEDONOSNOU – metoda C.17 podle přílohy směrnice 2001/59/ES
      1. účinné od 1. 5. 2004XVII.1 METODA

        účinné od 1. 5. 2004Tato zkouška akutní toxicity je replikou metody OECD TG 214 (1998).

        1. účinné od 1. 5. 2004XVII.1.1 ÚVOD

          účinné od 1. 5. 2004Tato zkouška toxicity je laboratorní metodou určenou k posouzení akutní kontaktní toxicity přípravků na ochranu rostlin a jiných chemických látek pro dospělou dělnici včely medonosné.

          účinné od 1. 5. 2004Při posuzování a hodnocení toxických charakteristik látek může být nezbytné stanovení akutní kontaktní toxicity pro včelu medonosnou, např. může-li dojít k expozici včel dané chemické látce. Zkouška akutní kontaktní toxicity se provádí s cílem stanovit vlastní toxicitu pesticidů a jiných chemických látek pro včely. Výsledky této zkoušky by měly být použity pro formulování potřeby dalšího posuzování. Tato metoda může být použita zejména ve stupňovaných programech hodnocení nebezpečnosti pesticidů pro včely založených na postupném přechodu od laboratorních zkoušek k semi-polním experimentům (1). Pesticidy mohou být zkoušeny ve formě účinné látky (ú. l.) nebo ve formě formulovaných přípravků. K ověření citlivosti včel a přesnosti zkušebního postupu se použije referenční látka.

        1. účinné od 1. 5. 2004XVII.1.2 DEFINICE

          účinné od 1. 5. 2004Akutní kontaktní toxicita: je nepříznivý účinek, ke kterému dojde nejpozději do 96 h od lokální aplikace jedné dávky zkoušené látky.

          účinné od 1. 5. 2004Dávka: je množství aplikované zkoušené látky. Dávka se vyjadřuje v hmotnosti (µg) zkoušené látky na jednoho zkušebního živočicha (µg na včelu).

          účinné od 1. 5. 2004LD50 (střední letální dávka) kontaktně: je statisticky vypočtená jednotlivá dávka látky, která může po kontaktní aplikaci způsobit úhyn 50 % jedinců. Hodnota LD50 se vyjadřuje v µg zkoušené látky na jednu včelu. U pesticidů muže být zkoušenou látkou buď účinná látka (ú. l) nebo formulovaný přípravek obsahující jednu nebo více účinných látek.

          účinné od 1. 5. 2004Mortalita: jedinec se považuje za uhynulý, je-li zcela nepohyblivý.

        1. účinné od 1. 5. 2004XVII.1.3 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY

          účinné od 1. 5. 2004Dospělé dělnice včely medonosné (Apis mellifera) se exponují řadě dávek zkoušené látky rozpuštěné ve vhodném nosiči přímou aplikací na hrudník (jako kapičky). Zkouška trvá 48 h. Jestliže mortalita v průběhu 24 a 48 h roste, zatímco kontrolní mortalita zůstává na přijatelné úrovni, tj. ≤ 10 %, je vhodné zkoušku prodloužit na maximálně 96 h. Mortalita se zaznamenává denně a porovnává se s kontrolními hodnotami. Výsledky zkoušky se analyzují s cílem vypočítat LD50 pro 24 h a 48 h a v případě prodloužené studie pro 72 h a 96 h.

        1. účinné od 1. 5. 2004XVII.1.4 VALIDITA ZKOUŠKY
          1. účinné od 1. 5. 2004Má-li být zkouška platná, musí být splněny následující podmínky:
            1. účinné od 1. 5. 2004— průměrná mortalita u všech kontrolních skupin nesmí na konci zkoušky překročit 10 %,
            2. účinné od 1. 5. 2004— LD50 pro referenční standard odpovídá specifikovanému rozsahu.
        1. účinné od 1. 5. 2004XVII.1.5 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY
          1. účinné od 1. 5. 2004XVII.1.5.1 Výběr včel

            účinné od 1. 5. 2004Použijí se mladé dospělé včely dělnice z téhož plemena, tj. včely stejného stáří, stejně krmené, stejného druhu atd. Včely by měly být získány z přiměřeně krmeného, zdravého včelstva s matkou, pokud možno bez nemocí a se známou anamnézou a fyziologickým stavem. Měly by být vybrány ráno v den zkoušky nebo by měly být vybrány večer před zkouškou a drženy v podmínkách zkoušky do příštího dne. Vhodné jsou včely z plástů bez plůdků. Včely by neměly být vybírány brzy na jaře nebo pozdě na podzim, neboť se během těchto období fyziologicky mění. Musí-li být zkoušky provedeny brzy na jaře nebo pozdě na podzim, měly by se včely vylíhnout v inkubátoru a měly by být živeny plástovým pylem (pyl sebraný z plástu) a cukrovým roztokem. Včely ošetřované chemickými látkami, jako jsou antibiotika a prostředky proti varoáze, by neměly být použity pro zkoušky toxicity po čtyři týdny od konce posledního ošetření.

          1. účinné od 1. 5. 2004XVII.1.5.2 Podmínky chovu a krmení

            účinné od 1. 5. 2004Použijí se snadno čistitelné a dobře větrané klícky. Lze použít jakýkoli vhodný materiál, např. klícky z korozivzdorné oceli, pletiva, plastu nebo jednorázové dřevěné klícky atd. Velikost zkušebních klícek by měla vyhovovat počtu včel, tj. klícky by měly poskytovat dostatek prostoru. Nasazují se pokud možno skupiny po 10 včelách.

            účinné od 1. 5. 2004Včely by měly být drženy v temnu v experimentální místnosti při teplotě 25 ± 2 °C. Po dobu zkoušky se zaznamenává relativní vlhkost, která je obvykle 50 – 70 %. Obsluha, včetně exponování a pozorování, může být prováděna za (denního) světla. Jako potrava se používá vodný roztok cukru o konečné koncentraci 500 g∙l-1 (50% (m/V)) a podává se za použití včelího krmítka po dobu zkoušky podle libosti. Lze použít skleněnou trubičku (přibližně 50 mm dlouhou, s průměrem 10 mm, zúženou na otevřeném konci na průměr asi 2 mm).

          1. účinné od 1. 5. 2004XVII.1.5.3 Příprava včel

            účinné od 1. 5. 2004Shromážděné včely mohou být za účelem aplikace zkušební látky narkotizovány oxidem uhličitým nebo dusíkem. Množství anestetika v době expozice by mělo být minimalizováno. Včely v agónii se před zahájením zkoušky nahradí zdravými včelami.

          1. účinné od 1. 5. 2004XVII.1.5.4 Příprava dávek

            účinné od 1. 5. 2004Zkušební látka se aplikuje jako roztok v nosiči, tj. v organickém rozpouštědle nebo ve vodě se smáčedlem. Jako organické rozpouštědlo se upřednostňuje aceton, mohou však být použity i jiná rozpouštědla s nízkou toxicitou pro včely (např. dimethylformamid, dimethylsulfoxid). U formulovaných přípravků dispergovaných ve vodě a u silně polárních organických látek nerozpustných v organických nosičových rozpouštědlech lze aplikaci usnadnit jejich rozpuštění ve slabém roztoku komerčního smáčedla (např. smáčedla Agral, Cittowett, Lubrol, Triton, Tween).

            účinné od 1. 5. 2004Připraví se vhodné kontrolní roztoky, tzn. použijí-li se k rozpuštění zkušební látky rozpouštědlo nebo dispergátor, použijí se dvě samostatné kontrolní skupiny: roztok ve vodě a roztok s rozpouštědlem/nosičem.

        1. účinné od 1. 5. 2004XVII.1.6 POSTUP
          1. účinné od 1. 5. 2004XVII.1.6.1 Zkušební a kontrolní skupiny

            účinné od 1. 5. 2004Počet zkoušených dávek a jejich paralelních experimentů by měl splňovat statistické požadavky na stanovení LD50 na hladině spolehlivosti 95 %. Zpravidla se pro zkoušku požaduje alespoň pět zkušebních koncentrací tvořících geometrickou řadu s faktorem nepřekračujícím 2,2 a pokrývajících rozsah pro LD50. Počet dávek se však stanoví s ohledem na směrnici křivky toxicity (dávka versus mortalita) a s ohledem na statistickou metodu zvolenou pro analýzu výsledků. Vhodné dávky je možné zvolit pomocí orientační zkoušky.

            účinné od 1. 5. 2004Každá zkušební koncentrace se podá alespoň třem paralelním zkušební skupinám o 10 včelách.

            účinné od 1. 5. 2004Vedle zkušebních skupin se nasadí alespoň tři kontrolní skupiny, každá o 10 včelách. Je-li použito organické rozpouštědlo nebo smáčedlo, zařadí se další tři kontrolní skupiny po 10 včelách pro rozpouštědlo a smáčedlo.

          1. účinné od 1. 5. 2004XVII.1.6.2 Referenční látka

            účinné od 1. 5. 2004V rámci zkušebních skupin musí být použita referenční látka. Vyberou se alespoň tři dávky pokrývající očekávanou hodnotu LD50. Pro každou zkušební dávku se nasadí alespoň tři paralelní klícky po 10 včelách. Upřednostňovanou referenční látkou je dimethoát, pro nějž se uvádí LD50, 24 h, kontaktně v rozmezí 0,10 – 0,30 µg účinné látky na včelu (2). Jsou však přijatelné i jiné referenční látky, pokud lze předložit dostatek údajů pro ověření očekávané reakce na dávku (např. parathion).

          1. účinné od 1. 5. 2004XVII.1.6.3 Expozice
            1. účinné od 1. 5. 2004XVII.1.6.3.1 Podávání dávek

              účinné od 1. 5. 2004U narkotizovaných včel se jednotlivě provede lokální aplikace. Včely se náhodně rozdělí do různých zkušebních a kontrolních skupin. Objem 1 µl roztoku obsahující zkušební látku ve vhodné koncentraci se aplikuje mikroaplikátorem na zádovou oblast hrudníku každé včely. Mohou být použity i jiné objemy, je-li to opodstatněné. Po aplikaci se včely umístí do zkušebních klícek a zásobí se cukerným roztokem.

            1. účinné od 1. 5. 2004XVII.1.6.3.2 Délka expozice

              účinné od 1. 5. 2004Zkouška má trvat nejlépe 48 h. Jestliže mortalita v průběhu 24 a 48 h roste, je vhodné zkoušku prodloužit na maximálně 96 h, pokud kontrolní mortalita nepřekračuje 10 %.

          1. účinné od 1. 5. 2004XVII.1.6.4 Pozorování

            účinné od 1. 5. 2004Mortalita se zaznamená po 4 h od aplikace a poté po 24 h a 48 h. Je-li nezbytné pozorování prodloužit, provedou se další vyhodnocení v 24hodinových intervalech až do maximálně 96 h, pokud mortalita v kontrolních skupinách nepřekračuje 10 %.

            účinné od 1. 5. 2004Zaznamená se neobvyklé chování pozorované během doby zkoušky.

          1. účinné od 1. 5. 2004XVII.1.6.5 Limitní zkouška

            účinné od 1. 5. 2004V některých případech (např. očekává-li se u látky nízká toxicita) může být provedena limitní zkouška za použití 100 µg účinné látky na včelu s cílem prokázat, že LD50 je vyšší než tato hodnota. Postupuje se stejným způsobem, včetně nasazení tří paralelních zkušebních skupin pro každou zkušební dávku, odpovídajících kontrolních skupin a použití referenční látky. Dojde-li k úhynům, musí se provést úplná studie. Jsou-li pozorovány subletální účinky (viz bod 1.6.4), zaznamenají se.

      1. účinné od 1. 5. 2004XVII.2. DATA A ZPRÁVY
        1. účinné od 1. 5. 2004XVII.2.1 DATA

          účinné od 1. 5. 2004Data se shrnou do tabulky, přičemž se pro každou zkušební skupinu, kontrolní skupiny a skupiny s referenční látkou uvede počet použitých včel, mortalita v každém pozorovacím čase a počet včel s nepříznivě ovlivněným chováním. Údaje o mortalitě se analyzují vhodnými statistickými metodami (např. probitovou analýzou, klouzavým průměrem, proložením binomického rozdělení) (3, 4). Sestrojí se křivky závislosti dávka-reakce pro každý čas pozorování (tj. 24 h, 48 h a podle potřeby 72 h, 96 h) a vypočtou se směrnice křivek a střední letální dávky (LD50) s 95% intervalem spolehlivosti. Korekce na mortalitu v kontrolních skupinách lze provést Abbottovou korekcí (4, 5). LD50 se vyjádří v µg zkušební látky na včelu.

        1. účinné od 1. 5. 2004XVII.2.2 PROTOKOL O ZKOUŠCE

          účinné od 1. 5. 2004Protokol o zkoušce musí obsahovat následující informace:

          1. účinné od 1. 5. 2004XVII.2.2.1 Zkoušená látka
            1. účinné od 1. 5. 2004— fyzikální stav a fyzikálně-chemické vlastnosti (např. stálost ve vodě, tlak par),
            2. účinné od 1. 5. 2004— údaje o chemické identitě včetně strukturního vzorce, čistota, (tj. u pesticidů identita a koncentrace účinné látky (účinných látek)).
          1. účinné od 1. 5. 2004XVII.2.2.2 Testovací druh
            1. účinné od 1. 5. 2004— vědecký název, plemeno, přibližné stáří (v týdnech), metoda výběru shromáždění včel, datum výběru,
            2. účinné od 1. 5. 2004— informace o včelstvech použitých pro shromáždění testovacích včel, včetně informací o zdravotním stavu, nemocech dospělců, o případné přípravě atd.
          1. účinné od 1. 5. 2004XVII.2.2.3 Zkušební podmínky
            1. účinné od 1. 5. 2004— teplota a relativní vlhkost v experimentální místnosti,
            2. účinné od 1. 5. 2004— podmínky chovu včetně typu, velikosti a materiálu klícek,
            3. účinné od 1. 5. 2004— metody aplikace zkoušené látky, např. použité nosně rozpouštědlo, aplikovaný objem zkušebního roztoku, použité anestetikum,
            4. účinné od 1. 5. 2004— uspořádání zkoušky, např. použité zkušební dávky a jejich počet, počet kontrolních skupin, pro každou dávku a kontrolu počet paralelních klícek a počet včel na klícku,
            5. účinné od 1. 5. 2004— datum zkoušky.
          1. účinné od 1. 5. 2004XVII.2.2.4 Výsledky
            1. účinné od 1. 5. 2004— výsledky předběžné orientační zkoušky, byla-li provedena,
            2. účinné od 1. 5. 2004— primární data: data: mortalita pro každou zkoušenou dávku v každém čase pozorování,
            3. účinné od 1. 5. 2004— graf křivek závislosti dávka-odezva na konci zkoušky;
            4. účinné od 1. 5. 2004— hodnoty LD50 s 95% intervaly spolehlivosti pro každý doporučený čas pozorování, a to pro zkoušenou látku a referenční látku,
            5. účinné od 1. 5. 2004— statistické metody použité pro stanovení LD50,
            6. účinné od 1. 5. 2004— mortalita v kontrolních skupinách,
            7. účinné od 1. 5. 2004— jiné pozorované nebo změřené biologické účinky a jakékoli neobvyklé reakce včel,
            8. účinné od 1. 5. 2004— jakákoli odchylka od zde popsaného zkušebního postupu metody a jiné důležité informace.
      1. účinné od 1. 5. 2004XVII.3 LITERATURA

        účinné od 1. 5. 2004(1) EPPO/Council of Europe (1993). Decision-Making Scheme for the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Products – Honeybees. EPPO bulletin, Vol. 23, N.1, str. 151 – 165. March 1993.

        účinné od 1. 5. 2004(2) Gough, H. J., McIndoe, E. C., Lewis, G. B. (1994). The use of dimethoate as a reference compound in laboratory acute toxicity tests on honeybees (Apis mellifera L.), 1981 – 1992. J. Apicultur. Research 22, str. 119 – 125.

        účinné od 1. 5. 2004(3) Litchfield, J. T. and Wilcoxon, F. (1949). A simplified method of evaluating dose-effect experiments. J. Pharmacol. Exper. Ther., 96, str. 99 – 113.

        účinné od 1. 5. 2004(4) Finney, D. J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, London and New York.

        účinné od 1. 5. 2004(5) Abbott, W. S. (1925). A method for computing the effectiveness of an insecticide. J. Econ. Entomol. 18, str. 265 – 267.

    1. účinné od 1. 5. 2004XVIII. METODA PRO STANOVENÍ ADSORPCE/ DESORPCE V ROVNOVÁŽNÉM STAVU – metoda C.18 podle přílohy směrnice 2001/59/ES
      1. účinné od 1. 5. 2004XVIII.1. METODA

        účinné od 1. 5. 2004Tato metoda je replikou metody OECD TG 106 pro stanovení půdní adsorpce/desorpce násadovou rovnovážnou metodou (Batch Equilibrium Method) (2000).

      1. účinné od 1. 5. 2004XVIII.1.1 ÚVOD

        účinné od 1. 5. 2004Tato metoda se opírá o okružní testy a seminář o výběru půd pro vývoj zkoušky adsorpce (1, 2, 3, 4) a rovněž o existující národní metodiky (5, 6, 7, 8, 9, 10, 11).

        účinné od 1. 5. 2004Studie adsorpce/desorpce jsou užitečné pro získávání důležitých informací o mobilitě a distribuci chemických látek v půdních, vodních a vzdušných složkách biosféry (12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21). Informace lze použít k předpovědi nebo např. odhadu dostupnosti chemické látky pro rozklad, (22, 23), transformace a příjmu organismy (24), vymývání půdním profilem, (16, 18, 19, 21, 25, 26, 27, 28); těkání z půdy (21, 29, 30); odtoku z půdního povrchu do vod (18, 31, 32). Data o adsorpci mohou být použita pro účely porovnání a modelování (19, 33, 34, 35).

        účinné od 1. 5. 2004Rozdělení chemické látky mezi půdu a vodní fázi je složitý proces, který závisí na řadě různých faktorů: na chemické povaze látky (12, 36, 37, 38, 39, 40), na charakteristikách půdy (4, 12, 13, 14, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49) a na klimatických faktorech, jako jsou srážky, teplota, sluneční svit a vítr. Početné fenomény a mechanismy účastnící se adsorpce chemické látky v půdě tedy nelze v celém rozsahu definovat zjednodušeným laboratorním modelem, na jakém je založena tato metoda. Přestože nelze tímto pokusem podchytit všechny možné případy z životního prostředí, poskytuje cenné informace o významnosti adsorpce chemické látky z hlediska životního prostředí. Viz také obecný úvod.

      1. účinné od 1. 5. 2004XVIII.1.2 POUŽITÍ

        účinné od 1. 5. 2004Tato metoda je zaměřena na odhad adsorpčního/desorpčního chování látky v půdách. Cílem je získat sorpční charakteristiky, které lze použít pro předpověď rozdělení za nejrůznějších podmínek v životním prostředí; k tomuto účelu se pro chemickou látku stanovují rovnovážné adsorpční koeficienty v různých půdách jako funkce půdních charakteristik (např. obsahu organického uhlíku, obsahu jílu, půdní textury a pH). Pro co nejširšího podchycení interakcí dané látky s půdami vyskytujícími se v přírodě musí být použity při zkoušce různé druhy půd.

        účinné od 1. 5. 2004V této metodě vyjadřuje adsorpce proces vázání chemické látky na půdní povrch; nerozlišuje se mezi různými adsorpčními procesy (fyzikální a chemickou adsorpcí) a procesy, jako jsou povrchově katalyzovaný rozklad, adsorpce velkých množství nebo chemická reakce. Adsorpce na koloidních částicích (průměr < 0,2 µm) vznikajících v půdě se nebere v úvahu.

        účinné od 1. 5. 2004Půdními parametry, které jsou považovány za nejdůležitější, jsou: obsah organického uhlíku (3, 4, 12, 13, 14, 41, 43, 44, 45, 46, 47, 48), obsah jílu a půdní textura (3, 4, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48) a pro disociující sloučeniny také pH (3, 4, 42). Dalšími půdními parametry, které mohou mít vliv na adsorpci/desorpci určité látky jsou efektivní kationtová výměnná kapacita (ECEC), obsah amorfních oxidů železa a hliníku, zejména u vulkanických a tropických půd (4) a rovněž měrný povrch (49).

        1. účinné od 1. 5. 2004Zkouška je navržena pro posouzení adsorpce chemické látky na různých druzích půd s různým obsahem organického uhlíku, jílu, různou půdní texturou a různým pH. Je trojstupňová:
          1. účinné od 1. 5. 2004Stupeň 1: Předběžná zkouška za účelem stanovení:
            1. účinné od 1. 5. 2004— poměru půda/roztok,
            2. účinné od 1. 5. 2004— rovnovážného adsorpčního času a množství zkoušené látky adsorbovaného v rovnováze,
            3. účinné od 1. 5. 2004— adsorpce zkoušené látky na stěnách zkušební nádoby a stálosti zkoušené látky v průběhu zkoušky.
          1. účinné od 1. 5. 2004Stupeň 2: Screeningová zkouška: studie adsorpční kinetiky a stanovení distribučních koeficientů Kd a Kou pro pět druhů půd a jednu koncentraci.
          2. účinné od 1. 5. 2004Stupeň 3: Stanovení Freundlichových isotherm za účelem zjištění vlivu koncentrace na velikost adsorpce na půdách.

        účinné od 1. 5. 2004Studie desorpce prostřednictvím desorpční kinetiky/ Freundlichových desorpčních isotherm (dodatek 1).

        1. účinné od 1. 5. 2004XVIII.1.3 DEFINICE A JEDNOTKY
          účinné od 1. 5. 2004
          TABULKA 1A: Druhy ryb doporučené pro zkoušku TABULKA 1B: Příklady dalších dobře popsaných druhů, které byly také použity DODATEK 1 NÁVOD K PROVEDENÍ ZKOUŠKY TOXICITY NA EMBRYÍCH A VÁČKOVÝCH PLŮDCÍCH DANIA PRUHOVANÉHO (BRACHYDANIO RERIO) ÚVOD PODMÍNKY PRO MATEČNÉ RYBY, REPRODUKCE A ČASNÁ VÝVOJOVÁ STÁDIA VÝPOČTY A STATISTIKA STANOVENÍ LC50 a EC50 ODHAD LOEC A NOEC LITERATURA DODATEK 2 ZKUŠEBNÍ PODMÍNKY, DÉLKA ZKOUŠKY A KRITÉRIA PŘEŽITÍ PRO DOPORUČENÉ DRUHY DODATEK 3 ZKUŠEBNÍ PODMÍNKY, DÉLKA ZKOUŠKY A KRITÉRIA PŘEŽITÍ PRO JINÉ DOBŘE POPSANÉ DRUHY DODATEK 4 NĚKTERÉ CHEMICKÉ CHARAKTERISTIKY PŘIJATELNÉ ŘEDICÍ VODY
          SymbolDefiniceJednotky
          Atiprocento adsorpce v čase ti%
          Aeqprocento adsorpce v adsorpční rovnováze%
          množství zkoušené látky adsorbované na půdě v čase tiµg
          množství zkoušené látky adsorbované na půdě za časový interval ∆tiµg
          množství zkoušené látky adsorbované na půdě v adsorpční rovnovázeµg
          m0množství zkoušené látky ve zkušební nádobě na začátku adsorpční zkouškyµg
          množství zkoušené látky naměřené v podílu v okamžiku tiµg
          množství zkoušené látky v roztoku v adsorpční rovnovázeµg
          mpůdamnožství půdní fáze vyjádřené v suché hmotnosti půdyg
          Czáshmotnostní koncentrace zásobního roztoku látkyµg∙cm-3
          C0počáteční hmotnostní koncentrace zkušebního roztoku v kontaktu s půdouµg∙cm-3
          hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi v čase ti, kdy je prováděna analýzaµg∙cm-3
          množství látky adsorbované na půdě v adsorpční rovnovázeµg∙cm-3
          hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi v adsorpční rovnovázeµg∙cm-3
          V0počáteční objem vodné fáze v kontaktu s půdou během adsorpční zkouškycm3
          objem podílu, ve kterém je látka stanovovánacm3
          Kddistribuční koeficient pro adsorpcicm3∙g-1
          Kouadsorpční koeficient normalizovaný na organický uhlíkcm3∙g-1
          Komdistribuční koeficient normalizovaný na obsah organického materiálucm3∙g-1
          Freundlichův adsorpční koeficientµg1-1/n(cm3)1/n∙g-1
          1/nFreundlichův exponent
          Dtiprocento desorpce v čase ti%
          D∆tiprocento desorpce za časový interval ∆ti%
          Kdeszdánlivý desorpční koeficientcm3∙g-1
          Freundlichův desorpční koeficientµg1-1/n (cm3)1/n∙g-1
          množství zkoušené látky desorbované z půdy v čase tiµg
          množství zkoušené látky desorbované z půdy za časový interval ∆tiµg
          analyticky stanovené množství látky ve vodné fázi v desorpční rovnovázeµg
          celkové množství zkoušené látky desorbované v desorpční rovnovázeµg
          množství látky, která zůstává adsorbovaná na půdě po uplynutí časového intervalu ∆tiµg
          množství látky, které zbylo (aniž se adsorbovalo) po ustavení adsorpční rovnováhy,
          a to v důsledku nekvantitativní výměny objemu vodné fáze          		µg
          množství zkoušené látky, které zůstalo adsorbované na půdě v desorpční rovnovázeµg∙g-1
          hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi v desorpční rovnovázeµg∙cm-3
          VTcelkový objem vodné fáze v kontaktu s půdou během experimentu pro studium desorpční
          kinetiky provedeného sériovou metodou          		cm3
          VRobjem supernatantu odebraného ze zkušební nádoby po dosažení adsorpční rovnováhy
          a nahrazeného stejným objemem 0,01M roztoku CaCl2          		cm3
          objem podílu odebraného k analýze od okamžiku ti během experimentu pro studium
          desorpční kinetiky provedeného sériovou metodou          		cm3
          objem roztoku odebraného ze zkušební nádoby (i) ke stanovení zkoušené látky v experimentu
          pro studium desorpční kinetiky (paralelní metoda)          		cm3
          objem roztoku odebraného ze zkušební nádoby ke stanovení zkoušené látky
          v desorpční rovnováze          		cm3
          MBmnožstevní bilance%
          mEcelkové množství zkoušené látky extrahované z půdy a ze stěn zkušební nádoby
          ve dvou krocích          		µg
          Vrecobjem supernatantu získaný po dosažení adsorpční rovnováhycm3
          Povrozdělovací koeficient oktanol/voda
          pKadisociační konstanta
          Svrozpustnost ve voděg∙l-1
        1. účinné od 1. 5. 2004XVIII.1.4 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY

          účinné od 1. 5. 2004Známé objemy roztoků zkoušené látky o známé koncentraci, značené nebo neznačené radionuklidy, se v 0,01M CaCl2 přidají k půdním vzorkům o známé sušině, které byly předběžně uvedeny do rovnováhy s 0,01M CaCl2. Směs se přiměřenou dobu protřepává. Půdní suspenze se poté oddělí centrifugací a podle požadavků zfiltruje a vodná fáze se analyzuje. Množství zkoušené látky adsorbované na půdním vzorku se vypočte z rozdílu mezi počátečním množstvím zkoušené látky v roztoku a množstvím, které v něm zbylo na konci experimentu (nepřímá metoda).

          účinné od 1. 5. 2004Alternativně lze adsorbované množství zkoušené látky stanovit také přímo analýzou půdy (přímá metoda). Tato metoda, která zahrnuje postupnou extrakci vhodným rozpouštědlem se doporučuje v případech, kdy nelze přesně stanovit rozdíl koncentrací látky v roztocích. Jde například o tyto případy: adsorpce zkoušené látky na stěnách zkušebních nádob, nestálost zkoušené látky v poměru k délce experimentu, nízká adsorpce s malou změnou koncentrace v roztoku a vysoká adsorpce, jejímž důsledkem je nízká koncentrace, kterou nelze přesně stanovit. Použije-li se látka značená radioizotopy, lze extrakci půdy obejít analýzou půdní fáze spočívající v jejím spálení a v měření kapalinovou scintilační spektrometrií. Měření kapalinovou scintilační spektrometrií je nespecifickou technikou, která nerozlišuje mezi mateřskými a transformačními produkty; měla by tedy být použita pouze tehdy, je-li zkoušené chemická látka po celou dobu studie stálá.

        1. účinné od 1. 5. 2004XVIII.1.5 INFORMACE O ZKOUŠENÉ LÁTCE

          účinné od 1. 5. 2004Chemikálie musí být analytické čistoty. Doporučuje se použití radioizotopově neznačených zkoušených látek se známým složením a alespoň 95% čistotou, nebo zkoušených látek značených radioizotopy, které mají známé složení a jsou radioizotopově čisté. U stopovačů s krátkým poločasem rozpadu musí být provedena korekce na rozpad.

          1. účinné od 1. 5. 2004Před prováděním zkoušek adsorpce-desorpce by měly být o zkoušené látce známy tyto informace:
            1. účinné od 1. 5. 2004a) rozpustnost ve vodě (A.6);
            2. účinné od 1. 5. 2004b) tlak par (A.4) a/nebo Henryho konstanta;
            3. účinné od 1. 5. 2004c) abiotický rozklad: hydrolýza jako funkce pH (C.7);
            4. účinné od 1. 5. 2004d) rozdělovací koeficient (A.8);
            5. účinné od 1. 5. 2004e) snadná rozložitelnost (C.4) nebo aerobní a anaerobní transformace v půdě;
            6. účinné od 1. 5. 2004f) pKa disociovatelných látek;
            7. účinné od 1. 5. 2004g) přímá fotolýza ve vodě (tj. UV-Vis absorpční spektrum ve vodě, kvantový výtěžek) a fotodegradace v půdě.
        1. účinné od 1. 5. 2004XVIII.1.6 POUŽITELNOST ZKOUŠKY

          účinné od 1. 5. 2004Zkouška je použitelná u látek, pro něž existuje analytická metoda s dostatečnou správností. Důležitým parametrem, který může ovlivnit spolehlivost výsledku, zejména při nepřímé metodě, je stálost zkoušené látky po celou dobu zkoušky. Je tedy nezbytné ověřit stabilitu v předběžné studii; je-li v průběhu zkoušky pozorována transformace látky, doporučuje se, aby byla v hlavní studii provedena analýza jak půdní, tak vodné fáze.

          účinné od 1. 5. 2004Obtíže mohou nastat při provádění této zkoušky u látek s nízkou rozpustností ve vodě (Sv < 10-4 g∙l-1) a rovněž u silně nabitých látek v důsledku toho, že koncentraci ve vodné fázi nelze změřit s dostatečnou správností. V těchto případech musí být podniknuty další kroky. Doporučení pro řešení těchto problémů je uvedeno v příslušných částech této metody.

          účinné od 1. 5. 2004Při zkoušení těkavých látek je třeba dbát na to, aby nedošlo v průběhu studie ke ztrátám.

        1. účinné od 1. 5. 2004XVIII.1.7 POPIS METODY
          1. účinné od 1. 5. 2004XVIII.1.7.1 Přístroje, pomůcky a reakční činidla
            1. účinné od 1. 5. 2004Standardní laboratorní vybavení, zejména:
              1. účinné od 1. 5. 2004a) Zkumavky nebo nádoby pro provedení experimentů. Je důležité, aby tyto zkumavky nebo nádoby
                1. účinné od 1. 5. 2004— patřily k centrifuze, aby se minimalizovaly nepřesnosti v důsledku manipulace a přenášení,
                2. účinné od 1. 5. 2004— byly z inertního materiálu, který minimalizuje adsorpci zkoušené látky na jejich stěnách.
              1. účinné od 1. 5. 2004b) Mísicí zařízení: překlápěcí mísič nebo rovnocenné zařízení; mísič musí v průběhu mísení udržovat půdu v suspenzi.