Platné znění

Vyhláška, kterou se u chemických látek a chemických přípravků stanoví základní metody pro zkoušení fyzikálně-chemických vlastností, výbušných vlastností a vlastností nebezpečných pro životní prostředí

účinné od 1. 5. 2004Požadováno je stanovení statistické významnosti, s jakou má být daná velikost změny (např. změny rychlosti růstu) rozeznána, nebo přesnost, s jakou má být odhadnuta hodnota ECx (např. x = 10, 20 nebo 30, pokud možno ne méně než 10). Bez toho nelze stanovit přesný rozsah studie.

účinné od 1. 5. 2004Je důležité vzít na vědomí, že uspořádání, které je optimální při použití jedné metody statistické analýzy (nejlépe využívá prostředky), není nezbytně optimální pro jinou metodu. Doporučené uspořádání pro odhad LOEC/NOEC tedy nebývá stejné jako uspořádání pro analýzu regresí.

účinné od 1. 5. 2004V mnoha případech se regresní analýze dává přednost před analýzou variance, a to z důvodů diskutovaných Stephanem a Rogersem (9). Není-li však nalezen vhodný regresní model (r2 < 0,9), měl by být stanoven poměr NOEC/LOEC.

  1. účinné od 1. 5. 2004XIV.1.7.1 Uspořádání pro analýzu regresí
    1. účinné od 1. 5. 2004Pro uspořádání zkoušky, která má být analyzována regresí, jsou důležité tyto zřetele:
      1. účinné od 1. 5. 2004a) koncentrace použité ve zkoušce musí v každém případě pokrývat koncentraci vyvolávající účinek (např. EC10,20,30) a rozsah koncentrací, při nichž dochází ke sledovanému účinku. Přesnost, s jakou mohou být odhadnuty koncentrace vyvolávajících účinek, bude nejlepší, bude-li koncentrace vyvolávající účinek ležet uprostřed rozsahu zkušebních koncentrací. Při výběru vhodných zkušebních koncentrací mohou být užitečné předběžné orientační zkoušky.
      2. účinné od 1. 5. 2004b) aby mohl být vytvořen uspokojivý statistický model, měla by zkouška zahrnovat alespoň jednu kontrolní nádrž a pět dalších nádrží o různých koncentracích. Podle vhodnosti by při použití solubilizačního činidla měla být vedle zkušebních skupin nasazena jedna kontrolní skupina vystavená koncentraci solubilizačního činidla použité při nejvyšší zkušební koncentraci (viz body 1.8.3 a 1.8.4);
      3. účinné od 1. 5. 2004c) může být použita vhodná geometrická nebo logaritmická řada koncentrací (10) (viz dodatek 3). Upřednostňuje se logaritmické stupňování koncentrací;
      4. účinné od 1. 5. 2004d) je-li k dispozici více než šest nádrží, měly by být další nádrže použity buď pro duplicitní stanovení, nebo by měly být použity pro koncentrace rozložené v rozsahu koncentrací tak, aby se zmenšily rozestupy mezi koncentracemi. Obě použití lze doporučit stejnou měrou.
  1. účinné od 1. 5. 2004XIV.1.7.2 Uspořádání pro odhad NOEC/LOEC analýzou variance (ANOVA)

    účinné od 1. 5. 2004Pro každou koncentraci by měly být nejlépe k dispozici nádrže pro duplicitní stanovení, statistická analýza by měla být provedena pro každou jednotlivou nádrž (11). Bez duplicitních nádrží není možné zohlednit jinou variabilitu mezi nádržemi, než jaká je důsledkem rozdílů mezi jednotlivými rybami. Zkušenosti ale ukazují (12), že variabilita mezi nádržemi byla velmi malá ve srovnání s variabilitou v rámci nádrže (tj. mezi rybami). Relativně přijatelnou alternativou je tedy provedení statistické analýzy pro jednotlivé ryby.

    účinné od 1. 5. 2004Zpravidla se použije alespoň pět zkušebních koncentrací tvořících geometrickou řadu s faktorem nepřekračujícím 3,2.

    účinné od 1. 5. 2004Provádí-li se zkouška s duplicitními nádržemi, měl by být počet duplicitních kontrolních nádrží, a tedy i počet ryb, dvojnásobkem počtu ryb pro každou zkoušenou koncentraci, který by měl být pro všechny koncentrace stejný (13, 14, 15). Nejsou-li naproti tomu duplicitní nádrže použity, měl by být v kontrolní skupině stejný počet ryb jako ve skupině pro každou zkušební koncentraci.

    účinné od 1. 5. 2004Je-li ANOVA založena na nádržích namísto jednotlivých rybách (což by znamenalo buď ryby jednotlivě označit nebo použít „pseudospecifickou“ rychlost růstu (viz bod 2.1.2)), je nezbytné počet nádrží dostatečně znásobit, aby bylo možné stanovit odchylku pro nádrže v rámci jednotlivé koncentrace. To znamená, že by měl být počet stupňů volnosti pro chybu v analýze variance alespoň 5 (11). Jsou-li duplicitně použity pouze kontroly, existuje nebezpečí, že bude variabilita chyby vychýlena, neboť může narůstat se střední hodnotou dotyčné rychlosti růstu. Vzhledem k tomu, že rychlost růstu s největší pravděpodobností klesá s rostoucí koncentrací, povede to k nadhodnocení variability.

  1. účinné od 1. 5. 2004XIV.1.8 POSTUP
    1. účinné od 1. 5. 2004XIV.1.8.1 Výběr a vážení testovacích ryb

      účinné od 1. 5. 2004Je důležité minimalizovat rozdíly v hmotnostech ryb na začátku zkoušky. Vhodná rozpětí velikostí ryb různých druhů doporučených pro tuto zkoušku jsou uvedena v dodatku 1. Rozpětí individuálních hmotností na začátku zkoušky by mělo být pro celou násadu ryb použitých ve zkoušce nejlépe ± 10 % aritmetického průměru hmotností a v žádném případě by nemělo překročit 25 %. Doporučuje se zvážit před zkouškou menší vzorek ryb s cílem odhadnout střední hodnotu hmotnosti.

      účinné od 1. 5. 200424 hodin před zahájením zkoušky se obsádka ryb přestane krmit. Poté se provede náhodný výběr ryb. Za použití běžného anestetika (např. vodný roztok trikainmethansulfonátu (MS 222) o koncentraci 100 mg/l neutralizovaný přídavkem dvou dílů hydrogenuhličitanu sodného na jeden díl MS 222) se ryby jednotlivě s přesností uvedenou v dodatku 1 zváží za účelem stanovení živé hmotnosti (po osušení do sucha). Ryby s hmotností v požadovaném rozsahu se náhodně rozdělí do nádrží. Zaznamená se celková živá hmotnost ryb v každé zkušební nádrži. Při manipulaci s rybami za použití anestetik (včetně osušení a zvážení) může u nedospělých ryb, a zejména u druhů o malé velikosti, dojít ke stresu a poranění. S nedospělými rybami se tedy musí manipulovat s nejvyšší opatrností, aby nedošlo u zkušebních ryb ke stresu a poranění.

      účinné od 1. 5. 2004Ryby se opět zváží po 28 dnech zkoušky (viz bod 1.8.6). Považuje-li se však za nezbytné nově vypočítat přísun potravy, mohou být ryby opět zváženy po 14 dnech zkoušky (viz bod 1.8.2.3). Ke stanovení změn velikosti ryb, na jejichž základě se upravuje přísun potravy, může být použita jiná metoda, např. fotografická metoda.

    1. účinné od 1. 5. 2004XIV.1.8.2 Podmínky expozice
      1. účinné od 1. 5. 2004XIV.1.8.2.1 Délka expozice

        účinné od 1. 5. 2004Zkouška trvá více než 28 dnů.

      1. účinné od 1. 5. 2004XIV.1.8.2.2 Velikost násady a hustota obsádky

        účinné od 1. 5. 2004Je důležité, aby velikost násady a hustota obsádky vyhovovaly použitému zkušebnímu druhu (viz dodatek 1). Je-li hustota obsádky příliš vysoká, dojde ke stísnění vedoucímu ke snížené rychlosti růstu a popřípadě k nemocem. Je-li příliš nízká, může vyvolat teritoriální chování, což by mohlo rovněž ovlivnit růst. V každém případě by měla být velikost násady tak nízká, aby bylo možné udržet koncentraci rozpuštěného kyslíku na alespoň 60 % ASV bez provzdušňování. Okružní test (3) ukázal, že u pstruha duhového je velikost násady 16 ryb o hmotnosti 3 – 5 g do objemu 40 litrů přijatelná. Doporučené obnovování vody během zkoušky je 6 litrů na gram ryb za den.

      1. účinné od 1. 5. 2004XIV.1.8.2.3 Krmení

        účinné od 1. 5. 2004Ryby by měly být krmeny dostatečným množstvím vhodného krmiva (dodatek 1), aby byla umožněna přijatelná rychlost růstu. Je třeba dbát na to, aby nedošlo k růstu mikroorganismů a k zakalení vody. U pstruha duhového by mělo těmto požadavkům vyhovovat množství odpovídající 4 % jejich tělesné hmotnosti za den (3, 16, 17, 18). Denní množství může být rozděleno na dva stejné podíly a podáno rybám dvakrát za den s odstupem alespoň pěti hodin.

        účinné od 1. 5. 2004Množství se řídí počáteční hmotností ryb v jednotlivé zkušební nádrži. Ryby se opět zváží 14. den a množství se nově vypočte. 24 hodin před vážením se ryby přestanou krmit. Nespotřebovaná potrava a výkaly se ze zkušebních nádrží každý den odstraní důkladným odsátím ze dna každé nádrže.

      1. účinné od 1. 5. 2004XIV.1.8.2.4 Světlo a teplota

        účinné od 1. 5. 2004Fotoperioda a teplota vody by měly vyhovovat zkušebním druhům (dodatek 1).

    1. účinné od 1. 5. 2004XIV.1.8.3 Zkušební koncentrace

      účinné od 1. 5. 2004Obvykle je nutných pět koncentrací zkoušené látky, a to bez ohledu na uspořádání zkoušky (viz bod 1.7.2). Při volbě vhodných zkušebních koncentrací by měla pomoci předcházející znalost toxicity zkoušené látky (např. ze zkoušek akutní toxicity nebo z orientačních studií). Použije-li se méně než pět koncentrací, mělo by být uvedeno odůvodnění. Nejvyšší zkušební koncentrace by neměla překročit rozpustnost látky ve vodě.

      účinné od 1. 5. 2004Použije-li se k usnadnění přípravy zásobního roztoku solubilizační činidlo, neměla by být jeho konečná koncentrace vyšší než 0,1 ml/l a měla by být ve všech zkušebních nádržích stejná (viz bod 1.6.3). Měla by však být vynaložena maximální snaha takové látky nepoužívat.

    1. účinné od 1. 5. 2004XIV.1.8.4 Kontrolní skupiny

      účinné od 1. 5. 2004Počet kontrolních skupin v ředicí vodě závisí na uspořádání zkoušky (viz body 1.7 až 1.7.2). Použije-li se solubilizační činidlo, měl by být nasazen stejný počet kontrolních skupin se solubilizačním činidlem jako s ředicí vodou.

    1. účinné od 1. 5. 2004XIV.1.8.5 Častost analytických stanovení a měření

      účinné od 1. 5. 2004Během zkoušky se v pravidelných intervalech (viz níže) stanovují koncentrace zkoušené látky

      účinné od 1. 5. 2004Při průtokových zkouškách se průtok zásobních roztoků toxické látky a ředicí vody kontroluje v určitých intervalech, nejlépe denně, a neměl by se v průběhu zkoušky měnit o více než 10 %. Očekávají-li se změny koncentrace zkoušené látky v rozmezí ± 20 % nominálních hodnot (tj. od 80 – 120 %, viz body 1.6.2 a 1.6.3), doporučuje se, aby byly nejnižší a nejvyšší zkoušené koncentrace analyzovány na začátku zkoušky a poté v týdenních intervalech. U zkoušek, u nichž se (na základě dat o stálosti látky) nepředpokládá, že se bude koncentrace zkoušené látky pohybovat v rozmezí ± 20 % nominální hodnoty, je nezbytné analyzovat všechny zkušební koncentrace, a to stejně často jako u stabilních látek.

      účinné od 1. 5. 2004U semistatických zkoušek (s obnovením média), u nichž se má zkušební koncentrace pohybovat v rozmezí ± 20 % nominálních hodnot, se doporučuje analyzovat nejvyšší a nejnižší zkušební koncentrace na začátku studie ihned po jejich přípravě a bezprostředně před obnovením a poté v týdenních intervalech. U zkoušek, u nichž se nepředpokládá, že se bude zkušební koncentrace pohybovat v rozmezí ± 20 nominální hodnoty, musí být všechny koncentrace analyzovány stejně často jako u stabilnějších látek.

      účinné od 1. 5. 2004Doporučuje se zakládat výsledky na naměřených koncentracích. Lze-li však prokázat, že po celou dobu zkoušky byla koncentrace zkoušené látky v roztoku uspokojivě udržována v rozmezí ±20 % nominální hodnoty, mohou být výsledky založeny na nominálních nebo naměřených hodnotách.

      účinné od 1. 5. 2004Může být nezbytné vzorky filtrovat (např. přes filtr velikostí pórů 0,45 um) nebo odstředit. Doporučuje se odstřeďování. Filtrace je přípustná jen neadsorbuje-li se zkoušená látka na filtry.

      účinné od 1. 5. 2004V průběhu zkoušky se měří v každé zkušební nádrži množství rozpuštěného kyslíku, pH a teplota. Celková tvrdost, alkalita a popřípadě solnost se měří v kontrolních nádržích a v jedné nádrži s nejvyšší koncentrací. Množství rozpuštěného kyslíku a solnost (podle potřeby) se měří alespoň třikrát (na začátku, uprostřed a na konci zkoušky). U semistatických zkoušek se doporučuje měřit množství rozpuštěného kyslíku častěji, nejlépe před každým obnovením média a po něm, nebo alespoň jednou týdně. pH se měří na začátku a na konci každé výměny vody u statických zkoušek a alespoň týdně u průtokových zkoušek. Tvrdost vody a alkalita se měří v každé zkoušce jednou. Teplota se měří nejlépe nepřetržitě alespoň v jedné zkušební nádrži.

    1. účinné od 1. 5. 2004XIV.1.8.6 Pozorování

      účinné od 1. 5. 2004Hmotnost: na konci každé zkoušky se musí ryby, které přežily, zvážit za účelem XIV.stanovení živé hmotnosti (po osušení do sucha), a to buď jako skupina pro každou zkušební nádrž, nebo jednotlivě. Vážení ryb jako skupin se upřednostňuje před vážením jednotlivých ryb, které vyžaduje, aby byly ryby jednotlivě označeny. V případě vážení jednotlivých ryb pro stanovení individuální specifické rychlosti růstu by neměla zvolená technika označení vyvolávat u ryb stres (alternativou ke značení ryb vymražením značky může být popřípadě použití barevného rybářského vlasce).

      účinné od 1. 5. 2004Ryby se v průběhu zkoušky vyšetřují denně a zaznamenávají se jakékoli odchylky (hemoragie, odbarvení) a neobvyklé chování. Každý úhyn se zaznamená a uhynulé ryby se co nejdříve odstraní. Uhynulé ryby se nenahrazují, neboť velikost násady a hustota obsádky by měly být dostatečné na to, aby nedošlo k ovlivnění růstu v důsledku změn počtu ryb. Bude však nutné upravit množství krmiva.

  1. účinné od 1. 5. 2004XIV.2 DATA A ZPRÁVY
    1. účinné od 1. 5. 2004XIV.2.1 ZPRACOVÁNÍ VÝSLEDKŮ

      účinné od 1. 5. 2004Doporučuje se, aby se návrhu zkoušky i analýzy výsledků zkoušky účastnil statistik, neboť tato zkušební metoda umožňuje značné variace v experimentálním uspořádání, například v počtu zkušebních nádrží, v počtu zkušebních koncentrací, v počtu ryb. Pokud jde o možnosti uspořádání zkoušky, nejsou zde uvedeny žádné pokyny.

      účinné od 1. 5. 2004Rychlost růstu se nevypočítává pro zkušební nádrže, v nichž mortalita překročila 10 %. Velikost mortality se ale uvede pro všechny zkušební koncentrace.

      účinné od 1. 5. 2004Bez ohledu na použitou metodu je hlavním ukazatelem specifická rychlost růstu r od okamžiku t1 do t2. Může být definována několika způsoby v závislosti na tom, zda jsou či nejsou ryby individuálně značeny nebo zda se požaduje průměrná hodnota pro nádrž.

      účinné od 1. 5. 2004

      účinné od 1. 5. 2004

      účinné od 1. 5. 2004

      1. účinné od 1. 5. 2004kde:
        1. účinné od 1. 5. 2004r1 = individuální specifická rychlost růstu ryby
        2. účinné od 1. 5. 2004r2 = průměrná specifická rychlost růstu pro nádrž
        3. účinné od 1. 5. 2004r3 = „pseudospecifická“ rychlost růstu
        4. účinné od 1. 5. 2004w1, w2 = hmotnosti určité ryby v čase t1 a t2
        5. účinné od 1. 5. 2004loge w1 = logaritmus hmotnosti jednotlivé ryby na začátku vyšetřovacího intervalu
        6. účinné od 1. 5. 2004loge w2 = logaritmus hmotnosti jednotlivé ryby na konci vyšetřovacího intervalu
        7. účinné od 1. 5. 2004loge w1 = průměr logaritmů hodnot w1 pro ryby v nádrži na začátku vyšetřovacího intervalu
        8. účinné od 1. 5. 2004loge w2 = průměr logaritmů hodnot w2 pro ryby v nádrži na konci vyšetřovacího intervalu
        9. účinné od 1. 5. 2004t1, t2 = čas (ve dnech) začátku a konce vyšetřovacího intervalu
        10. účinné od 1. 5. 2004r1, r2, r3 mohou být vypočteny pro interval 0 – 28 dnů a popřípadě (bylo-li provedeno měření 14. den) pro intervaly 0 – 14 a 14 – 28 dnů.
      1. účinné od 1. 5. 2004XIV.2.1.1 Analýza výsledků regresí (modelování závislosti koncentrace – odezva)

        účinné od 1. 5. 2004Touto metodou se závislostí mezi specifickou rychlostí růstu a koncentrací proloží vhodná matematická funkce, a to umožní odhadnout „ECx“, tj. jakoukoli požadovanou hodnotu EC. U této metody není nutný výpočet r pro jednotlivou rybu (r1) a namísto toho se analýza založí na průměrné hodnotě r (r2) pro nádrž. Dává se přednost posledně uvedené metodě. Je také vhodnější při použití velmi malých druhů.

        účinné od 1. 5. 2004Průměrné specifické rychlosti růstu pro nádrž (r2) se graficky vynesou proti koncentraci kvůli kontrole závislosti odezvy.

        účinné od 1. 5. 2004K vyjádření závislosti r2 na koncentraci se zvolí vhodný model; jeho volba musí být řádně zdůvodněna.

        účinné od 1. 5. 2004Liší-li se pro jednotlivé nádrže počty ryb, které přežily, prokládá se vážený model s cílem zohlednit různé velikosti skupin.

        účinné od 1. 5. 2004Metoda proložení modelu musí umožnit odhadnout například hodnotu EC20 a stanovit její rozptyl (buď směrodatnou odchylku nebo interval spolehlivosti). Graf proloženého modelu se vynese spolu s daty, aby byla zřejmá vhodnost použitého modelu (9, 19, 20, 21).

      1. účinné od 1. 5. 2004XIV.2.1.2 Analýza výsledků pro stanovení LOEC

        účinné od 1. 5. 2004Bylo-li ve zkoušce použito pro každou koncentraci více nádrží, může být odhad LOEC založen na analýze variance (ANOVA) průměrné specifické rychlosti růstu pro nádrž (viz bod 2.1) následované vhodným srovnáním průměrné hodnoty r pro každou koncentraci s průměrnou hodnotou r pro kontrolní skupiny (např. Dunnettovým nebo Williamsovým testem (13, 14, 15, 22)), aby se zjistila nejmenší koncentrace, u níž je na úrovni pravděpodobnosti 0,05 rozdíl významný. Nejsou-li předpoklady pro použití parametrických metod splněny, kvůli jinému než normálnímu rozdělení (např. se použije Shapiro-Wilkův test) nebo kvůli heterogennímu rozptylu (Bartlettův test), měla by být před provedením ANOVA zvážena transformace dat za účelem homogenizace rozptylů nebo by měla být provedena vážená ANOVA.

        účinné od 1. 5. 2004Není-li pro každou koncentraci počet nádrží znásoben, nebude ANOVA u jednotlivé nádrže citlivá nebo bude nemožná. V takovém případě je přijatelným kompromisem založit ANOVA na „pseudospecifické“ rychlosti růstu r3 nebo na jednotlivých rybách.

        účinné od 1. 5. 2004Průměrná hodnota r3 pro každou koncentraci může být poté porovnána s průměrnou hodnotou r3 pro kontrolní skupiny. Hodnotu LOEC lze poté nalézt výše uvedeným způsobem. Je třeba vzít na vědomí, že tato metoda neumožňuje zohlednit variabilitu mezi nádržemi ve větší míře, než s jakou se počítá v důsledku variability mezi rybami, a ani před ní nechrání. Ukázalo se však (9), že variabilita mezi nádržemi byla ve srovnání s variabilitou v rámci nádrže (tj. mezi rybami) velmi malá. Nejsou-li v analýze využity jednotlivé ryby, musí být ve zprávě uvedena metoda nalezení odlehlých hodnot a její použití musí být zdůvodněno.

    1. účinné od 1. 5. 2004XIV.2.2 INTERPRETACE VÝSLEDKŮ

      účinné od 1. 5. 2004Výsledky je třeba interpretovat opatrně, leží-li naměřené hodnoty koncentrací toxické látky v roztocích blízko meze stanovitelnosti analytické metody, nebo klesá-li u semistatických zkoušek koncentrace zkoušené látky od okamžiku přípravy roztoku do jeho obnovení.

    1. účinné od 1. 5. 2004XIV.2.3 PROTOKOL O ZKOUŠCE
      1. účinné od 1. 5. 2004Protokol o zkoušce musí obsahovat následující informace:
      2. účinné od 1. 5. 2004XIV.2.3.1 Zkoušená látka
        1. účinné od 1. 5. 2004— fyzikální stav a relevantní fyzikálně-chemické vlastnosti,
        2. účinné od 1. 5. 2004— údaje o chemické identitě včetně údajů o čistotě a podle potřeby o metodě kvantitativního stanovení zkoušené látky.
      1. účinné od 1. 5. 2004XIV.2.3.2 Testovací druh
        1. účinné od 1. 5. 2004— vědecký název, podle možnosti,
        2. účinné od 1. 5. 2004— kmen, velikost, původ, jakákoli příprava atd.,
      1. účinné od 1. 5. 2004XIV.2.3.3 Zkušební podmínky
        1. účinné od 1. 5. 2004— použitý zkušební postup (např. semistatický/s obnovením, průtokový, nasazování, hustota obsádky atd.),
        2. účinné od 1. 5. 2004— uspořádání zkoušky (např. počet zkušebních nádrží, zkušební koncentrace a znásobení počtu nádrží, počet ryb v nádrži),
        3. účinné od 1. 5. 2004— metoda přípravy zásobních roztoků a častost obnovování (je-li použito, uvede se solubilizační činidlo a jeho koncentrace),
        4. účinné od 1. 5. 2004— nominální zkušební koncentrace, střední hodnota naměřených hodnot v jednotlivých nádržích, její směrodatná odchylka a metody jejich stanovení a důkazy toho, že naměřené hodnoty odpovídají koncentracím zkoušené látky v pravém roztoku,
        5. účinné od 1. 5. 2004— charakteristiky ředicí vody: pH, alkalinita, tvrdost, teplota, koncentrace rozpuštěného kyslíku, koncentrace zbytkového chloru (je-li měřena), obsah celkového organického uhlíku, obsah suspendovaných látek, popřípadě solnost zkušebního média a výsledky jakýchkoli jiných provedených měření,
        6. účinné od 1. 5. 2004— kvalita vody ve zkušebních nádržích: pH, tvrdost, teplota a koncentrace rozpuštěného kyslíku,
        7. účinné od 1. 5. 2004— podrobné informace o krmení (např. druh krmiva (krmiv), původ, podávané množství a frekvence krmení).
      1. účinné od 1. 5. 2004XIV.2.3.4 Výsledky
        1. účinné od 1. 5. 2004— doklady o tom, že kontrolní skupiny vyhověly kriteriu přežití, a data o mortalitě pro každou zkušební koncentraci,
        2. účinné od 1. 5. 2004— použité metody statistické analýzy, statistiky založené na znásobeném počtu nádrží nebo na jednotlivých rybách, zpracování dat a zdůvodnění použitých metod,
        3. účinné od 1. 5. 2004— data ve formě tabulky o individuálních a středních hodnotách hmotností ryb v den 0, 14 (bylo-li prováděno vážení) a 28, hodnoty průměrných rychlostí růstu pro nádrž nebo popřípadě pseudospecifických rychlostí růstu pro intervaly 0 – 28 dnů nebo popřípadě 0 – 14 a 14 – 28 dnů,
        4. účinné od 1. 5. 2004— výsledky statistické analýzy (tj. regresní analýzy nebo ANOVA) nejlépe ve formě tabulky nebo v grafické formě a hodnota LOEC (p = 0,05) a NOEC nebo ECx, popřípadě se směrodatnými odchylkami,
        5. účinné od 1. 5. 2004— výskyt jakýchkoli neobvyklých reakcí ryb a viditelné účinky vyvolané zkoušenou látkou.
  1. účinné od 1. 5. 2004XIV.3 LITERATURA

    účinné od 1. 5. 2004(1) Solbe J. F. de LG (1987). Environmental Effects of Chemicals (CFM 9350 SLD). Report on a UK Ring Test of a Method for Studying the Effects of Chemicals on the Growth Rate of Fish. WRc Report No PRD 1388-M/2.

    účinné od 1. 5. 2004(2) Meyer, A., Bierman, C. H., Orti, G. (1993). The phylogenetic position of the zebrafish (Danio rerio), a model system in developmental biology: an invitation to the comparative method. Proc. R. Soc. Lond. B. 252, 231-236.

    účinné od 1. 5. 2004(3) Ashley S., Mallett M. J., Grandy N. J. (1990). EEC Ring Test of a Method for Determining the Effects of Chemicals on the Growth Rate of Fish. Final Report to the Commission of the European Communities. WRc Report No EEC 2600-M.

    účinné od 1. 5. 2004(4) Crossland N. O. (1985). A method to evaluate effects of toxic chemicals on fish growth. Chemosphere, 14, 1855-1870.

    účinné od 1. 5. 2004(5) Nagel R., Bresh H., Caspers N., Hansen P. D., Market M., Munk R., Scholz N., Höfte B. B. (1991). Effect of 3,4-dichloroaniline on the early life stages of the Zebrafish (Brachydanio rerio): results of a comparative laboratory study. Ecotox. Environ. Safety, 21, 157-164.

    účinné od 1. 5. 2004(6) Yamamoto, Tokio. (1975). Series of stock cultures in biological field. Medaka (killifish) biology and strains. Keigaku Publish. Tokio, Japonsko.

    účinné od 1. 5. 2004(7) Holcombe, G. W., Benoit D. A., Hammermeister, D. E., Leonard, E. N., Johnson, R. D. (1995). Acute and long-term effects of nine chemicals on the Japanese medaka (Oryzias latipes). Arch. Environ. Contam. Toxicol. 28, 287-297.

    účinné od 1. 5. 2004(8) Benoit, D. A., Holcombe, G. W., Spehar, R. L. (1991). Guidelines for conducting early life toxicity tests with Japanese medaka (Oryzias latipes). Ecological Research Series EPA-600/3-91-063. US Environmental Protection Agency, Duluth, Minnesota.

    účinné od 1. 5. 2004(9) Stephan C. E., Rogers J. W. (1985). Advantages of using regression analysis to calculate results of chronic toxicity tests. Aquatic Toxicology and Hazard Assessment: Eighth Symposium, ASTM STP 891, R. C. Bahner, D. J. Hansen, eds., American Society for Testing and Materials, Filadelfie, 328-338.

    účinné od 1. 5. 2004(10) Environment Canada (1992). Biological test method: toxicity tests using early life stages of salmonid fish (rainbow trout, coho salmon, or atlantic salmon). Conservation and Protection, Ontario, Report EPS 1/RM/28, 81 str.

    účinné od 1. 5. 2004(11) Cox D. R. (1958). Planning of experiments. Wiley Edt.

    účinné od 1. 5. 2004(12) Pack S. (1991). Statistical issues concerning the design of tests for determining the effects of chemicals on the growth rate of fish. Room Document 4, OECD Ad Hoc Meeting of Experts on Aquatic Toxicology, WRc Medmenham, UK, 10.–12. prosinec 1991.

    účinné od 1. 5. 2004(13) Dunnett C. W. (1955). A Multiple Comparisons Procedure for Comparing Several Treatments with a Control, J. Amer. Statist. Assoc., 50, 1096-1121.

    účinné od 1. 5. 2004(14) Dunnett C. W. (1964). New tables for multiple comparisons with a control. J. Amer. Statist. Assoc, 20, 482-491.

    účinné od 1. 5. 2004(15) Williams D. A. (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. J. Amer. Statist. Assoc 27, 103-117.

    účinné od 1. 5. 2004(16) Johnston, W. L., Atkinson, J. L., Glanville N. T. (1994). A technique using sequential feedings of different coloured food to determine food intake by individual rainbow trout, Oncorhynchus mykiss: effect of feeding level. Aquaculture, 120, 123-133.

    účinné od 1. 5. 2004(17) Quinton, J. C., Blake, R. W. (1990). The effect of feed cycling and ration level on the compensatory growth response in rainbow trout, Oncorhynchus mykiss. Journal of Fish Biology, 37, 33-41.

    účinné od 1. 5. 2004(18) Post, G. (1987). Nutrition and Nutritional Diseases of Fish. Chapter IX in Testbook of Fish Health. T.F.H. Publications, Inc. Neptune City, New Jersey, USA. 288 str.

    účinné od 1. 5. 2004(19) Bruce, R. D., Versteeg D. J. (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environ. Toxicol. Chem. 11, 1485-1494.

    účinné od 1. 5. 2004(20) DeGraeve, G. M., Cooney, J. M., Pollock, T. L., Reichenbach, J. H., Dean, Marcus, M. D., McIntyre, D. O. (1989). Precision of EPA seven-day fathead minnow larval survival and growth test; intra and interlaboratory study. Report EA-6189 (American Petroleum Institute Publication, No 4468). Electric Power Research Institute, Palo Alto, CA.

    účinné od 1. 5. 2004(21) Norbert-King T. J. (1988). An interpolation estimate for chronic toxicity: the ICp approach. US Environmental Protection Agency. Environmental Research Lab., Duluth, Minnesota. Tech. Rep. No 05-88 of National Effluent Toxicity Assesment Center. Sept. 1988. 12 str.

    účinné od 1. 5. 2004(22) Williams D. A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. J. Amer. Statist. Assoc., 28, 510-531.

účinné od 1. 5. 2004DODATEK 1

účinné od 1. 5. 2004DRUHY RYB DOPORUČNÉ KE ZKOUŠENÍ A VHODNÉ ZKUŠEBNÍ PODMÍNKY

účinné od 1. 5. 2004
DODATEK 1 DRUHY RYB DOPORUČNÉ KE ZKOUŠENÍ A VHODNÉ ZKUŠEBNÍ PODMÍNKY
DruhyDoporučený
rozsah
zkušební
teploty
(°C)		Fotoperioda
(h)		Doporučené
rozpětí
počáteční
hmotnosti ryb
(g)		Doporučená přesnost
měření		Velikost
násady
(g/l)		Hustota
obsádky
(l-1)		KrmivoDélka
zkoušky
(d)
Doporučené druhy:
 Oncorhynchus mykiss
 pstruh duhový		 12,5-16,0 12-16 1-5 na 100 mg 1,2-2,0 4sušené krmivo
pro plůdek lososovitých
ryb		 ≥ 28
Jiné dobře popsané druhy:
Danio rerio
 danio pruhované		21-25 12-16 0,050-0,100 na 1 mg 0,2-1,05-10 živé krmivo
(Brachionus Artemia)
 ≥ 28
Oryzias latipes
halančík japonský		21-25 12-16 0,050-0,100 na 1 mg 0,2-1,05-20 živé krmivo
(Brachionus Artemia)		 ≥ 28

účinné od 1. 5. 2004DODATEK 2

účinné od 1. 5. 2004NĚKTERÉ CHEMICKÉ CHARAKTERISTIKY PŘIJATELNÉ ŘEDICÍ VODY

účinné od 1. 5. 2004
DODATEK 1 DRUHY RYB DOPORUČNÉ KE ZKOUŠENÍ A VHODNÉ ZKUŠEBNÍ PODMÍNKY DODATEK 2 NĚKTERÉ CHEMICKÉ CHARAKTERISTIKY PŘIJATELNÉ ŘEDICÍ VODY
LátkaKoncentrace
Nerozpuštěné látky< 20 mg/l
Celkový organický uhlík< 2 mg/l
Nedisociovaný amoniak< 1µg/l
Zbytkový chlor< 10 µg/l
Celkové organofosforové pesticidy< 50 ng/l
Celkové organochlorové pesticidy a polychlorované bifenyly< 50 ng/l
Celkový organický chlor< 25 ng/l

účinné od 1. 5. 2004DODATEK 3

účinné od 1. 5. 2004LOGARITMICKÁ ŘADA KONCENTRACÍ VHODNÁ PRO ZKOUŠKU TOXICITY (9)

účinné od 1. 5. 2004
DODATEK 1 DRUHY RYB DOPORUČNÉ KE ZKOUŠENÍ A VHODNÉ ZKUŠEBNÍ PODMÍNKY DODATEK 2 NĚKTERÉ CHEMICKÉ CHARAKTERISTIKY PŘIJATELNÉ ŘEDICÍ VODY DODATEK 3 LOGARITMICKÁ ŘADA KONCENTRACÍ VHODNÁ PRO ZKOUŠKU TOXICITY (9)
Sloupec (počet koncentrací mezi 100 a 10, nebo mezi 10 a 1)(1)
1234567
100100100100100100100
32465663687275
10223240465256
3,2101825323742
1,04,61016222732
2,25,610151924
1,03,26,3101418
1,84,06,81013
1,02,54,67,210
1,63,25,27,5
1,02,23,75,6
1,52,74,2
1,01,93,2
1,42,4
1,01,8
1,3
1,0
  • účinné od 1. 5. 20041 Ze sloupců může být zvolena řada pěti (nebo více) po sobě jdoucích koncentrací. Mezilehlé body pro koncentrace ve sloupci (x) jsou uvedeny ve sloupci (2x + 1). Uvedené hodnoty mohou být koncentracemi vyjádřenými v objemových nebo hmotnostních procentech (mg/l nebo µg/l). Hodnoty mohou být podle potřeby násobeny nebo děleny jakoukoli mocninou 10. Řada ve sloupci 1 by mohla být použita při značné nejistotě, pokud jde stupeň toxicity.
    1. účinné od 1. 5. 2004XV. METODA PRO STANOVENÍ TOXICITY NA RYBÍCH EMBRYÍCH A POTĚRU - KRÁTKODOBÁ ZKOUŠKA – metoda C.15 podle přílohy směrnice 2001/59/ES
      1. účinné od 1. 5. 2004XV.1 METODA

        účinné od 1. 5. 2004Tato zkouška krátkodobé toxicity je replikou metody OECD TG 212 (1998).

        1. účinné od 1. 5. 2004XV.1.1 ÚVOD

          účinné od 1. 5. 2004Tato zkouška krátkodobé toxicity na rybím embryu a váčkovém plůdku je krátkodobou zkouškou, při níž jsou exponována životní stádia od čerstvě oplodněných jiker do stadia váčkových plůdků. Při zkoušce na embryu a na váčkovém plůdku se nekrmí, zkouška by tedy měla být ukončena dokud je váčkový plůdek stále vyživován ze žloutkového váčku.

          účinné od 1. 5. 2004Zkouška je určena k zjištění letálních a v omezené míře subletálních účinků chemických látek na specifická stadia a testovací druhy. Tato zkouška by měla poskytnout užitečné informace, neboť by a) mohla být přechodem mezi letálními a subletálními zkouškami, b) mohla být použita jako screeningová zkouška pro úplnou zkoušku toxicity na časných vývojových stadiích nebo pro zkoušky chronické toxicity a c) mohla by být použita pro zkoušení na druzích, u nichž nejsou dostatečně rozvinuty chovné techniky, aby pokryly období od endogenního k exogennímu vyživování.

          účinné od 1. 5. 2004Je třeba mít na paměti, že pouze zkoušky pokrývající celý životní cyklus ryb obecně umožňují odhadnout chronickou toxicitu chemické látky pro ryby a že jakékoli omezení expozice nějakého životního stadia může snížit citlivost a tím podhodnotit chronickou toxicitu. Očekává se tedy, že zkouška na embryu a váčkovém plůdku je méně citlivá než úplná zkouška na časných vývojových stádiích, zejména pokud jde o vysoce lipofilní chemické látky (log Po/v > 4) a chemické látky se specifickým mechanismem účinku. V citlivostech těchto dvou zkoušek se však očekávají menší rozdíly v případě chemických látek s nespecifickým, narkotickým mechanismem účinku (1).

          účinné od 1. 5. 2004Před publikováním této zkoušky bylo nejvíce zkušeností s touto zkouškou na embryu a váčkovém plůdku získáno u sladkovodní ryby Danio rerio Hamilton-Buchanan (Teleostei, Cyprinidae – obecný název danio pruhované). Podrobnější pokyny pro zkoušku s tímto druhem jsou tedy uvedeny v dodatku 1. To nevylučuje použití jiného druhu, pro který jsou zkušenosti rovněž k dispozici (tabulky IA a IB).

        1. účinné od 1. 5. 2004XV.1.2 DEFINICE

          účinné od 1. 5. 2004Nejnižší koncentrace s pozorovanými účinky (Lowest observed effect concentration, LOEC): je nejnižší zkoušená koncentrace zkoušené látky, při níž jsou pozorovány významné účinky ve srovnání s kontrolou (na úrovni pravděpodobnosti falešně pozitivního hodnocení p < 0,05). Všechny zkoušené koncentrace vyšší než LOEC musí mít stejné nebo vážnější škodlivé účinky, než účinky pozorované při koncentraci LOEC.

          účinné od 1. 5. 2004NOEC (no observed effect concentration, koncentrace bez pozorovaných účinků): je zkušební koncentrace bezprostředně nižší než LOEC.

        1. účinné od 1. 5. 2004XV.1.3 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY

          účinné od 1. 5. 2004Embrya a váčkové plůdky se vystaví rozsahu koncentrací zkoušené látky rozpuštěné ve vodě. Zkouška umožňuje volit mezi semistatickým a průtokovým uspořádáním. Volba závisí na povaze zkoušené látky. Zkouška se zahájí umístěním oplodněných jiker do zkušebních nádrží a ukončí se těsně před tím, než dojde k úplné absorpci žloutkového váčku čerstvých plůdků v některé ze zkušebních nádrží, nebo než začne v kontrolních skupinách docházet k úhynu v důsledku hladovění. Posoudí se letální a subletální účinky a porovnají se s kontrolními hodnotami s cílem stanovit nejnižší koncentraci s pozorovanými účinky, tedy koncentraci bez pozorovaných účinků. Účinky mohou být eventuálně analyzovány za použití regresního modelu s cílem odhadnout koncentraci, která způsobuje určitý procentuálně vyjádřený účinek (tj. LC/ECx, kde x je definovaný procentuální účinek).

        1. účinné od 1. 5. 2004XV.1.4 INFORMACE O ZKOUŠENÉ LÁTCE

          účinné od 1. 5. 2004Měly by být dostupné výsledky zkoušky akutní toxicity (viz metoda C.1) provedené nejlépe na druhu zvolenému pro tuto zkoušku. Výsledky mohou být užitečné při výběru vhodného rozsahu zkušebních koncentrací ve zkoušce na časných vývojových stádiích. Měly by být známy rozpustnost látky ve vodě (včetně rozpustnosti ve zkušební vodě) a tlak par látky. Měla by být k dispozici vhodná analytická metoda pro kvantitativní stanovení látky ve zkušebních roztocích, a to se známou a doloženou správností a známou mezí stanovitelnosti.

          účinné od 1. 5. 2004Užitečnými informacemi o zkoušené látce pro účely stanovení zkušebních podmínek jsou strukturní vzorec, čistota látky, stálost na světle, pKa, Po/v a výsledky zkoušky snadné biologické rozložitelnosti (viz metoda C.4).

        1. účinné od 1. 5. 2004XV.1.5 VALIDITA ZKOUŠKY
          1. účinné od 1. 5. 2004Má-li být zkouška platná, musí být splněny následující podmínky:
            1. účinné od 1. 5. 2004— celková míra přežití oplodněných jiker v kontrolních skupinách a podle potřeby v nádržích, do nichž bylo přidáno pouze rozpouštědlo, musí být vyšší nebo rovna limitům stanoveným v dodatcích 2 a 3,
            2. účinné od 1. 5. 2004— koncentrace rozpuštěného kyslíku musí ležet mezi 60 a 100 % nasycení vzduchem (ASV) po celou dobu zkoušky,
            3. účinné od 1. 5. 2004— teplota vody se po celou dobu zkoušky nesmí mezi zkušebními nádržemi nebo den ode dne lišit o více než ± 1,5 °C a měla by být udržována v rozpětí teplot stanoveném pro zkušební druh (dodatky 2 a 3,).
        1. účinné od 1. 5. 2004XV.1.6 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY
          1. účinné od 1. 5. 2004XV.1.6.1 Zkušební nádrže

            účinné od 1. 5. 2004Mohou být použity jakékoli nádrže ze skla nebo z jiného inertního materiálu. Rozměry zkušebních nádrží by měly být dostatečné k tomu, aby vyhovovaly velikosti násady (viz bod 1.7.1.2). Doporučuje se, aby byly nádrže umístěny ve zkušebním prostoru náhodně. Uspořádání do náhodných bloků s možností expozice v každém bloku se upřednostňuje před zcela náhodným uspořádáním, když existují systémové účinky v laboratoři, které mohou být blokovým uspořádáním kontrolovány. Je-li použito blokové uspořádání, mělo by být zohledněno při následné analýze dat. Nádrže by měly být chráněny před nežádoucími rušivými vlivy.

          1. účinné od 1. 5. 2004XV.1.6.2 Výběr druhů ryb

            účinné od 1. 5. 2004Doporučené druhy ryb jsou uvedeny v tabulce 1A. To nevylučuje použití jiného druhu (příklady jsou uvedeny v tabulce 1B), zkušební postup musí být ale upraven, aby byly vytvořeny vhodné zkušební podmínky. V takovém případě by měly být uvedeny důvody pro výběr druhu a experimentální podmínky.

          1. účinné od 1. 5. 2004XV.1.6.3 Chov matečných ryb

            účinné od 1. 5. 2004Podrobnosti o chovu matečných ryb v uspokojivých podmínkách jsou uvedeny v metodě OECD TG 210 (1) a v literatuře (2, 3, 4, 5, 6).

          1. účinné od 1. 5. 2004XV.1.6.4 Chov embryí a plůdků

            účinné od 1. 5. 2004Embrya a čerstvě vykulené plůdky mohou být exponovány v hlavní nádrži v menších nádobách s pletivovými stěnami nebo uzávěry, aby jimi mohl proudit zkušební roztok. Nevířivého průtoku nádobami lze dosáhnout jejich zavěšení do ramen, pomocí nichž lze pohybovat nádobami nahoru a dolů, přičemž organismy zůstanou stále ponořeny; lze rovněž použít syfonový systém přítoku a výpusti. Oplodněné jikry lososovitých ryb mohou ležet na podložce nebo pletivu s dostatečně velkými oky, aby jimi mohly plůdky po vylíhnutí propadnout. K přemístění embryí a plůdků v semistatické zkoušce s každodenní úplnou výměnou média je vhodné použít Pasteurovy pipety. (viz bod 1.6.6).

            účinné od 1. 5. 2004Jsou-li k udržení jiker v hlavní nádrži použity nádoby, mřížky nebo pletiva, měly by být po vylíhnutí plůdků odstraněny (1), pokud ovšem nemají být ponechány k zamezení úniku ryb. Je-li třeba plůdky přemístit, neměly by být vystaveny vzduchu a neměly by se k jejich vytažení z nádob používat síťky (taková opatrnost není nutná u méně křehkých druhů, např. u kapra). Okamžik přemístění se liší podle druhu a nemusí být vždy nutný. U semistatických technik mohou být použity kádinky nebo mělké nádobky a podle potřeby mohou být opatřeny sítem umístěným nepatrně nad dnem kádinky. Je-li objem těchto nádob dostatečný, aby vyhovoval požadavkům na nasazování (viz bod 1.7.1.2) nemusí být přemístění embryí nebo plůdků nutné.

          1. účinné od 1. 5. 2004XV.1.6.5 Voda

            účinné od 1. 5. 2004Pro tuto zkoušku je vhodná jakákoliv voda, která vyhovuje chemickým charakteristikám přijatelné ředicím vody, jak jsou uvedeny v dodatku 4 a v níž testovací druhy kontrolních skupin přežívají alespoň tak, jak je uvedeno v dodatcích 2 a 3. Měla by mít po celou dobu zkoušky stejnou kvalitu. pH by se nemělo měnit o více než ± 0,5. Pro ujištění, že ředící voda nebude mít přílišný vliv na výsledky zkoušky (například tvorbou komplexů se zkoušenou látkou) nebo nepříznivý vliv na stav matečných ryb, by měly být odebírány v pravidelných intervalech její vzorky pro analýzu. Je-li kvalita ředicí vody relativně konstantní, mělo by být stanovení těžkých kovů (např. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd a Ni), hlavních aniontů a kationtů (např. Ca, Mg, Na, K, Cl a SO4), pesticidů (např. celkový obsah organických fosforových a chlorových pesticidů), celkový obsah organického uhlíku a suspendovaných látek provedeno např. každé tři měsíce. Je-li prokázáno, že kvalita vody je konstantní po dobu alespoň jednoho roku, mohou být stanovení méně častá a intervaly lze prodloužit (např. každých šest měsíců).

          1. účinné od 1. 5. 2004XV.1.6.6 Zkušební roztoky

            účinné od 1. 5. 2004Zkušební roztoky o zvolených koncentracích se připraví ředěním zásobního roztoku.

            účinné od 1. 5. 2004Zásobní roztok by měl být nejlépe připraven jednoduchým mechanickým mícháním nebo protřepáváním zkoušené látky v ředicí vodě (např. mechanickým mícháním a sonifikací). Pro dosažení vhodné koncentrace zásobního roztoku mohou být použity saturační kolony. Neměla by být používána rozpouštědla nebo dispergátory (solubilizační činidla), v některých případech však může být použití takových látek pro vytvoření zásobního roztoku o vhodné koncentraci nezbytné. Ke vhodným rozpouštědlům patří aceton, ethanol, methanol, dimethylformamid a triethylenglykol. Ke vhodným dispergátorům patří Cremophor RH40, Tween 80, 0,01% methylcelulosa a HCO-40. Snadno biologicky rozložitelná činidla (např. aceton) nebo vysoce těkavé sloučeniny je třeba používat rozvážně, neboť mohou způsobit problémy s růstem bakterií v průtokových zkouškách. Je-li použito solubilizační činidlo, nesmí mít významné účinky na přežití ani viditelné nepříznivé účinky na časná vývojová stádia, což musí být prokázáno na kontrolní skupině vystavené pouze rozpouštědlu. Měla by však být vynaložena maximální snaha takové látky nepoužívat.

            účinné od 1. 5. 2004U semistatických technik mohou být použity dva různé postupy obměny; buď i) se do čistých nádob připraví nové zkušební roztoky a přežívající jikry a plůdky se s malým objemem starého roztoku opatrně přemístí do nových nádob, aniž by se vystavily vzduchu, nebo ii) se testovací organismy ponechají v nádobě a vymění se určitý podíl (alespoň tři čtvrtiny) zkušební vody. Častost obnovování média bude záviset na stálosti zkoušené látky, avšak doporučuje se obnovovat médium denně. Není-li podle předběžných zkoušek stálosti (viz bod 1.4) koncentrace zkoušené látky mezi obnoveními média stálá, (tj. nepohybuje se v intervalu 80 – 120 % nominální koncentrace nebo klesá pod 80 % naměřené počáteční koncentrace), měla by být zvážena průtoková zkouška. V každém případě je třeba dbát na to, aby plůdky nebyly při obnovování vody vystaveny stresu.

            účinné od 1. 5. 2004Při průtokových zkouškách je pro zajištění řady koncentrací nezbytný systém, který nepřetržitě dávkuje a ředí zásobní roztok zkoušené látky (např. dávkovací čerpadlo, zařízení pro proporcionální ředění, saturační systém). Průtok zásobních roztoků a ředicí vody by měl být kontrolován v určitých intervalech, nejlépe denně, a neměl by se v průběhu zkoušky měnit o více než 10 %. Jako vhodný by shledán průtok zajišťující výměnu alespoň pěti objemů nádrže za 24 h (2).

        1. účinné od 1. 5. 2004XV.1.7 POSTUP

          účinné od 1. 5. 2004Užitečné informace o provádění zkoušek toxicity na rybím embryu a váčkovém plůdku jsou dostupné v literatuře, přičemž některé literární zdroje (7, 8, 9) jsou uvedeny v tomto textu v oddílu s literaturou.

          1. účinné od 1. 5. 2004XV.1.7.1 Podmínky expozice
            1. účinné od 1. 5. 2004XV.1.7.1.1 Délka expozice

              účinné od 1. 5. 2004Zkouška se zahájí nejlépe do 30 minut po oplodnění jiker. Embrya se ponoří do zkušebního roztoku před započetím rýhování blastuly, nebo co nejdříve po něm, a v každém případě před počátkem stádia gastruly. U jiker získaných od komerčního dodavatele nemusí být možné zahájit zkoušku ihned po oplodnění. Vhledem k tomu, že citlivost zkoušky může být závažně ovlivněna zpoždění začátku zkoušky, měla by být zkouška zahájena do osmi hodin po oplodnění. Vzhledem k tomu, že se plůdky v průběhu expozice nekrmí, ukončí se zkouška těsně před tím, než dojde k úplné absorpci žloutkového váčku u plůdků v některé ze zkušebních nádrží, nebo než začne v kontrolních skupinách docházet k úhynu v důsledku hladovění. Délka zkoušky bude záviset na použitém druhu. Některé doporučené délky zkoušky jsou uvedeny v dodatcích 2 a 3.

            1. účinné od 1. 5. 2004XV.1.7.1.2 Nasazování

              účinné od 1. 5. 2004Počet oplodněných jiker na začátku zkoušky by měl být dostatečný ke splnění statistických požadavků. Měly by být k expozici náhodně rozděleny a na jednu koncentraci by mělo být rozděleno alespoň 30 jiker rovným dílem (nebo alespoň jak je to jen možné s ohledem na to, že u některých druhů může být obtížné získat stejně velké podíly) mezi alespoň tři další zkušební nádrže. Velikost násady (biomasa v jednotce objemu) by měla být tak nízká, aby bylo možné udržet koncentraci rozpuštěného kyslíku na alespoň 60 % ASV bez provzdušňování. U průtokových zkoušek se doporučuje nasazování nepřekračující 0,5 g/l za 24 h a v žádném okamžiku nepřekračující 5 g/l roztoku (2).

            1. účinné od 1. 5. 2004XV.1.7.1.3 Světlo a teplota

              účinné od 1. 5. 2004Fotoperioda a teplota zkušební vody by měly vyhovovat zkušebním druhům (dodatky 2 a 3). Pro sledování teploty může sloužit další zkušební nádrž.

          1. účinné od 1. 5. 2004XV.1.7.2 Zkušební koncentrace

            účinné od 1. 5. 2004Obvykle je nezbytných pět koncentrací zkoušené látky lišících se od sebe faktorem nepřekračujícím 3,2. Při výběru rozsahu zkušebních koncentrací by měla být zohledněna křivka závislosti hodnoty LC50 na délce expozice ve studii akutní toxicity. Za určitých okolností může být oprávněné použít méně než pět koncentrací, např. v limitní zkoušce, a užší rozsah koncentrací. Použití méně než pěti koncentrací by mělo být zdůvodněno. Koncentrace látky, které jsou vyšší než 96hodinová LC50 nebo vyšší než 100 mg/l, podle toho, co je nižší, nemusí být zkoušeny. Látky by neměly být zkoušeny pro koncentrace vyšší, než je jejich rozpustnost ve zkušební vodě.

            účinné od 1. 5. 2004Použije-li se k usnadnění přípravy zásobního roztoku solubilizační činidlo (viz bod 1.6.6), neměla by být jeho konečná koncentrace ve zkušební nádrži vyšší než 0,1 ml/l a měla by být ve všech zkušebních nádržích stejná.

          1. účinné od 1. 5. 2004XV.1.7.3 Kontrolní skupiny

            účinné od 1. 5. 2004Jako další zkušební sady by měly být nasazeny kontrolní skupina v ředicí vodě (příslušným způsoben znásobená) a podle potřeby také jedna kontrolní skupina se solubilizačním činidlem (příslušným způsoben znásobená).

          1. účinné od 1. 5. 2004XV.1.7.4 Častost analytických stanovení a měření

            účinné od 1. 5. 2004Během zkoušky se koncentrace zkoušené látky stanovují v pravidelných intervalech.

            účinné od 1. 5. 2004U semistatických zkoušek, pokud se předpokládá, že se bude zkušební koncentrace pohybovat v rozmezí ± 20 % nominálních hodnot (tj. od 80 do 120 %, viz bod 1.4 a 1.6.6), se doporučuje analyzovat nejvyšší a nejnižší zkušební koncentrace na začátku studie ihned po jejich přípravě a bezprostředně před obnovením alespoň v nejméně třech nádržích (tj. analýzy se provedou na vzorku téhož roztoku – ihned po jeho přípravě a při jeho výměně).