Vyhláška, kterou se u chemických látek a chemických přípravků stanoví základní metody pro zkoušení fyzikálně-chemických vlastností, výbušných vlastností a vlastností nebezpečných pro životní prostředí, 222/2004 Sb., účinné od 1. 5. 2004

Předchozí stránka

Zásobní roztoky o požadované koncentraci se připraví rozpuštěním látky v deionizované vodě nebo ve vodě podle bodu 1.6.1.2.

Zvolené zkušební koncentrace se připraví ředěním zásobního roztoku. Jsou-li zkoušeny vysoké koncentrace látky, lze látku rozpustit přímo v ředicí vodě.

Látky se obvykle zkoušejí až do meze jejich rozpustnosti. U některých látek (např. u látek s nízkou rozpustností ve vodě nebo vysokou hodnotou P_o/v, nebo u látek, které ve vodě vytvářejí spíše stabilní disperse než pravé roztoky) je možné provést zkoušku při koncentraci vyšší, než je mez rozpustnosti, aby bylo zajištěno, že je dosaženo maximální koncentrace odpovídající maximální rozpustnosti/stabilitě. Je ovšem nutné, aby tato koncentrace jinak nenarušovala zkušební systém (např. vytvořením filmu na hladině bránícímu okysličení vody atd.).

Pro přípravu zásobních roztoků látek s nízkou rozpustností ve vodě nebo pro usnadnění rozptýlení látky ve zkušebním médiu lze použít ultrazvukovou dispergaci, organická rozpouštědla či emulgátory nebo dispergátory. Použijí-li se takové pomocné látky, měly by všechny zkušební koncentrace obsahovat stejné množství těchto pomocných látek a stejné koncentraci pomocné látky jako ve zkušebních sériích by měly být exponovány další kontrolní dafnie. Koncentrace pomocných látek by měly být minimální a v žádném případě by neměla překročit 100 mg/l zkušebního média.

Zkouška se provede bez úpravy pH. Existují-li známky toho, že dochází k výrazné změně pH, doporučuje se zkoušku opakovat s úpravou pH a výsledky zaznamenat. V takovém případě se upraví pH zásobního roztoku na pH vody k ředění, pokud proti tomu neexistuji specifické důvody. Při úpravě pH se dává přednost HCl a NaOH. Úprava pH se provede tak, aby nebyla koncentrace zkušební látky v zásobním roztoku v podstatné míře změněna. Dojde-li úpravou ve zkušebním médiu k chemické reakci nebo ke srážení, skutečnosti se zaznamenají ve zprávě.

II.1.6.1.2 Zkušební voda
Pro tuto zkoušku se použije upravená voda (viz doplněk 1 a odkaz (2): ISO 6341).
Aby nebylo nutné aklimatizovat dafnie před zkouškou, doporučuje se, aby byla voda pro kultivaci podobné jakosti (pH, tvrdost), jako voda pro zkoušku.

II.1.6.2 Přístroje
1. Použijí se běžné laboratorní přístroje a zařízení. Zařízení, které přijde do styku se zkušebními roztoky, by mělo být nejlépe skleněné:
  1. — přístroj pro měření koncentrace kyslíku (s mikroelektrodou, nebo jiný vhodný přístroj na měření koncentrace rozpuštěného kyslíku ve vzorcích malého objemu),
  2. — vhodný přístroj pro měření teploty,
  3. — pH-metr,
  4. — vybavení pro stanovení tvrdosti vody.

II.1.6.3 Testovací organismy
Přednost se dává druhu Daphnia magna, ačkoliv se připouští také druh Daphnia pulex. Testovací dafnie musí být na začátku zkoušky mladší než 24 h, musí být laboratorně odchované, bez zjevných nemocí a musí být známého původu (např. chov, předchozí ošetření, atd.).

II.1.6.4 Zkušební postup
Před vlastní zkouškou může být provedena předběžná zkouška s cílem získat informace o rozsahu koncentrací, které mají být použity v hlavní zkoušce.
Kromě sérií zkoušek se provede kontrolní zkouška bez zkušební látky a podle potřeby kontrolní zkouška s pomocnou látkou.
1. Dafnie se exponují zkušební látce následujícím způsobem:
  1. — délka expozice: 48 h,
  2. — počet dafnií: nejméně 20 na každou zkušební koncentraci, nejlépe rozdělených na čtyři skupiny po pěti dafniích nebo na dvě skupiny po 10 dafniích,
  3. — obsádka: na každou dafnii by měly připadat 2 ml zkušebního roztoku,
  4. — zkušební koncentrace: zkušební roztok se připraví bezprostředně před nasazením dafnií, nejlépe bez použití jiného rozpouštědla než vody. Připraví se koncentrace tvořící geometrickou řadu, přičemž poměr mezi koncentracemi nesmí být vyšší než 2,2. Zároveň s kontrolami se zkoušejí koncentrace dostatečné pro to, aby po 48 h vyvolaly nulovou nebo a 100% imobilizaci, a dále mezilehlé koncentrace umožňující výpočet 48hodinové EC₅₀,
  5. — voda: viz 1.6.1.2,
  6. — osvětlení: střídání světla a tmy je libovolné,
  7. — teplota: zkušební teplota by měla být 18 až 22 °C, avšak v rámci dané zkoušky kolísající v tomto rozmezí maximálně o ±1 °C,
  8. — provzdušňování: zkušební roztok nesmí být provzdušňován probubláváním,
  9. — krmení: žádné.
Měření pH a obsahu rozpuštěného kyslíku v kontrolních skupinách a u všech zkušebních koncentrací se provede na konci zkoušky; pH zkušebního roztoku nesmí být měněno.
Těkavé sloučeniny se zkoušejí v hermeticky uzavřených nádobách naplněných po okraj, dostatečně velkých, aby nedošlo k nedostatku kyslíku.
Prohlídka dafnií se provede nejpozději po 24 h a znovu po 48 h.
1. Limitní zkouška
  1. S využitím postupů popsaných v této metodě může být provedena limitní zkouška s koncentrací 100 mg·l^-1 s cílem prokázat, že EC₅₀ je vyšší než tato koncentrace.
  2. Je-li povaha zkušební látky taková, že ve vodě nelze dosáhnout koncentrace 100 mg·l^-1, provede se limitní zkouška při koncentraci odpovídající rozpustnosti této látky v použitém médiu (nebo při maximální koncentraci, kdy látka vytváří stabilní disperzi) (viz také bod 1.6.1.1).
  3. Limitní zkouška se provede s 20 dafniemi rozdělenými do dvou nebo čtyř skupin a se stejným počtem v kontrolní skupině (v kontrolních skupinách). Dojde-li k imobilizaci, musí se provést celá studie.

II.2 DATA A HODNOCENÍ
Na pravděpodobnostní logaritmický papír se pro každé období, kdy byla prováděna pozorování (24 a 48 h), vynese mortalita v procentech proti koncentraci.
Pokud je to možné, odhadnou se pro každé pozorovací období EC₅₀ a meze spolehlivosti (p = 0,05); tyto hodnoty se zaokrouhlí na jednu, nebo nejvýše na dvě platné číslice (příklad zaokrouhlení na dvě platné číslice: 173,5 se zaokrouhlí na 170, 0,127 na 0,13, 1,21 na 1,2).
V případech, kdy je sklon křivky závislosti mortality v procentech na koncentraci látky příliš strmý, aby umožnil výpočet hodnoty EC₅₀, postačuje grafický odhad této hodnoty.
Jestliže dvě po sobě jdoucí koncentrace lišící se faktorem 2,2 vyvolají nulovou a 100% imobilizaci, jsou dostatečnou informací o rozpětí, ve kterém EC₅₀ leží.
Zjistí-li se, že není možné udržet stabilitu nebo homogenitu zkušební látky, uvede se to ve zprávě a výsledky se interpretují s opatrností.

II.3 ZPRÁVY
1. Protokol o zkoušce má pokud možno obsahovat následující údaje:
  1. — údaje o testovacím organismu (vědecký název, kmen, dodavatel nebo původ, veškerá předchozí ošetření, metoda chovu – včetně původu, druhu a množství potravy, frekvence krmení);
  2. — zdroj ředicí vody a hlavní chemické charakteristiky (pH, teplota, tvrdost);
  3. — u látek s malou rozpustností ve vodě údaj o metodě přípravy zásobních a zkušebních roztoků;
  4. — koncentrace všech pomocných látek;
  5. — přehled použitých koncentrací a veškeré dostupné informace o stabilitě zkušební látky ve zkušebním roztoku při použitých koncentracích;
  6. — jestliže byly provedeny chemické analýzy, údaje o použitých metodách a získané výsledky;
  7. — výsledek limitní zkoušky, pokud byla provedena;
  8. — popis zkušebního zařízení;
  9. — světelný režim;
  10. — koncentrace rozpuštěného kyslíku, hodnoty pH, teplota zkušebních roztoků;
  11. — důkaz, že byla splněna kritéria jakosti;
  12. — tabulka kumulativních hodnot imobility při každé koncentraci a při kontrolní zkoušce (a popřípadě při kontrolní zkoušce s pomocnou látkou) při každé z doporučených dob pozorování (24 a 48 h);
  13. — graf křivky závislosti účinku, vyjádřeného v procentech, na koncentraci na konci zkoušky;
  14. — podle možnosti hodnoty EC₅₀ při každé z doporučených dob pozorování (při 95% intervalu spolehlivosti)
  15. — použité statistické metody stanovení hodnot EC₅₀;
  16. — při použití referenční látky údaj o získaných výsledcích;
  17. — nejvyšší zkušební koncentrace, která nevyvolala za dobu zkoušky imobilizaci;
  18. — nejnižší zkušební koncentrace, která vyvolala za dobu zkoušky 100% imobilizaci.

II.4 LITERATURA
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guidelines 202, Decision of the Council C(81) 30 final and updates.
(2) International Standard ISO, Water Quality – Determination of inhibition of mobility of Daphnia magna Straus, ISO 6341-1989.
(3) AFNOR Inhibition of mobility of Daphnia magna Straus (Cladocera – crustacea) NFT 90 301 (January 1983).
(4) Verfahrensvorschlag des Umweltbundesamtes zum akuten Daphnien-Test. Rudolph, P., Boje, R. Ökotoxikologie, Grundlagen für die ökotoxikologische Bewertung von Umweltchemikalien nach dem Chemikaliengesetz, ecomed 1986.
(5) DIN Testverfahren mit Wasserorganismen 38412 (L1) und (L11).
(6) Finney, D. J. Statistical Methods in Biological Assay. Griffin, Weycombe, U.K., 1978.
(7) Litchfield, J. T., Wilcoxon, F. A simplified method of evaluating dose-effect experiments. J. Pharmacol. Exper. Ther., 1949, 96, 99-113.
(8) Sprague, J. B. Measurement of pollutant toxicity to fish. I Bioassay methods for acute toxicity. Water Res., 1969, 3, 793-821.
(9) Sprague, J. B. Measurement of pollutant toxicity to fish. II Utilising and applying bioassay results. Water Res. 1970, 4, 3-32.
(10) Stephan, C. E. Methods for calculating an LC₅₀. In Aquatic Toxicology and Hazard Evaluation (F. I. Mayer, J. L. Hamelink (eds.)). American Society for Testing and Materials. ASTM, 1977, STP 634, 65-84.
(11) Stephan, C. E., Busch, K. A., Smith, R., Burke, J., Andrews, R. W. A computer program for calculating an LC₅₀. US EPA.

DODATEK 1

Upravená voda

Příklad vhodné ředicí vody (podle ISO 6341)

Všechny chemikálie musí být čistoty p.a.

Voda musí být kvalitní destilovaná nebo deionizovaná s vodivostí menší než 5 μS·cm^-1.

Destilační přístroj nesmí obsahovat žádné měděné části.

Zásobní roztoky:

DODATEK 1 Upravená voda
CaCl₂·2H₂O (chlorid vápenatý dihydrát) se rozpustí ve vodě a doplní vodou na 1 litr.	11,76 g
MgSO₄·7H₂O (síran hořečnatý heptahydrát) se rozpustí ve vodě a doplní vodou na 1 litr.	4,93 g
NaHCO₃ (hydrogenuhličitan sodný) se rozpustí ve vodě a doplní vodou na 1 litr.	2,59 g
KCl (chlorid draselný) se rozpustí ve vodě a doplní vodou na 1 litr.	0,23 g

Upravená ředicí voda

Smísí se po 25 ml všech čtyř zásobních roztoků a doplní vodou na 1 litr.

Provzdušňuje se, dokud koncentrace rozpuštěného kyslíku neodpovídá koncentraci nasycení vzdušným kyslíkem.

pH musí být 7,8 ± 0,2.

Podle potřeby se pH upraví pomocí NaOH (hydroxid sodný) nebo HCl (kyselina chlorovodíková).

Tato ředicí voda se nechá 12 h stát a nemusí být dále provzdušňována.

Koncentrace úhrnu iontů Ca a Mg v tomto roztoku je 2,5 mmol·l^-1. Poměr množství iontů Ca : Mg je 4 : 1 a poměr množství iontů Na : K je 10 : 1. Celková koncentrace alkalických kovů v tomto roztoku je 0,8 mmol·l^-1.

Jakákoli odchylka v přípravě vody k ředění nesmí změnit složení ani vlastnosti vody.

DODATEK 2

Souhrn výsledků kruhového testu EHS provedeného v roce 1978 (citovaného také v (2)).

Upozornění: účelem tohoto kruhového testu bylo stanovení 24hodinové hodnoty EC₅₀.

Použité látky:
1. 1) Dichroman draselný
2. 2) Kyselina tetrapropylbenzensulfonová
3. 3) Kyselina tetrapropylbenzensulfonová, sodná sůl
4. 4) Kyselina 2,4,5-trichlorfenoxyoctová, draselná sůl
  
  DODATEK 1 Upravená voda DODATEK 2
  Látka Počet zúčastněných
  laboratoří Počet výsledků pro
  výpočet Střední hodnota
  24hodinové EC₅₀mg/l
  1 46 129 1,5
  2 36 108 27
  3 31 84 27
  4 32 72 770

DODATEK 1 Upravená voda DODATEK 2
Látka	Počet zúčastněných laboratoří	Počet výsledků pro výpočet	Střední hodnota 24hodinové EC₅₀mg/l
1	46	129	1,5
2	36	108	27
3	31	84	27
4	32	72	770

DODATEK 3

Příklad závislosti imobilizace, vyjádřené v procentech, na koncentraci

Příklad stanovení EC₅₀ s použitím pravděpodobnostního logaritmického papíru

III. METODA PRO STANOVENÍ INHIBICE RŮSTU ŘAS – metoda C.3 podle přílohy směrnice 92/69/EHS

III.1 METODA

III.1.1 ÚVOD
Účelem této zkoušky je stanovit účinky látky na růst jednobuněčných zelených řas. Relativně krátkodobými zkouškami (72 h) lze posoudit účinky na několik generací řas. Tato metoda může být upravena pro použití s několika druhy řas, přičemž musí být v protokolu o zkoušce uveden popis metody.
Použití metody je nejsnadnější v případě látek rozpustných ve vodě, které za podmínek zkoušky pravděpodobně zůstávají ve vodě.
Metodu lze použít pro látky, které přímo neovlivňují měření růstu řas.
Je žádoucí mít před započetím zkoušky k dispozici co nejúplnější údaje o rozpustnosti látky ve vodě, o tenzi par, chemické stabilitě, disociačních konstantách a o biologické rozložitelnosti látky.
Další informace (např. strukturní vzorec, stupeň čistoty, druh a podíl významných nečistot v procentech, přítomnost a množství přísad a rozdělovací koeficient n-oktanol/voda) je třeba vzít v úvahu při plánování zkoušky i při interpretaci výsledků.

III.1.2 DEFINICE A JEDNOTKY
Hustota buněk: počet buněk na jeden mililitr.
Růst: zvyšování hustoty buněk během doby trvání zkoušky.
Růstová rychlost: nárůst hustoty buněk za jednotku času.
EC₅₀: v této metodě jde o koncentraci zkušební látky, která má za následek 50% snížení růstu (E_bC₅₀) nebo růstové rychlosti (E_rC₅₀) vzhledem ke kontrole.
NOEC (no observed effect concentration): v této metodě jde o je nejvyšší zkoušenou koncentraci, při níž není pozorováno žádné významné snížení růstu nebo růstové rychlosti ve srovnání s kontrolou.
Všechny koncentrace zkušební látky se udávají v hmotnosti na jednotku objemu (mg·l^-1). Mohou se také vyjádřit v hmotnostních podílech (mg·kg^-1).

III.1.3 REFERENČNÍ LÁTKY
Zkoušky s referenčními látkami mohou být provedeny s cílem prokázat, že se reakce zkušebních druhů za laboratorních zkušebních podmínek podstatně nezměnila.
Při použití referenční látky musí být výsledky uvedeny do protokolu o zkoušce. Jako referenční látka může být použit dichroman draselný, ale jeho barva může ovlivnit kvalitu a intenzitu světla dostupného buňkám a také spektrofotometrická měření, pokud se použijí. Dichroman draselný byl použit v mezinárodních mezilaboratorních testech (viz (3) a doplněk 2).

III.1.4 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY
Může být provedena limitní zkouška s koncentrací 100 mg·l^-1, s cílem prokázat, že EC₅₀ je vyšší než tato koncentrace.
Exponenciálně rostoucí kultury vybraných zelených řas jsou po několik generací vystaveny za definovaných podmínek různým koncentracím zkušební látky.
Zkušební roztoky se kultivují 72 h, během nichž se alespoň každých 24 h měří hustota buněk v každém roztoku. Stanoví se snížení růstu ve srovnání s kontrolní kulturou.

III.1.5. KRITÉRIA JAKOSTI
Kritéria jakosti se vztahují jak na limitní zkoušku, tak na celý zkušební postup.
Hustota buněk v kontrolních kulturách by se měla za 3 dny zvýšit alespoň šestnáctkrát.
Koncentrace zkušební látky nesmí po celou zkoušky klesnout pod 80 % původní hodnoty koncentrace.
U látek, které se ve zkušebním médiu lehce rozpouštějí a dávají stabilní roztoky, tj. v podstatné míře netěkají, nerozkládají se, nehydrolyzují nebo se neadsorbují, lze počáteční koncentraci pokládat za ekvivalentní s nominální koncentrací. Musí být potvrzeno, že byly koncentrace po celou zkoušku udrženy a že kritéria jakosti byla dodržena.
1. U látek, které
  1. i) jsou ve zkušebním médiu špatně rozpustné, nebo
  2. ii) mohou vytvářet stabilní emulze nebo disperse, nebo
  3. iii) jsou ve vodných roztocích nestabilní,
  4. musí být počáteční koncentrace brána jako koncentrace naměřená v roztoku na začátku zkoušky. Koncentrace se stanoví po určité době jejího ustálení.
Ve všech uvedených případech musí být během zkoušky provedena další měření s cílem potvrdit skutečné expoziční koncentrace nebo dodržení kritérií jakosti.
Je známo, že podstatná část zkušební látky může být během zkoušky zabudována do biomasy řas. Proto by se za účelem prokázání dodržení kritérií jakosti mělo brát v úvahu jak množství látky zabudované do biomasy řas, tak látka v roztoku (nebo, není-li to technicky možné, ve vodním sloupci). Protože však stanovení koncentrace látky v biomase řas může představovat technické obtíže, může být dodržení kritérií jakosti prokázáno zkouškou s nejvyšší koncentrací látky, ale bez řas, a měřením koncentrací v roztoku (nebo, není-li to technicky možné, ve vodním sloupci) na začátku a na konci zkoušky.

III.1.6 POPIS ZKUŠEBNÍHO POSTUPU

III.1.6.1 Činidla

III.1.6.1.1 Roztoky zkušebních látek
Zásobní roztoky o požadované koncentraci se připraví rozpuštěním látky v deionizované vodě nebo ve vodě podle bodu 1.6.1.2.
Zvolené zkušební koncentrace se připraví přidáním vhodného alikvotního podílu k předkulturám řas (viz doplněk 1).
Látky se obvykle zkoušejí až do meze jejich rozpustnosti. U některých látek (např. u látek s nízkou rozpustností ve vodě nebo vysokou hodnotou P_o/v nebo u látek, které ve vodě vytvářejí spíše stabilní disperse než pravé roztoky) je možné provést zkoušku při koncentraci vyšší, než je mez rozpustnosti, aby bylo zajištěno, že je dosaženo maximální koncentrace odpovídající maximální rozpustnosti/stabilitě. Je ovšem nutné, aby tato koncentrace jinak nenarušovala zkušební systém (např. vytvořením filmu na hladině bránícímu okysličení vody atd.).
Pro přípravu zásobních roztoků látek s nízkou rozpustností ve vodě nebo pro usnadnění rozptýlení látky ve zkušebním médiu lze použít ultrazvukovou dispergaci, organická rozpouštědla či emulgátory nebo dispergátory. Použijí-li se takové pomocné látky, měly by všechny zkušební koncentrace obsahovat stejné množství těchto pomocných látek a stejné koncentraci pomocné látky jako ve zkušebních sériích by měly být exponovány další kontroly. Koncentrace pomocných látek by měla být minimální a v žádném případě by neměla překročit 100 mg na l zkušebního média.
Zkouška se provede bez úpravy pH. Existují-li známky toho, že dochází k výrazné změně pH, doporučuje se zkoušku opakovat s úpravou pH a výsledky zaznamenat. V takovém případě se upraví pH zásobního roztoku na pH vody k ředění, pokud proti tomu neexistuji specifické důvody. Při úpravě pH se dává přednost HCl a NaOH. Úprava pH se provede tak, aby nebyla koncentrace zkušební látky v zásobním roztoku v podstatné míře změněna. Dojde-li úpravou ve zkušebním médiu k chemické reakci nebo ke srážení, skutečnosti se zaznamenají.

III.1.6.1.2 Zkušební médium

Voda musí být kvalitní destilovaná nebo deionizovaná s vodivostí menší než 5 μS·cm^-1. Destilační přístroj nesmí obsahovat žádné měděné části.

Je doporučeno následující médium:

Podle následující tabulky se připraví čtyři zásobní roztoky. Tyto roztoky se sterilizují membránovou filtrací nebo v autoklávu a skladují se v temnu při 4 °C. Zásobní roztok č. 4 by se měl sterilizovat pouze membránovou filtrací. Ředěním těchto roztoků se získají konečné živné koncentrace zkušebních roztoků.

DODATEK 1 Upravená voda DODATEK 2 DODATEK 3 Příklad závislosti imobilizace, vyjádřené v procentech, na koncentraci
Živina	Koncentrace v zásobním roztoku	Konečná koncentrace ve zkušebním roztoku
Zásobní roztok č. 1: makroživiny
NH₄Cl	1,5	15 mg·l^-1
MgCl₂·6H₂O	1,2	12 mg·l^-1
CaCl₂·2H₂O	1,8	18 mg·l^-1
MgSO₄·7H₂O	1,5	15 mg·l^-1
KH₂PO₄	0,16	1,6 mg·l^-1
Zásobní roztok č. 2: Fe - EDTA
FeCl₃·6H₂O	80	0,08 mg·l^-1
Na₂EDTA·2H₂O	100	0,1 mg·l^-1
Zásobní roztok č. 3: stopové prvky
H₃BO₃	185	0,18 mg·l^-1
MnCl₂·4H₂O	415	0,415 mg·l^-1
ZnCl₂	3	310^-3 mg·l^-1
CoCl₂·6H₂O	1,5	1,510^-3 mg·l^-1
CuCl₂·2H₂O	0,01	110^-5 mg·l^-1
Na₂MoO₄·2H₂O	7	710^-3 mg·l^-1
Zásobní roztok č. 4: NaHCO₃
NaHCO₃	50	50 mg·l^-1

Po ustálení a po provzdušnění by mělo mít médium hodnotu pH přibližně 8.

III.1.6.2 Přístroje a pomůcky
1. — Běžné laboratorní vybavení.
2. — Kultivační baňky o vhodném objemu (např. Erlenmeyerovy baňky na 250 ml jsou vhodné v případě zkušebního roztoku o objemu 100 ml). Všechny zkušební baňky by měly být identické, pokud jde o materiál a rozměry.
3. — Kultivační zařízení: místnost nebo komora, v nichž lze udržovat teplotu 21 – 25 °C ± 2 °C a stálé rovnoměrné osvětlení v rozsahu vlnových délek od 400 do 700 nm. Jestliže všechny řasy v kontrolních kulturách dosáhly doporučené růstové rychlosti, lze předpokládat, že podmínky pro jejich růst, včetně intenzity světla, jsou vyhovující.
U zkušebních roztoků s průměrnými koncentracemi se doporučuje použít světelnou intenzitu od 60 do 120 μE·m^-2·s^-1(35 – 70·10¹⁸ fotonů m^-2·s^-1) při měření v rozsahu 400 – 700 nm vhodným detektorem. Při měření intenzity luxmetry je přijatelný rozsah odpovídající 6000 – 10 000 lx.
Této světelné intenzity lze dosáhnout umístěním čtyř až sedmi univerzálních bílých 30W zářivek (teplota chromatičnosti přibližně 4 300 K) ve vzdálenosti 0,35 m od kultury řas.
1. — Měření hustoty buněk by se mělo provádět přímým počítáním živých buněk, např. pod mikroskopem s počítacími komůrkami. Za předpokladu dostatečné citlivosti a prokázané dobré korelace s buněčnou hustotou mohou být použity i jiné postupy (fotometrie, turbidimetrie,...).

III.1.6.3 Testovací organismy
1. Je doporučeno použít rychle rostoucí druhy zelených řas vhodné pro kultivaci a zkoušení. Dává se přednost následujícím druhům:
  1. — Selenastrum capricornutum, např. ATCC 22662 nebo CCAP 278/4,
  2. — Scenedesmus subspicatus, např. 86.81 SAG.
  3. Poznámka:
    1. ATCC = American Type Culture Collection (USA)
    2. CCAP = Culture Centre of Algae and Protozoa (VB)
    3. SAG = Collection of algal culture (Göttingen, SRN)
Použití jiného druhu řas musí být uvedeno ve zprávě.

III.1.6.4 Zkušební postup
Koncentrační rozmezí, ve kterém lze očekávat účinky, se určí na základě výsledků orientačních zkoušek.
Dva parametry, jež jsou mírou růstu (biomasa a růstová rychlost), mohou poskytovat zcela rozdílné hodnoty snížení růstu; v orientační zkoušce by měly být použity oba parametry, aby mohlo zajištěno, že geometrická řada koncentrací umožní odhadnout jak E_bC₅₀, tak E_rC₅₀.
Počáteční hustota buněk
Doporučuje se, aby byla počáteční hustota buněk řasy Selenastrum capricornutum a řasy Scenedesmus subspicatus ve zkušebních roztocích přibližně 10⁴ buněk na ml. Použije-li se jiný druh řasy, měla by být biomasa srovnatelná.
Koncentrace zkušební látky
Pro zkoušku se připraví geometrická řada nejméně pěti koncentrací lišících se od sebe vždy faktorem nepřekračujícím 2,2. Nejnižší zkoušená koncentrace by neměla vykazovat žádný pozorovatelný účinek na růst řas. Nejvyšší zkoušená koncentrace by měla omezit růst ve srovnání s kontrolní zkouškou nejméně o 50 %, nejlépe by měla růst zcela zastavit.
Opakování a kontroly
Plán zkoušky by měl zahrnovat tři opakování s každou zkušební koncentrací. Dále se provedou tři kontroly bez zkušební látky, a je-li použita pomocná látka, též tři kontroly s touto látkou. Je-li pro to důvod, může být plán zkoušky upraven tak, že se použije více koncentračních úrovní a sníží se počet opakování zkoušky s každou koncentrací.
Provedení zkoušky
Zkušební roztoky o požadované koncentraci zkušební látky a požadovaném množství inokula řas se připraví přidáním alikvotních podílů zásobního roztoku zkušební látky k vhodnému množství prekultury řas (viz doplněk 1).
Kultivační baňky se protřepou a umístí se do kultivačního zařízení. Buňky řas se udržují v suspensi třepáním, mícháním nebo probubláváním vzduchem, aby se zlepšila výměna plynů a zmenšilo se kolísání pH ve zkušebních roztocích. Kultury se udržují při teplotě 21 – 25 °C udržované s přesností na ± 2 °C.
Hustota buněk v každé baňce se stanoví nejméně po 24, 48 a 72 h po zahájení zkoušky. Používá-li se měření hustoty buněk jiná metoda, než je jejich přímé počítání, použije se ke stanovení pozadí filtrované médium pro kultivaci řas obsahující odpovídající koncentraci zkušební chemické látky.
pH se měří na začátku zkoušky a po 72 h.
Hodnota pH by se neměla během zkoušky změnit víc než o 1,5.
Zkoušení těkavých látek
V současné době neexistuje obecně přijatý způsob zkoušení těkavých látek. Je-li o látce známo, že se snadno vypařuje, mohou být použity uzavřené kultivační nádoby se zvětšeným mrtvým objemem. Při plánování objemu horní části kultivačních baněk se musí zohlednit eventuální nedostatek CO₂. Byly navrženy varianty této metody (4).
Měl by být učiněn pokus stanovit množství zkušební látky, které v roztoku zůstalo; při interpretaci výsledků zkoušek s těkavými látkami v uzavřených systémech je doporučeno postupovat mimořádně opatrně.
Limitní zkouška
S využitím postupů popsaných v této metodě může být provedena limitní zkouška s koncentrací 100 mg·l^-1 s cílem prokázat, že EC₅₀ je vyšší než tato koncentrace.
Je-li povaha zkušební látky taková, že nelze ve vodě dosáhnout koncentrace 100 mg·l^-1, provede se limitní zkouška při koncentraci odpovídající rozpustnosti této látky v použitém médiu (nebo při maximální koncentraci, kdy látka vytváří stabilní disperzi) (viz také bod 1.6.1.1).
Limitní zkouška se provede alespoň třikrát, se stejným počtem kontrol. V limitní zkoušce se stanoví oba parametry, jež jsou mírou růstu (biomasa a růstová rychlost).
Zjistí-li se v limitní zkoušce pokles růstu biomasy nebo růstové rychlosti ve srovnání s kontrolami o 25 % nebo více, provede se úplná zkouška.

III.2 DATA A HODNOCENÍ
Naměřené hustoty buněk ve zkušební kultuře a v kontrolách se spolu s koncentracemi zkušební látky a dobami měření shrnou do tabulky. Střední hodnota hustoty buněk pro každou zkušební koncentraci a pro kontroly se vynese proti času (0 – 72 h) a sestrojí se růstová křivka.
Vztah koncentrace/účinek se stanoví dvěma následujícími postupy. Některé látky mohou růst při nízkých koncentracích stimulovat. V úvahu by měla být vzata pouze data udávající potlačení růstu mezi 0 a 100 %.
1. III.2.1 POROVNÁNÍ PLOCH POD RŮSTOVÝMI KŘIVKAMI
  1. Plocha mezi růstovou křivkou a vodorovnou linií N = N₀ se vypočte podle následujícího vzorce:
    1. kde
      1. A = plocha,
      2. N₀ = počet buněk v ml v čase t₀ (na počátku zkoušky),
      3. N₁ = naměřený počet buněk v 1 ml v čase t₁,
      4. N_n = naměřený počet buněk v 1 ml v čase t_n,
      5. t₁ = doba prvního měření od počátku zkoušky,
      6. t_n = doba n-tého měření od počátku zkoušky,
      7. n = počet měření od počátku zkoušky.
  1. Potlačení růstu vyjádřené v % (I_A) se pro každou koncentraci zkušební látky vypočte podle vzorce:
    1. kde
      1. A_c = plocha mezi růstovou křivkou kontrolní zkoušky a horizontální linií N = N₀,
      2. A_t = plocha mezi růstovou křivkou při koncentraci t a horizontální linií N = N₀.
  Hodnoty I_A se nanesou na semilogaritmický nebo na pravděpodobnostní semilogaritmický papír proti odpovídajícím koncentracím. Vynesou-li se body na pravděpodobnostní papír, proloží se body přímka, a to ručně nebo regresním výpočtem.
  Hodnota EC₅₀ se odhadne odečtením z regresní přímky jako koncentrace odpovídající 50% snížení růstu (I_A ⁼ 50 %). Pro jednoznačné označení této hodnoty v rámci této metody výpočtu se doporučuje použít symbol E_bC_50. Je důležité, aby byla s hodnotou E_bC₅₀ uvedena příslušná expoziční doba, např. E_bC₅₀ (0 − 72 h).
1. III.2.2 POROVNÁNÍ RŮSTOVÝCH RYCHLOSTÍ
  1. Průměrnou specifickou růstovou rychlost (μ) pro exponenciálně rostoucí kultury lze vypočítat jako:
    1. kde t₀ je čas začátku zkoušky.
  Průměrnou specifickou růstovou rychlost lze také odvodit ze sklonu regresní přímky v závislosti ln N na čase.
  1. Snížení specifické růstové rychlosti vyjádřené v procentech pro každou koncentraci zkušební látky (I_μt) se vypočte podle vzorce:
    1. kde
      1. μ_c = střední specifická růstová rychlost v kontrole,
      2. μ_t = střední specifická růstová rychlost pro zkušební koncentraci t.
  Snížení střední specifické růstové rychlosti v procentech při všech koncentracích zkušební látky ve srovnání s kontrolní hodnotou se vynese proti logaritmu koncentrace. Hodnotu EC₅₀ lze odečíst z výsledného grafu. Pro jednoznačné označení EC₅₀ odvozené touto metodou se doporučuje použít symbol E_rC₅₀. Musí být uvedeny okamžiky měření, např. vztahuje-li se hodnota k času 0 a k 72 h, označí se symbolem E_rC₅₀ (0 – 72 h):
2. Poznámka: Ve výrazu pro specifickou růstovou rychlost vystupují logaritmy, tzn. malé změny růstové rychlosti mohou odpovídat velkým změnám biomasy. Hodnoty E_bC a E_rC tedy nejsou číselně srovnatelné.
1. III.2.3 VÝPOČET NOEC
  Hodnota koncentrace nezpůsobující žádné pozorovatelné účinky (NOEC) se stanoví vhodnou statistickou metodou pro srovnávání více vzorků (např. analýza rozptylu a Dunnettův test) s využitím jednotlivých hodnot ploch pod růstovými křivkami A (viz bod 2.1) nebo specifických růstových rychlostí μ (viz bod 2.2).

III.3 ZPRÁVY
1. Protokol o zkoušce má pokud možno obsahovat následující údaje:
  1. — zkušební látka: údaje o chemické identitě;
  2. — testovací organismus: původ, laboratorní kultura, číslo kmene, metoda kultivace;
  3. — zkušební podmínky:
    1. — datum zahájení a ukončení zkoušky a délka zkoušení,
    2. — teplota,
    3. — složení média,
    4. — kultivační zařízení,
    5. — hodnoty pH roztoku na počátku a na konci zkoušky (je-li pozorováno kolísání pH o více než 1,5, uvede se vysvětlení),
    6. — nosič a metoda použitá pro rozpouštění zkušební látky, koncentrace nosiče ve zkušebních roztocích,
    7. — intenzita a kvalita světla,
    8. — zkoušené koncentrace (naměřené nebo nominální);
  1. — výsledky:
    1. — koncentrace buněk v jednotlivých baňkách v každé době měření a metoda měření koncentrace buněk,
    2. — průměrné hodnoty koncentrace buněk,
    3. — růstové křivky,
    4. — grafické znázornění vztahu koncentrace – účinek,
    5. — hodnoty EC a metoda výpočtu,
    6. — NOEC,
    7. — další pozorované účinky.

III.4 LITERATURA
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 201, Decision of the Council C(81) 30 Final.
(2) Umweltbundesamt, Berlin, 1984, Verfahrensvorschlag „Hemmung der Zellvermehrung bei der Grünalge Scenedesmus subspicatus“, In: Rudolph / Boje: Ökotoxikologie, ecomed, Landsberg,1986.
(3) ISO 8692 – Water quality – Fresh water algal growth inhibition test with Scenedesmus subspicatus and Selenastrum capricornutum.
(4) S. Galassi, M. Vighi. Chemosphere, 1981, 10, 1123-1126.

DODATEK 1

Příklad postupu kultivace řas

Obecné poznámky

Účelem kultivace následujícím postupem je získání kultur řas pro zkoušky toxicity.

Měly by být použity vhodné metody k tomu, aby bylo zajištěno, že kultury řas nebudou infikovány bakteriemi (ISO 4833). Vhodné mohou být axenické kultury, avšak základem jsou jednodruhové kultury.

Všechny operace se provádějí za sterilních podmínek, aby nedošlo ke kontaminaci bakteriemi a jinými řasami. Kontaminované kultury se vyřadí.

Postupy při získání kultur řas

Příprava živných roztoků (média):

Médium lze připravit zředěním koncentrovaných základních roztoků živin. K získání pevného média se přidává 0,8 % agaru. Použité médium by mělo být sterilní. Sterilizace v autoklávu může vést ke ztrátě NH₃.

Kmenová kultura:

Kmenové kultury jsou malé kultury řas, které se pravidelně přenášejí do čerstvého média, kde slouží jako výchozí testovací materiál. Nejsou-li kultury pravidelně používány, vyočkovávají se na šikmý agar. Poté se nejméně jednou za dva měsíce přenášejí do čerstvého média.

Kmenové kultury se pěstují v Erlenmeyerových baňkách obsahujících vhodné medium (objem přibližně 100 ml). Jsou-li řasy kultivovány při teplotě 20 °C a stálém osvětlení, musí se přenášet každý týden.

Při přeočkování se přenese sterilní pipetou do baňky s čerstvým mediem takové množství „staré“ kultury, aby byla výchozí koncentrace u rychle rostoucího druhu řas asi stokrát menší než koncentrace kultury staré.

Růstovou rychlost druhu řas lze odečíst z růstové křivky. Je-li známa, lze z ní odhadnout hustotu, při níž musí být kultura přenesena do čerstvého média. K tomu musí dojít před fází odumírání kultury.

Předkultura:

Účelem předkultur je poskytnout dostatečné množství řas potřebných pro naočkování testovacích kultur. Předkultura se kultivuje za zkušebních podmínek a použije se ještě během exponenciálního růstu, to znamená obvykle po třídenní inkubační lhůtě. Obsahují-li kultury řas deformované nebo abnormální buňky, musí se odstranit.

DODATEK 2

V normě ISO 8692 - Jakost vody - Růstová inhibiční zkouška na sladkovodních řasách Scenedesmus subspicatus a Selenastrum capricornutum jsou uvedeny výsledky mezilaboratorních zkoušek dichromanu draselného provedených 16 laboratořemi.

DODATEK 1 Upravená voda DODATEK 2 DODATEK 3 Příklad závislosti imobilizace, vyjádřené v procentech, na koncentraci DODATEK 1 Příklad postupu kultivace řas Obecné poznámky Postupy při získání kultur řas DODATEK 2
	Střední hodnota (mg·l^-1)	Rozpětí (mg·l^-1)
E_rC₅₀(0 - 72 h)	0,84	0,60 až 1,03
E_bC₅₀(0 - 72 h)	0,53	0,20 až 0,75

IV. METODY PRO STANOVENÍ „SNADNÉ“ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI – metody C.4 podle přílohy směrnice 92/69/EHS

IV.I.1 ÚVOD
1. Je popsáno šest metod, které umožňují screeningové posouzení snadné biologické rozložitelnosti chemických látek v aerobním vodním prostředí:
  1. a) Zkouška na úbytek rozpuštěného organického uhlíku (DOC) (metoda C.4-A)
  2. b) Modifikovaná screeningová zkouška OECD - na úbytek DOC (metoda C.4-B)
  3. c) Zkouška na uvolňování oxidu uhličitého (CO2) (modifikovaná Sturmova zkouška) (metoda C.4-C)
  4. d) Zkouška manometrickou respirometrií (metoda C.4-D)
  5. e) Zkouška v uzavřených lahvičkách (metoda C.4-E)
  6. f) Zkouška MITI (Ministerstvo zahraničního obchodu a průmyslu – Japonsko) (metoda C.4-F)
Obecné a společné úvahy pro všech šest zkoušek jsou uvedeny v části I metody. Specifické body jednotlivých metod jsou uvedeny v částech II až VII. Přílohy obsahují definice, vzorce a návody.
Mezilaboratorní srovnávací test OECD provedený v roce 1988 ukázal, že metody poskytují shodné výsledky. V závislosti na fyzikálním charakteru látky, která má být zkoušena, se však může dávat přednost určité metodě.

IV.I.2 VÝBĚR VHODNÉ METODY

Pro volbu nejvhodnější metody jsou nezbytné informace o rozpustnosti, tenzi par a o adsorpčních vlastnostech chemické látky. Pro výpočet teoretických hodnot a/nebo ověření naměřených hodnot parametrů, např. TSK, TCO₂, DOC, TOC, CHSK (viz přílohy I a II) je nutné znát chemickou strukturu nebo vzorec.

Zkušební chemické látky, jejichž rozpustnost ve vodě je alespoň 100 mg·l^-1, lze zkoušet všemi metodami za předpokladu, že netěkají a neadsorbují se. Pro látky špatně rozpustné ve vodě, které těkají nebo se adsorbují, jsou vhodné metody uvedené v tabulce 1. Způsob, jakým je třeba zacházet s látkami špatně rozpustnými ve vodě a s látkami těkavými, je popsán v příloze III. Mírně těkavé látky je možno zkoušet metodou úbytku DOC, pokud je ve zkušebních nádobách (které musí být vhodně uzavřeny) dostatečně velký prostor pro plyn. V tomto případě musí být provedena abiotická kontrola pro zohlednění případné fyzikální ztráty.

Tabulka 1: Použitelnost zkušebních metod

DODATEK 1 Upravená voda DODATEK 2 DODATEK 3 Příklad závislosti imobilizace, vyjádřené v procentech, na koncentraci DODATEK 1 Příklad postupu kultivace řas Obecné poznámky Postupy při získání kultur řas DODATEK 2 Tabulka 1: Použitelnost zkušebních metod
Zkouška	Analytická metoda	Vhodnost pro látky
		špatně r ozpustné	těkavé	adsorbující se
na úbytek DOC	rozpuštěný organický uhlík	—	—	+ /−
modif. zkouška OECD – na úbytek DOC	rozpuštěný organický uhlík	—	—	+ /−
na uvolňování CO₂	respirometrie: uvolňování CO₂	+	—	+
manometrická respirometrie	manometrická respirometrie: spotřeba kyslíku	+	+ /−	+
zkouška v uzavřených lahvičkách	respirometrie: rozpuštěný kyslík	+ /−	+	+
MITI	respirometrie: spotřeba kyslíku	+	+/−	+

Pro interpretaci získaných výsledků, zejména pokud jsou výsledky nízké nebo marginální, se vyžadují informace o čistotě nebo relativních podílech hlavních složek zkušebního materiálu.

Pro volbu vhodných zkušebních koncentrací mohou být velmi užitečné informace o toxicitě zkušební chemické látky pro bakterie (příloha IV); tyto informace mohou být důležité pro správnou interpretaci nízkých hodnot biologického rozkladu.

IV.I.3 REFERENČNÍ LÁTKY
Pro ověření postupu se souběžně se zkouškou a ve vlastní baňce zkoušejí referenční chemické látky, které splňují kritéria snadné biologické rozložitelnosti.
Vhodnými chemickými látkami jsou anilin (čerstvě předestilovaný), natrium-acetát, natrium-benzoát. Všechny tyto referenční chemické látky se za podmínek v uvedených metodách rozkládají, i když se záměrně nepřidá žádné inokulum.
Byl podán návrh hledat referenční chemickou látku, která by byla snadno rozložitelná, avšak vyžadovala by přidání inokula. Navržen byl kalium-hydrogen-ftalát. O této látce je třeba ještě získat více údajů, než ji bude možné přijmout jako referenční látku.
V respirometrických zkouškách mohou v důsledku nitrifikace ovlivnit spotřebu kyslíku látky obsahující dusík (viz přílohy II a V).

IV.I.4 PODSTATA ZKUŠEBNÍCH METOD
Roztok nebo suspense zkušební látky v minerálním prostředí se inokuluje a kultivuje v aerobních podmínkách v temnu nebo v difuzním světle. Množství DOC ve zkušebním roztoku pocházející z inokula se musí udržovat ve srovnání s DOC pocházejícího ze zkušební látky co nejnižší. Endogenní aktivita inokula se zohlední na základě souběžné slepé zkoušky s inokulem, avšak bez zkoušené látky, třebaže endogenní aktivita buněk v přítomnosti látky přesně neodpovídá aktivitě v endogenní kontrolní zkoušce. Za účelem kontroly postupu se souběžně provádí zkouška s referenční látkou.
Obecně se rozklad sleduje stanovením parametrů jako DOC, tvorba CO₂ nebo spotřeba kyslíku a měření se provádějí v dostatečně krátkých intervalech, aby bylo možné identifikovat začátek a konec biologického rozkladu. Měření automatickými respirometry je kontinuální. Někdy se doplňkově k jinému parametru měří DOC, avšak obvykle pouze na začátku a na konci zkoušky. Lze rovněž použít specifickou chemickou analýzu, kterou se vyhodnotí primární rozklad zkušební látky nebo kterou se stanoví koncentrace kteréhokoli vzniklého meziproduktu (ve zkoušce MITI povinné).
Zkouška obvykle trvá 28 dnů. Je však možné ukončit měření před uplynutím 28 dní, tj. jakmile vykazuje křivka biologického rozkladu plató po tři po sobě následující měření. Je také možné měření po 28 dnech prodloužit, jestliže z křivky vyplývá, že biologický rozklad začal, avšak 28. dne ještě nebylo ještě dosaženo plató.

IV.I.5 KRITÉRIA JAKOSTI
1. IV.I.5.1 Reprodukovatelnost
  Vzhledem k charakteru biologického rozkladu a směsných populací bakterií používaných jako inokula se stanovení provádějí nejméně duplicitně.
  Je obecně známo, že čím vyšší je koncentrace mikroorganismů přidaných na počátku do zkušebního média, tím menší jsou rozdíly mezi vícenásobnými měřeními. Okružní testy rovněž ukázaly, že mezi výsledky získanými různými laboratořemi mohou být velké rozdíly, avšak u snadno biologicky rozložitelných sloučenin se obvykle dosahuje dobré shody.
1. IV.I.5.2 Platnost zkoušky
  Zkouška se považuje za platnou, je-li na konci zkoušky nebo popřípadě na konci 10denního období rozkladu rozdíl hodnot krajních výsledků vícenásobných měření rozkladu zkušební chemické látky v oblasti plató křivky menší než 20 % a dosáhl-li stupeň rozkladu referenční látky vyjádřený v procentech úrovně snadné biologické rozložitelnosti do 14 dní. Není-li splněna kterákoli z těchto podmínek, měření se opakuje. Vzhledem k náročnosti metod neznamenají nízké hodnoty nutně skutečnost, že zkušební látka není v podmínkách životního prostředí biologicky rozložitelná, ale znamenají, že k prokázání biologické rozložitelnosti jsou třeba další studie.
  Jestliže ve zkoušce toxicity zahrnující jak zkušební látku, tak referenční chemickou látku došlo během 14 dnů k méně než 35% rozkladu (stanoveného podle DOC) nebo k méně než 25% rozkladu (stanoveného podle TSK nebo TCO₂), lze zkušební chemické látky považovat za inhibující (viz také příloha IV). Série zkoušek by měla být opakována, pokud možno s nižší koncentrací zkušební chemické látky a/nebo s vyšší koncentrací inokula, avšak ne s koncentrací vyšší než 30 mg tuhých látek v litru.

IV.I.6 OBECNÉ POSTUPY A PŘÍPRAVA

Obecné podmínky pro zkoušky jsou shrnuty v tabulce 2. Přístroje a další experimentální podmínky specifické pro jednotlivé metody jsou popsány dále v kapitolách pro tyto příslušné metody.

Tabulka 2: Zkušební podmínky

DODATEK 1 Upravená voda DODATEK 2 DODATEK 3 Příklad závislosti imobilizace, vyjádřené v procentech, na koncentraci DODATEK 1 Příklad postupu kultivace řas Obecné poznámky Postupy při získání kultur řas DODATEK 2 Tabulka 1: Použitelnost zkušebních metod Tabulka 2: Zkušební podmínky
Zkouška	Zkouška na úbytek DOC	Zkouška na uvolňování CO₂	Manometrická respirometrie	Modif. screeningová zkouška OECD	Zkouška v uzavřených lahvičkách	Zkouška MITI (I)
Koncentrace zkušební látky
mg·l^-1			100		2 - 10	100
mg DOG/1	10-40	10 - 20		10 - 40
mg TSK/l			50 - 100		5 - 10
Koncentrace inokula (buňky/l, přibližně)	≤ 30 mg/l SL nebo ≤ 100 ml odpadní vody/l (10⁷-10⁸)			0,5 ml sekundární odpadní vody/l (10⁵)	≤ 5 ml odpadní vody/l (10⁴-10⁶)	30 mg/l SL (10⁷-10⁸)
Koncentrace prvků v minerálním médiu (v mg·l^-1)
P	116				11,6	29
N	1,3				0,13	1,3
Na	86				8,6	17,2
K	122				12,2	36,5
Mg	2,2				2,2	6,6
Ca	9,9				9,9	29,7
Fe	0,05 – 0,1				0,05 - 0,1	0,15
pH	7,4 ± 0,2					nejlépe 7,0
Teplota	22 ± 2 °C					25 ± 1 °C
DOC = rozpuštěný organický uhlík, TSK = teoretická spotřeba kyslíku, SL = suspendované látky

IV.I.6.1 Ředicí voda
Používá se deionizovaná nebo destilovaná voda neobsahující inhibující koncentrace toxických látek (např. ionty Cu²⁺). Voda smí obsahovat nejvýše 10 % obsahu organického uhlíku vneseného zkušebním materiálem. Vysoká čistota vody pro zkoušky je nezbytná pro to, aby se nevyskytovaly vysoké hodnoty slepého pokusu. Kontaminace může pocházet z vlastních přítomných nečistot, z materiálu měniče iontů, z rozkladných látek z bakterií a řas. Pro každou sérii měření se použije pouze jedna šarže vody, která byla předem překontrolována analýzou DOC. Tato kontrola není nutná u zkoušky v uzavřených lahvičkách, spotřeba kyslíku vodou však musí být nízká.

IV.I.6.2 Zásobní roztoky minerálních složek

Pro přípravu zkušebních roztoků se připraví zásobní roztoky o vhodných koncentracích minerálních složek Níže uvedené zásobní roztoky je možné použít (při různých zřeďovacích faktorech) pro metodu s úbytkem DOC, modifikovanou screeningovou metodu OECD, metodu s uvolňováním CO₂, pro manometrickou respirometrii a pro metodu s uzavřenými lahvičkami.

Zřeďovací faktory a specifická příprava minerálního media pro zkoušku MITI jsou uvedeny v oddílech pro jednotlivé zkoušky.

Zásobní roztoky:

Za použití reakčních činidel čistoty p.a. se připraví následující zásobní roztoky:

DODATEK 1 Upravená voda DODATEK 2 DODATEK 3 Příklad závislosti imobilizace, vyjádřené v procentech, na koncentraci DODATEK 1 Příklad postupu kultivace řas Obecné poznámky Postupy při získání kultur řas DODATEK 2 Tabulka 1: Použitelnost zkušebních metod Tabulka 2: Zkušební podmínky
a)	Dihydrogenfosforečnan draselný, KH₂PO₄	8,50 g
	Hydrogenfosforečnan didraselný, K₂HPO₄	21,75 g
	Hydrogenfosforečnan disodný dihydrát, Na₂HPO₄·2H₂O	33,40 g
	Chlorid amonný, NH₄Cl	0,50 g

Rozpustí se ve vodě a doplní na 1 litr. pH roztoku musí být 7,4.

DODATEK 1 Upravená voda DODATEK 2 DODATEK 3 Příklad závislosti imobilizace, vyjádřené v procentech, na koncentraci DODATEK 1 Příklad postupu kultivace řas Obecné poznámky Postupy při získání kultur řas DODATEK 2 Tabulka 1: Použitelnost zkušebních metod Tabulka 2: Zkušební podmínky
b)	Chlorid vápenatý bezvodý, CaCl₂	27,50 g
	nebo chlorid vápenatý dihydrát, CaCl₂·2H₂O	36,40 g

Rozpustí se ve vodě a doplní na 1 litr.

DODATEK 1 Upravená voda DODATEK 2 DODATEK 3 Příklad závislosti imobilizace, vyjádřené v procentech, na koncentraci DODATEK 1 Příklad postupu kultivace řas Obecné poznámky Postupy při získání kultur řas DODATEK 2 Tabulka 1: Použitelnost zkušebních metod Tabulka 2: Zkušební podmínky
c)	Síran hořečnatý heptahydrát, MgSO₄·7H₂O	22,50 g

Rozpustí se ve vodě a doplní na 1 litr.

DODATEK 1 Upravená voda DODATEK 2 DODATEK 3 Příklad závislosti imobilizace, vyjádřené v procentech, na koncentraci DODATEK 1 Příklad postupu kultivace řas Obecné poznámky Postupy při získání kultur řas DODATEK 2 Tabulka 1: Použitelnost zkušebních metod Tabulka 2: Zkušební podmínky
d)	Chlorid železitý hexahydrát, FeCl₃·6H₂O	0,25 g

Rozpustí se ve vodě a doplní na 1 litr.

Poznámka: Aby nebylo nutné připravovat tento roztok bezprostředně před použitím, přidá se jedna kapka koncentrované kyseliny chlorovodíkové nebo 0,4 g disodné soli kyseliny ethylendiamintetraoctové (EDTA) na 1 litr.

IV.I.6.3 Zásobní roztoky chemických látek
Pokud je rozpustnost vyšší než 1 g·l^-1, rozpustí se například 1 – 10 g (podle potřeby) zkušební nebo referenční látky v deionizované vodě a doplní se na 1 litr. Jinak se zásobní roztoky připravují v minerálním médiu, nebo se chemická látka přidá přímo do minerálního média. Pokud jde o postup s méně rozpustnými chemickými látkami, viz příloha III; ve zkoušce MITI (metoda C.4-F) se nepoužívají ani rozpouštědla, ani emulgační činidla.

IV.I.6.4 Inokula
Inokulum lze získat z řady zdrojů: z aktivovaného kalu, ze splaškových vod (nechlorovaných), z povrchových vod a půd nebo z jejich směsi. Používá-li se aktivovaný kal ve zkoušce na úbytek DOC, na uvolňování CO₂ a ve zkoušce manometrickou respirometrií, měl by být odebrán z čistírny nebo z laboratorní jednotky čistící převážně domovní odpadní vody. U inokulí z jiných zdrojů byl zjištěn větší rozptyl výsledků. V modifikované screeningové zkoušce OECD a ve zkoušce v uzavřených lahvičkách je potřebné zředěnější inokulum bez vloček kalu a nejvhodnějším zdrojem je voda z druhého stupně čistírny domovních odpadních vod nebo z laboratorní jednotky. Pro zkoušku MITI se inokulum získává ze směsi zdrojů a je popsáno v oddílu věnovaném této zkoušce.
1. IV.I.6.4.1 Inokulum z aktivovaných kalů
  Odebere se čerstvý vzorek aktivovaného kalu z aerační nádrže čistírny odpadních vod nebo laboratorní jednotky čistící převážně domovní odpadní vody. Podle potřeby se filtrací přes jemné síto odstraní hrubé částice a kal se udržuje v aerobních podmínkách.
  Jinou možností je usazení nebo odstředění (např. 10 min při 1 100 g) po odstranění hrubých částic. Voda nad usazeninou se odstraní. Kal se promyje minerálním médiem. Koncentrovaný kal se suspenduje v minerálním médiu na koncentraci 3 – 5 g suspendovaných tuhých látek na litr a až do použití se provzdušňuje.
  Kal by měl být odebrán z dobře fungující konvenční čistírny. Je-li nutné odebrat kal z čistírny s vysokým výkonem nebo předpokládá-li se, že kal obsahuje inhibitory, je třeba jej promýt. Po důkladném promíchání se kal nechá usadit nebo se odstředí, voda nad usazeninou se odstraní a promytý kal se opět suspenduje v nové dávce minerálního média. Tento postup se opakuje, dokud se kal nepovažuje za prostý přebytečného substrátu nebo inhibitoru.
  Po opakovaném suspendování nebo z neupravovaného kalu se těsně před použitím odebere vzorek pro stanovení hmotnosti sušiny suspendovaných tuhých látek.
  Další možností je homogenizace aktivovaného kalu (3 – 5 g suspendovaných látek v litru). Kal se 2 min zpracovává v mechanickém mísiči při střední rychlosti. Promíchaný kal se nechá 30 min, popřípadě déle, usazovat a kapalina se dekantuje pro použití jako inokulum v koncentraci 10 ml na litr minerálního média.
1. IV.I.6.4.2 Jiné zdroje inokula
  Inokulum lze získat z výstupu z druhého stupně čistírny odpadních vod nebo laboratorní jednotky zpracovávající převážně domovní odpadní vody Odebere se čerstvý vzorek a během přepravy se udržuje v aerobních podmínkách. Nechá se 1 h usadit nebo se zfiltruje přes hrubý filtrační papír a dekantovaná kapalina nebo filtrát se až do použití udržuje v aerobních podmínkách. Na litr média lze použít až 100 ml tohoto typu inokula.
  Dalším zdrojem inokula je povrchová voda. V tomto případě se odebere vzorek vhodné povrchové vody, např. říční nebo jezerní vody, a uchovává se až do použití v aerobních podmínkách. V případě potřeby se inokulum zkoncentruje filtrací nebo odstředěním.

IV.I.6.5 Předběžná úprava inokulí
Inokula je možné předběžně upravit pro experimentální podmínky, ale nikoli předběžně adaptovat na zkušební látku. Předběžná úprava spočívá v aeraci aktivovaného kalu v minerálním médiu nebo výstupu z druhého stupně čistírny po dobu 5 – 7 dnů při zkušební teplotě. Předběžná úprava někdy zlepší přesnost zkušebních metod snížením hodnot ze slepých pokusů. Předběžná úprava inokula pro zkoušku MITI se nepovažuje za nutnou.

IV.I.6.6 Abiotické kontroly
V případě potřeby se kontroluje možný abiotický rozklad zkušební látky stanovením úbytku DOC, přijmu kyslíku nebo uvolňování oxidu uhličitého ve sterilních kontrolách bez inokula. Sterilizace se provádí filtrací přes membránu (0,2 – 0,45 μm) nebo přidáním vhodné toxické látky v odpovídající koncentraci. Používá-li se membránová filtrace, odebírají se vzorky asepticky, aby byla zachována sterilita. Pokud nebyla předem vyloučena adsorpce zkušební látky, měly by zkoušky, kterými se sleduje biologický rozklad podle úbytku DOC, zejména při použití inokula z aktivovaného kalu, zahrnovat abiotickou kontrolu, která je inokulována a intoxikována.

IV.I.6.7 Počet nasazených baněk
Počet nasazených baněk v typické zkoušce je uveden v oddílech věnovaných jednotlivým zkouškám.
1. Mohou být použity tyto baňky:
  1. Zkušební suspense: obsahující zkušební látku a inokulum
  2. Slepá zkouška s inokulem: obsahující pouze inokulum
  3. Kontrolní zkouška postupu: obsahující referenční látku a inokulum
  4. Abiotická sterilní kontrola: sterilní, obsahující zkušební látku (viz I.6.6)
  5. Kontrola adsorpce: obsahující zkušební látku, inokulum a sterilizační činidlo
  6. Kontrola toxicity: obsahující zkušební látku, referenční látku a inokulum
Stanovení ve zkušební suspensi a slepý pokus s inokulem musí být prováděny souběžně. Doporučuje se, aby stanovení v ostatních baňkách bylo prováděno rovněž souběžně.
To však nemusí být vždy možné. Je třeba zajistit, aby se odebíral dostatečný počet vzorků nebo aby se prováděl dostatečný počet odečtů pro vyhodnocení procenta úbytku v 10denním období rozkladu.

IV.I.7 DATA A HODNOCENÍ
Při výpočtu rozkladu v procentech D_t, se použijí střední hodnoty z měření parametru provedených duplicitně v obou zkušebních nádobách a ze slepého pokusu s inokulem. Vzorce jsou uvedeny dále v oddílech pro jednotlivé zkoušky. Průběh rozkladu se znázorní graficky a vyznačí se 10denní období rozkladu. Vypočte se a uvede úbytek v procentech dosažený na konci 10denního období rozkladu a hodnota pro plató křivky nebo popřípadě hodnota odpovídající konci zkoušky.

Následující stránka