Platné znění

Vyhláška, kterou se u chemických látek a chemických přípravků stanoví základní metody pro zkoušení fyzikálně-chemických vlastností, výbušných vlastností a vlastností nebezpečných pro životní prostředí

Požaduje-li se stanovení fyzikálně-chemické spotřeby kyslíku, připraví se roztok zkušební látky obvykle o koncentraci 100 mg TSK na litr sterilizovaný přídavkem vhodné toxické látky (viz I.6.6).

Připravené objemy roztoků zkušební a referenční chemické látky se rozdělí alespoň duplicitně do baněk. Do dalších baněk se přidá pouze minerální médium (pro kontrolu inokula) a podle potřeby směs roztoku zkušební a referenční chemické látky a sterilní roztok.

Je-li zkušební chemická látka špatně rozpustná, odváží se nebo odměří v tomto stádiu přímo do baněk, nebo se postupuje podle přílohy III. Do lahví pro absorpci CO2 se přidá hydroxid draselný, pelety hydroxidu sodného nebo jiný absorbent.

  1. IVD.2.5 Počet baněk v typické zkoušce
    1. Baňka 1 a 2: Zkušební suspense
    2. Baňka 3 a 4: Slepá zkouška s inokulem
    3. Baňka 5: Kontrolní zkouška postupu
    4. Dále se doporučují se nebo se podle potřeby použijí:
      1. Baňka 6: Sterilní kontrola
      2. Baňka 7: Kontrola toxicity
      3. Viz také bod I.6.7.
  1. IVD.2.6 Provedení zkoušky

    V baňkách se nechá ustavit požadovaná teplota a vybrané baňky se inokulují přidáním aktivovaného kalu nebo jiného zdroje inokula, aby nebyla koncentrace suspendovaných látek větší než 30 mg·l-1. Zařízení se sestaví, spustí se míchačka, přezkouší se na vzduchotěsnost a zahájí se měření spotřeby kyslíku. Obvykle není třeba věnovat zkoušce žádnou zvláštní pozornost, kromě nezbytných odečtů a denní kontroly teploty a míchání.

    Z pravidelných častých odečtů se podle postupu uvedeného výrobcem zařízení vypočte spotřeba kyslíku. Na konci inkubace, obvykle po 28 dnech, se změří pH v baňkách, a to zvláště tehdy, je-li spotřeba kyslíku malá nebo větší než TSKNH4 (platí pro látky obsahující dusík).

    V případě potřeby se na začátku a na konci odebírá vzorek z respiračních nádobek pro stanovení DOC nebo pro specifickou analýzu (viz příloha II, bod 4). Při počátečním odběru z baňky se zajistí, aby byl znám objem zkušební suspense, která v baňce zůstala. Je-li kyslík spotřebováván látkami obsahujícími dusík, stanoví se přírůstek koncentrací dusičnanů a dusitanů za 28 dnů a vypočte se korekce na spotřebu kyslíku nitrifikací (příloha V).

  1. IVD.3 DATA A ZPRÁVY
    1. IVD.3.1 Zpracování výsledků
      1. Spotřeba kyslíku (mg) zkušební látkou za danou dobu (korigovaná na spotřebu kyslíku inokulem za stejnou dobu ve slepé zkoušce) se podělí hmotností zkušební látky v baňce. Získá se tak hodnota BSK vyjádřená v mg kyslíku na mg zkušební látky:

      1. Biologický rozklad v procentech se vypočte buď z rovnice:

        1. nebo z rovnice:

      Je třeba poznamenat, že tyto dvě metody nemusí poskytovat stejné hodnoty; přednost se dává první metodě.

      Pro látky, jež obsahují dusík, se použije vhodná hodnota TSK (pro NH4 nebo NO3) podle toho, zda se očekává nitrifikace, či nikoli (příloha II, bod 2). Jestliže k nitrifikaci dochází, avšak není úplná, vypočte se korekce na spotřebu kyslíku při nitrifikaci ze změn koncentrace dusitanů a dusičnanů (příloha V).

      V případě, že se provádí nepovinné stanovení organického uhlíku a/nebo specifické chemické látky, vypočte se stupeň rozkladu podle bodu I.7.

      Všechny výsledky se zaznamenají do příslušného formuláře přehledu dat.

    1. IVD.3.2 Platnost výsledků

      Obvyklá spotřeba kyslíku inokulem je 20 – 30 mg O2 na litr a neměla by být větší než 60 mg·l-1 za 28 dnů. Hodnoty větší než 60 mg·l-1 vyžadují kritické přehodnocení výsledků a experimentální techniky. Je-li pH mimo rozpětí 6 – 8,5 a spotřeba kyslíku zkušební látkou je menší než 60 %, měla by být zkouška opakována s nižší koncentrací zkušební látky.

      Viz také I.5.2.

    1. IVD.3.3 Zprávy

      Viz I.8.

  1. IVD.4 PŘEHLED DAT

    Dále je uveden příklad přehledu dat:

    ZKOUŠKA MANOMETRICKOU RESPIROMETRIÍ

    1. 1. LABORATOŘ
    2. 2. DATUM ZAHÁJENÍ ZKOUŠKY
    3. 3. ZKUŠEBNÍ LÁTKA
      1. Název:
        1. Koncentrace zásobního roztoku: mg·l-1
        2. Počáteční koncentrace v médiu, C0: mg·l-1
        3. Objem zkušební baňky (V): ml
        4. TSK nebo CHSK: v mg O2 na mg zkušební látky (NH4, NO3):
    1. 4. INOKULUM
      1. Zdroj:
        1. Provedená úprava:
          1. Předběžná úprava, pokud byla provedena:
            1. Koncentrace suspendovaných látek v reakční směsi: mg·l-1
    1. 5. SPOTŘEBA KYSLÍKU: BIOLOGICKÁ ROZLOŽITELNOST
      ZKOUŠKA MANOMETRICKOU RESPIROMETRIÍ
      Čas (dny)
      07142128
      Spotřeba O2 (mg)
      zkušební látkou      		1
      2
      a, průměr
      Spotřeba O2 (mg)
      ve slepé zkoušce      		3
      4
      b, průměr
      Korigovaná BSK (mg)
      BSK na mg zkušební
      látky
      Rozklad v %
      		D1 (a1)
      D2 (a2)
      Průměr*
      V = objem média ve zkušební baňce
    2. * Hodnoty D1 a D2 by neměly být průměrovány, je-li mezi nimi výrazný rozdíl.
    3. Poznámka: Podobný formulář lze použít i pro referenční látku a pro kontroly toxicity.
    1. 6. KOREKCE NA NITRIFIKACI (viz příloha V)
      ZKOUŠKA MANOMETRICKOU RESPIROMETRIÍ
      Den028Rozdíl
      i) Koncentrace dusičnanů (mg N na litr)(N)
      ii) Kyslíkový ekvivalent (4,57 × N × V) (mg)——
      iii) Koncentrace dusitanů (mg N na litr)(N)
      iv) Kyslíkový ekvivalent (3,43 × N × V) (mg)——
      ii + iv) Celkový kyslíkový ekvivalent——
    1. 7. ANALÝZA UHLÍKU (podle volby)
      1. Analyzátor uhlíku:
        ZKOUŠKA MANOMETRICKOU RESPIROMETRIÍ
        Čas (dny)Slepá zkouška (mg·l-1)Zkušební látka(mg·l-1)
        0(Cbl(0))(C0)
        28*(Cbl(t))(Ct)
        * nebo na konci inkubace

    1. 8. SPECIFICKÁ ANALÝZA (nepovinné)
      1. Sb = koncentrace ve fyzikálně-chemické kontrole (sterilní) po 28 dnech,
      2. Sa = koncentrace v inokulované baňce po 28 dnech.

    1. 9. ABIOTICKÝ ROZKLAD (nepovinné)

      a = spotřeba kyslíku ve sterilních baňkách po 28 dnech v mg,

      (viz oddíl 1 a 3)

  1. IVE. METODA PRO STANOVENÍ „SNADNÉ“ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI POMOCÍ ZKOUŠKY V UZAVŘENÝCH LAHVIČKÁCH – metoda C.4-E podle přílohy směrnice 92/69/EHS
    1. IVE.1. PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY

      Roztok zkušební látky v minerálním médiu, obvykle o koncentraci 2 až 5 mg·l-1, se inokuluje malým množstvím mikroorganismů ze směsné kultury a udržuje se ve zcela naplněných uzavřených lahvičkách, v temnu a při konstantní teplotě. Rozklad se sleduje po dobu 28 dnů prostřednictvím analýzy rozpuštěného kyslíku. Množství spotřebovaného kyslíku po korekci na souběžnou slepou zkoušku s inokulem se vyjádří jako TSK nebo CHSK.

    1. IVE.2 POPIS METODY
      1. IVE.2.1 Přístroje a pomůcky
        1. a) Lahve pro analýzu BSK se skleněnými zátkami, např. na 250 − 300 ml.
        2. b) Vodní lázeň nebo inkubátor pro udržování lahviček při konstantní teplotě (tolerance ±1 °C nebo menší) v temnu.
        3. c) Velké skleněné lahve na 2 − 5 l pro přípravu média a pro naplnění lahviček pro analýzu BSK.
        4. d) Kyslíková elektroda a oxymetr nebo vybavení a činidla pro Winklerovu titrační metodu.
      1. IVE.2.2 Příprava minerálního média

        Příprava zásobních roztoků je popsána v části I.6.2.

        Smísí se po 1 ml roztoků a) až d) a doplní se vodou na 1 litr.

      1. IVE.2.3 Příprava inokula

        Inokulum se obvykle získává z výstupu z druhého stupně čistírny odpadních vod nebo laboratorní jednotky zpracovávající převážně domovní odpadní vody. Alternativním zdrojem inokula může být povrchová voda. Obvykle se použije jedna kapka (0,05 ml) až 5 ml filtrátu na litr média; k nalezení optimálního objemu dané odpadní vody může být nezbytné provést pokusy (viz I.6.4.2 a I.6.5).

      1. IVE.2.4 Příprava lahviček

        Minerální médium se alespoň 20 min silně provzdušňuje. Všechny série zkoušek se provedou s minerálním médiem ze stejné dávky. Obecně je médium připraveno k použití po 20 h stání při zkušební teplotě. Pro kontrolu se stanoví obsah kyslíku v médiu; jeho obsah by měl být asi 9 mg·l-1 při 20 °C. Všechny operace přenosu média nasyceného vzduchem a jeho plnění se provedou tak, aby nevznikaly bublinky, např. pomocí nasávaček.

        Připravují se shodné skupiny lahviček pro analýzu BSK pro stanovení se zkušební látkou a referenční látkou v souběžných sériích experimentů. Připraví se dostatečný počet lahviček, včetně slepých pokusů, tak, aby v každém zvoleném časovém intervalu, např. 0, 7, 14, 21 a 28 dnů, bylo možné provést alespoň dvě měření spotřeby kyslíku. K tomu, aby bylo možné rozpoznat 10denní období rozkladu, může být potřeba více lahviček.

        Velké lahve se přibližně do jedné třetiny naplní provzdušněným médiem. Poté se zvlášť do jednotlivých velkých lahví přidá dostatečný objem zásobního roztoku zkušební látky a referenční látky, a to obvykle tak, aby nebyla konečná koncentrace chemických látek větší než 10 mg·l-1. Ke slepému pokusu v další velké lahvi se nepřidávají žádné chemické látky.

        S cílem zajistit, aby aktivita inokula nebyla omezená, nesmí koncentrace kyslíku v lahvičkách pro analýzu BSK klesnout pod 0,5 mg·l-1. Toto omezuje koncentraci zkušební látky na 2 mg·l-1. Pro látky, které se špatně rozkládají, a pro látky s nízkou hodnotou TSK lze použít koncentraci 5 - 10 mg·l-1. V některých případech se doporučuje provést souběžné série měření při dvou různých koncentracích zkušební látky, např. při 2 a 5 mg·l-1. Obvykle se TSK počítá na základě tvorby amonných solí, ale v případech, kdy se předpokládá nitrifikace nebo kdy dochází k nitrifikaci, se TSK vypočte na základě tvorby dusičnanů (TSKNO3, viz příloha II, bod 2). V případech, kdy nitrifikace není úplná, se provede korekce na změny analyticky stanovených koncentrací dusitanů a dusičnanů (viz příloha V).

        Má-li být vyšetřena toxicita zkušební látky (např. v případě dříve zjištěné nízké biologické rozložitelnosti), je nezbytné nasadit další sérii lahviček.

        Připraví se další velká láhev s provzdušněným minerálním médiem (naplněná asi do jedné třetiny objemu), do které se přidá zkušební a referenční chemická látka o konečné koncentraci obvykle stejné jako v případě ostatních velkých lahví.

        Roztoky ve velkých lahvích se inokulují výstupem z druhého stupně čistírny odpadních vod (jedna kapka nebo 0,05 až 5 ml·l-1) nebo z jiného zdroje inokula, jako je např. říční voda (viz I.6.4.2). Nakonec se lahve doplní na objem provzdušněným minerálním médiem za použití hadičky, která sahá na dno, aby se dosáhlo dostatečného promíchání.

      1. IVE.2.5 Počet lahviček v typické zkoušce
        1. V typické zkoušce se použijí následující lahvičky:
          1. nejméně 10 lahviček se zkušební látkou a inokulem (zkušební suspense),
          2. nejméně 10 lahviček pouze s inokulem (slepá zkouška s inokulem),
          3. nejméně 10 lahviček s referenční látkou a inokulem (kontrolní zkouška postupu),
          4. a podle potřeby 6 lahviček se zkoušenou látkou, referenční látkou a inokulem (kontrola toxicity). Pro rozpoznání 10denního období rozkladu je však potřebný dvojnásobný počet lahviček.
      1. IVE.2.6 Provedení zkoušky

        Všechny připravené roztoky se ihned po přípravě rozdělí do příslušné skupiny lahviček pro analýzu BSK, a to pomocí hadičky zavedené do spodní čtvrtiny velké lahve (nikoliv ke dnu) tak, aby se všechny lahvičky pro analýzu BSK zcela naplnily. Jemně se poklepe, aby se odstranily bublinky. V lahvičkách se Winklerovou metodou nebo pomocí oxymetru ihned stanoví obsah rozpuštěného kyslíku k počátku zkoušky (k času nula). Obsah lahviček lze konzervovat pro pozdější analýzu přídavkem síranu manganatého a hydroxidu sodného (prvním Winklerovým činidlem). Před provedením zbývajících kroků Winklerovy metody se pečlivě uzavřené lahvičky obsahující kyslík vázaný ve formě hydratovaného oxidu manganitého skladují v temnu nejdéle 24 h při teplotě 10 − 20 °C. Zbývající souběžně připravené lahvičky se uzavřou tak, aby v nich nezůstaly bublinky vzduchu, a inkubují se v temnu při 20 °C. Každá série musí být doprovázena úplnou sérií slepého pokusu s inokulovaným médiem. Ve všech sériích se během 28 dnů inkubace v pravidelných intervalech (nejméně jednou týdně) stanoví alespoň ve dvou lahvičkách obsah rozpuštěného kyslíku.

        Týdenní vzorky umožní stanovení rozkladu v procentech ve 14denním období rozkladu, zatímco vzorky odebírané každé 3 − 4 dny umožní rozpoznat 10denní období rozkladu, což vyžaduje dvojnásobný počet lahviček.

        U látek obsahujících dusík se provede korekce na spotřebu kyslíku při nitrifikaci. K tomuto účelu se stanoví koncentrace rozpuštěného kyslíku oxymetrem a poté se z lahvičky pro analýzu BSK odebere vzorek pro stanovení dusitanů a dusičnanů. Z přírůstku koncentrace dusitanů a dusičnanů se vypočte množství spotřebovaného kyslíku (viz příloha V).

    1. IVE.3 DATA A ZPRÁVY
      1. IVE.3.1 Zpracování výsledků

        Nejprve se vypočte BSK, ke které došlo po každé časové periodě, a to odečtením spotřeby kyslíku (v mg O2 na litr) ve slepém pokusu s inokulem od spotřeby, zkušební chemickou látkou. Takto korigovaná spotřeba se vydělí koncentrací zkušební látky (mg·l-1) a získá se specifická BSK v mg kyslíku na mg zkušební látky. Biologická rozložitelnost v procentech se vypočte jako podíl specifické BSK a specifické TSK (vypočtené podle přílohy II, bodu 2) nebo CHSK (stanovené analyticky, viz příloha II, bod 3), tedy:

        1. nebo

        Je třeba poznamenat, že tyto dvě metody nemusí poskytovat stejné hodnoty; přednost se dává první metodě.

        Pro látky, jež obsahují dusík, se použije odpovídající hodnota TSK (pro NH4 nebo NO3) podle toho, zda se očekává nitrifikace, či nikoli (příloha II, bod 2). Jestliže k nitrifikaci dochází, avšak není úplná, vypočte se korekce na spotřebu kyslíku při nitrifikaci ze změn koncentrace dusitanů a dusičnanů (příloha V).

      1. IVE.3.2 Platnost výsledků

        Spotřeba kyslíku ve slepém pokusu s inokulem by neměla být po 28 dnech vyšší než 1,5 mg·l-1. Vyšší hodnoty vyžadují přešetření experimentální techniky. Zbytková koncentrace kyslíku ve zkušebních lahvičkách by neměla nikdy klesnout pod 0,5 mg·l-1. Takto nízké úrovně kyslíku jsou platné pouze tehdy, lze-li použitou metodou stanovení rozpuštěného kyslíku tak nízké úrovně přesně změřit.

        Viz také I.5.2.

      1. IVE.3.3 Zprávy

        Viz I.8.

    1. IVE.4 PŘEHLED DAT

      Dále je uveden příklad přehledu dat:

      ZKOUŠKA V UZAVŘENÝCH LAHVIČKÁCH

      1. 1. LABORATOŘ
      2. 2. DATUM ZAHÁJENÍ ZKOUŠKY
      3. 3. ZKUŠEBNÍ LÁTKA
        1. Název:
          1. Koncentrace zásobního roztoku: mg·l-1
          2. Počáteční koncentrace v lahvičce: mg·l-1
          3. TSK nebo CHSK: v mg O2 na mg zkušební látky
      1. 4. INOKULUM
        1. Zdroj:
          1. Provedená úprava:
            1. Předběžná úprava, pokud byla provedena:
              1. Koncentrace v reakční směsi: mg·l-1
      1. 5. STANOVENÍ ROZPUŠTĚNÉHO KYSLÍKU:

        Metoda: Winklerova metoda / oxymetr

        Analýzy lahviček

        ZKOUŠKA MANOMETRICKOU RESPIROMETRIÍ ZKOUŠKA V UZAVŘENÝCH LAHVIČKÁCH Analýzy lahviček
        Doba kultivace (d)Rozpuštěný kyslík
        (mg·l-1)
        0n1n2
        Slepá zkouška (bez
        chemické látky)        		1C1
        2C2
        Průměr
        Zkušební chemická
        látka        		1a1
        2a2
        Průměr
      2. Poznámka: podobný formulář lze použít i pro referenční látku a pro kontroly toxicity.
      1. 6. KOREKCE NA NITRIFIKACI (viz příloha V)
        ZKOUŠKA MANOMETRICKOU RESPIROMETRIÍ ZKOUŠKA V UZAVŘENÝCH LAHVIČKÁCH Analýzy lahviček
        Doba kultivace0n1n2n3
        i) Koncentrace dusičnanů (mg N na litr)
        ii) Změna koncentrace dusičnanů (mg N na litr)—
        iii) Kyslíkový ekvivalent (mg·l-1)—
        iv) Koncentrace dusitanů (mg N na litr)
        v) Změna koncentrace dusitanů (mg N na litr)—
        vi) Kyslíkový ekvivalent (mg·l-1)—
        iii + vi) Celkový kyslíkový ekvivalent (mg·l-1)—
      1. 7. ÚBYTEK ROZPUŠTĚNÉHO KYSLÍKU: ROZKLAD V PROCENTECH
        ZKOUŠKA MANOMETRICKOU RESPIROMETRIÍ ZKOUŠKA V UZAVŘENÝCH LAHVIČKÁCH Analýzy lahviček
        Úbytek po n dnech (mg·l-1)
        n1n2n3
        LAHVIČKA 1:
        LAHVIČKA 2:
        LAHVIČKA 1:
        LAHVIČKA 2:
      2. * Hodnoty nelze průměrovat, je-li mezi nimi výrazný rozdíl.
        1. mt0 = hodnota pro zkušební lahvičku v čase 0
        2. mtx = hodnota pro zkušební lahvičku v čase x
        3. mb0 = hodnota pro slepý pokus v čase 0
        4. mbx = hodnota pro slepý pokus v čase x

        Použijí se rovněž korekce na nitrifikaci z bodu iii + vi v oddílu 6.

      1. 8. ÚBYTEK ROZPUŠTĚNÉHO KYSLÍKU VE SLEPÉM POKUSU

        Spotřeba kyslíku ve slepém pokusu je v mg·l-1. Tato spotřeba je důležitá pro platnost zkoušky. Měla by být menší než 1,5 mg·l-1.

  1. IVF. METODA PRO STANOVENÍ „SNADNÉ“ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI POMOCÍ ZKOUŠKY MITI – metoda C.4-F podle přílohy směrnice 92/69/EHS
    1. IVF.1 PODSTATA METODY

      Měření spotřeby kyslíku v míchaném roztoku nebo suspensi zkušební chemické látky v minerálním médiu inokulovaném speciální kulturou neadaptovaných mikroorganismů se provádí automaticky po dobu 28 dnů za tmy v uzavřeném respirometru při 25 ± 1 °C. Uvolňovaný oxid uhličitý se jímá v hydroxidu sodném. Biologická rozložitelnost se vyjádří jako spotřeba kyslíku (korigovaná na slepý pokus) vyjádřená v procentech teoretické spotřeby kyslíku (TSK). Primární biologická rozložitelnost vyjádřená v procentech se rovněž vypočte z doplňkové specifické chemické analýzy provedené na začátku a na konci kultivace, popřípadě z analýzy DOC.

    1. IVF.2 POPIS METODY
      1. IVF.2.1 Přístroje a pomůcky
        1. a) automatický elektrolytický měřič BSK nebo respirometr standardně vybavený 6 baňkami na 300 ml opatřenými uzávěry obsahujícími absorbent CO2;
        2. b) místnost s konstantní teplotou nebo vodní lázeň nastavená na 25 ± 1 °C;
        3. c) zařízení pro membránovou filtraci (nepovinné);
        4. d) analyzátor uhlíku (nepovinné).
      1. IVF.2.2 Příprava minerálního média
        ZKOUŠKA MANOMETRICKOU RESPIROMETRIÍ ZKOUŠKA V UZAVŘENÝCH LAHVIČKÁCH Analýzy lahviček
        a)Dihydrogenfosforečnan draselný, KH2PO48,50
        Hydrogenfosforečnan didraselný, K2HPO421,75 g
        Hydrogenfosforečnan disodný dodekahydrát, Na2HPO4·12H2O44,60 g
        Chlorid amonný, NH4Cl1,70 g
        Rozpustí se ve vodě a doplní na 1 litr. pH roztoku musí být 7,2.
        ZKOUŠKA MANOMETRICKOU RESPIROMETRIÍ ZKOUŠKA V UZAVŘENÝCH LAHVIČKÁCH Analýzy lahviček
        b)Síran hořečnatý heptahydrát, MgSO4·7H2O22,50 g
        Rozpustí se ve vodě a doplní na 1 litr.
        ZKOUŠKA MANOMETRICKOU RESPIROMETRIÍ ZKOUŠKA V UZAVŘENÝCH LAHVIČKÁCH Analýzy lahviček
        c)Chlorid vápenatý bezvodý, CaCl227,50 g
        Rozpustí se ve vodě a doplní na 1 litr.
        ZKOUŠKA MANOMETRICKOU RESPIROMETRIÍ ZKOUŠKA V UZAVŘENÝCH LAHVIČKÁCH Analýzy lahviček
        d)Chlorid železitý hexahydrát, FeCl3·6H2O0,25 g
        Rozpustí se ve vodě a doplní na 1 litr.

        Spojí se po 3 ml roztoků a), b), c), a d) a doplní se na 1 litr.

      1. IVF.2.3 Příprava inokula

        Odeberou se čerstvé vzorky nejméně z deseti lokalit, kde se používají a vypouštějí různé chemické látky. Z míst, jako jsou čistírny městských a průmyslových odpadních vod, řeky, jezera a moře se odeberou litrové vzorky kalu, povrchových půd, vody atd., které se pečlivě smíchají. Po odstranění vyplavených látek a ustálení se pH supernatantu upraví na 7 ± 1 hydroxidem sodným nebo kyselinou fosforečnou.

        Vhodným objemem filtrovaného supernatantu se naplní nádoba na aktivaci kalu a kapalina se 23½ h provzdušňuje. Třicet minut po ukončení provzdušňování se odlije přibližně jedna třetina celkového objemu supernatantu a k usazenému materiálu se přidá stejný objem roztoku (pH 7), který obsahuje vždy po 0,1 % glukosy, peptonu a dihydrogenfosforečnanu draselného, a obnoví se provzdušňování. Tento postup se opakuje jednou denně. Kalová jednotka musí být provozovaná podle zásad správné laboratorní praxe: odtok má být čirý, teplota má být udržována při 25 ± 2°C, pH má být 7 ± 1, kal se má dobře usazovat, provzdušňování musí být za všech okolností dostatečné, mají být přítomni prvoci a aktivita kalu se má kontrolovat pomocí referenční látky nejméně každé tři měsíce. Inokulum se nepoužívá dříve než po 1 měsíci kultivace, ale ne později než po čtyřech měsících. Proto se v pravidelných intervalech jednou za tři měsíce odebírají vzorky z 10 míst.

        K udržení stejné aktivity čerstvého a starého kalu se filtrovaný supernatant aktivovaného použitého kalu mísí se stejným objemem filtrovaného supernatantu čerstvě odebraného kalu pocházejícího z deseti zdrojů a směs se kultivuje podle výše uvedeného postupu. Kal se použije jako inokulum až 18 – 24 h po uvedeném zpracování.

      1. IVF.2.4 Příprava baněk
        1. Připraví se následujících 6 baněk:
          1. Baňka č. 1: zkušební chemická látka v ředicí vodě, 100 mg·l-1
          2. Baňky č. 2, 3, 4: zkušební chemická látka v minerálním médiu, 100 mg·l-1
          3. Baňka č. 5: referenční látka (např. anilin) v minerálním médiu, 100 mg·l-1
          4. Baňka č. 6: pouze minerální médium

        Špatně rozpustné chemické látky se odváží nebo odměří, nebo se zpracují podle přílohy III, s výjimkou těch, u nichž nesmějí být použita rozpouštědla ani emulgátory. Do speciálních uzávěrů všech lahví se přidá absorbent oxidu uhličitého. pH v baňkách č. 2, 3 a 4 se upraví na 7,0.

      1. IVF.2.5 Provedení zkoušky

        Baňky č. 2, 3, 4 (zkušební suspense), č. 5 (kontrola aktivity), č. 6 (slepý pokus s inokulem) se inokulují malým množstvím inokula tak, aby byla výsledná koncentrace kalu 30 mg·l-1. Do lahve č. 1 se inokulum nepřidává, slouží jako abiotická kontrola. Zařízení se sestaví, přezkouší se na vzduchotěsnost, spustí se míchačka a v temnu se zahájí měření spotřeby kyslíku. Denně se kontroluje teplota, míchání, coulometrický zapisovač spotřeby kyslíku a zaznamenají se všechny změny barvy obsahu baněk. Spotřeba kyslíku pro 6 baněk se odečítá přímo, např. šestikanálovým zapisovačem, čímž se získá křivka BSK. Na konci kultivace, obvykle po 28 dnech, se změří pH v baňkách a stanoví se zbytková koncentrace zkušební chemické látky a jejích produktů rozkladu a v případě zkoušení látek rozpustných ve vodě také koncentrace DOC (postup podle přílohy II, bodu 4). Zvláštní pozornost je třeba věnovat těkavým látkám. Pokud se předpokládá nitrifikace, stanoví se podle možnosti koncentrace dusičnanů a dusitanů.

    1. IVF.3 DATA A ZPRÁVY
      1. IVF.3.1 Zpracování výsledků
        1. Spotřeba kyslíku (mg) zkušební látkou za danou dobu (korigovaná na spotřebu inokulem za stejnou dobu ve slepém pokusu) se podělí hmotností použité zkušební látky. Získá se tak hodnota BSK vyjádřená v mg kyslíku na mg zkušební látky:

        1. Biologický rozklad v procentech se vypočte buď z rovnice:

        Pro směsi se TSK vypočte z elementární analýzy, tak jako pro jednoduché sloučeniny. Použije se odpovídající hodnota TSK (TSKNH4 nebo TSKNO3) podle toho, zda se očekává nitrifikace, či nikoli (příloha II, bod 2). Jestliže k nitrifikaci dochází, avšak není úplná, vypočte se korekce na spotřebu kyslíku při nitrifikaci ze změn koncentrace dusitanů a dusičnanů (příloha V).

        1. Vypočte se primární biologický rozklad v procentech z úbytku specifické (výchozí) chemické látky (viz I.7.2):

        Zjistí-li se při měření fyzikálně-chemického úbytku ztráta zkušební chemické látky v baňce č. 1, zaznamená se to a jako koncentrace zkušební látky (Sb) po 28 dnech se pro výpočet biologické rozložitelnosti dosadí tato koncentrace.

        1. Stanovuje-li se koncentrace DOC (nepovinné), vypočte se konečná hodnota biologického rozkladu v procentech podle vztahu:

          jak je uvedeno v bodě I.7.1. Zjistí-li se při měření fyzikálně-chemického úbytku ztráta DOC v baňce č. 1, použije se při výpočtu biologického rozkladu v procentech tato koncentrace DOC.

        Všechny výsledky se zaznamenají do přehledu dat.

      1. IVF.3.2 Platnost výsledků

        Obvyklá spotřeba kyslíku inokulem je 20 – 30 mg O2 na litr a neměla by být větší než 60 mg·l-1 za 28 dnů. Hodnoty větší než 60 mg·l-1 vyžadují kritické přehodnocení výsledků a experimentální techniky. Je-li pH mimo rozpětí 6 – 8,5 a spotřeba kyslíku zkušební látkou je menší než 60 %, měla by být zkouška opakována s nižší koncentrací zkušební látky.

        Viz také I.5.2.

        V případě, že rozklad anilinu vypočtený ze spotřeby kyslíku nepřekročí po 7 dnech 40 % a po 14 dnech 65 %, považuje se zkouška za neplatnou.

      1. IVF.3.3 Zprávy

        Viz I.8.

    1. IVF.4 PŘEHLED DAT

      Dále je uveden příklad přehledu dat:

      ZKOUŠKA MITI (I)

      1. 1. LABORATOŘ
      2. 2. DATUM ZAHÁJENÍ ZKOUŠKY
      3. 3. ZKUŠEBNÍ LÁTKA
        1. Název:
          1. Koncentrace chemické látky v zásobním roztoku: mg·l-1
          2. Počáteční koncentrace chemické látky v médiu, C0: mg·l-1
          3. Objem reakční směsi, V: ml
          4. TSK: mg O2 na litr
      1. 4. INOKULUM
        1. Místa odběru kalu:
          ZKOUŠKA MANOMETRICKOU RESPIROMETRIÍ ZKOUŠKA V UZAVŘENÝCH LAHVIČKÁCH Analýzy lahviček ZKOUŠKA MITI (I)
          1)...6)...
          2)...7)...
          3)...8)...
          4)...9)...
          5)...10)...

        Koncentrace suspendovaných látek v aktivovaném kalu po aklimatizaci se syntetickými splašky mg·l-1.

        Objem aktivovaného kalu v litru konečného média = ... ml

        Koncentrace kalu v konečném médiu = ... mg·l-1

      1. 5. SPOTŘEBA KYSLÍKU: BIOLOGICKÁ ROZLOŽITELNOST
        1. Typ použitého respirometru:
          ZKOUŠKA MANOMETRICKOU RESPIROMETRIÍ ZKOUŠKA V UZAVŘENÝCH LAHVIČKÁCH Analýzy lahviček ZKOUŠKA MITI (I)
          Čas (dny)
          07142128
          Spotřeba O2 (mg)
          zkušební látkou          		a1
          a2
          a3
          Spotřeba O2 (mg)
          ve slepé zkoušce          		b
          Korigovaná spotřeba
          O2(mg)

          BSK na mg zkušební
          látky          		Baňka 1
          Baňka 2
          Baňka 3
          Rozklad v %

          		1
          2
          3
          Průměr*
        2. Poznámka: podobný formulář lze použít i pro referenční látku.
        3. * Hodnoty nelze průměrovat, je-li mezi nimi výrazný rozdíl.
      1. 6. ANALÝZA UHLÍKU (podle volby)
        1. Analyzátor uhlíku:
          ZKOUŠKA MANOMETRICKOU RESPIROMETRIÍ ZKOUŠKA V UZAVŘENÝCH LAHVIČKÁCH Analýzy lahviček ZKOUŠKA MITI (I)
          BaňkaDOCúbytek
          DOC v %          		Průměr
          Naměřená
          hodnota          		Korigovaná
          hodnota
          Voda + zkušební látkaa——
          Kal + zkušební látkab1
          Kal + zkušební látkab2
          Kal + zkušební látkab3
          Kontrolní slepá zkouškac———

      1. 7. DATA ZE SPECIFICKÉ CHEMICKÉ ANALÝZY
        ZKOUŠKA MANOMETRICKOU RESPIROMETRIÍ ZKOUŠKA V UZAVŘENÝCH LAHVIČKÁCH Analýzy lahviček ZKOUŠKA MITI (I)
        Zbytkové množství zkušební
        chemické látky na konci zkoušky        		Rozklad v %
        Slepá zkouška s vodouSb
        Inokulované médiumSa1
        Sa2
        Sa3

        Rozklad v % se vypočte pro baňky a1, a2, a3.

      1. 8. POZNÁMKY

        Připojí se křivka závislosti BSK na čase, je-li k dispozici.

    PŘÍLOHA I

    ZKRATKY A DEFINICE

    DO: Rozpuštěný kyslík (dissolved oxygen) (mg·l-1) je koncentrace kyslíku, který je rozpuštěn ve vodném vzorku.

    BSK: Biochemická spotřeba kyslíku (biochemical oxygen demand, BOD) (g) je množství kyslíku, jež je v průběhu metabolizace zkušební látky spotřebováno mikroorganismy; vyjadřuje se také jako spotřeba kyslíku v gramech na gram zkušební látky. (Viz metoda C.5).

    CHSK: Chemická spotřeba kyslíku (chemical oxygen demand, COD) (g) je množství kyslíku, jež je spotřebováno v průběhu oxidace zkušební látky horkým kyselým dichromanem; je měřítkem množství přítomných oxidovatelných látek; vyjadřuje se také v gramech kyslíku spotřebovaného na gram zkušební látky. (Viz metoda C.6).

    DOC: Rozpuštěný organický uhlík (dissolved organic carbon) je celkový organický uhlík, který je přítomný v roztoku nebo projde přes filtr o velikosti pórů 0,45 μm nebo zůstane v supernatantu po odstřeďování po dobu 15 min při zrychlení 40 000 m·s-2 (asi 4 000 g).

    TSK: Teoretická spotřeba kyslíku (theoretical oxygen demand, ThOD) (mg) je celkové množství kyslíku nezbytné pro úplnou oxidaci chemické látky; vypočte se z molekulového vzorce látky (viz příloha II, bod 2) a vyjadřuje se také jako množství kyslíku v mg nezbytné na mg zkušební látky.

    TCO2: Teoretický oxid uhličitý (theoretical carbon dioxide, ThCO2) je množství oxidu uhličitého, které by mělo vzniknout ze známého nebo změřeného obsahu uhlíku ve zkušební látce za předpokladu její úplné mineralizace; vyjadřuje se v mg oxidu uhličitého uvolněného z 1 mg zkušební látky.

    TOC: Celkový organický uhlík (total organic carbon) ve vzorku je součtem organického uhlíku v roztoku a v suspensi.

    IC: Anorganický uhlík (inorganic carbon).

    TC: Celkový uhlík (total carbon) je součtem organického a anorganického uhlíku ve vzorku.

    1. Primární biologický rozklad:
    2. jsou změny chemické struktury látky způsobené biologickým působením, vedoucí ke ztrátě specifických vlastnosti látky.
    3. Úplný biologický rozklad (aerobní):
    4. je stupeň rozkladu látky dosažený po jejím úplném zužitkování mikroorganismy, vedoucí k produkci oxidu uhličitého, vody, minerálních solí a nové mikrobiální buněčné hmoty (biomasy).
    5. Snadno biologicky rozložitelná:
    6. je dohodnutá klasifikace chemických látek, které prošly screeningovými zkouškami úplné biologické rozložitelnosti; tyto zkoušky jsou tak přísné, že lze předpokládat, že se látky budou ve vodném prostředí za aerobních podmínek rychle a úplně biologicky rozkládat.
    7. Biologicky rozložitelná:
    8. je klasifikace chemických látek, pro něž existuje nepochybný důkaz o jejich biologické rozložitelnosti (primární nebo konečné) v kterékoli uznávané zkoušce biologické rozložitelnosti.
    9. Odstranitelnost:
    10. je náklonnost látek k jejich odstranění při biologickém čištění odpadních vod, aniž by byl nepříznivě ovlivněn normální průběh čisticích pochodů. Látky snadno biologicky rozložitelné jsou obecně odstranitelné, avšak ne všechny rozložitelné látky jsou odstranitelné. Mohou zde působit také abiotické procesy.
    11. Fáze iniciace:
    12. je doba, ve zkoušce na úbytek rozpuštěného organického uhlíku, od inokulace do dosažení alespoň 10% biologického rozkladu. Fáze iniciace je často různě dlouhá a špatně reprodukovatelná.
    13. Doba rozkladu:
    14. je doba od konce fáze zdržení do dosažení 90 % maximální dosažitelné úrovně rozkladu.
    15. 10denní období rozkladu:
    16. je 10 dnů, které následují bezprostředně po dosažení 10% rozkladu.

    PŘÍLOHA II

    VÝPOČET A STANOVENÍ NĚKTERÝCH SOUHRNNÝCH PARAMETRŮ

    V závislosti na zvolené zkušební metodě se vyžaduje určení některých souhrnných parametrů. V následujícím oddíle je popsán výpočet těchto hodnot. Využití těchto parametrů je popsáno u jednotlivých metod.

    1. 1. Obsah uhlíku

      Obsah uhlíku se počítá ze známého elementárního složení nebo se stanoví analýzou prvků ve zkušební látce.

    1. 2. Teoretická spotřeba kyslíku (TSK)

      Teoretickou spotřebu kyslíku (TSK) lze vypočítat ze znalosti elementárního složení nebo z výsledků analýzy prvků. Pro látku

      CcHhClclNnNanaOoPpSs

      1. bez nitrifikace,

      1. nebo s nitrifikací,

    1. 3. Chemická spotřeba kyslíku (CHSK)

      Chemická spotřeba kyslíku (CHSK) se stanoví metodou C.6.

    1. 4. Rozpuštěný organický uhlík (DOC)

      Rozpuštěným organickým uhlíkem je podle definice organický uhlík přítomný ve vodném roztoku chemické látky nebo směsi, který projde přes filtr o velikosti pórů 0,45 μm.

      Odeberou se vzorky ze zkušebních nádob a ihned se filtrují pomocí filtračního zařízení s vhodným membránovým filtrem. Prvních 20 ml (toto množství může být při použití malých filtrů zmenšeno) se odstraní. 10 – 20 ml, nebo v případě nástřiku menší objem (objem závisí na množství potřebném pro analýzu), se uschová pro analýzu uhlíku. Koncentrace DOC se stanoví pomocí analyzátoru organického uhlíku, který umožňuje přesné stanovení koncentrace uhlíku, která je menší nebo rovna 10 % počáteční koncentrace DOC použité ve zkoušce.

      Zfiltrované vzorky, které není možné analyzovat ve stejný pracovní den, se uchovávají v ledničce 48 h při 2 – 4 °C nebo delší dobu při teplotě nižší než –18 °C.

      1. Poznámky:
        1. Membránové filtry jsou často impregnovány povrchově aktivními látkami za účelem jejich hydrofilizace. Filtr tedy může obsahovat až několik mg rozpustného organického uhlíku, který může ovlivnit stanovení biologické rozložitelnosti.
        2. Povrchově aktivní látky a jiné rozpustné organické látky se z filtrů odstraňují vyvařením třikrát jednu hodinu v deionizované vodě. Filtry lze poté skladovat 1 týden ve vodě. Při použití filtračních patron pro jedno použití se musí u každé šarže ověřit, zda neobsahuje rozpustný organický uhlík.
        3. V závislosti na typu membránového filtru může docházet k adsorpci zkušební látky na filtru. Doporučuje se ověřit, zda k adsorpci zkušební chemické látky na filtru nedochází.
        4. Místo filtrace lze použít k rozlišení TOC od DOC odstřeďování při 40 000 m·s-1 (4 000 g) po dobu 15 min. Tato metoda však není spolehlivá při počáteční koncentraci DOC < 10 mg·l-1, protože buď nelze odstranit všechny bakterie, nebo se zpětně rozpouští uhlík, který je součástí bakteriální plasmy.

    LITERATURA

    1. — Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. 12th ed., Am. Publ. Hlth. Ass., Am. Wat. Poll. Control Fed., Oxygen Demand, 1965, p 65.
    2. — Wagner, R. von Wasser, 1976, vol 46, 139.
    3. — DIN-Entwurf 38 409, Teil 41 – Deutsches Einheitsverfahren zur Wasser-, Abwasserund Schlammuntersuchung, Summarische Wirkungs- und Stoffkenngrössen (Gruppe H). Bestimmung des Chemischen Sauerstoffbedarfs (CSB) (H 41), Normenausschuss Wasserwesen (NAW) in DIN Deutsches Institut für Normung e.V.
    4. — Gerike, P. The biodegradability testing of poorly water soluble compounds. Chemosphere, 1984, vol 13(1), 169.

    PŘÍLOHA III

    VYHODNOCENÍ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI ŠPATNĚ ROZPUSTNÝCH LÁTEK

    Při zkouškách biologické rozložitelnosti špatně rozpustných látek si zaslouží zvláštní pozornost následující aspekty.

    Zatímco odběr vzorků homogenních kapalin je problémem jen zřídka, u tuhých látek se doporučuje provést homogenizaci vhodnými prostředky, aby v důsledku nehomogenity nedošlo k chybám. Zvláštní pozornost musí být věnována odběrům reprezentativních vzorků o několika miligramech ze směsí látek, které obsahují velké množství nečistot.

    V průběhu zkoušek lze použít různé způsoby míchání. Je třeba věnovat pozornost tomu, aby míchání bylo přiměřené právě pro udržení látky v disperzi a nedocházelo k přehřívání, nadměrnému pěnění a nadměrným třecím silám.

    Může se použít emulgátor vytvářející stabilní disperzi chemické látky. Nesmí být toxický pro bakterie a nesmí se biologicky rozkládat nebo pěnit za zkušebních podmínek.

    Stejná kritéria jako pro emulgátory platí i pro rozpouštědla.

    U tuhých zkušebních látek se nedoporučuje používat tuhé nosiče, mohou však být vhodné v případě olejovitých látek.

    Použijí-li se pomocné látky, jako jsou emulgátory, rozpouštědla a nosiče, musí být proveden slepý pokus s pomocnou látkou.

    Pro studium biologické rozložitelnosti špatně rozpustných látek lze použít kteroukoli ze tří respirometrických zkoušek (zkouška na úbytek CO2, na BSK, zkouška MITI).

    LITERATURA

    1. — de Morsier, A. et al. Biodegradation tests for poorly soluble compounds. Chemosphere, 1987, 16, 833.
    2. — Gerike, P. The Biodegradability testing of poorly water soluble compounds. Chemosphere, 1984, 13, 169.

    PŘÍLOHA IV

    VYHODNOCENÍ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI LÁTEK POTENCIÁLNĚ TOXICKÝCH PRO INOKULUM

    Je-li chemická látka podrobena zkoušení snadné biologické rozložitelnosti a jeví se jako biologicky nerozložitelná, doporučuje se postupovat při požadavku rozlišit inhibiční působení od odolnosti látky vůči rozkladu následujícím způsobem (Reynolds et al., 1987).

    Ve zkouškách toxicity i ve zkouškách biologické rozložitelnosti se použijí podobná nebo stejná inokula.

    K posouzení toxicity chemických látek zkoušených ve zkouškách snadné biologické rozložitelnosti se doporučuje použít zkoušku inhibice dýchání aktivovaného kalu (směrnice 88/302/EHS), stanovení BSK nebo metodu inhibice růstu nebo kombinaci těchto metod.

    Nemá-li dojít k inhibici z důvodu toxicity, měla by být koncentrace zkušební látky použitá ve zkouškách snadné biologické rozložitelnosti menší než 1/10 hodnoty EC50 (nebo menší než EC20) zjištěné zkouškou toxicity. Látky s EC50 > 300 mg·l-1 pravděpodobně nemají při zkouškách snadné biologické rozložitelnosti toxické účinky.

    Hodnoty EC50 < 20 mg·l-1 mohou při následném zkoušení působit potíže. Měly by být použity nízké koncentrace, což vyžaduje použít přísné a citlivé zkoušky v uzavřených lahvičkách nebo materiál značený 14C. Použití vyšších koncentrací zkušební látky může být popřípadě umožněno nasazením aklimatizovaného inokula. V tomto případě se však ztrácí specifické kritérium zkoušky snadné biologické rozložitelnosti.

    LITERATURA

    Reynolds, L. et al., Evaluation of the toxicity of substances to be assessed for biodegradability. Chemosphere, 1987, 16, 2259.

    PŘÍLOHA V

    KOREKCE NA SPOTŘEBU KYSLÍKU PŘI NITRIFIKACI

    Chyby způsobené tím, že při stanovení spotřeby kyslíku ve zkouškách látek, které neobsahují dusík, není vzata v úvahu nitrifikace, nejsou významné (nejsou větší než 5 %), i když je oxidace amoniakálního dusíku ve zkušebních nádobách a ve slepém pokusu nepravidelná. U zkušebních látek obsahujících dusík může dojít ke značným chybám.

    1. Dochází-li k nitrifikaci, avšak nikoli úplné, musí být spotřeba kyslíku reakční směsí korigována na množství kyslíku spotřebovaného na oxidaci amoniaku a amonných iontů na dusitany a dusičnany, jsou-li změny koncentrace dusitanů a dusičnanů během kultivace stanoveny pomocí následujících rovnic:

      2 NH4Cl + 3 O2 = 2 HNO2 + 2 HCl + 2 H2O (1)

      2 HNO2 + O2 = 2 HNO3 (2)

    1. Celkově:

      2 NH4Cl + 4 O2 = 2 HNO3 + 2 HCl + 2 H2O (3)

    Podle rovnice 1 je spotřeba kyslíku při oxidaci 28 g dusíku obsaženého v NH4Cl na dusitan 96 g, tzn., že přepočítávací faktor je 3,43 (96/28). Stejně tak je podle rovnice 3 spotřeba kyslíku při oxidaci na dusičnan 128 g, tzn. přepočítávací faktor je 4,57 (128/28).

    Protože popsané reakce následují po sobě, přičemž jsou realizovány odlišnými druhy bakterií, může koncentrace dusitanů stoupat i klesat; při poklesu roste odpovídajícím způsobem koncentrace dusičnanů. Spotřeba kyslíku při tvorbě dusičnanů se tedy vypočte vynásobením přírůstku koncentrace dusičnanů faktorem 4,57, zatímco spotřeba kyslíku při tvorbě dusitanů se vypočte vynásobením přírůstku koncentrace dusitanů faktorem 3,43, nebo při poklesu obsahu dusitanů se ztráty kyslíku vypočtou vynásobením poklesu koncentrace faktorem -3,43.

    1. To znamená:
      1. spotřeba O2 při tvorbě dusičnanů = 4,57 × přírůstek koncentrace dusičnanů (4)
      2. spotřeba O2 při tvorbě dusitanů = 3,43 × přírůstek koncentrace dusitanů (5)
      3. ztráta O2 při úbytku dusitanů: = −3,43 × pokles koncentrace dusitanů (6)
    1. Tedy
      1. spotřeba O2 při nitrifikaci = ± 3,43 × změna koncentrace dusitanů + 4,57 × změna koncentrace dusičnanů (7)
    1. a proto
      1. spotřeba O2 v důsledku oxidace C = celková pozorovaná spotřeba – spotřeba v důsledku nitrifikace (8)

    Jinými slovy, pokud se stanoví pouze celkový oxidovaný N, je možno za spotřebu kyslíku v důsledku nitrifikace považovat v prvém přiblížení hodnotu 4,57 x přírůstek oxidovaného dusíku.