Vyhláška Ministerstva zdravotnictví, kterou se mění vyhláška Ministerstva zdravotnictví č. 1/1998 Sb., kterou se stanoví požadavky na jakost, postup při přípravě, zkoušení, uchovávání a dávkování léčiv (Český lékopis 1997)

Alkalické nečistoty. 5,0 g se převede do zkumavky a opatrně se přidá směs obsahující 0,05 ml roztoku modři bromfenolové R (0,4 g/l) v lihu 96% R, 0,3 ml vody R a 10 ml lihu 96% R. Pokud je to nutné, směs se před přidáním neutralizuje kyselinou chlorovodíkovou 0,01 mol/l RS nebo hydroxidem sodným 0,01 mol/l RS. Protřepe se a nechá se stát. Ke změně zbarvení horní vrstvy na žluté se spotřebuje nejvýše 1,0 ml kyseliny chlorovodíkové 0,01 mol/l VS.

Volný glycerol. Nejvýše 3,0%. 1,20 g se rozpustí v 25,0 ml dichlormethanu R, je-li třeba zahřátím. Po ochlazení se přidá 100 ml vody R, protřepe se a přidá se 25,0 ml roztoku kyseliny jodisté R (6 g/l). Protřepe se, nechá se 30 min stát a pak se přidá 40 ml roztoku jodidu draselného R (75 g/l) a nechá se stát 1 min. Uvolněný jod se titruje thiosíranem sodným 0,1 mol/l VS za použití 1 ml škrobu RS jako indikátoru. Provede se slepá zkouška.

1 ml thiosíranu sodného 0,1 mol/l VS odpovídá 2,3 mg glycerolu.

Podíl mastných kyselin. Provede se plynová chromatografie (2.4.22). Frakce mastných kyselin má následující složení:

1. - kyselina palmitová: 4,0 % až 20,0 %,
2. - kyselina stearová: nejvýše 6,0 %,
3. - kyselina olejová: 20,0 % až 35,0 %,
4. - kyselina linolová: 50,0 % až 65,0 %,
5. - kyselina linolenová: nejvýše 2,0 %,
6. - kyselina arachidová: nejvýše 1,0 %,
7. - kyselina eikosenová: nejvýše 1,0 %.

Zbytkový ethylenoxid a dioxan (2.4.25). Nejvýše 1 μg/g zbytkového ethylenoxidu a 10 μg/g zbytkového dioxanu. Při výpočtu obsahu dioxanu se použije korekční faktor 1/5.

Těžké kovy (2.4.8). 2,0 g vyhovují limitní zkoušce C na těžké kovy (10 μg/g). Porovnávací roztok se připraví za použití 2 ml základního roztoku olova (10 μg Pb/ml).

Voda, semimikrostanovení (2.5.12). Nejvýše 1,0 %; stanoví se s 1,00 g zkoušené látky za použití směsi objemových dílů methanolu bezvodého R a dichlormethanu R (30 + 70) jako rozpouštědla.

Celkový popel (2.4.16). Nejvýše 0,1 %; stanoví se s 1,00 g zkoušené látky.

Uchovávání

V dobře uzavřených obalech, chráněn před světlem, při pokojové teplotě.

Označování

V označení na obalu se uvede druh makrogolu (tj. relativní molekulová hmotnost makrogolu) nebo počet oxyethylenových jednotek v molekule (jmenovitá hodnota).

Glyceromacrogoli oleas

Glyceromakrogololeat

Synonymum. Macrogolglyceroli oleas

Je to směs monoesterů, diesterů a triesterů glycerolu a monoesterů a diesterů makrogolů. Získávají se částečnou alkoholýzou nenasycených olejů s převažujícím obsahem triacylglycerolů kyseliny olejové s použitím makrogolu s relativní molekulovou hmotností 300 až 400 nebo esterifikací glycerolu a makrogolu s nenasycenými mastnými kyselinami nebo smícháním esterů glycerolu a oxyethylenových kondenzátů s mastnými kyselinami těchto nenasycených olejů.

Vlastnosti

Jantarově žlutá olejovitá kapalina, jejíž zbarvení se může prohloubit skladováním delší dobu při 20 °C. Je prakticky nerozpustný, ale dispergovatelný ve vodě, snadno rozpustný v dichlormethanu.

Viskozita při 40 °C je asi 35 mPa.s, relativní hustota při 20 °C je asi 0,95, index lomu při 20 °C je asi 1,47.

Zkoušky totožnosti

1. A. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití vrstvy vhodného silikagelu.

   Zkoušený roztok. 1,0 g se rozpustí v dichlormethanu R a zředí se jím na 20 ml.

   Na vrstvu se nanese 10 μl zkoušeného roztoku a vyvíjí se směsí objemových dílů hexanu R a etheru R (30 + 70) po dráze 15 cm. Vrstva se usuší na vzduchu, postříká se roztokem rhodaminu B R (0,1 g/l) v lihu 96% R a pozoruje se v ultrafialovém světle při 365 nm. Na chromatogramu jsou skvrny odpovídající triacylglycerolům s R_F asi 0,9 (R_st = 1), 1,3-diacylglycerolům (R_st = 0,7), 1,2-diacylglycerolům (R_st = 0,6), monoacylglycerolům (R_st = 0,1) a esterům makrogolu (R_st = 0).

1. B. Zkouška Číslo hydroxylové, viz Zkoušky na čistotu, je zároveň zkouškou totožnosti.
2. C. Podíl Složení mastných kyselin, viz Zkoušky na čistotu, je zároveň zkouškou totožnosti.
3. D. Zkouška Číslo zmýdelnění, viz Zkoušky na čistotu, je zároveň zkouškou totožnosti.

Zkoušky na čistotu

Číslo kyselosti (2.5.1). Nejvýše 2,0; stanoví se s 2,00 g zkoušené látky.

Číslo hydroxylové (2.5.3, Metoda A). 45 až 65; stanoví se s 1,00 g zkoušené látky.

Číslo jodové (2.5.4). 75 až 95.

Číslo peroxidové (2.5.5). Nejvýše 12,0; stanoví se s 2,00 g zkoušené látky.

Číslo zmýdelnění (2.5.6). 150 až 170; stanoví se s 2,00 g zkoušené látky.

Alkalické nečistoty. 5,0 g se převede do zkumavky a opatrně se přidá směs obsahující 0,05 ml roztoku modři bromfenolové R (0,4 g/l) v lihu 96% R, 0,3 ml vody R a 10 ml lihu 96% R. Pokud je to nutné, směs se před přidáním neutralizuje kyselinou chlorovodíkovou 0,01 mol/l RS nebo hydroxidem sodným 0,01 mol/l RS. Protřepe se a nechá se stát. Ke změně zbarvení horní vrstvy na žluté se spotřebuje nejvýše 1,0 ml kyseliny chlorovodíkové 0,01 mol/l VS.

Volný glycerol. Nejvýše 3,0%. 1,20 g se rozpustí v 25,0 ml dichlormethanu R, je-li třeba zahřátím. Po ochlazení se přidá 100 ml vody R, protřepe se a přidá se 25,0 ml roztoku kyseliny jodisté R (6 g/l). Protřepe se, nechá se 30 min stát a pak se přidá 40 ml roztoku jodidu draselného R (75 g/l) a nechá se stát 1 min. Uvolněný jod se titruje thiosíranem sodným 0,1 mol/l VS za použití 1 ml škrobu RS jako indikátoru. Provede se slepá zkouška.

1 ml thiosíranu sodného 0,1 mol/l VS odpovídá 2,3 mg glycerolu.

Podíl mastných kyselin. Provede se plynová chromatografie (2.4.22). Frakce mastných kyselin má následující složení:

1. - kyselina palmitová: 4,0 % až 9,0 %,
2. - kyselina stearová: nejvýše 6,0 %,
3. - kyselina olejová: 58,0 % až 80,0 %,
4. - kyselina linolová: 15,0 % až 35,0 %,
5. - kyselina linolenová: nejvýše 2,0 %,
6. - kyselina arachidová: nejvýše 2,0 %,
7. - kyselina eikosenová: nejvýše 2,0 %.

Zbytkový ethylenoxid a dioxan (2.4.25). Nejvýše 1 μg/g zbytkového ethylenoxidu a 10 μg/g zbytkového dioxanu. Při výpočtu obsahu dioxanu se použije korekční faktor 1/5.

Těžké kovy (2.4.8). 2,0 g vyhovují limitní zkoušce C na těžké kovy (10 μg/g). Porovnávací roztok se připraví za použití 2 ml základního roztoku olova (10 μg Pb/ml).

Voda, semimikrostanovení (2.5.12). Nejvýše 1,0 %; stanoví se s 1,00 g zkoušené látky za použití směsi objemových dílů methanolu bezvodého R a dichlormethanu R (30 + 70) jako rozpouštědla.

Celkový popel (2.4.16). Nejvýše 0,1 %; stanoví se s 1,00 g zkoušené látky.

Uchovávání

V dobře uzavřených obalech, chráněn před světlem, při pokojové teplotě.

Označování

V označení na obalu se uvede druh makrogolu (tj. relativní molekulová hmotnost makrogolu) nebo počet oxyethylenových jednotek v molekule (jmenovitá hodnota).

Glyceromacrogoli stearas

Glyceromakrogolstearat

Synonymum. Macrogolglyceroli stearas

Je to směs monoesterů, diesterů a triesterů glycerolu amonoesterů adiesterů makrogolů s průměrnou relativní molekulovou hmotností 300 až 4000. Získávají se částečnou alkoholýzou nasycených olejů, obsahujících hlavně triacylglyceroly kyseliny stearové s užitím makrogolu nebo esterifikací glycerolu a makrogolu s nasycenými mastnými kyselinami nebo smícháním esterů glycerolu a oxyethylenových kondenzátů s mastnými kyselinami těchto nasycených olejů. Hydroxylové číslo se liší nejvýše o 15 jednotek od jmenovité hodnoty. Číslo zmýdelnění se liší nejvýše o 10 jednotek od jmenovité hodnoty.

Výroba

Je-li glyceromakrogolstearat získáván z tkání savců nebo jiných materiálů teplokrevných zvířat, např. tuku z vlny, musí tato zvířata splňovat požadavky oprávněné autority, které se kladou na zvířata určená pro humánní konzumaci. Navíc tyto tkáně nesmí obsahovat specifický rizikový materiál, který je definován odpovídajícími mezinárodními, nebo kde je to vhodné, národními požadavky.

Vlastnosti

Světle žlutá voskovitá pevná látka. Je dispergovatelný v teplé vodě a v teplém parafinovém oleji, snadno rozpustný v dichlormethanu, dobře rozpustný v teplém ethanolu.

Zkoušky totožnosti

1. A. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití vrstvy vhodného silikagelu.

   Zkoušený roztok. 1,0 g se rozpustí v dichlormethanu R a zředí se jím na 20 ml.

   Na vrstvu se nanese 10 μl zkoušeného roztoku a vyvíjí se směsí objemových dílů hexanu R a etheru R (30 + 70) po dráze 15 cm. Vrstva se usuší na vzduchu, postříká se roztokem rhodaminu B R (0,1 g/l) v lihu 96% R a pozoruje se v ultrafialovém světle při 365 nm. Na chromatogramu jsou skvrny odpovídající triacylglycerolům s R_F asi 0,9 (R_st = 1), 1,3-diacylglycerolům (R_st = 0,7), 1,2-diacylglycerolům (R_st = 0,6), monoacylglycerolům (R_st = 0,1) a esterům makrogolu (R_st = 0).

1. B. Zkouška Číslo hydroxylové, viz Zkoušky na čistotu, je zároveň zkouškou totožnosti.
2. C. Zkouška Podíl mastných kyselin, viz Zkoušky na čistotu, je zároveň zkouškou totožnosti.
3. D. Zkouška Číslo zmýdelnění, viz Zkoušky na čistotu, je zároveň zkouškou totožnosti.

Zkoušky na čistotu

Číslo kyselosti (2.5.1). Nejvýše 2,0; stanoví se s 2,00 g zkoušené látky.

Číslo hydroxylové (2.5.3, Metoda A). Liší se nejvýše o 15 jednotek od jmenovité hodnoty; stanoví se s 1,00 g zkoušené látky.

Číslo peroxidové (2.5.5). Nejvýše 6,0; stanoví se s 2,00 g zkoušené látky.

Číslo zmýdelnění (2.5.6). Liší se nejvýše o 10 jednotek od jmenovité hodnoty; stanoví se s 2,00 g zkoušené látky.

Alkalické nečistoty. 5,0 g se převede do zkumavky a opatrně se přidá směs obsahující 0,05 ml roztoku modři bromfenolové R (0,4 g/l) v lihu 96% R, 0,3 ml vody R a 10 ml lihu 96% R. Pokud je to nutné, směs se před přidáním neutralizuje kyselinou chlorovodíkovou 0,01 mol/l RS nebo hydroxidem sodným 0,01 mol/l RS. Protřepe se a nechá se stát. Ke změně zbarvení horní vrstvy na žluté se spotřebuje nejvýše 1,0 ml kyseliny chlorovodíkové 0,01 mol/l VS.

Volný glycerol. Nejvýše 3,0%. 1,20 g se rozpustí v 25,0 ml dichlormethanu R, je-li třeba zahřátím. Po ochlazení se přidá 100 ml vody R, protřepe se a přidá se 25,0 ml roztoku kyseliny jodisté R (6 g/l). Protřepe se, nechá se 30 min stát a pak se přidá 40 ml roztoku jodidu draselného R (75 g/l) a nechá se stát 1 min. Uvolněný jod se titruje thiosíranem sodným 0,1 mol/l VS za použití 1 ml škrobu RS jako indikátoru. Provede se slepá zkouška.

1 ml thiosíranu sodného 0,1 mol/l VS odpovídá 2,3 mg glycerolu.

Podíl mastných kyselin. Provede se plynová chromatografie (2.4.22). Frakce mastných kyselin má následující složení:

1. - kyselina laurová: nejvýše 5,0 %,
2. - kyselina myristová: nejvýše 5,0 %,
3. - rozdílná jmenovitá množtví kyseliny palmitové a kyseliny stearové. Součet množství C₁₆H₃₂O₂ a C₁₈H₃₆O₂ je nejméně 90,0 %.

Zbytkový ethylenoxid a dioxan (2.4.25). Nejvýše 1 μg/g zbytkového ethylenoxidu a 10 μg/g zbytkového dioxanu. Při výpočtu obsahu dioxanu se použije korekční faktor 1/5.

Těžké kovy (2.4.8). 2,0 g vyhovují limitní zkoušce C na těžké kovy (10 μg/g). Porovnávací roztok se připraví za použití 2 ml základního roztoku olova (10 μg Pb/ml).

Voda, semimikrostanovení (2.5.12). Nejvýše 1,0 %; stanoví se s 1,00 g zkoušené látky za použití směsi objemových dílů methanolu bezvodého R a dichlormethanu R (30 + 70) jako rozpouštědla.

Celkový popel (2.4.16). Nejvýše 0,2 %; stanoví se s 1,00 g zkoušené látky.

Uchovávání

V dobře uzavřených obalech.

Označování

V označení na obalu se uvede jmenovitá hodnota čísla hydroxylového, jmenovitá hodnota čísla zmýdelnění a druh makrogolu (tj. relativní molekulová hmotnost makrogolu) nebo počet oxyethylenových jednotek v molekule (jmenovitá hodnota).

† Gonadorelini acetas

Gonadoreliniumacetat

Je to sůl peptidu hypotalamu povzbuzujícího uvolnění hormonu stimulujícího folikuly a luteinizačního hormonu z hypofýzy s kyselinou octovou. Počítáno na bezvodou látku prostou kyseliny octové, obsahuje 95,0 % až 102,0 % peptidu C₅₅H₇₅N₁₇O₁₃. Získává se chemickou syntézou.

Vlastnosti

Bílý nebo slabě nažloutlý prášek. Je dobře rozpustný ve vodě a v roztoku kyseliny octové ledové 1% (V/V), mírně rozpustný v methanolu.

Zkoušky totožnosti

1. A. Hodnotí se chromatogramy získané ve zkoušce Stanovení obsahu. Retenční čas a velikost hlavního píku na chromatogramu zkoušeného roztoku se přibližně shoduje s retenčním časem a velikostí hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (a).
2. B. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití vrstvy silikagelu G R.

   Použije se zkoušený roztok a porovnávací roztok (a) ze zkoušky Stanovení obsahu.

   Na vrstvu se nanese odděleně po 10 10 μl každého roztoku a vyvíjí se směsí objemových dílů kyseliny octové ledové R, vody R, methanolu R a dichlorimethanu R (6 + 14 + 45 + 60) po dráze 15 cm. Vrstva se 5 min suší na vzduchu. Na dno chromatografické komory se umístí odpařovací miska se směsí obsahující 10 ml roztoku manganistanu draselného R (50 g/l) a 3 ml kyseliny chlorovodíkové R, komora se uzavře a nechá se stát. Suchá deska se umístí do komory a komora se uzavře. Vrstva se nechá 2 min v kontaktu s parami chloru, pak se deska vyjme a umístí do proudu studeného vzduchu, dokud se neodstraní přebytek chloru a vrstva pod nanášecími body se s 0,05 ml škrobu s jodidem draselným RS nezbarví modře. Postříká se škrobem s jodidem draselným RS; hlavní skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku se polohou a velikostí shoduje s hlavní skvrnou na chromatogramu porovnávacího roztoku (a).

Zkoušky na čistotu

Vzhled roztoku. Roztok zkoušené látky (10 g/l) je čirý (2.2.1) a není zbarven intenzivněji než porovnávací barevný roztok Z5 (2.2.2, Metoda II).

Specifická optická otáčivost (2.2.7). –54° až –66°, přepočteno na stanovený obsah peptidu, viz Stanovení obsahu. Měří se roztok připravený rozpuštěním 10,0 mg v 1,0 ml roztoku kyseliny octové ledové R 1% (V/V).

Absorbance (2.2.25). 10,0 mg se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 100,0 ml. Absorbance měřená v maximu při 278 nm je 0,55 až 0,61, přepočteno na stanovený obsah peptidu.

Aminokyseliny. Provede se za použití analyzátoru aminokyselin. Přístroj se kalibruje směsí obsahuiící ekvimolární množství amoniaku, elvcinu a L-forem následuiících aminokvselin:

1. a polovinu ekvimolárního množství L-cystinu. Pro validaci metody se používá vhodný vnitřní standard jako je DL-norleucin.

Zkoušený roztok. 1,0 mg se umístí do vhodné, důkladně vyčištěné zkumavky z tvrdého skla, 100 mm dlouhé, s vnitřním průměrem 6 mm. Přidá se vhodné množství roztoku kyseliny chlorovodíkové R 50% (V/V). Zkumavka se ponoří do mrazicí směsi o teplotě –5 °C, tlak se sníží pod 133 Pa a zkumavka se utěsní. Zahřívá se 16 h při 110 °C až 115 °C. Po ochlazení se zkumavka otevře a obsah se převede pětkrát 0,2 ml vody R do 10 ml baňky a odpaří se do sucha za sníženého tlaku nad hydroxidem draselným R. Zbytek se převede do tlumivého roztoku vhodného pro analyzátor aminokyselin a zředí se jím na vhodný objem.

Do analyzátoru aminokyselin se aplikuje vhodný, přesně změřený objem zkoušeného roztoku tak, aby výška píku aminokyseliny, přítomné v největším množství, byla nejméně 90 % celého rozsahu zapisovače.

Obsah každé aminokyseliny se vyjádří v molech. Relativní poměry aminokyselin se vypočítají tak, že jedna sedmina součtu látkového množství histidinu, kyseliny glutamové, leucinu, prolinu, glycinu, tyrosinu a argininu odpovídá jedné. Hodnoty klesají v následujících limitech: serin 0,7 až 1,05; kyselina glutamová 0,95 až 1,05; prolin 0,95 až 1,05; glycin 1,9 až 2,1; leucin 0,9 až 1,1; tyrosin 0,7 až 1,05; histidin 0,95 až 1,05 a arginin 0,95 až 1,05. Lysin a isoleucin nejsou přítomny, ostatní aminokyseliny s výjimkou tryptofanu jsou přítomny nejvýše ve stopových množstvích.

Příbuzné látky. Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29), postupem popsaným ve zkoušce Stanovení obsahu.

Nastříkne se 20 μl porovnávacího roztoku (b). Citlivost systému se nastaví tak, aby výška hlavního píku na chromatogramu byla nejméně 50 % celého rozsahu zapisovače.

Nastříkne se 20 μl zkoušeného roztoku. Chromatogram se zaznamenává po dobu odpovídající dvojnásobku retenčního času gonadorelinu. Na chromatogramu zkoušeného roztoku plocha žádného píku, kromě hlavního, není větší než dvojnásobek plochy hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) (2 %) a součet ploch všech píku, kromě hlavního píku, není větší než pětinásobek plochy hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) (5 %). Nepřihlíží se k píkům s plochou menší než 0,05násobek plochy hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b).

Kyselina octová. Nejvýše 7,5 %, provede se plynová chromatografie (2.2.28) za použití 1 -butanolu R jako vnitřního standardu.

Roztok vnitřního standardu. 1 ml 1-butanolu R se zředí vodou R na 100 ml. 5 ml tohoto roztoku se zředí kyselinou chlorovodíkovou 0,01 mol/l RS na 100 ml.

Zkoušený roztok. 0,150 g se rozpustí v roztoku vnitřního standardu a zředí se jím na 10,0 ml.

Porovnávací roztok. 1,0 g kyseliny octové ledové R se zředí kyselinou chlorovodíkovou 0,01 mol/l RS na 20,0 ml. 1,0 ml tohoto roztoku se zředí roztokem vnitřního standardu na 50,0 ml.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

1. - křemenné kapilární kolony kolony délky 50 m a vnitřního průměru 0,32 mm nebo 0,53 mm, s vnitřním povrchem potaženým 5 μm vrstvou poly(difenyl)(dimethyl)siloxanu R,
2. - helia pro chromátografii R jako nosného plynu s lineární rychlostí asi 30 cm/s,
3. - dělicího poměru asi 15,
4. - plamenoionizačního detektoru.

Teplota kolony se udržuje na 95 °C, teplota nástřikového prostoru a detektoru na 250 °C. Nastříkne se po 2 μl každého roztoku a vypočítá se obsah kyseliny octové v gonadoreliniumacetatu.

Voda, semimikrostanovení (2.5.12). Nejvýše 7,0 %, stanoví se s 0,500 g zkoušené látky.

Sterilita (2.6.1). Pokud je látka určena k výrobě parenterálních přípravků bez dalšího vhodného sterilizačního postupu, vyhovuje zkoušce na sterilitu.

Bakteriální endotoxiny (2.6.14). Pokud je látka určena k výrobě parenterálních přípravků bez dalšího postupu odstraňujícího bakteriální endotoxiny, vyhovuje zkoušce na bakteriální endotoxiny, obsahuje-li nejvýše 70 m.j. endotoxinu v miligramu gonadoreliniumacetatu.

Stanovení obsahu

Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29).

Zkoušený roztok. 5,0 mg se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 10,0 ml.

Porovnávací roztok (a). 5,0 mg gonadorelinu CRL se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 10,0 ml. Porovnávací roztok (b). 1,0 ml zkoušeného roztoku se zředí vodou R na 100,0 ml.

Porovnávací roztok (c). 2,5 mg se rozpustí v 1 ml kyseliny chlorovodíkové 0,1 mol/l RS a zahřívá se 4 h ve vodní lázni při 65 °C. Přidá se 1 ml hydroxidu sodného 0,1 mol/l RS a zředí se vodou R na 5,0 ml.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

1. - nerezové ocelové kolony délky 0,12 m a vnitřního průměru 4,0 mm, naplněné silikagelem oktadecylsilanizovaným pro chromatografii R (5 μm),
2. - mobilní fáze, která je směsí objemových dílů acetonitrilu R a roztoku kyseliny fosforečné R 1,18% (V/V) (13 + 87), (pH se upraví na hodnotu 2,3 triethylaminem R); průtoková rychlost je 1,5 ml/min,
3. - spektrofotometrického detektoru, 215 nm.

Nastříkne se 20 pl porovnávacího roztoku (c). Zkoušku lze hodnotit, jestliže rozlišení mezi prvním a druhým píkem je nejméně 2,0.

Nastříkne se 20 μl zkoušeného roztoku a 20 μl porovnávacího roztoku (a). Obsah gonadorelinu se vypočítá z deklarovaného obsahu gonadorelinu CRL.

Uchovávání

Ve vzduchotěsných obalech, chráněn před světlem, při teplotě 2 °C až 8 °C. Pokud je látka sterilní, uchovává se ve sterilních vzduchotěsných zabezpečených obalech.

Separandum.

Označování

V označení na obalu se uvede:

1. - množství peptidu v lahvičce,
2. - zda je látka sterilní,
3. - zda je látka prostá bakteriálních endotoxinů.

Gossypii oleum hydrogenatum

Hydrogenovaný bavlníkový olej

Je to produkt získaný čištěním a hydrogenací oleje získaného ze semen pěstovaných rostlin různých odrůd druhu Gossypium hirsutum L. nebo jiných druhů rodu Gossypium. Obsahuje většinou triacylglyceroly kyseliny palmitové a kyseliny stearové.

Vlastnosti

Bílá hmota nebo prášek, který zahřátím taje na čirou světle žlutou kapalinu. Je prakticky nerozpustný ve vodě, snadno rozpustný v dichlormethanu a v toluenu, velmi těžce rozpustný v lihu 96%.

Zkoušky totožnosti

1. A. Zkouška Teplota tání, viz Zkoušky na čistotu, je zároveň zkouškou totožnosti.
2. B. Zkouška Cizí mastné oleje, viz Zkoušky na čistotu, je zároveň zkouškou totožnosti.

Zkoušky na čistotu

Teplota tání (2.2.14). 57 °C až 70 °C.

Číslo kyselosti (2.5.1). Nejvýše 0,5; 10,0 g se rozpustí v 50 ml horké směsi stejných objemových dílů lihu 96% R a toluenu R, předem zneutralizované hydroxidem draselným 0,1 mol/l VS za použití 0,5 ml fenolftaleinu RS1 jako indikátoru. Titruje se ihned ještě horký roztok.

Peroxidové číslo (2.5.5). Nejvýše 5,0.

Nezmýdelnitelné látky (2.5.7). Nejvýše 1,0 %; stanoví se s 5,0 g zkoušené látky.

Zásaditě reagující látky. 2,0 g se rozpustí opatrným zahřátím ve směsi složené z 1,5 ml lihu 96% R a 3 ml toluenu R a přidá se 0,05 ml roztoku modři bromfenolové R (0,4 g/l) v lihu 96% R. Ke změně zbarvení na žluté se spotřebuje nejvýše 0,4 ml kyseliny chlorovodíkové 0,01 mol/l VS.

Cizí mastné oleje. Provede se zkouška Cizí oleje v mastných olejích plynovou chromatografií (2.4.22).

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

1. - křemenné kapilární kolony délky 25 m a vnitřního průměru 0,25 mm s vnitřní stěnou pokrytou poly(kyanopropyl)siloxanem R (tloušťka filmu 0,2 μm),
2. - helia pro chromatografií R jako nosného plynu s průtokovou rychlostí 0,65 ml/min,
3. - plamenoionizačního detektoru,
4. - injektoru s děličem (1 : 100).

Teplota kolony se udržuje 35 min na l80°C, teplota nástřikového prostoru a detektoru na 250 °C.

Podíl mastných kyselin oleje má toto složení:

1. - nasycené mastné kyseliny s délkou řetězce méně než C₁₄: nejvýše 0,2 %,
2. - kyselina myristová: nejvýše 1,0 %,
3. - kyselina palmitová: 19,0 % až 26,0 %,
4. - kyselina stearová: 68,0 % až 80,0 %,
5. - kyselina olejová a její izomery (C_18:1 délkou řetězce odpovídá poly(kyanopropyl)siloxanu 18,5 až 18,8): nejvýše 4,0 %,
6. - kyselina linolenová a její izomery (C_18:2 délkou řetězce odpovídá poly(kyanopropyl)siloxanu 19,4 až 19,8): nejvýše 1,0 %,
7. - kyselina arachidová: nejvýše 1,0 %,
8. - kyselina behenová: nejvýše 1,0 %,
9. - kyselina lignocerová: nejvýše 0,5 %.

Nikl. Nejvýše 1 μg Ni/g. Provede se atomová absorpční spektrometrie (2.2.23, Metoda II).

Zkoušený roztok. 5,0 g se převede do předem zváženého vyžíhaného platinového nebo křemenného kelímku a opatrně se zahřívá. Zkoušená látka se zabalí do bezpopelného filtračního papíru a opatrně se spálí. Po spálení zkoušené látky se zahřívání přeruší a pak se žíhá v muflové peci při 600 °C, dokud není popel bílý. Po ochlazení se zbytek převede dvakrát 2 ml kyseliny chlorovodíkové zředěné RS do 25ml odměmé baňky. Přidá se 0,3 ml kyseliny dusičně R a zředí se vodou destilovanou R na 25,0 ml.

Porovnávací roztoky. Připraví se tři porovnávací roztoky přidáním 1,0 ml, 2,0 ml a 4,0 ml základního roztoku niklu (0,2 μg Ni/ml) ke 2,0 ml zkoušeného roztoku a zředěním vodou destilovanou R na 10,0 ml.

Měří se absorbance při 232 nm za použití niklové lampy s dutou katodou jako zdroje záření, grafitové pícky jako atomizátoru a argonu R jako nosného plynu.

Uchovávání

Chráněn před světlem.

Graminis radix

Oddenek pýru

Synonyma. Graminis rhizoma, Radix graminis, Rhizoma graminis

Je to celý nebo řezaný omytý a usušený oddenek druhu Agropyron repens (L.) BEAUV. (Elymus repens (L.) GOULD), bez adventivních kořenů.

Vlastnosti

Makroskopický a mikroskopický popis, viz Zkoušky totožnosti A a B.

Zkoušky totožnosti

1. A. Lesklé, nažloutlé, světle hnědé nebo žlutohnědé kousky oddenku 2 mm až 3 mm silné, podélně rýhované. Nodia (kolénka) se zbytky velmi tenkých kořenů a bělavými nebo nahnědlými šupinovitými listy; intemodia (články) jsou více než 6 cm dlouhá, podélně rýhovaná, uvnitř dutá. Na příčném řezu nodii je patrná nažloutlá dřeň.
2. B. Droga se upráškuje (355). Prášek je bělavě žlutý. Pozoruje se pod mikroskopem v chloralhydrátu RS. Práškovaná droga je charakteristická těmito znaky: úlomky pokožky kryté silnou kutikulou, buňky pokožky jsou pravoúhlé, protáhlé, se stěnami ztlustlými, tečkovanými, mírně vlnitě zprohýbanými, vzájemně se střídají s malými okrouhlými až téměř čtvercovými buňkami, buňky endodermis podkovovitě ztlustlé; četné úlomky mírně ztlustlých vláken a skupin cév se štěrbinovitými tečkami nebo cév šroubovité a prstencovitě ztlustlých.

Zkoušky na čistotu

Cynodon dactylon, Imperata cylindrica. Droga se pozoruje pod mikroskopem v jodu RS1.

Nejsou patrná modře zbarvená škrobová zrna ani podkovovitě ztlustlé buňky endodermis.

Cizí příměsi (2.8.2). Nejvýše 15,0 % šedočerných kousků oddenků (řezaná droga).

Látky extrahovatelné vodou. 5,0 g práškované drogy (355) se smíchá s 200 ml vroucí vody R a za občasného protřepávání se nechá 10 min stát. Po ochlazení se doplní vodou R na 200,0 ml a zfiltruje se. 20,0 ml filtrátu se odpaří na vodní lázni do sucha. Zbytek se suší v sušárně při 100 °C až 105 °C. Zbytek po vysušení váží nejméně 0,125 g (25 %).

Ztráta sušením (2.2.32). Nejvýše 12,0 %; 1,000 g práškované drogy (355) se suší 2 h v sušárně při 100 °C až 105 °C.

Celkový popel (2.4.16). Nejvýše 5,0 %.

Popel nerozpustný v kyselině chlorovodíkové (2.8.1). Nejvýše 1,5 %.

Uchovávání

V dobře uzavřených obalech, chráněn před světlem.

Gummiresina myrrha

Myrhová klejopryskyřice

Synonymum. Myrrha

Je to na vzduchu ztvrdlá klejopryskyřice získaná z kmenů a větví druhu Commiphora molmol ENGLER po naříznutí nebo samovolným vytékáním. Může pocházet i z jiných druhů rodu Commiphora.

Vlastnosti

Droga má hořkou chuť.

Makroskopický a mikroskopický popis, viz Zkoušky totožnosti A a B.

Zkoušky totožnosti

1. A. Světle nebo tmavě oranžově hnědá nepravidelná nebo okrouhlá zrna nebo kousky různé velikosti s různě zbarvenými částicemi. Na povrchu jsou většinou pokryty šedým až žlutohnědým prachem.
2. B. Droga se upráškuje (355). Prášek je hnědavě žlutý až červenohnědý. Pozoruje se pod mikroskopem v chloralhydrátu RS. Práškovaná droga je charakteristická těmito znaky: jen malé množství úlomků tkáně matečné rostliny včetně červenohnědých úlomků korku; mnohohranných až podlouhlých sklereid, s výrazně ztlustlými tečkovanými, zdřevnatělými stěnami a hnědým obsahem, jednotlivých nebo ve skupinách; úlomků tenkostěnného parenchymu, sklerenchymatických vláken; nepravidelných hranolovitých až mnohohranných krystalů šťavelanu vápenatého asi 10 μm až 25 μm velkých.
3. C. Hodnotí se chromatogramy získané ve zkoušce Commiphora mukul, viz Zkoušky na čistotu. Vrstva se postříká anisaldehydem RS, zahřívá se 10 min při 100 °C až 105 °C a pozoruje se v denním světle. Na chromatogramu porovnávacího roztoku je v dolní třetině oranžovočervená skvrna (thymol) a ve střední části fialová skvrna (anethol). Na chromatogramu zkoušeného roztoku je intenzivně fialová skvrna (furanoeudesma-1,3-dien) s hodnotou R_F vyšší než hodnota R_F anetholu na chromatogramu porovnávacího roztoku. Tato skvrna velikostí a intenzitou zbarvení převyšuje ostatní skvrny na chromatogramu zkoušeného roztoku. Na chromatogramu zkoušeného roztoku jsou další fialové skvrny, jedna z nich odpovídá polohou skvrně anetholu a dvě intenzivně zbarvené skvrny (horní je kurzerenon a dolní je 2-methoxyfuranodien) odpovídají polohou skvrně thymolu na chromatogramu porovnávacího roztoku Na chromatogramu zkoušeného roztoku mohou být další fialové skvrny.

Zkoušky na čistotu

Cizí příměsi (2.8.2). Vyhovuje zkoušce na cizí příměsi.

Commiphora mukul. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití desky s vrstvou silikagelu pro TLC R.

Zkoušený roztok. 0,5 g práškované drogy (355) se smíchá s 5,0 ml lihu 96% R a zahřívá se 2 min až 3 min na vodní lázni. Po ochlazení se zfiltruje.

Porovnávací roztok. 10 mg thymolu R a 40 μl anetholu R se rozpustí v 10 ml lihu 96% R.

Na vrstvu se nanese odděleně do pruhů po 10 μl obou roztoků. Vyvíjí se směsí objemových dílů ethylacetatu R a toluenu R (2 + 98) po dráze 15 cm. Vrstva se usuší na vzduchu a pozoruje se v ultrafialovém světle při 365 nm. Na chromatrogramu zkoušeného roztoku není v dolní třetině skvrna s modrou až fialovou fluorescencí.

Látky nerozpustné v lihu. Nejvýše 70%. 1,000 g práškované drogy (250) se smíchá se 30 ml lihu 96% R a 10 min se intenzivně protřepává. Supernatantní tekutina se zfiltruje předem zváženým filtrem ze slinutého skla (16) tak, aby sediment zůstal v baňce. Postup se provede ještě dvakrát s 20 ml lihu 96% R, pak se sediment kvantitativně převede na filtr a baňka se vypláchne lihem 96% R. Filtr se zbytkem se suší v sušárně při 100 °C až 105 °C a pak se zváží.

Ztráta sušením (2.2.32). Nejvýše 15,0 %; 1,000 g práškované drogy (355) se suší 2 h v sušárně při 100 °C až 105 °C.

Celkový popel (2.4.16). Nejvýše 1,0%.

Uchovávání

Chráněna před světlem.

Halothanum

Halothan

Je to (RS)-2-brom-2-chlor-1,1,1-trifluorethan stabilizovaný 0,01 % thymolu.

Vlastnosti

Čirá bezbarvá těkavá těžká nehořlavá kapalina. Je těžce rozpustný ve vodě, mísitelný s ethanolem, s etherem a s trichlorethylenem.

Zkoušky totožnosti

Základní sestava zkoušek: B.

Alternativní sestava zkoušek: A a C, viz Obecné zásady (1.2).

1. A. Zkouška Destilační rozmezí, viz Zkoušky na čistotu, je zároveň zkouškou totožnosti.
2. B. Infračervené absorpční spektrum (2.2.24) zkoušené látky se shoduje s referenčním spektrem Ph. Eur. halotanu. Měří se v 0,1 mm kyvetě.
3. C. K 0,1 ml se přidají ve zkumavce 2 ml terc.butanolu R. Přidá se 1 ml edetanu měďnatého RS, 0,5 ml amoniaku 26% R a směs 0,4 ml peroxidu vodíku koncentrovaného R a 1,6 ml vody R (roztoka). Současně se připraví kontrolní roztok (roztokb). Obě zkumavky se ponoří na 15 min do vodní lázně při 50 °C, ochladí se a přidá se 0,3 ml kyseliny octové ledové R. K 1 ml každého roztoku (a) a (b) se přidá 0,5 ml směsi stejných objemových dílů čerstvě připraveného alizarinu S RS a dusičnan-oxidu zirkoničitého RS. Roztok (a) je žlutý, roztok (b) je červený.

   K 1 ml každého roztoku (a) a (b) se přidá 1 ml tlumivého roztoku o pH 5,2, 1 ml červeně fenolové RS zředěné vodou R 1 : 10 a 0,1 ml chloraminu T RS. Roztok (a) je modrofialový, roztok (b) je žlutý.

   Ke 2 ml každého roztoku (a) a (b) se přidá 0,5 ml směsi objemových dílů kyseliny sírové R a vody R (25 + 75), 0,5 ml acetonu R a 0,2 ml roztoku bromičnanu draselného R (50 g/l) a protřepe se. Zkumavky se zahřívají 2 min ve vodní lázni při 50 °C, ochladí se a přidá se 0,5 ml směsi stejných objemových dílů kyseliny dusičné R a vody R a dále 0,5 ml dusičnanu stříbrného RS2. Roztok (a) opalizuje a po několika minutách vznikne bílá sraženina, roztok (b) zůstane čirý.

Zkoušky na čistotu

Kysele nebo zásaditě reagující látky. K 20 ml se přidá 20 ml vody prosté oxidu uhličitého R, 3 min se třepe a nechá se stát. Oddělí se vodná vrstva a přidá se 0,2 ml červeně bromkresolové RS. Ke změně zbarvení indikátoru se spotřebuje nejvýše 0,1 ml hydroxidu sodného 0,01 mol/l VS nebo 0,6 ml kyseliny chlorovodíkové 0,01 mol/l VS.

Relativní hustota (2.2.5). 1,872 až 1,877.

Destilační rozmezí (2.2.11). 49,0 °C až 51,0 °C; 95 % předestiluje v rozmezí 1,0 °C.

Těkavé příbuzné látky. Provede se plynová chromatografie (2.2.28) za použití trichlortrifluorethanu CRL jako vnitřního standardu.

Zkoušený roztok (a). Použije se zkoušená látka.

Zkoušený roztok (b). 5,0 ml trichlortrifluorethanu CRL se zředí zkoušenou látkou na 100,0 ml.

1.0 ml roztoku se zředí zkoušenou látkou na 100,0 ml. 1,0 ml tohoto roztoku se dále zředí zkoušenou látkou na 10,0 ml.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

1. - kolony délky 2,75 m a vnitřního průměru 5 mm naplněné křemelinou silanizovanou pro chromatografii R1 (180 μm až 250 μm) impregnovanou 30 % makrogolu 400 R v prvních 1,8 m délky kolony a 30 % dinonylftalatu R ve zbytku délky kolony,
2. - dusíku pro chromatografii R jako nosného plynu s průtokovou rychlostí 30 ml/min,
3. - plamenoionizačního detektoru.

Teplota kolony se udržuje na 50 °C. Nastřikuje se po 5 μl zkoušeného roztoku (a) a (b).

Na chromatogramu zkoušeného roztoku (b) součet ploch všech píků, kromě hlavního píku a píku odpovídajícího vnitřnímu standardu, není větší než plocha píku vnitřního standardu korigovaná, je-li třeba, na nečistoty se stejným retenčním časem jako má vnitřní standard (0,005 %).

Bromidy a chloridy. K 10 ml se přidá 20 ml vody R a 3 min se třepe. K5ml vodné vrstvy se přidá 5 ml vody R, 0,05 ml kyseliny dusičné R a 0,2 ml dusičnanu stříbrného RS1. Roztok neopalizuje intenzivněji než směs 5 ml vodné vrstvy a 5 ml vody R.

Brom a chlor. K 10 ml vodné vrstvy získané ve zkoušce Bromidy a chloridy se přidá 1 ml škrobu s jodidem draselným RS; nevznikne modré zbarvení.

Thymol. Provede se plynová chromatografie (2.2.28) za použití mentholu R jako vnitřního standardu.

Roztok vnitřního standardu. 0,10 g mentholu R se rozpustí v dichlormethanu R a zředí se jím na 100,0 ml.

Zkoušený roztok. K 20,0 ml se přidá 5,0 ml roztoku vnitřního standardu.

Porovnávací roztok. 20,0 mg thymolu R se rozpustí v dichlormethanu R a zředí se jím na 100,0 ml. K 20,0 ml se přidá 5,0 ml roztoku vnitřního standardu.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

1. - kapilární kolony z křemenného skla délky 15 m a vnitřního průměru 0,53 mm pokryté filmem 1,5 jim polydimethylsiloxanu R,
2. - dusíku pro chromatografii R jako nosného plynu s průtokovou rychlostí 15 ml/min,
3. - plamenoionizačního detektoru.

Teplota kolony se udržuje na 150 °C, teplota nástřikového prostoru na 170 °C a teplota detektoru na 200 °C.

Nastřikuje se odděleně po 1,0 μl roztoku vnitřního standardu, zkoušeného roztoku a porovnávacího roztoku. Na chromatogramu zkoušeného roztoku je plocha píku odpovídajícího thymolu nejméně 75% a nejvýše 115% plochy odpovídajícího píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (0,008 % až 0,012 %).

Netěkavé látky. 50 ml se odpaří na vodní lázni do sucha. Zbytek sušený 2 h při 100 °C až 105 °C váží nejvýše 1 mg (20 mg/l).

Uchovávání

Ve vzduchotěsných obalech, chráněn před světlem, při teplotě nepřesahující 25 °C. Při výběru materiálu, ze kterého je vyroben obal, se bere v úvahu reaktivita halothanu s některými kovy.

Nečistoty

1. A. 1,1,1,4,4,4-hexafluor-2-buten,

1. B. 2-chlor-1,1,1,4,4,4-hexafluor-2-buten (Z a E),

1. C. 2,3-dichlor-1,1,1,4,4,4-hexafluor-2-buten (Z a E),

1. D. 2-brom-1,1,1,4,4,4-hexafluor-2-buten (E),

1. E. 2-chlor-1,1,1-trifluorethan,

1. F. 1,1,2-trichlor-1,2,2-trifluorethan,

1. G. 1-brom-1-chlor-2,2-difluorethylen,

1. H. 2,2-dichlor-1,1,1-trifluorethan,

1. I. 1-brom-1,1-dichlor-2,2,2-trifluorethan,

1. J. 1,2-dichlor-1,1-difluorethan.

Helianthi oleum raffinatum

Slunečnicový olej čištěný

Synonymum. Helianthi annui oleum raffinatum, Helianthi oleum

CAS 8001-21-6

Je to mastný olej získaný ze semen druhu Helianthus annuus C. lisováním nebo extrakcí a následným čištěním. Může být přidána vhodná antioxidační přísada.

Vlastnosti

Čirá světle žlutá tekutina. Je prakticky nerozpustný ve vodě a v lihu 96 %, mísitelný s etherem petrolejovým (TV: 40 °C až 60 °C).

Relativní hustota je asi 0,921 a index lomu je asi 1,474.

Zkoušky totožnosti

Provede se zkouška Totožnost mastných olejů tenko vrstvou chromatografií (2.3.2). Chromatogram zkoušeného roztoku se shoduje s charakteristickým chromatogramem pro slunečnicový olej.

Zkoušky na čistotu

Číslo kyselosti (2.5.1). Nejvýše 0,5; stanoví se s 10,0 g zkoušené látky.

Číslo peroxidové (2.5.5). Nejvýše 10,0.

Nezmýdelnitelné látky (2.5.7). Nejvýše 1,5 %; stanoví se s 5,0 g zkoušené látky.

Zásaditě reagující látky (2.4.19). Vyhovuje zkoušce Zásaditě reagující látky v mastných olejích.

Podíl mastných kyselin. Provede se zkouška Cizí oleje v mastných olejích plynovou chromatografií (2.4.22). Podíl mastných kyselin v oleji má následující složení:

1. - kyselina palmitová: 4,0 % až 9,0 %,
2. - kyselina stearová: 1,0 % až 7,0 %,
3. - kyselina olejová: 14,0 % až 40,0 %,
4. - kyselina linolová: 48,0 % až 74,0 %.

Uchovávání

Ve zcela naplněných, vzduchotěsných obalech, chráněn před světlem.

Označování

V označení na obalu se uvede:

1. - název a množství přidaného antioxidantu,
2. - zda byl olej získán lisováním nebo extrakcí.

Hexetidinum

Hexetidin

Je to 1,3-bis(2-ethylhexyl)-5-methylhexahydropyrimidin-5-amin. Obsahuje 98,0 % až 102,0 % sloučeniny C₂₁H₄₅N₃.

Vlastnosti

Bezbarvá nebo slabě nažloutlá olejovitá kapalina. Je velmi těžce rozpustný ve vodě, velmi snadno rozpustný v acetonu, v lihu 96% a v dichlormethanu. Rozpouští se ve zředěných minerálních kyselinách.

Zkoušky totožnosti

Základní sestava zkoušek: A.

Alternativní sestava zkoušek: B, C a D, viz Obecné zásady (1.2).

1. A. Infračervené absorpční spektrum (2.2.24) zkoušené látky se shoduje se spektrem hexetidinu CRL.
2. B. Hodnotí se chromatogramy ze zkoušky Příbuzné látky, viz Zkoušky na čistotu. Hlavní skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku (b) se polohou, barvou a velikostí shoduje s hlavní skvrnou na chromatogramu porovnávacího roztoku (a).
3. C. K 0,2 ml se přidají 2 ml kyseliny sírové R a 2 mg kyseliny chromotropové sodné soli R a zahřívá se ve vodní lázni při 60 °C; vzniká fialové zbarvení.
4. D. 0,2 ml se rozpustí v 1 ml dichlormethanu R. Přidá se 0,5 ml síranu měďnatého RS, 0,05 ml kyseliny sírové v lihu 0,25 mol/l RS a 5 ml vody R, protřepe se a nechá se stát; spodní vrstva má tmavě modré zbarvení.

Zkoušky na čistotu

Vzhled. Zkoušená látka je čirá (2.2.1) a není zbarvena intenzivněji než porovnávací barevné roztoky Ž₅ nebo ZŽ₅ (2.2.2, Metoda II).

Relativní hustota (2.2.5). 0,864 až 0,870.

Index lomu (2.2.6). 1,461 až 1,467.

Optická otáčivost (2.2.7). – 0,10° až +0,10°; měří se roztok připravený rozpuštěním 1,0 g v ethanolu R a zředěním stejným rozpouštědlem na 10,0 ml.

Absorbance (2.2.25). 0,50 g se rozpustí v heptanu R a zředí se jím na 50,0 ml. Absorbance roztoku měřená při 270 nm až 350 nm není větší než 0,1.

Příbuzné látky. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití vrstvy silikagelu H R.

Roztoky se připravují bezprostředně před použitím.

Zkoušený roztok (a). 2,0 g se rozpustí v heptanu R a zředí se jím na 20 ml.

Zkoušený roztok (b). 1 ml zkoušeného roztoku (a) se zředí heptanem R na 10 ml.

Porovnávací roztok (a). 20 mg hexetidinu CRL se rozpustí v heptanu R a zředí se jím na 2 ml. Porovnávací roztok (b). 1 ml zkoušeného roztoku (a) se zředí heptanem R na 100 ml.

Porovnávací roztok (c). 5 ml porovnávacího roztoku (b) se zředí heptanem R na 10 ml. Porovnávací roztok (d). 10 mg dehydrohexetidinu CRL se rozpustí ve zkoušeném roztoku (a) a zředí se jím na 10 ml.

Na vrstvu se nanese odděleně po 1 μl každého roztoku. Na dno chromatografické komory se umístí odpařovací miska obsahující amoniak 32% R. Suchá deska se umístí do komory, komora se uzavře a na vrstvu se 15 min nechají působit páry amoniaku. Deska se vyjme a nechá se odvětrat v proudu vzduchu do vymizení pachu rozpouštědel. Vyvíjí se směsí objemových dílů methanolu R a toluenu R (20 + 80) po dráze 15 cm. Vrstva se nechá uschnout na vzduchu a vystaví se na 30 min působení jodových par. Na chromatogramu zkoušeného roztoku (a) žádná skvrna, kromě hlavní skvrny, není intenzivnější než skvrna na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) (1 %) a nejvýše dvě skvrny jsou intenzivnější než skvrna na chromatogramu porovnávacího roztoku (c) (0,5 %). Zkoušku lze hodnotit, jestliže na chromatogramu porovnávacího roztoku (d) jsou dvě zřetelně oddělené skvrny.

Těžké kovy (2.4.8). 2,0 g se rozpustí ve směsi objemových dílů vody R a acetonu R (15 + 85) a zředí se jí na 20 ml. 12 ml tohoto roztoku vyhovuje limitní zkoušce B na těžké kovy (10 μg/g). Porovnávací roztok olova 1 μgPb/ml) se připraví zředěním základního roztoku olova (100 μg Pb/ml) směsí objemových dílů vody R a acetonu R (15 + 85).

Síranový popel (2.4.14). Nejvýše 0,1 %; stanoví se s 1,00 g zkoušené látky.

Stanovení obsahu

0,150 g se rozpustí v 80 ml kyseliny octové bezvodé R a titruje se kyselinou chloristou 0,1 mol/l VS za potenciometrické indikace bodu ekvivalence (2.2.20).

1 ml kyseliny chloristé 0,1 mol/l VS odpovídá 16,98 mg C₂₁H₄₅N₃.

Uchovávání

V dobře uzavřených obalech, chráněn před světlem.

Nečistoty

1. A. 2-ethyl-N-{[ -(2-ethylhexyl)-4-methyl-4,5-dihydro-1H-imidazol-4-yl]methyl} hexan-1-amin (dehydrohexetidin),

1. B. N,Nˊ-bis (2-ethylhexyl)-2-methylpropan-1,2,3-triamin (triamin),

1. C. 2,6-bis(2-ethylhexy)-7a-methylhexahydro-1H-imidazo[1,5-c]imidazol(hexedin),

1. D. Kyselina 1,5-naftalendisulfonova

† Histidini hydrochloridum monohydricum¹)

Monohydrát histidiniumchloridu

Je to monohydrát (S)-4-(2-amino-2-karboxyethyl)imidazoliumchloridu. Počítáno na vysušenou látku, obsahuje 98,5 % až 101,0 % sloučeniny C₆H₁₀ClN₃O₂.

Výroba

Je-li vyráběn fermentací, vyhovuje požadavkům článku Producta fermentationis.

Vlastnosti

Bílý krystalický prášek nebo bezbarvé krystaly. Je snadno rozpustný ve vodě, těžce rozpustný v lihu 96%, prakticky nerozpustný v etheru.

Zkoušky totožnosti

Základní sestava zkoušek: A, B, C a F.

Alternativní sestava zkoušek: A, B, D, E a F, viz Obecné zásady (1.2).

1. A. Zkouška Specifická optická otáčivost, viz Zkoušky na čistotu, je zároveň zkouškou totožnosti.
2. B. Zkouška Hodnota pH, viz Zkoušky na čistotu, je zároveň zkouškou totožnosti.
3. C. Infračervené absorpční spektrum (2.2.24) tablety zkoušené látky se shoduje se spektrem tablety monohydrátu histidiniumchloridu CRL.
4. D. Hodnotí se chromatogramy získané ve zkoušce Látky reagující s ninhydrinem, viz Zkoušky na čistotu. Hlavní skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku (b) odpovídá polohou, zbarvením a velikostí hlavní skvrně na chromatogramu porovnávacího roztoku (a).
5. E. Asi 0,1 g se rozpustí v 7 ml vody R a přidají se 3 ml roztoku hydroxidu sodného R (200 g/l) (roztok 1). 50 mg kyseliny sulfanilové R se rozpustí ve směsi 0,1 ml kyseliny chlorovodíkové R a 10 ml vody R a přidá se 0,1 ml dusitanu sodného RS (roztok 2). Roztok 2 se přidá k roztoku 1 a promíchá se; vzniká oranžově červené zbarvení.
6. F. Asi 20 mg vyhovuje zkoušce (a) na chloridy (2.3.1).

Zkoušky na čistotu

Roztok S. 2,5 g se rozpustí ve vodě prosté oxidu uhličitého R připravené z vody destilované R a zředí se jí na 50 ml.

Vzhled roztoku. Roztok S je čirý (2.2.1) a není zbarven intenzivněji než porovnávací barevný roztok HŽ₆ (2.2.2, Metoda II).

Hodnota pH (2.2.3). 3,0 až 5,0; měří se roztok S.

Specifická optická otáčivost (2.2.7). +9,2° až +10,6°, počítáno na vysušenou látku; měří se roztok připravený rozpuštěním 2,75 g ve 12,0 ml kyseliny chlorovodíkové RS1 a zředěním vodou R na 25,0 ml.

Látky reagující s ninhydrinem. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití desky s vrstvou silikagelu pro TLC R.

Zkoušený roztok (a). 0,10 g se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 10 ml.

Zkoušený roztok (b). 1 ml zkoušeného roztoku (a) se zředí vodou R na 50 ml.

Porovnávací roztok (a). 10 mg monohydrátu histidiniumchloridu CRL se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 50 ml.

Porovnávací roztok (b). 5 ml zkoušeného roztoku (b) se zředí vodou R na 20 ml.

Porovnávací roztok (c). 10 mg monohydrátu histidiniumchloridu CRL a 10 mg prolinu CRL se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 25 ml.

Na vrstvu se odděleně nanese po 5 μl každého roztoku, vysuší se v proudu vzduchu a vyvíjí se směsí objemových dílů kyseliny octové ledové R, vody R a 1-butanolu R (20 + 20 + 60) po dráze 15 cm. Vrstva se vysuší na vzduchu, postříká se ninhydrinem RS a zahřívá se 15 min při 100 °C až 105 °C. Žádná skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku (a), kromě hlavní skvrny, není intenzivnější než skvrna na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) (0,5 %). Zkoušku lze hodnotit, jestliže na chromatogramu porovnávacího roztoku (c) jsou dvě zřetelně oddělené skvrny.

Sírany (2.4.13). 10 ml roztoku S se zředí vodou destilovanou R na 15 ml. Tento roztok vyhovuje limitní zkoušce na sírany (300 μg/g).

Amonium. Připraví se dvě hodinová sklíčka o průměru 60 mm a umístí se vedle sebe. Na vnitřní stěnu horního sklíčka se přilepí čtvereček papíru lakmusového červeného R o straně 5 mm a zvlhčí

se několika kapkami vody R. 50 mg jemně upráškované zkoušené látky se umístí na spodní hodinové sklíčko a rozpustí se v 0,5 ml vody R. K roztoku se přidá 0,30 g oxidu horečnatého těžkého R a rychle se zamíchá skleněnou tyčinkou. Sklíčko s lakmusovým papírem se překlopí na sklíčko se zkoušenou látkou a vzniklá komůrka se zahřívá 15 min při 40 °C. Lakmusový papír není zbarven intenzivněji modře než lakmusový papír u porovnávacího vzorku připraveného současně stejným způsobem za použití 0,1 ml základního roztoku amonia (100 μg NH₄/ml), 0,5 ml vody R a 0,30 g oxidu horečnatého těžkého R (200 μg/g).

Železo (2.4.9). 1,0 g se rozpustí v dělicí nálevce v 10 ml kyseliny chlorovodíkové zředěné RS a vytřepává se třikrát po 3 min vždy s 10 ml isobutylmethylketonu R1. Ke spojeným organickým vrstvám se přidá 10 ml vody R a třepe se 3 min. Vodná vrstva vyhovuje limitní zkoušce na železo (10 μg/g).

Těžké kovy (2.4.8). 2,0 g se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 20 ml. 12 ml tohoto roztoku vyhovuje limitní zkoušce A na těžké kovy (10 μg/g). Porovnávací roztok se připraví za použití základního roztoku olova (1 μg Pb/ml).

Ztráta sušením (2.2.32). 7,0 % až 10 %; 1,000 g se suší v sušárně při 145 °C až 150 °C.

Síranový popel (2.4.14). Nejvýše 0,1 %; stanoví se s 1,00 g zkoušené látky.

Stanovení obsahu

0,160 g se rozpustí v 50 ml vody prosté oxidu uhličitého R a titruje se hydroxidem sodným 0,1 mol/l VS za potenciometrické indikace bodu ekvivalence (2.2.20).

1 ml hydroxidu sodného 0,1 mol/l VS odpovídá 19,16 mg C₆H₁₀C1N₃O₂.

Uchovávání

V dobře uzavřených obalech, chráněn před světlem.

Separandum.

† Histidinum¹)

Histidin

Je to kyselina (S)-2-amino-3-(4-imidazolyl)propionová. Počítáno na vysušenou látku, obsahuje 98,5 % až 101,0 % sloučeniny C₆H₉N₃O₂.

Výroba

Je-li vyráběn fermentací, vyhovuje požadavkům článku Producta fermentationis.

Vlastnosti

Bílý krystalický prášek nebo bezbarvé krystaly. Je dobře rozpustný ve vodě, velmi těžce rozpustný v lihu 96%, prakticky nerozpustný v etheru.

Zkoušky totožnosti

Základní sestava zkoušek: A a B.

Alternativní sestava zkoušek: A, C a D, viz Obecné zásady (1.2).

1. A. Zkouška Specifická optická otáčivost, viz Zkoušky na čistotu Je zároveň zkouškou totožnosti.
2. B. Infračervené absorpční spektrum (2.2.24) tablety zkoušené látky se shoduje se spektrem tablety histidinu CRL. Jestliže se spektrum zkoušené látky liší od spektra referenční látky, rozpustí se odděleně obě látky v co nejmenším množství vody R, odpaří se při 60 °C do sucha a se získanými zbytky se zaznamenají nová spektra.
3. C. Hodnotí se chromatogramy získané ve zkoušce Látky reagující s ninhydrinem, viz Zkoušky na čistotu. Hlavní skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku (b) odpovídá polohou, zbarvením a velikostí hlavní skvrně na chromatogramu porovnávacího roztoku (a).
4. D. Asi 0,1 g se rozpustí v 7 ml vody R a přidají se 3 ml roztoku hydroxidu sodného R (200 g/l) (roztok 1). 50 mg kyseliny sulfanilové R se rozpustí ve směsi 0,1 ml kyseliny chlorovodíkové R a 10 ml vody R a přidá se 0,1 ml dusitanu sodného RS (roztok 2). Roztok 2 se přidá k roztoku 1 a promíchá se; vzniká oranžově červené zbarvení.

Zkoušky na čistotu

Roztok S. 2,5 g se rozpustí zahřátím ve vodní lázni ve vodě destilované R a zředí se jí na 50 ml.

Vzhled roztoku. Roztok S je čirý (2.2.1) a není zbarven intenzivněji než porovnávací barevný roztok HŽ₇ (2.2.2, Metoda II).

Specifická optická otáčivost (2.2.7). +11,8° až +12,8°, počítáno na vysušenou látku; měří se roztok připravený rozpuštěním 2,75 g ve 12,0 ml kyseliny chlorovodíkové RS a zředěním vodou R na 25,0 ml.

Látky reagující s ninhydrinem. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití desky s vrstvou silikagelu pro TLC R.

Zkoušený roztok (a). 0,10 g se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 10 ml.

Zkoušený roztok (b). 1 ml zkoušeného roztoku (a) se zředí vodou R na 50 ml.

Porovnávací roztok (a). 10 mg histidinu CRL se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 50 ml. Porovnávací roztok (b). 5 ml zkoušeného roztoku (b) se zředí vodou R na 20 ml.

Porovnávací roztok (c). 10 mg histidinu CRL a 10 mg prolinu CRL se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 25 ml.

Na vrstvu se odděleně nanese po 5 μl každého roztoku, vysuší se v proudu vzduchu a vyvíjí se směsí objemových dílů kyseliny octové ledové R, vody R a 1-butanolu R (20 + 20 + 60) po dráze 15 cm. Vrstva se vysuší na vzduchu, postříká se ninhydrinem RS a zahřívá se 15 min při 100 °C až 105 °C. Žádná skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku (a), kromě hlavní skvrny, není intenzivnější než skvrna na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) (0,5 %). Zkoušku lze hodnotit, jestliže na chromatogramu porovnávacího roztoku (c) jsou dvě zřetelně oddělené skvrny.

Chloridy (2.4.4). 5 ml roztoku S zředěného vodou R na 15 ml vyhovuje limitní zkoušce na chloridy (200 μg/g).

Sírany (2.4.13). 10 ml roztoku S se zředí vodou destilovanou R na 15 ml. Tento roztok vyhovuje limitní zkoušce na sírany (300 μg/g).

Amonium. Připraví se dvě hodinová sklíčka o průměru 60 mm a umístí se vedle sebe. Na vnitřní stěnu horního sklíčka se přilepí čtvereček papíru lakmusového červeného R o straně 5 mm a zvlhčí se několika kapkami vody R. 50 mg jemně upráškované zkoušené látky se umístí na spodní hodinové sklíčko a rozpustí se v 0,5 ml vody R. K roztoku se přidá 0,30 g oxidu horečnatého těžkého R a rychle se zamíchá skleněnou tyčinkou. Sklíčko s lakmusovým papírem se překlopí na sklíčko se zkoušenou látkou a vzniklá komůrka se zahřívá 15 min při 40 °C. Lakmusový papír není zbarven intenzivněji modře než lakmusový papír u porovnávacího vzorku připraveného současně stejným způsobem za použití 0,1 ml základního roztoku amonia (100 μg NH₄/ml), 0,5 ml vody R a 0,30 g oxidu horečnatého těžkého R (200 μg/g).

Železo (2.4.9). 1,0 g se rozpustí v dělicí nálevce v 10 ml kyseliny chlorovodíkové zředěné RS a vytřepává se třikrát po 3 min vždy s 10 ml isobutylmethylketonu R1. Ke spojeným organickým vrstvám se přidá 10 ml vody R a třepe se 3 min. Vodná vrstva vyhovuje limitní zkoušce na železo (10 μg/g).

Těžké kovy (2.4.8). 2,0 g vyhovují limitní zkoušce D na těžké kovy (10 μg/g). Porovnávací roztok se připraví za použití 2 ml základního roztoku olova (1 μg Pb/ml).

Ztráta sušením (2.2.32). Nejvýše 0,5 %; 1,000 g se suší v sušárně při 100 °C až 105 °C.

Síranový popel (2.4.14). Nejvýše 0,1 %; stanoví se s 1,00 g zkoušené látky.

Stanovení obsahu

0,130 g se rozpustí v 50 ml vody R a titruje se kyselinou chlorovodíkovou 0,1 mol/l VS za potenciometrické indikace bodu ekvivalence (2.2.20).

1 ml kyseliny chlorovodíkové 0,1 mol/l VS odpovídá 15,52 mg C₆H₉N₃O₂.

Uchovávání

V dobře uzavřených obalech, chráněn před světlem.

Separandum.

† Hydrocortisonum

Hydrokortison

Je to 11β,I7,21-trihydroxy-4-pregnen-3,20-dion. Počítáno na vysušenou látku, obsahuje 97,0 % až 103,0 % sloučeniny C₂₁H₃₀O₅.

Vlastnosti

Bílý nebo téměř bílý krystalický prášek. Je prakticky nerozpustný ve vodě, mírně rozpustný v acetonu a v lihu 96%, těžce rozpustný v dichlormethanu.

Vykazuje polymorfismus.

Zkoušky totožnosti

Základní sestava zkoušek: A a B.

Alternativní sestava zkoušek: C a D, viz Obecné zásady (1.2).

1. A. Infračervené absorpční spektrum (2.2.24) zkoušené látky se shoduje se spektrem hydrokortisonu CRL. Jestliže spektrum zkoušené látky a spektrum referenční látky v tuhém stavu vykazují rozdíly, rozpustí se obě látky odděleně v co nejmenším množství acetonu R, odpaří se do sucha na vodní lázni a se zbytky se znovu zaznamenají spektra látek.
2. B. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití vhodného silikagelu s fluorescenčním indikátorem pro detekci při 254 nm.

   Zkoušený roztok. 10 mg se rozpustí ve směsi objemových dílů methanolu R a dichlormethanu R (1 + 9) a zředí se stejnou směsí na 10 ml.

   Porovnávací roztok (a). 20 mg hydrokortisonu CRL se rozpustí ve směsi objemových dílů methanolu R a dichlormethanu R (1 + 9) a zředí se stejnou směsí na 20 ml.

   Porovnávací roztok (b). 10 mg prednisolonu CRL se rozpustí v porovnávacím roztoku (a) a zředí se jím na 10 ml.

   Na vrstvu se odděleně nanese po 5 μl každého roztoku a vyvíjí se mobilní fází připravenou přidáním směsi objemových dílů vody R a methanolu R (1,2 + 8) do směsi objemových dílů etheru R a dichlormethanu R (15 + 77) po dráze 15 cm. Potom se vrstva podruhé vyvíjí směsí objemových dílů 1-butanolu R nasyceného vodou R, toluenu R a etheru R (5 + 15 + 80) po dráze 15 cm. Vrstva se usuší na vzduchu a pozoruje se v ultrafialovém světle při 254 nm. Hlavní skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku odpovídá polohou a velikostí hlavní skvrně na chromatogramu porovnávacího roztoku (a). Vrstva se postříká kyselinou sírovou v lihu RS a zahřívá se 10 min nebo do objevení skvrn při 120 °C. Po ochlazení se vrstva pozoruje v denním světle a v ultrafialovém světle při 365 nm. Hlavní skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku odpovídá polohou, zbarvením v denním světle a fluorescencí v ultrafialovém světle při 365 nm a velikostí hlavní skvrně na chromatogramu porovnávacího roztoku (a). Zkoušku lze hodnotit, jestliže na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) jsou dvě zřetelně oddělené skvrny.

1. C. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití vhodného silikagelu s fluorescenčním indikátorem pro detekci při 254 nm.

   Zkoušený roztok (a). 25 mg se rozpustí v methanolu R a zředí se jím na 5 ml (tento roztok se použije také k přípravě zkoušeného roztoku (b)). 2 ml tohoto roztoku se zředí dichlormet- hanem R na 10 ml.

   Zkoušený roztok (b). 0,4 ml roztoku získaného při přípravě zkoušeného roztoku (a) se přenesou do skleněné zkumavky 100 mm dlouhé a o průměru 20 mm opatřené skleněnou nebo polytetrafluorethylenovou zátkou. Rozpouštědlo se odpaří za mírného zahřátí pod proudem dusíku R. Přidají se 2 ml roztoku kyseliny octové ledové R 15% (V/V) a 50 mg bismutičnanu sodného R. Zkumavka se uzavře a 1 h se třepe na mechanické třepačce za chánění před světlem. Přidají se 2 ml roztoku kyseliny octové ledové R 15% (V/V), směs se zfiltruje do 50ml dělicí nálevky a filtr se promyje dvakrát 5 ml vody R. Čirý filtrát se protřepe s 10 ml dichlormethanu R, organická vrstva se promyje 5 ml hydroxidu sodného 1 mol/l RS, dvakrát 5 ml vody R a vysuší se síranem sodným bezvodým R.

   Porovnávací roztok (a). 25 mg hydrokortisonu CRL se rozpustí v methanolu R a zředí se jím na 5 ml (tento roztok se použije také k přípravě porovnávacího roztoku (b)). 2 ml tohoto roztoku se zředí dichlormethanem R na 10 ml.

   Porovnávací roztok (b). 0,4 ml roztoku získaného při přípravě porovnávacího roztoku (a) se přenesou do skleněné zkumavky 100 mm dlouhé a o průměru 20 mm opatřené skleněnou nebo polytetrafluorethylenovou zátkou. Rozpouštědlo se odpaří za mírného zahřátí pod proudem dusíku R. Přidají se 2 ml roztoku kyseliny octové ledové R 15% (V/V) a 50 mg bismutičnanu sodného R. Zkumavka se uzavře a 1 h se třepe na mechanické třepačce za chránění před světlem. Přidají se 2 ml roztoku kyseliny octové ledové R 15% (V/V), směs se zfiltruje do 50ml dělicí nálevky a filtr se promyje dvakrát 5 ml vody R. Čirý filtrát se protřepe s 10 ml dichlormethanu R, organická vrstva se promyje 5 ml hydroxidu sodného 1 mol/l RS, dvakrát 5 ml vody R a vysuší se síranem sodným bezvodým R.

   Na vrstvu se odděleně nanese 5 μl zkoušeného roztoku (a), 5 μl porovnávacího roztoku (a), 25 μl zkoušeného roztoku (b) a 25 μl porovnávacího roztoku (b); poslední dva roztoky se nanášejí po malých množstvích do malých skvrn. Vyvíjí se mobilní fází připravenou přidáním směsi objemových dílů vody R a methanolu R (1,2 + 8) do směsi objemových dílů etheru R a dichlormethanu R (15 + 77) po dráze 15 cm. Potom se vrstva podruhé vyvíjí směsí objemových dílů 1-butanolu R nasyceného vodou R, toluenu R a etheru R (5 + 15 + 80) po dráze 15 cm. Vrstva se usuší na vzduchu a pozoruje se v ultrafialovém světle při 254 nm. Hlavní skvrna na chromatogramech zkoušených roztoků odpovídá polohou a velikostí hlavní skvrně na chromatogramu odpovídajícího porovnávacího roztoku. Vrstva se postříká kyselinou sírovou v lihu RS a zahřívá se 10 min nebo do objevení skvrn při 120 °C. Po ochlazení se vrstva pozoruje v denním světle a v ultrafialovém světle při 365 nm. Hlavní skvrna na chromatogramech zkoušených roztoků odpovídá polohou, zbarvením v denním světle, fluorescencí v ultrafialovém světle při 365 nm a velikostí hlavní skvrně na chromatogramu odpovídajícího porovnávacího roztoku. Hlavní skvrny na chromatogramu zkoušeného roztoku (b) a porovnávacího roztoku (b) mají hodnotu R_F zřetelně vyšší než hlavní skvrny na chromatogramu zkoušeného roztoku (a) a porovnávacího roztoku (a).

1. D. Asi 2 mg se přidají ke 2 ml kyseliny sírové R a třepe se do rozpuštění; do 5 min vznikne intenzivní hnědočervené zbarvení se zelenou fluorescencí, která je intenzivní v ultrafialovém světle při 365 nm. Roztok se přidá k 10 ml vody R a promíchá se; zbarvení zmizí a zůstane čirý roztok. Fluorescence v ultrafialovém světle zůstává.

Zkoušky na čistotu

Specifická optická otáčivost (2.2.7). +150° až +156°; počítáno na vysušenou látku. Měří se roztok připravený rozpuštěním 0,250 g v dioxanu R a zředěním stejným rozpouštědlem na 25,0 ml.

Příbuzné látky. Stanoví se kapalinovou chromatografií (2.2.29). Roztoky se připraví bezprostředně před použitím.

Zkoušený roztok. 25,0 mg se rozpustí ve 2 ml tetrahydrofuranu R a zředí se vodou R na 10,0 ml.

Porovnávací roztok (a). 2 mg hydrokortisonu CRL a 2 mg prednisolonu R se rozpustí v mobilní fázi a zředí se jí na 100,0 ml.

Porovnávací roztok (b). 1,0 ml zkoušeného roztoku se zředí mobilní fází na 100,0 ml.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

1. - nerezové ocelové kolony délky 0,25 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné silikagelem oktadecylsilanizovaným deaktivovaným pro chromatografii bazických látek s odstíněnými silanolovými skupinami R (5 μm),
2. - mobilní fáze, kterou je směs připravená takto: v 1000ml odměrné baňce se smíchá 220 ml tetrahydrofuranu R a 700 ml vody R a nechá se ustálit; zředí se na 1000 ml vodou R a znovu se promíchá, průtoková rychlost je 1 ml/min,
3. - spektrofotometrického detektoru, 254 nm.

Teplota kolony se udržuje na 45 °C.

Kolona se ustálí promýváním mobilní fází po dobu 30 min při průtokové rychlosti 1 ml/min. Nastříkne se 20 μl porovnávacího roztoku (b) a nastaví se citlivost systému tak, aby výška hlavního píku byla nejméně 50 % celé stupnice zapisovače.

Nastříkne se 20 μl porovnávacího roztoku (a). Při zaznamenání chromatogramu za předepsaných podmínek jsou retenční časy prednisolonu asi 14 min a hydrokortisonu asi 15,5 min. Zkoušku lze hodnotit, jestliže rozlišení mezi píky prednisolonu a hydrokortisonu je nejméně 2,2. Je-li třeba, upraví se koncentrace tetrahydrofuranu R v mobilní fázi.

Nastříkne se odděleně 20 μl směsi rozpouštědel použitých pro zkoušený roztok jako slepá zkouška, 20 μl zkoušeného roztoku a 20 μl porovnávacího roztoku (b) Chromatogram zkoušeného roztoku se zaznamenává po dobu odpovídající čtyřnásobku retenčního času hlavního píku. Na chromatogramu zkoušeného roztoku plocha žádného píku, kromě hlavního píku, není větší než polovina plochy hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) (0,5 %); součet ploch všech píků, kromě hlavního píku, není větší než l,5násobek plochy hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) (1,5 %). Nepřihlíží se k pikům, jejichž plocha je menší než 0,05násobek plochy hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) a k pikům získaným při slepé zkoušce.

Ztráta sušením (2.232). Nejvýše 1,0 %; 0,500 g se suší v sušárně při 100 °C až 105 °C. Stanovení obsahu

0,100 g se rozpustí v lihu 96% R a zředí se jím na 100,0 ml. 2,0 ml tohoto roztoku se zředí lihem 96% R na 100,0 ml. Měří se absorbance (2.2.25) v maximu při 241,5 nm.

Obsah C₂₁H₃₀O₅ se vypočítá za použití specifické absorbance, která má hodnotu 440.

Uchovávání

Chráněn před světlem.

Separandum.

Nečistoty

1. A. prednisolon,
2. B. kortison,
3. C. hydrokortisonacetat,

1. D. 6β,11β, 17,21-tetrahydroxy-4-pregnen-3,20-dion (6β-hydroxyhydrokortison),

1. E. 11β,17,21-trihydroxy-4,6-pregnadien-3,20-dion (Δ⁶-hydrokortison),

1. F. 17,21-dihydroxy-4-pregnen-3,20-dion (Reichsteinova látka),

1. G. 11β,17-dihydroxy-3,20-dioxo-4-pregnen-21-al.

Hydroxyethylis salicylas

Hydroxyethylsalicylat

Je to 2-hydroxyethyl-2-hydroxybenzoat. Obsahuje 98,0 % až 102,0 % sloučeniny C₉H₁₀O₄.

Vlastnosti

Olejovitá bezbarvá nebo téměř bezbarvá kapalina. Je mírně rozpustný ve vodě, velmi snadno rozpustný v acetonu, v etheru a v dichlormethanu, snadno rozpustný v lihu 96%.

Zkoušky totožnosti

Základní sestava zkoušek: A a B.

Alternativní sestava zkoušek: A, C, D a E, viz Obecné zásady (1.2).

1. A. Zkouška Index lomu, viz Zkoušky na čistotu, je zároveň zkouškou totožnosti.
2. B. Infračervené absorpční spektrum (2.2.24) tenkého filmu zkoušené látky se shoduje se spektrem tenkého filmu hydroxyethylsalicylatu CRL.
3. C. Hodnotí se chromatogramy ze zkoušky Příbuzné látky, viz Zkoušky na čistotu. Hlavní skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku (b) se polohou a velikostí shoduje s hlavní skvrnou na chromatogramu porovnávacího roztoku (a).
4. D. K 1 ml roztoku S, viz Zkoušky na čistotu, se přidá 1 ml vody R a 0,2 ml chloridu železitého RS2; vznikne fialovočervené zbarvení, které zmizí ihned po přidání 2 ml kyseliny octové zředěné RS. Může zůstat velmi slabé fialové zbarvení.
5. E. 1 g se smíchá ve zkumavce 160 mm dlouhé se 2,0 g jemně rozetřeného síranu manganatého R. Do zkumavky se vloží 2 cm hluboko proužek filtračního papíru impregnovaného čerstvě připravenou směsí objemových dílů roztoku diethanolaminu R 20 % (V/V) a roztoku nitroprussidu sodného R (50 g/l) (1 + 11), jehož pH bylo upraveno kyselinou chlorovodíkovou 1 mol/l RS na hodnotu 9,8. Zkumavka se 1 min až 2 min zahřívá nad otevřeným plamenem. Filtrační papír zmodrá.

Zkoušky na čistotu

Roztok S. 2,5 g se rozpustí ve 40 ml lihu 96% R a zředí se vodou destilovanou R na 50 ml.

Vzhled roztoku. Roztok S je čirý (2.2.1) a bezbarvý (2.2.2, Metoda II).

Kysele nebo zásaditě reagující látky. Ke 2 ml roztoku S se přidá 0,1 ml červeně methylové RS a 0,2 ml hydroxidu sodného 0,01 mol/l VS; roztok se zbarví žlutě. Přidá se 0,3 ml kyseliny chlorovodíkové 0,01 mol/l VS; roztok se zbarví červeně.

Relativní hustota (2.2.5). 1,252 až 1,257.

Index lomu (2.2.6). 1,548 až 1,551.

Příbuzné látky. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití vrstvy vhodného silikagelu s fluorescenčním indikátorem pro detekci při 254 nm.

Zkoušený roztok (a). 0,50 g se rozpustí v methanolu R a zředí se jím na 10 ml.

Zkoušený roztok (b). 2 ml zkoušeného roztoku (a) se zředí methanolem R na 50 ml.

Porovnávací roztok (a). 50,0 mg hydroxyethylsalicylatu CRL se rozpustí v methanolu R a zředí se jím na 25 ml.

Porovnávací roztok (b). 2,5 ml zkoušeného roztoku (b) se zředí methanolem R na 10 ml. Porovnávací roztok (c). 0,10 g ethylenglykolu R se rozpustí v methanolu R a zředí se jím na 50 ml. 1,25 ml tohoto roztoku se zředí methanolem R na 10 ml.

Na vrstvu se nanese odděleně po 10 pl každého roztoku a vyvíjí se směsí objemových dílů kyseliny octové ledové R, ethylacetatu R a cyklohexanu R (20 + 20 + 60) po dráze 15 cm. Vrstva se suší v proudu chladného vzduchu a pak se pozoruje v ultrafialovém světle při 254 nm.

Na chromatogramu zkoušeného roztoku (a) žádná skvrna, kromě hlavní skvrny, není intenzivnější než skvrna na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) (1 %). Vrstva se postříká vanadičnanem amonným RS, 10 min se zahřívá při 100 °C a po 10 min chladnutí se pozoruje v denním světle.

Na chromatogramu zkoušeného roztoku (a) žádná skvrna, odpovídající ethylenglykolu, není intenzivnější než skvrna na chromatogramu porovnávacího roztoku (c) (0,5 %) a žádná skvrna, kromě hlavní skvrny a skvrny odpovídající ethylenglykolu, není intenzivnější než skvrna na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) (1 %). Zkoušku lze hodnotit, jestliže na chromatogramu porovnávacího roztoku (c) je zřetelně viditelná skvrna.

Chloridy (2.4.4). 10 ml roztoku S se zředí vodou R na 15 ml. Roztok vyhovuje limitní zkoušce na chloridy (100 μg/g).

Sírany (2.4.13). 12 ml roztoku S se zředí vodou destilovanou R na 15 ml. Roztok vyhovuje limitní zkoušce na sírany (250 μg/g).

Síranový popel (2.4.14). Nejvýše 0,1 %, stanoví se s 1,00 g zkoušené látky.

Stanovení obsahu

0,125 g se rozpustí ve 30 ml kyseliny octové ledové R v baňce se zabroušenou zátkou. Přidá se 10 ml kyseliny sírové zředěné RS, 1,5 g bromidu draselného R a 50,0 ml bromičnanu draselného 0,02 mol/l VS. Baňka se ihned uzavře a ponechá se stát 15 min za ochrany před světlem. Ihned po otevření baňky se přidá 1,5 g jodidu draselného R a titruje se thiosíranem sodným 0,1 mol/l VS. Před ukončením titrace se přidá 1 ml škrobu RS. Provede se slepá zkouška.

1 ml bromičnanu draselného 0,02 mol/l VS odpovídá 5,466 mg C₉H₁₀O₄.

Uchovávání

V dobře uzavřených obalech, chráněn před světlem.

Nečistoty

1. A. kyselina salicylová,

1. B. 1,2-ethandiol (ethylenglykol).

Imipenemum

Imipenem

Je to monohydrát kyseliny (5R,6S)-6-[(R)-1-hydroxyethyl]-3-{[2-[(iminomethyl)amino]ethyl]-thio}-7-oxo-1-azabicyklo[3,2,0]hept-2-en-2-karboxylové. Počítáno na bezvodou látku, obsahuje 98,0 % až 101,0 % sloučeniny C₁₂H₁₇N₃O₄S.

Vlastnosti

Bílý téměř bílý nebo světle žlutý prášek. Je mírně rozpustný ve vodě, těžce rozpustný v methanolu.

Zkoušky totožnosti

Infračervené absorpční spektrum (2.2.24) zkoušené látky se shoduje se spektrem imipenemu CRL.

Zkoušky na čistotu

Vzhled roztoku. 0,500 g se rozpustí v tlumivém roztoku fosforečnanovém o pH 7,0 (3) a zředí se jím na 50 ml. Roztok neopalizuje intenzivněji než porovnávací suspenze II (2.2.1) a není zbarven intenzivněji než nejpodobnější porovnávací barevný roztok intenzity 6 (2.2.2, Metoda II).

Hodnota pH (2.2.3). 4,5 až 7,0; měří se roztok připravený rozpuštěním 0,500 g ve vodě prosté oxidu uhličitého R a zředěním stejným rozpouštědlem na 100,0 ml.

Specifická optická otáčivost (2.2.7). +84° až+89°, počítáno na bezvodou látku a měřeno při 25 °C; měří se roztok připravený rozpuštěním 0,125 g v tlumivém roztoku fosforečnanovém o pH 7,0 (3) a zředěním stejným rozpouštědlem na 25,0 ml.

Příbuzné látky. Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29) popsaná ve zkoušce Stanovení obsahu.

Nastříkne se 20 μl porovnávacího roztoku (b). Nastaví se citlivost detektoru tak, aby výška hlavního píku na chromatogramu byla nejméně 50 % celé stupnice zapisovače. Nastříkne se 20 μl zkoušeného roztoku a chromatogram se zaznamenává po dobu odpovídající dvojnásobku retenčního času hlavního píku. Na chromatogramu zkoušeného roztoku plocha píku thienamycinu není větší než plocha hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) (1 %), plocha žádného píku, kromě hlavního píku a píku thienamycinu, není větší než 0,3násobek plochy hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) (0,3 %), součet ploch všech píků, kromě hlavního píku a píku thienamycinu, není větší než plocha hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) (1 %). Nepřihlíží se k pikům, jejichž plocha je menší než 0,lnásobek plochy hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b).

Aceton a 2-propanol. Celkem nejvýše 0,25 %; stanoví se head-space plynovou chromatografií (2.2.28).

Zkoušený roztok. 0,100 g zkoušené látky a 1,0 g síranu sodného bezvodého R se rozpustí ve 20ml lahvičce ve vodě R a zředí se jí na 5,0 ml, uzavře se a 10 min se protřepává.

Porovnávací roztok. 0,250 g acetonu R a 0,250 g 2-propanolu R se zředí vodou R na 50,0 ml. 1,0 ml tohoto roztoku se zředí vodou R na 100,0 ml (odpovídá 0,25% acetonu a 0,25% 2- propanolu). 5,0 ml tohoto roztoku se převede do 20ml lahvičky a přidá se 1,0 g síranu sodného bezvodého R, uzavře se a 10 min se protřepává.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

1. - křemenné kapilární kolony délky 30 m a vnitřního průměru 0,53 mm s vnitřním povrchem porytým 1,5|im filmem makro gólu 20 000 R,
2. - helia pro chromatografií R jako nosného plynu,
3. - plamenoionizačního detektoru.

Teplota kolony se udržuje po dobu 7 min na 60 °C, pak se zvyšuje rychlostí 15 °C/min na teplotu 240 °C, při níž se udržuje 20 min, teplota nástřikového prostoru se udržuje při 140 °C a teplota detektoru při 260 °C. Lahvičky se zahřívají 60 min při 85 °C. Nastříkne se po 1 ml plynné fáze každého roztoku.

Voda, semimikrostanovení (2.5.12). 5 % až 8 %, stanoví se s 0,200 g zkoušené látky. Použije se jodosiřičité činidlo obsahující imidazol místo pyridinu a ke každému stanovení čistá nádobka.

Síranový popel (2.4.14). Nejvýše 0,2 %; stanoví se s 1,00 g zkoušené látky.

Sterilita (2.6.1). Pokud je látka určena k výrobě parenterálních přípravků bez dalšího vhodného sterilizačního postupu, vyhovuje zkoušce na sterilitu.

Bakteriální endotoxiny (2.6.14). Pokud je látka určena k výrobě parenterálních přípravků bez dalšího vhodného postupu odstraňujícího bakteriální endotoxiny, vyhovuje zkoušce na bakteriální endotoxiny, obsahuje-li nejvýše 0,17 m.j. endotoxinu v miligramu.

Stanovení obsahu

Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29).

Roztoky se uchovávají v ledové lázni a použijí se do 8 h od přípravy.

Zkoušený roztok. 40,0 mg se rozpustí v mobilní fázi a zředí se jí na 100,0 ml.

Porovnávací roztok (a). 40,0 mg imipenemu CRL se rozpustí v mobilní fázi a zředí se jí na 100,0 ml.

Porovnávací roztok (b). 1,0 ml zkoušeného roztoku se zředí mobilní fází na 100,0 ml.

Porovnávací roztok (c). 20 ml zkoušeného roztoku se 5 min zahřívá při 80 °C, pH roztoku bylo předem upraveno na hodnotu 10 hydroxidem sodným RS.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

1. - nerezové ocelové kolony délky 0,25 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné silikagelem oktadecylsilanizovaným pro chromatografii R (5 puť),
2. - mobilní fáze, která je směsí objemových dílů acetonitrilu R a roztoku hydrogenfosforečnanu draselného R (8,7 g/l), předem zneutralizovaného kyselinou fosforečnou zředěnou RS na hodnotu pH 7,3 (0,7 + 99,3), při průtokové rychlosti 1,0 ml/min,
3. - spektrofotometrického detektoru, 254 nm.

Nastříkne se 20 μl porovnávacího roztoku (a). Citlivost detektoru se nastaví tak, aby výška hlavního píku na chromatogramu byla nejméně 50 % celé stupnice zapisovače. Nastříkne se 20 μl porovnávacího roztoku (c). Při zaznamenání chromatogramů za předepsaných podmínek je retenční čas imipenemu asi 9 min a relativní retenční čas thienamycinu vztažený k imipenemu asi 0,8. Zkoušku lze hodnotit, jestliže rozlišení mezi píkem imipenemu a píkem thienamycinu je nejméně 3,5. Nastříkne se šestkrát po 20 μl porovnávacího roztoku (a). Zkoušku lze hodnotit, jestliže relativní směrodatná odchylka plochy píku imipenemu je nejvýše 1,0%. Nastřikuje se střídavě zkoušený roztok a porovnávací roztok (a).

Uchovávání

Ve vzduchotěsných obalech, při teplotě 2 °C až 8 °C. Pokud je látka sterilní, uchovává se ve sterilních vzduchotěsných zabezpečených obalech.

Označování

V označení na obalu se uvede, zda je látka:

1. - sterilní,
2. - prostá bakteriálních endotoxinů.

Nečistoty

1. A. kyselina (5R,6S)-3-[(2-aminoethyl)thio]-6-[(R)-1-hydroxyethyl]-7-oxo-1-azabicyklo[3,2,0]hept-2-en-2-karboxylová (thienamycin).

† Insulinum

Insulin

Je to čištěná přírodní antidiabetická látka získaná z hovězí nebo prasečí slinivky břišní. Počítáno na vysušenou látku, obsahuje 93,0% až 105,0% prasečího insulinu C₂₅₆H₃₈₁N₆₅O₇₆S₆ nebo hovězího insulinu C₂₅₄H₃₇₇N₆₅O₇₅S₆ a odpovídajícího příslušného A21 deamidoinsulinu.

1 m.j. insulinu odpovídá 0,0345 mg prasečího insulinu a 0,0342 mg hovězího insulinu.

Výroba

Zvířata, ze kterých je insulin získáván, musí splňovat požadavky oprávněné autority, které se kladou na zvířata určená pro humánní konzumaci. Navíc tyto tkáně nesmí obsahovat specifický rizikový materiál, který je definován odpovídajícími mezinárodními, nebo kde je to vhodné, národními požadavky.

Vlastnosti

Bílý nebo téměř bílý prášek. Je prakticky nerozpustný ve vodě, v ethanolu a v etheru. Rozpouští se ve zředěných minerálních kyselinách a za rozkladu ve zředěných alkalických hydroxidech.

Zkoušky totožnosti

1. A. Hodnotí se chromatogramy získané ve zkoušce Stanovení obsahu. Retenční čas hlavního píku na chromatogramu zkoušeného roztoku odpovídá retenčnímu času hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) nebo, kde je to vhodné, porovnávacímu roztoku (c).
2. B. Provede se peptidové mapování.

   Zkoušený roztok. Připraví se roztok zkoušené látky v kyselině chlorovodíkové 0,01 mol/l RS tak, aby obsahoval 2,0 mg/ml insulinu a 500 μl tohoto roztoku se převede do čisté zkumavky. Přidají se 2,0 ml tlumivého roztoku HEPES opH7,5 a 400 μl roztoku proteasy kmene V8 zlatého stafylokoka R (1 mg/ml). Zkumavka se uzavře a inkubuje se 6 h při 25 °C. Reakce se zastaví přidáním 2,9 ml tlumivého roztoku síranového o pH 2,0.

   Porovnávací roztok. Připraví se současně stejným způsobem jako zkoušený roztok za použití hovězího insulinu CRL nebo prasečího insulinu CRL, co je vhodné, místo zkoušené látky. Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29).

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

1. - nerezové ocelové kolony délky 0,1 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné silikagelem oktadecylsilanizovaným pro chromatografii R (3 μm),
2. - mobilní fáze s průtokovou rychlostí 1 ml/min:
   1. - mobilní fáze A - smíchá se 100 ml acetonitrilu pro chromatografii R, 700 ml vody R a 200 ml tlumivého roztoku síranového o pH 2,0, směs se zfiltruje a odplyní.
   2. - mobilní fáze B - smíchá se 400 ml acetonitrilu pro chromatografii R, 400 ml vody R a 200 ml tlumivého roztoku síranového o pH 2,0, směs se zfiltruje a odplyní.

   Eluční podmínky jsou popsány v níže uvedené tabulce (pokud je třeba, upraví se gradient k dělení enzymaticky štěpeného insulinu):

   Uchovávání Označování Glyceromacrogoli oleas Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Uchovávání Označování Glyceromacrogoli stearas Výroba Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Uchovávání Označování † Gonadorelini acetas Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání Označování Gossypii oleum hydrogenatum Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Uchovávání Graminis radix Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Uchovávání Gummiresina myrrha Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Uchovávání Halothanum Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Uchovávání Nečistoty Helianthi oleum raffinatum Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Uchovávání Označování Hexetidinum Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání Nečistoty † Histidini hydrochloridum monohydricum1) Výroba Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání † Histidinum1) Výroba Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání † Hydrocortisonum Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Uchovávání Nečistoty Hydroxyethylis salicylas Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání Nečistoty Imipenemum Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání Označování Nečistoty † Insulinum Výroba Vlastnosti Zkoušky totožnosti

   Čas (min)	Mobilní fáze A % (V/V)	Mobilní fáze B % (V/V)	Poznámka
   0 - 60	90 → 30	10 → 70	lineární gradient
   60 - 65	30 → 0	70 → 100	lineární gradient
   65 - 70	0	100	izokraticky

1. - spektrofotometrického detektoru, 214 nm.

Teplota kolony se udržuje na 40 °C.

Kolona se ustaluje při počátečních podmínkách nejméně 15 min. Provede se slepá zkouška za výše uvedeného gradientu.

Nastříkne se 50 μl zkoušeného roztoku a 50μpl porovnávacího roztoku. Zkoušku lze hodnotit, jestliže chromatogram obou roztoků kvalitativně odpovídá referenčnímu chromatogramu Ph. Eur. enzymaticky štěpeného hovězího insulinu nebo referenčnímu chromatogramu Ph Eur. enzymaticky štěpeného prasečího insulinu, jak je třeba. Na chromatogramu porovnávacího roztoku se určí totožnost píků štěpením vzniklých fragmentů I, II a III. Faktor symetrie píků fragmentu II a III je nejvýše 1,5 a rozlišení mezi dvěma píky je nejméně 1,9.

Chromatografický profil zkoušeného roztoku odpovídá chromatogramu porovnávacího roztoku. Poznámka: Retenční čas fragmentu I prasečího insulinu je stejný jako pro lidský insulin. Retenční čas fragmentu II je stejný pro všechny insuliny. Retenční čas fragmentu III hovězího insulinu je stejný jako pro prasečí insulin.

Zkoušky na čistotu

Nečistoty s molekulovou hmotností větší než insulin. Provede se vylučovací chromatografie (2.2.30).

Zkoušený roztok. 4 mg se rozpustí v 1,0 ml kyseliny chlorovodíkové 0,01 mol/l RS.

Roztok pro rozlišení. Použije se roztok insulinu (asi 4 mg/ml), který obsahuje více než 0,4 % vysokomolekulárních bílkovin. Mohou být použity injekční přípravky insulinu, roztok nebo suspenze, které se vyčeří dostatečným množstvím kyseliny chlorovodíkové 6 mol/l RS obsahující určité procento vysokomolekulárních bílkovin, nebo roztoky připravené z insulinu rozpuštěním v kyselině chlorovodíkové 0,01 mol/l RS. Insulin obsahující určité procento vysokomolekulárních bílkovin může být připraven tak, že se prášek insulinu asi 10 dní nechá stát při pokojové teplotě.

Roztoky se udržují při teplotě 2 °C až 10 °C a použijí se do 7 dnů. Při použití automatického dávkovače se jeho teplota nastaví na 2 °C až 10 °C.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

1. - kolony délky 0,3 m a vnitřního průměru nejméně 7,5 mm naplněné silikagelem hydrofilním pro chromatografii R (5 μm až 10 μm), vhodného stupně pro separaci monomerního insulinu z dimeru a polymerů,
2. - mobilní fáze, kterou je zfiltrovaná a odplyněná směs objemových dílů kyseliny octové ledové R, acetonitrilu R a roztoku argininu R (1,0 g/1) (15 + 20 + 65), s průtokovou rychlostí 0,5 ml/min,
3. - spektrofotometrického detektoru, 276 nm.

Ustalování kolony. Před použitím nové kolony pro chromatografickou analýzu se ustaluje kolona opakovaným nástřikem roztoku insulinu obsahujícího vysokomolekulární bílkoviny. Nejméně třikrát se nastříkne roztok pro rozlišení. Kolona je ustálena, když výsledky dvou po sobě následujících nástřiků jsou opakovatelné.

Nastříkne se 100 μl roztoku pro rozlišení. Při zaznamenání chromatogramu za předepsaných podmínek retenční časy jsou: polymerní komplex insulinu 13 min až 17 min, kovalentní dimer insulinu asi 17,5 min, monomerní insulin asi 20 min, soli asi 22 min. Zkoušku lze hodnotit, jestliže rozlišení, definované poměrem výšky píku dimeru k výšce minima mezi píky monomeru a dimeru, je nejméně 2,0.

Nastříkne se 100 μl zkoušeného roztoku. Chromatogram se zaznamenává asi 35 min. Na získaném chromatogramu součet ploch píků s retenčním časem kratším než retenční čas hlavního píku není větší než 1,0 % celkové plochy píků. Nepřihlíží se k žádnému píku s retenčním časem delším než retenční čas píku insulinu.

Příbuzné bílkoviny. Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29) způsobem popsaným ve zkoušce Stanovení obsahu, s elučními podmínkami popsanými v následující tabulce:

Roztoky se udržují při 2 °C až 10 °C a použijí se do 24 h. Zkontroluje se způsobilost systému (rozlišení, linearita) způsobem popsaným ve zkoušce Stanovení obsahu. Pokud je třeba, upraví se relativní poměry mobilních fází tak, aby se zajistila úplná eluce prasečího A21 deamidoinsulinu před začátkem gradientu. Profil gradientu může být upraven tak, aby se zajistila eluce všech příbuzných nečistot insulinu.

Nastříkne se 20 μl porovnávacího roztoku (b) nebo, kde je to vhodné, porovnávacího roztoku (c) a 20 μI zkoušeného roztoku. Je-li třeba, upraví se nastřikovaný objem na objem mezi 10 μl a 20 μl v souladu s výsledky získanými pro zkoušku linearity popsanou ve Stanovení obsahu. Chromatogramy se zaznamenávají asi 50 min. Na chromatogramu každého porovnávacího roztoku A21 se objeví deamidoinsulin jako malý pík za hlavním píkem s relativním retenčním časem asi 1,3 vzhledem k hlavnímu píku. Na chromatogramu zkoušeného roztoku plocha píku A21 deamidoinsulinu není větší než 3,0 % z celkové plochy píku; součet ploch všech píků, kromě příslušného insulinu a A21 deamidoinsulinu, není větší než 3,0 % z celkové plochy píků.

Imunoreaktivita proinsulinu (PLI). Nejvýše 10 μg/g; počítáno na vysušenou látku. Imunoreaktivita proinsulinu se zkouší vhodnou, dostatečně citlivou imunochemickou metodou (2.7.7), jako je radioimunoanalýza za použití mezinárodní referenční látky pro prasečí nebo, kde je to vhodné, pro hovězí pro insulin ke kalibraci metody.

Zinek. Nejvýše 1,0 %, počítáno na vysušenou látku; stanoví se atomovou absorpční spektrometrií (2.2.23, Metoda I).

Zkoušený roztok. 50,0 mg se rozpustí v kyselině chlorovodíkové 0,01 mol/l RS a zředí se jí na 25,0 ml. Je-li třeba, zředí se kyselinou chlorovodíkovou 0,01 mol/l RS na koncentraci např. 0,4 μg Zn/ml až 1,6 μg Zn/ml.

Porovnávací roztoky. Připraví se roztoky obsahující 0,40 μg Zn/ml, 0,80 μg Zn/ml, 1,00 μg Zn/ml, 1,20 μg Zn/ml, 1,60 μg Zn/ml za použití čerstvě připraveného základního roztoku zinku (5 mg Zn/ml) zředěním kyselinou chlorovodíkovou 0,01 mol/l RS.

Měří se absorbance při 213,9 nm za použití zinkové lampy s dutou katodou jako zdroje záření a plamene vzduch-acetylen vhodného složení (např. 1 l vzduchu/min a 2 l acetylenu/min).

Ztráta sušením (2.2.32). Nejvýše 10,0 %; 0,200 g se suší 24 h v sušárně při 100 °C až 105 °C.

Síranový popel (2.4.14). Nejvýše 2,5%, počítáno na vysušenou látku; stanoví se s 0,200 g zkoušené látky.

Bakteriální endotoxiny (2.6.14). Pokud je látka určena k výrobě parenterálních přípravků bez dalšího postupu odstraňujícího bakteriální endotoxiny, vyhovuje zkoušce na bakteriální endotoxiny, obsahuje-li nejvýše 10 m.j. endotoxinu v miligramu.

Stanovení obsahu

Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29).

Zkoušený roztok. 40,0 mg se rozpustí v kyselině chlorovodíkové 0,01 mol/l RS a zředí se jí na 10,0 ml.

Porovnávací roztok (a). Obsah lahvičky lidského insulinu CRL se rozpustí v kyselině chlorovodíkové 0,01 mol/l RS a zředí se jí tak, aby výsledný roztok obsahoval 4,0 mg/ml.

Porovnávací roztok (b). Obsah lahvičky prasečího insulinu CRL se rozpustí v kyselině chlorovodíkové 0,01 mol/l RS a zředí se jí tak, aby výsledný roztok obsahoval 4,0 mg/ml.

Porovnávací roztok (c). Jestliže je zkoušená látka hovězí insulin, rozpustí se 40,0 mg hovězího insulinu CRL v 10,0 ml kyseliny chlorovodíkové 0,01 mol/l RS.

Porovnávací roztok (d). 1,0 ml porovnávacího roztoku (b) se zředí kyselinou chlorovodíkovou 0,01 mol/l RS na 10,0 ml.

Porovnávací roztok (e). 1,0 ml porovnávacího roztoku (c) se zředí kyselinou chlorovodíkovou 0,01 mol/l RS na 10,0 ml.

Roztok pro rozlišení. 1,0 ml porovnávacího roztoku (a) se smíchá s 1,0 ml porovnávacího roztoku (b).

Roztoky se udržují při teplotě 2 °C až 10 °C a použijí se do 48 h. Při použití automatického dávkovače se teplota udržuje při 2 °C až 10 °C.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

1. - ocelové nerezové kolony délky 0,25 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné silikagelem oktadecylsilanizovaným pro chromatografii R (5 μm);
2. - mobilní fáze, kterou jsou následující roztoky připravené a uchovávané při teplotě nejméně 20 °C; průtoková rychlost je 1 ml/min;
   1. - mobilní fáze A - 28,4 g síranu sodného bezvodého R se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 1000 ml. Přidá se 2,7 ml kyseliny fosforečné R, je-li třeba, upraví se pH na hodnotu 2,3 ethanolaminem R, zfiltruje se a roztok se odplyní;
   2. - mobilní fáze B - 550 ml mobilní fáze A se smíchá s 450 ml acetonitrilu R. Roztok se zahřeje na teplotu nejméně 20 °C, aby se předešlo srážení (smíchání mobilní fáze A s acetonitrilem je endotermická reakce). Zfiltruje se a roztok se odplyní;

1. - spektrofotometrického detektoru, 214 nm.

Teplota kolony se udržuje na 40 °C.

Kolona se promývá směsí objemových dílů mobilní fáze A a mobilní fáze B (42 + 58). V případě potřeby se upraví složení mobilní fáze.

Nastříkne se 20 μl roztoku pro rozlišení a 20 μl porovnávacího roztoku (b). Zaznamená se chromatogram roztoku pro rozlišení až pík odpovídající hlavnímu píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) je zřetelně viditelný. Na chromatogramu roztoku pro rozlišení se určí totožost píků prasečího insulinu a lidského insulinu. Zkoušku lze hodnotit, jestliže rozlišení mezi píky odpovídající lidskému insulinu a prasečímu insulinu je nejméně 1,2. Je-li třeba, upraví se koncentrace acetonitrilu v mobilní fázi tak, aby bylo dosaženo předepsaného rozlišení.

Nastříkne se 20 μl zkoušeného roztoku a pro prasečí insulin po 20 μl porovnávacího roztoku (b) a (d), nebo pro hovězí insulin po 20 μl porovnávacího roztoku (c) a (e). Zkoušku lze hodnotit, jestliže plocha hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) nebo (c) je (10 ± 0,5)násobkem plochy hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (d) nebo (e). Pokud je tato zkouška neúspěšná, upraví se nastřikovaný objem na 10 μl až 20 μl, aby byl lineární rozsah detektoru.

Vypočítá se obsah insulinu (C₂₅₆H₃₈₁N₆₅07₆S₆ nebo C₂₅₄H₃₇₇N₆₅O₇₅S₆) a odpovídajícího A21 deamidoinsulinu z plochy hlavního píku a plochy píku A21 deamidoinsulinu na chromatogramu zkoušeného roztoku a vhodného porovnávacího roztoku a deklarovaného obsahu prasečího insulinu aA21 deamidoinsulinu v prasečím insulinu CRL nebo hovězího insulinu a A21 deamidoinsulinu hovězího insulinu v hovězím insulinu CRL, jak je třeba.

Uchovávání

Ve vzduchotěsných obalech, chráněn před světlem, při –20 °C do uvolnění pro výrobu. Po rozpuštění se insulin uchovává při (5 ± 3) °C po krátkou dobu, než bude použit pro výrobu přípravku. Při vážení je třeba insulin chránit před vzdušnou vlhkostí, insulin musí mít pokojovou teplotu. Separandum.

Označování

V označení na obalu se uvede:

1. - druh zvířete, z kterého byla látka získána,
2. - zda je látka prostá bakteriálních endotoxinů.

† Insulinum humanum

Lidský insulin

Je to protein se strukturou antidiabetického hormonu produkovaného lidskou slinivkou břišní. Počítáno na vysušenou látku, obsahuje 95,0 % až 105,0 % lidského insulinu C₂₅₇H₃₈₃N₆₅O₇₇S₆ a lidského A21 deamidoinsulinu. 1 m.j. insulinu odpovídá 0,0347 mg lidského insulinu.

Výroba

Lidský insulin je vyráběn za podmínek minimalizujících mikrobiální znečištění. Vyrábí se buď enzymatickou přeměnou a vhodným čištěním insulinu získaného z prasečí slinivky břišní, nebo metodou založenou na rekombinantní DNK (rDNK) technologii. Lidský insulin vyráběný rDNK technologií odpovídá článku Producta ab ADN recombinante.

U lidského insulinu vyráběného enzymatickou přeměnou insulinu získaného z prasečí slinivky se ve validovaném výrobním procesu odstraňuje zbytková proteolytická účinnost. Oprávěná autorita může požadovat dodatečné zkoušky.

U lidského insulinu vyráběného rDNK technologií se neprovádí následující zkouška u každé šarže konečného výrobku, pokud oprávněná autorita neudělila výjimku.

Bílkoviny hostitelské buňky. Nejvýše 10 μg/g; stanoví se postupem uvedeným v článku Producta ab ADN recombinante.

Vlastnosti

Bílý nebo téměř bílý prášek. Je prakticky nerozpustný ve vodě, v ethanolu a v etheru. Rozpouští se ve zředěných minerálních kyselinách a za rozkladu ve zředěných alkalických hydroxidech.

Zkoušky totožnosti

1. A. Hodnotí se chromatogramy získané ve zkoušce Stanovení obsahu. Retenční čas hlavního píku na chromatogramu zkoušeného roztoku odpovídá retenčnímu času hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (a).
2. B. Provede se peptidové mapování.

   Zkoušený roztok. Připraví se roztok zkoušené látky v kyselině chlorovodíkové 0,01 mol/l RS tak, aby obsahoval 2,0 mg/ml lidského insulinu a 500 μl tohoto roztoku se převede do čisté zkumavky. Přidají se 2,0 ml tlumivého roztoku HEPES o pH 7,5 a 400 μl roztoku proteasy kmene V8 zlatého stafylokoka R (1 mg/ml). Zkumavka se uzavře a inkubuje se 6 h při 25 °C. Reakce se zastaví přidáním 2,9 ml tlumivého roztoku síranového o pH 2,0.

   Porovnávací roztok. Připraví se současně stejným způsobem jako zkoušený roztok za použití lidského insulinu CRL místo zkoušené látky.

   Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29).

   Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

   1. - nerezové ocelové kolony délky 0,1 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné silikagelem oktadecylsilanizovaným pro chromatograjU R (3 μm),
   2. - mobilní fáze s průtokovou rychlostí 1 ml/min:
      1. - mobilní fáze A - smíchá se 100 ml acetonitrilu pro chromatografii R, 700 ml vody R a 200 ml tlumivého roztoku síranového o pH 2,0, směs se zfiltruje a odplyní,
      2. - mobilní fáze B - smíchá se 400 ml acetonitrilu pro chromatografii R, 400 ml vody R a 200 ml tlumivého roztoku síranového o pH 2,0, směs se zfiltruje a odplyní,

      Eluční podmínky jsou popsány v níže uvedené tabulce (pokud je třeba, upraví se gradient k dělení enzymaticky štěpeného insulinu):

      Uchovávání Označování Glyceromacrogoli oleas Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Uchovávání Označování Glyceromacrogoli stearas Výroba Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Uchovávání Označování † Gonadorelini acetas Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání Označování Gossypii oleum hydrogenatum Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Uchovávání Graminis radix Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Uchovávání Gummiresina myrrha Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Uchovávání Halothanum Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Uchovávání Nečistoty Helianthi oleum raffinatum Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Uchovávání Označování Hexetidinum Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání Nečistoty † Histidini hydrochloridum monohydricum1) Výroba Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání † Histidinum1) Výroba Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání † Hydrocortisonum Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Uchovávání Nečistoty Hydroxyethylis salicylas Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání Nečistoty Imipenemum Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání Označování Nečistoty † Insulinum Výroba Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání Označování † Insulinum humanum Výroba Vlastnosti Zkoušky totožnosti

      Čas (min)	Mobilní fáze A % (V/V)	Mobilní fáze B % (V/V)	Poznámka
      0 - 60	90 → 30	10 → 70	lineární gradient
      60 - 65	30 → 0	70 → 100	lineární gradient
      65 - 70	0	100	izokraticky

   1. - spektrofotometrického detektoru, 214 nm.

   Teplota kolony se udržuje na 40 °C.

   Kolona se ustaluje při počátečních podmínkách nejméně 15 min. Provede se slepá zkouška za výše uvedeného gradientu.

   Nastříkne se 50 μl zkoušeného roztoku a 50 μl porovnávacího roztoku. Zkoušku lze hodnotit, jestliže chromatogram obou roztoků kvalitativně odpovídá referenčnímu chromatogramu Ph. Eur. enzymaticky štěpeného lidského insulinu. Na chromatogramu porovnávacího roztoku se určí totožnost píku štěpením vzniklých fragmentů I, II a III. Faktor symetrie píků fragmentu II a III je nejvýše 1,5 a rozlišení mezi dvěma píky je nejméně 3,4.

   Chromatografický profil zkoušeného roztoku odpovídá chromatogramu porovnávacího roztoku.

3. Poznámka: Retenční čas fragmentu I prasečího insulinu je stejný jako pro lidský insulin. Retenční čas fragmentu II je stejný pro všechny insuliny. Retenční čas fragmentu III hovězího insulinu je stejný jako pro prasečí insulin.

Zkoušky na čistotu

Nečistoty s molekulovou hmotností větší než insulin. Provede se vylučovací chromatografie (2.2.30).

Zkoušený roztok. 4 mg se rozpustí v 1,0 ml kyseliny chlorovodíkové 0,01 mol/l RS.

Roztok pro rozlišení. Použije se roztok insulinu (asi 4 mg/ml), který obsahuje více než 0,4 % vysokomolekulárních bílkovin. Mohou být použity injekční přípravky insulinu, roztok nebo suspenze, která se vy čeří dostatečným množstvím kyseliny chlorovodíkové 6 mol/l RS, obsahující určité procento vysokomolekulárních bílkovin, nebo roztoky připravené z insulinu rozpuštěním v kyselině chlorovodíkové 0,01 mol/l RS. Insulin obsahující určité procento vysokomolekulárních bílkovin může být připraven tak, že se prášek insulinu asi 10 dní nechá stát při pokojové teplotě.

Roztoky se udržují při teplotě 2 °C až 10 °C a použijí se do 7 dnů. Při použití automatického dávkovače se jeho teplota nastaví na 2 °C až 10 °C.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

1. - kolony délky 0,3 m a vnitřního průměru nejméně 7,5 mm naplněné silikagelem hydrofilním pro chromatografii R (5 μm až 10 μm), vhodného stupně pro separaci monomerního insulinu z dimeru a polymerů,
2. - mobilní fáze, kterou je zfiltrovaná a odplyněná směs objemových dílů kyseliny octové ledové R, acetonitrilu R a roztoku argininu R (1,0 g/1) (15 + 20 + 65), průtoková rychlost je 0,5 ml/min,
3. - spektrofotometrického detektoru, 276 nm.