Obr. 2.4.24-1 Typický chromatogram rozpouštědel třídy 1 za použití podmínek popsaných pro systém A a Postup 1. Plamenoionizační detektor.
4: benzen; 10: chlorid uhličitý; 14: 1,2-dichlorethan; 15: 1,1-dichlorethylen; 52: 1,1,1- trichlorethan.
Nastříkne se 1 ml plynné fáze porovnávacího roztoku (b) na kolonu popsanou v systému A a zaznamená se chromatogram za takových podmínek, aby mohlo být určeno rozlišení mezi píky odpovídajícími acetonitrilu a dichlormethanu. Systém je vhodný, jestliže získaný chromatogram je podobný chromatogramu na obrázku 2.4.24-2 a rozlišení mezi píky acetonitrilu a dichlormethanu je nejméně 1,0.
Nastříkne se 1 ml plynné fáze zkoušeného roztoku na kolonu popsanou v systému A. Jestliže na získaném chromatogramu není žádný pík odpovídající jednomu z píků zbytkových rozpouštědel na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) nebo (b), pak zkoušená látka vyhovuje požadavkům zkoušky. Jestliže kterýkoliv pík na chromatogramu zkoušeného roztoku odpovídá některému z píků zbytkových rozpouštědel na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) nebo (b), musí být použit systém B.
Nastříkne se 1 ml plynné fáze porovnávacího roztoku (a) na kolonu popsanou v systému B a zaznamená se chromatogram za takových podmínek, aby mohl být stanoven poměr signálu k šumu pro benzen. Tento poměr musí být nejméně 5. Typický chromatogram je ukázán na obrázku 2.4.24-3.
Nastříkne se 1 ml plynné fáze porovnávacího roztoku (a1) na kolonu popsanou v systému B. Píky odpovídající zbytkovým rozpouštědlům třídy 1 musí být ještě detegovatelné.
Nastříkne se 1 ml plynné fáze porovnávacího roztoku (b) na kolonu popsanou v systému B a zaznamená se chromatogram za takových podmínek, aby mohlo být určeno rozlišení mezi píky odpovídajícími acetonitrilu a trichlorethylenu. Systém je vhodný, jestliže získaný chromatogram je podobný chromatogramu na obrázku 2.4.24-4 a rozlišení mezi píky acetonitrilu a trichlorethylenu je nejméně 1,0.
Nastříkne se 1 ml plynné fáze zkoušeného roztoku na kolonu popsanou v systému B. Jestliže na získaném chromatogramu není žádný pík odpovídající jednomu z píků zbytkových rozpouštědel na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) nebo (b), pak zkoušená látka vyhovuje požadavkům zkoušky. Jestliže kterýkoliv pík na chromatogramu zkoušeného roztoku odpovídá některému z píků zbytkových rozpouštědel na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) nebo (b) a potvrzuje závěr zkoušky za použití systému A, postupuje se takto:
Nastříkne se 1 ml plynné fáze porovnávacího roztoku (c) na kolonu popsanou pro systém A nebo systém B. Je-li nutné, nastaví se citlivost systému tak, aby výška píku odpovídajícího určovanému zbytkovému rozpouštědlu (rozpouštědlům) byla nejméně 50 % celé stupnice zapisovače.
Nastříkne se 1 ml plynné fáze porovnávacího roztoku (d) na kolonu. Nesmí být pozorovatelný žádný interferující pík.
Nastříkne se 1 ml plynné fáze zkoušeného roztoku a 1 ml plynné fáze porovnávacího roztoku (c) na kolonu. Tyto nástřiky se opakují ještě dvakrát.
Obr. 2.4.24-2 Chromatogram rozpouštědel třídy 2 za použití podmínek popsaných pro systém A a Postup 1. Plamenoionizační detektor.
3: acetonitril; 11: chloroform; 13: cyklohexan; 16a: cis-1,2-dichlorethylen; 17: dichlormethan; 29: hexan; 30: 2-hexanon; 34: methanol; 49: pyridin; 51: toluen; 53: 1,1,2-trichlorethylen; 54: xylen ortho, meta, para; 58: chlorbenzen; 61: tetralin; 62: methylcyklohexan; 63: nitromethan; 64: 1,2-dimethoxyethan, DMSO dimethylsulfoxid.
Obr. 2.4.24-3 Chromatogram zbytkových rozpouštědel třídy 1 za použití podmínek popsaných pro systém B a Postup 1. Plamenoionizační detektor.
4: benzen; 10: chlorid uhličitý; 14: 1,2-dichlorethan; 15: 1,1-dichlorethylen; 52: 1,1,1-trichlorethan.
Obr. 2.4.24-4 Typický chromatogram zbytkových rozpouštědel třídy 2 za použití podmínek popsaných pro systém B a Postup 1. Plamenoionizační detektor.
3: acetonitril; 11: chloroform; 13: cyklohexan; 16a: cis-1,2-dichlorethylen; 17: dichlormethan; 23: 1,4-dioxan; 29: hexan; 30: 2-hexanon; 34: methanol; 49: pyridin; 51: toluen; 53: 1,1,2-trichlorethylen; 54: xylen, ortho, meta, para; 58: chlorbenzen; 61: tetralin; 62: methylcyklohexan; 63: nitromethan; 64: 1,2-dimethoxyethan.
Průměrná hodnota plochy píku zbytkového rozpouštědla (rozpouštědel) na chromatogramu zkoušeného roztoku nesmí být větší než polovina průměrné hodnoty plochy píku odpovídajícího zbytkového rozpouštědla (rozpouštědel) na chromatogramu porovnávacího roztoku (c). Zkoušku lze hodnotit, jestliže relativní směrodatná odchylka rozdílů ploch píků analytu získaných ze tří párů opakovaných nástřiků porovnávacího roztoku (a) a zkoušeného roztoku je nejvýše 15 %.
Průběhový diagram postupu je ukázán na obrázku 2.4.24-5.
Jsou-li zbytková rozpouštědla (třída 2 nebo třída 3) přítomna v koncentracích 0,1 % a větších, může být jejich obsah stanovován metodou standardního přídavku.
Obr. 2.4.24-5 Průběhový diagram pro identifikaci zbytkových rozpouštědel a aplikaci limitní zkoušky
| 2.4.26 N,N-Dimethylanilin |  |
- A. Stanoví se plynovou chromatografií (2.2.28) za použití N,N-diethylanilinu R jako vnitřního standardu.
Roztok vnitřního standardu. 50 mg N,N-diethylanilinu R se rozpustí ve 4 ml kyseliny chlorovodíkové 0,1 mol/l RS a zředí se vodou R na 50 ml. 1 ml tohoto roztoku se zředí vodou R na 100 ml. Zkoušený roztok. 0,50 g se rozpustí ve zkumavce se zabroušenou zátkou ve 30,0 ml vody R. Přidá se 1,0 ml roztoku vnitřního standardu. Teplota roztoku se upraví na 26 °C až 28 °C. Přidá se 1,0 ml hydroxidu sodného koncentrovaného RS a míchá se do úplného rozpuštění. Přidají se 2,0 ml trimethylpentanu R. Třepe se 2 min a vrstvy se nechají oddělit. Použije se horní vrstva.
Porovnávací roztok. 50,0 mg N,N-dimethylanilinu R se rozpustí ve 4,0 ml kyseliny chlorovodíkové 0,1 mol/l RS a zředí se vodou R na 50,0 ml. 1,0 ml tohoto roztoku se zředí vodou R na 100,0 ml. 1,0 ml tohoto roztoku se zředí vodou R na 30,0 ml. Přidá se 1,0 ml roztoku vnitřního standardu a 1,0 ml hydroxidu sodného koncentrovaného RS. Přidají se 2,0 ml trimethylpentanu R. Třepe se 2 min a vrstvy se nechají oddělit. Použije se horní vrstva.
Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:
- - křemenné kapilární kolony délky 25 m a vnitřního průměru 0,32 mm s vnitřní stěnou pokrytou filmem síťovaného polyfenylmethylsiloxanu R (tlouštka filmu 0,52 μm),
- - helia pro chromatografií R jako nosného plynu s dělicím poměrem 1 : 20, vstupním tlakem na koloně 50 kPa a průtokem na děliči 20 ml/min,
- - plamenoionizačního detektoru,
- - vstřikovací trubice se skládá z kolony dlouhé asi 1 cm naplněné křemelinou pro plynovou chro matografii R impregnovanou 10 % polydimethylsiloxanu R.
Teplota kolony se udržuje 5 min na 150 °C, pak se zvyšuje rychlostí 20 °C/min na 275 °C a při této teplotě se udržuje 3 min, teplota nástřikového prostoru se udržuje na 220 °C a teplota detektoru na 300 °C.
Retenční časy jsou: pro N,N-dimethylanilin asi 3,6 min a pro N,N-diethylanilin asi 5,0 min.
Nastřikuje se 1 μl zkoušeného roztoku a 1 μl porovnávacího roztoku.
- B. Stanoví se plynovou chromatografií (2.2.28) za použití natalenu R jako vnitřního standardu.
Roztok vnitřního standardu. 50 mg naftalenu R se rozpustí v cyklohexanu R a zředí se jím na 50 ml. 5 ml tohoto roztoku se zředí cyklohexanem R na 100 ml.
Zkoušený roztok. K 1,00 g zkoušené látky se přidá ve zkumavce se zabroušenou zátkou 5 ml hydroxidu sodného 1 mol/l RS a 1,0 ml roztoku vnitřního standardu. Zkumavka se uzavře a intenzivně třepe 1 min. Je-li nutno, odstředí se. Použije se horní vrstva.
Porovnávací roztok. K 50,0 mg N,N-dimethylanilinu R se přidají 2 ml kyseliny chlorovodíkové R a 20 ml vody R, třepe se do rozpuštění a zředí se vodou R na 50,0 ml. 5,0 ml tohoto roztoku se zředí vodou R na 250,0 ml. K 1,0 ml se ve zkumavce se zabroušenou zátkou přidá 5 ml hydroxidu sodného 1 mol/l RS a 1,0 ml roztoku vnitřního standardu. Zkumavka se uzavře a intenzivně třepe 1 min. Je-li nutno, odstředí se. Použije se horní vrstva.
Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:
- - skleněné kolony délky 2 m a vnitřního průměru 2 mm naplněné křemelinou silanizovanou pro plynovou chromatografii R impregnovanou 3 % polyfenylmethylsiloxanu R,
- - dusíku pro chromatografii R jako nosného plynu při průtokové rychlosti 30 ml/min,
- - plamenoionizačního detektoru.
Teplota kolony se udržuje na 120 °C, teplota nástřikového prostoru a detektoru na 150 °C.
Nastřikuje se 1 μl zkoušeného roztoku a 1 μl porovnávacího roztoku.
- 2.5. Stanovení obsahu
2.5.5 Číslo peroxidové 
Číslo peroxidové IP udává množství aktivního kyslíku v milimolech obsažené v peroxidické formě v 1000 g látky, stanoví se metodami popsanými níže.
Jestliže není předepsáno jinak, použije se metoda A. Každá změna metody A na metodu B by měla být validována.
Metoda A
5,00 g zkoušené látky (m) se převede do 250ml kuželové baňky se zabroušenou skleněnou zátkou. Přidá se 30 ml směsi objemových dílů kyseliny octově ledové R a chloroformu R (3 + 2) a třepe se do rozpuštění látky. Potom se přidá 0,5 ml jodidu draselného nasyceného RS, promíchá se a přesně za 1 min se přidá 30 ml vody R. Titruje se thiosíranem sodným 0,01 mol/l VS, který se pomalu přidává za rovnoměrného míchání do změny žlutého zbarvení na téměř bezbarvé. Potom se přidá 5 ml škrobu RS a pokračuje se v titraci přidáváním thiosíranu sodného 0,01 mol/l VS po kapkách a za stálého míchání do odbarvení. Současně se za stejných podmínek provede slepá zkouška, při níž spotřeba thiosíranu sodného 0,01 mol/l VS není vyšší než 0,10 ml.
Číslo peroxidové se vypočítá podle vzorce:
v němž značí:
n1 - spotřebu thiosíranu sodného 0,01 mol/l VS při titraci v ml,
n2 - spotřebu thiosíranu sodného 0,01 mol/l VS při slepé zkoušce v ml,
m - navážku zkoušené látky v g.
Metoda B
Postup se provede za chránění před aktinickým světlem.
Předepsané množství zkoušené látky (m), viz tabulka 2.5.5-1, se převede do kuželovité baňky opatřené zátkou. Přidá se 50 ml směsi objemových dílů trimethylpentanu R a kyseliny octové ledové R (2 + 3) a míchá se do rozpuštění zkoušené látky. Pipetou o vhodném objemu se přidá 0,5 ml jodidu draselného nasyceného RS, baňka se uzavře a promíchá se. Roztok se nechá stát 1 min ± 1 s, nejméně třikrát se důkladně protřepe a potom se přidá 30 ml vody R.
Tab. 2.5.5-1
Metoda A Metoda B Tab. 2.5.5-1 Předpokládané číslo peroxidové Navážka zkoušené látky (g) 0 až 12 2,00 až 5,00 12 až 20 1,20 až 2,00 20 až 30 0,80 až 1,20 30 až 50 0,500 až 0,800 50 až 90 0,300 až 0,500 Roztok se titruje thiosíranem sodným 0,1 mol/l VS, přidává se postupně za stálého intenzivního míchání do změny žlutého zbarvení na téměř bezbarvé. Přidá se asi 0,5 ml škrobu RS1 a pokračuje se v titraci za stálého míchání zvláště v blízkosti bodu ekvivalence, aby se uvolnil všechen jod z vrstvy rozpouštědla. Roztok thiosíranu sodného se přidává po kapkách až do odbarvení.
Pokud se při titraci spotřebuje méně než 0,5 ml thiosíranu sodného 0,1 mol/l VS, opakuje se stanovení za použití thiosíranu sodného 0,01 mol/l VS za stálého intenzivního míchám.
- Poznámka. K 15 s až 30 s zpoždění při neutralizaci škrobového indikátora dochází pro peroxidové číslo 70 a vyšší, trimethylpentan má sklon pěnit na povrchu vodného prostředí a v tomto případě je třeba přiměřeně míchat rozpouštědlo a odměrný roztok, až do uvolnění poslední stopy jodu. Doporučuje se použít thiosíran sodný 0,01 mol/l VS pro peroxidové číslo nižší než 150. Může se přidat malé množství (0,5 % až 1,0 %) vyšších HLB emulgátorů k reakční směsi, aby se zpomalilo dělení fází a zkrátilo se tak zpoždění při uvolnění jodu.
Provede se slepá zkouška. Jestliže spotřeba titračního činidla při slepé zkoušce je vyšší než 0,1 ml, odstraní se nečistoty činidel a opakuje se stanovení.
Číslo peroxidové se vypočítá podle vzorce:
v němž značí:
c - koncentraci thiosíranu sodného v mol/l,
V1 - spotřebu thiosíranu sodného při titraci v ml,
V0 - spotřebu thiosíranu sodného při slepé zkoušce v ml,
m - navážku zkoušené látky v g.
Metoda A Metoda B Tab. 2.5.5-1 2.5.31 Ribosa v polysacharidových vakcínách 
Zkoušený roztok. Použije se odměrná baňka vhodného objemu pro přípravu roztoku přípravku obsahujícího asi 5 mg suchého polysacharidu v mililitru. Do této baňky se kvantitativně přenese obsah nádobky a zředí se vodou R na potřebný objem. Dále se roztok zředí tak, aby objemy použité při zkoušce obsahovaly 2,5 μg až 25 μg ribosy. Zředěný roztok se převede po 0,20 ml do tří zkumavek a po 0,40 ml do dalších tří zkumavek.
Porovnávací roztoky. 25 mg ribosy R se rozpustí ve vodě R a zředí se ji na 100,0 ml (základní roztok obsahující 0,25 g/l ribosy). Bezprostředné před použitím se zředí 1 ml základního roztoku vodou R na 10,0 ml (pracovní zředění: 25 mg/l ribosy). Do šesti zkumavek se přenese 0,10 ml, 0,20 ml, 0,40 ml, 0,60 ml, 0,80 ml a 1,0 ml tohoto roztoku.
Slepá zkouška. Použijí se 2 ml vody R.
Postup. Obsah každé zkumavky se doplní vodou R na objem 2 ml, protřepe se a do každé zkumavky se přidají 2 ml roztoku chloridu železitého R (0,5 g/l) v kyselině chlorovodíkové R. Po protřepání se přidá 0,2 ml roztoku orcinolu R (100 g/l) v ethanolu R. Zkumavky se vloží na 20 min do vodní lázně a potom se ochladí v ledové vodě. Měří se absorbance (2.2.25) každého roztoku při 670 nm proti kontrolnímu roztoku získanému při slepé zkoušce. Sestrojí se kalibrační křivka ze zjištěných absorbancí šesti porovnávacích roztoků a odpovídajících obsahu ribosy a odečte se množství ribosy pro každé zředění zkoušeného roztoku. Ze tří získaných hodnot pro každý objem se vypočítá průměr.
- 2.5.32 Coulometrická titrace, mikrometoda
Metoda A Metoda B Tab. 2.5.5-1 Princip metody Coulometrická titrace vody je založena na kvantitativní reakci vody s oxidem siřičitým a jodem v bezvodém prostředí za přítomnosti zásady s dostatečnou tlumicí kapacitou. Na rozdíl od odměrné metody uvedené ve stati (2.5.12) je jod produkován elektrochemicky v reakční nádobce oxidací jodidu. Jod generovaný na anodě reaguje okamžitě s vodou a oxidem siřičitým, které jsou obsaženy v reakční nádobce. Množství vody v látce je přímo úměrné množství elektrického náboje spotřebovaného do bodu ekvivalence titrace. Když všechna voda v nádobce (stanovené látce) zreagovala, je dosaženo bodu ekvivalence a objeví se nadbytek jodu. 1 mol jodu odpovídá 1 molu vody, množství elektrického náboje 10,71 C odpovídá 1 mg vody.
Vlhkost ze systému je odstraněna předchozí elektrolýzou. Jednotlivá stanovení se mohou provádět po sobě ve stejném roztoku zkoumadel za následujících podmínek:
- - každá složka zkoušené směsi je kompatibilní s dalšími složkami,
- - neprobíhají žádné další reakce,
- - objem a vodní kapacita elektrolytového zkoumadla jsou dostatečné.
Coulometrická titrace je omezena na stanovení malých množství vody, nejlépe v rozmezí 10 μg až 10 mg.
Přesnost a správnost metody jsou podmíněny především tím, jak účinně lze vyloučit ze systému atmosférickou vlhkost. To lze monitorovat měřením velikosti posunu základní linie.
Zařízení
Zařízení se skládá z reakční nádobky, elektrod a elektromagnetické míchačky. Nádobka je tvořena větším prostorem anodovým a menším prostorem katodovým. V závislosti na tvaru elektrod mohou být oba prostory odděleny membránou a v každém prostoru je platinová elektroda. Kapalné nebo rozpuštěné vzorky jsou vnášeny přes septum injekční stříkačky. Alternativně může být použita technika odpařování, při níž je vzorek zahříván ve zkumavce (sušárně) a voda je odpařována a vedena do reakční nádobky proudem suchého inertního plynu. Obecně je třeba se vyhnout vnášení pevných vzorků do reakční nádobky. Avšak, je-li to nezbytné, provádí se to utěsněným vstupem. Je třeba učinit vhodná opatření, aby se zabránilo zanesení vlhkosti ze vzduchu, např. pracuje se v boxu opatřeném rukavicemi v atmosféře suchého inertního plynu. Postup analýzy je řízen vhodným elektronickým zařízením, které též zobrazuje výsledek.
Pracovní postup
Obě části nádobky se naplní elektrolytovým zkoumadlem pro mikrostanovení vody R podle návodu výrobce a provede se coulometrická titrace do trvalého konečného bodu. Předepsané množství zkoušené látky se vnese do reakční nádobky, 30 s se míchá, pokud není v článku uvedeno jinak, a znovu se titruje do trvalého konečného bodu. V případě, že je použito sušárny, předepsané množství vzorku se převede do zkumavky a zahřívá se. Po odpaření vody ze vzorku do reakční nádobky se začne titrovat. Hodnota se odečte z výstupu přístroje a vypočítá se, je-li to nutné, procentuální obsah nebo množství vody ve zkoušené látce. Pokud je to vhodné podle druhu vzorku a přípravku, provede se slepá zkouška.
Ověření správnosti
Mezi dvě po sobě následující titrace vzorku se vnese do nádobky přesně zvážené množství vody řádově stejné velikosti, jako je množství vody ve vzorku, buď jako voda R, nebo ve formě základního roztoku pro mikrostanovení vody a provede se coulometrická titrace. Výtěžnost se pohybuje v rozmezí 97,5 % až 102,5 % pro přidání 1000 μg H2O, v rozmezí 90,0 % až 110,0 % pro přidání 100 μg H2O.
- 2.6 Biologické zkoušky
Metoda A Metoda B Tab. 2.5.5-1 Zařízení Pracovní postup Ověření správnosti 2.6.1 Zkoušky na sterilitu 1) 
Tato zkouška se provádí s léčivými látkami, pomocnými látkami, léčivými přípravky a zdravotnickými prostředky, u nichž je lékopisem předepsána sterilita. Vyhovující výsledek však pouze udává, že zkoušený vzorek není znečištěn žádným mikrobem zjistitelným v podmínkách zkoušky. Seznam dalších požadavků k prokázání sterility celé šarže je uveden na konci tohoto textu.
Opatření proti mikrobiálnímu znečištění
Zkouška na sterilitu se provádí za aseptických podmínek, např. použitím laminárního boxu o třídě čistoty A umístěného v místnosti vyhovující třídě čistoty B, nebo v izolátoru. Opatření přijatá proti kontaminaci nepůsobí na mikroorganismy, které se mají při zkoušce zjistit. Pracovní podmínky, v nichž je zkouška prováděna, se pravidelně monitorují vhodným vzorkováním pracovního prostředí a provádějí se vhodné kontroly, jak jsou popsány v příslušných směrnicích Evropského společenství a v navazujících Notes for guidance on GMP.
Živné půdy
Následující živné půdy byly shledány vhodnými pro zkoušku na sterilitu. Thioglykolanová půda je především určena pro kultivaci anaerobních bakterií, ale umožní zjistit také aerobní bakterie. Půda z hydrolyzátů soji a kaseinu je především určena pro kultivaci aerobních bakterií, ale je vhodná i pro kultivaci hub. Mohou se používat i jiné živné půdy, pokud prokazatelně podporují růst široké řady mikroorganismů.
Thioglykolanová půda
Metoda A Metoda B Tab. 2.5.5-1 Zařízení Pracovní postup Ověření správnosti Opatření proti mikrobiálnímu znečištění Živné půdy L-cystin 0,5 g agar granulovaný (obsah vlhkosti do 15 %) 0,75 g chlorid sodný 2,5 g glukosa monohydrát 5,5 g kvasničný výtažek (rozpustný ve vodě) 5,0 g pankreatický hydrolyzát kaseinu 15,0 g thioglykolan sodný nebo 0,5 g kyselina thioglykolová 0,3 ml roztok sodné soli resazurinu (1 g/l) čerstvě připravený 1,0 ml voda R 1000 ml pH se upraví tak, aby po sterilizaci bylo 7,1 ± 0,2. Smíchá se L-cystin, agar, chlorid sodný, glukosa, kvasničný výtažek a pankreaticky hydrolyzát kaseinu s vodou a zahřívá se, dokud se nerozpustí. Přidá se thioglykolan sodný nebo kyselina thioglykolová do roztoku a přidá se, je-li třeba, hydroxid sodný 1 mol/l RS tak, aby roztok po sterilizaci měl pH 7,1 ± 0,2. Je-li zapotřebí filtrace, zahřeje se roztok téměř až k varu a za tepla se filtruje navlhčeným filtračním papírem. Potom se přidá roztok sodné soli resazurinu, promíchá se a rozplní do vhodných nádob, které zajistí takový poměr povrchu k výšce sloupce půdy, aby se do konce inkubační doby nezměnilo pohlcováním kyslíku barevně víc, než horní třetina půdy. Používá se validovaný postup sterilizace. Uchovává se při teplotě 2 °C až 25 °C ve sterilních, utěsněných nádobách, není-li určen a k okamžitému použití. Je-li třeba, regeneruje se půda těsně před použitím, např. 20 min zahříváním ve vodní lázni a rychlým ochlazením. Nesterilní vzduch se přitom nesmí dostat do nádoby.
Půda z hydrolyzátu sóji a kaseinu
Metoda A Metoda B Tab. 2.5.5-1 Zařízení Pracovní postup Ověření správnosti Opatření proti mikrobiálnímu znečištění Živné půdy pankreatický hydrolyzát kaseinu 17,0 g papainový hydrolyzát sóji 3,0 g chlorid sodný 5,0 g hydrogenfosforečnan draselný 2,5 g glukosa monohydrát 2,5 g voda R 1000 ml pH se upraví tak, aby po sterilizaci bylo 7,3 ± 0,2.
Pevné látky se za mírného zahřátí rozpustí ve vodě a roztok se ochladí na pokojovou teplotu. V případě potřeby se přidá hydroxid sodný 1 mol/l RS tak, aby roztok měl po sterilizaci pH 7,3 ± 0,2. Je-li třeba, filtruje se do vyjasnění, rozplní se do vhodných nádob a sterilizuje se validovaným postupem. Uchovává se při teplotě mezi 2 °C až 25 °C ve sterilních, utěsněných nádobách, pokud není určena pro okamžité použití.
Užité půdy, ať již ty výše popsané nebo jiné, vyhovují následujícím zkouškám provedeným před zkouškou zkoušeného přípravku nebo současně s ní.
Sterilita. Vzorky živné půdy se 14 dní inkubují při teplotách podle tabulky 2.6.1-1. Není pozorován růst mikroorganismů.
Růstová zkouška aerobních a anaerobních bakterií a hub. Části vybrané půdy se naočkují malým počtem jednoho typu mikroorganismu (10 až 100 jednotek vytvářejících kolonie), který je uveden v tabulce 2.6.1-1, a inkubují se za podmínek podle této tabulky nejdéle 3 dny v případě bakterií a nejdéle 5 dní v případě hub. Rody a kmeny uvedené v tabulce nejsou jediné, které lze použít; jiné mikroorganismy mohou být také vhodné.
Použije se metoda výchozí kultury (systému jednotné inokulace), takže živé mikroorganismy užité pro očkování nejsou vzdáleny o více než pět generací od původní výchozí kultury.
Půdy jsou vhodné tehdy, objeví-li se jasně viditelný časný růst mikroorganismů.
Validační zkouška
Pro každý typ mikroorganismu uvedený v tabulce 2.6.1-1 se provede zkouška, jak je popsáno dále v odstavci Zkouška na sterilitu zkoušeného přípravku. Užije se přesně stejná metoda s výjimkou následujících modifikací.
Membránová filtrace
Po převedení obsahu zkoušené nádoby nebo nádob na membránu se přidá inokulum malého množství živých mikroorganismů (je vhodné 10 až 100 jednotek vytvářejících kolonie) do poslední části sterilního promývacího roztoku.
Tab. 2.6.1-1 Mikroorganismy vhodné pro růstovou a validační zkoušku
Metoda A Metoda B Tab. 2.5.5-1 Zařízení Pracovní postup Ověření správnosti Opatření proti mikrobiálnímu znečištění Živné půdy Validační zkouška Membránová filtrace Tab. 2.6.1-1 Mikroorganismy vhodné pro růstovou a validační zkoušku Živná půda Mikroorganismus Inkubace druh doporučený kmen Teplota (°C) maximální doba Aerobní bakterie Pro všechny aeroby Staphylococcus aureus ATCC 6538P Thioglykolanová
půdaCIP 53,156 NCTC 7447 CCM 2022 CNCTC Mau 28/58 Bacillus subtilis ATCC 6633 CIP 52,62 32,5+ 2,5 3 dny NCIB 8054 CCM 1999 CNCTC Bs 8/58 Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 NCIMB 8626 CIP 82,118 CCM 1961 CNCTC Ps 37/65 Anaerobní bakterie Pro všechny anaeroby Clostridium sporogenes ATCC 19404 32,5 ± 2,5 3 dny CIP 79,3 CCM 4409 CNCTC Cl 66/79 Půda
z hydrolyzátů sóji a kaseinu*Houby Pro všechny houby Candida albicans ATCC 10231 IP 4872 22,5 ± 2,5 5 dní ATCC 2091 IP 1180,79 CCM 8226 CNCTC 55/79 Aspergillus niger ATCC 16404 CCM 8222 - *v této půdě se pomnožuje též Baccilus subtilis (ATCC 6633 nebo CIP 52,62)
Přímé očkování
Po převedení obsahu zkoušené nádoby nebo nádob do živné půdy se přidá inokulum malého množství živých mikroorganismů (je vhodné 10 až 100 jednotek vytvářejících kolonie).
V obou případech se provede růstová zkouška jako pozitivní kontrola. Všechny nádoby s živnou půdou se inkubují při teplotách podle tabulky 2.6.1-1 po dobu nejvýše 3 dnů pro bakterie a 5 dnů pro houby.
Dojde-li k jasně viditelnému časnému růstu, vizuálně srovnatelnému srůstem v kontrolních nádobkách bez zkoušeného přípravku, potom přípravek nemá v podmínkách zkoušky žádný protimikrobní účinek nebo takový účinek byl uspokojivě vyloučen. Zkouška na sterilitu se pak může provést bez dalších modifikací.
Nedojde-li v přítomnosti zkoušeného přípravku k jasně viditelnému časnému růstu, vizuálně srovnatelnému s růstem v kontrolních nádobkách bez zkoušeného přípravku, přípravek má protimikrobní účinek, který nebyl v podmínkách zkoušky uspokojivě vyloučen. Podmínky zkoušky se upraví tak, aby byl protimikrobní účinek odstraněn a zkouška se opakuje.
Tato validace se provádí:
- a) má-li se na sterilitu zkoušet nový přípravek,
- b) kdykoliv se změní experimentální podmínky zkoušky.
Validace se může provést současně se zkouškou na sterilitu zkoušeného přípravku, ale před hodnocením výsledku této zkoušky.
Zkouška na sterilitu zkoušeného přípravku
Zkouška se může provést metodou membránové filtrace nebo přímým očkováním zkoušeného přípravku do živné půdy. Vhodné negativní kontroly jsou obsaženy v každém případě. Všude tam, kde to povaha přípravku dovolí, tj. u filtrovatelných vodných, lihových nebo olejových přípravků, u přípravků mísitelných nebo rozpustných ve vodných nebo olejových rozpouštědlech, které samy v podmínkách zkoušky nemají žádný protimikrobní účinek, se použije metoda membránové filtrace.
Membránová filtrace
Použijí se membránové filtry s jmenovitou velikostí pórů nejvýše 0,45 μm, jejichž účinnost zadržet mikroorganismy byla ověřena. Filtry např. z dusičnanů celulosy se používají pro vodné, olejové a slabě lihové roztoky, filtry z octanu celulosy se používají pro silně lihové roztoky. Pro určité přípravky, např. antibiotika, mohou být zapotřebí speciální filtry.
Dále popsaná metoda je určena pro filtry o průměru 50 mm. Pokud se použijí filtry jiného průměru, měly by se jim přizpůsobit objemy zřeďovacího i promývacího roztoku. Filtrační přístroj a membránové filtry se sterilizují vhodnými postupy. Přístroj je upraven tak, aby zkoušený roztok mohl být do něho naplněn a filtrován za aseptických podmínek a aby umožnil vyjmutí membránového filtru a jeho přenesení do živné půdy nebo aby bylo možné provést inkubaci po přidání živné půdy do přístroje.
Vodné roztoky. Je-li to vhodné, přenese se na membránový filtr malé množství vhodné sterilní tekutiny, jako např. neutrální roztok masového nebo kaseinového peptonu (1g/l) o pH 7,1 ± 0,2, a zfiltruje se. Tekutina může obsahovat vhodné neutralizační anebo inaktivační látky, např. v případě antibiotik.
Na membránový filtr nebo filtry se přenese obsah zkoušené nádoby nebo nádob, a je-li třeba, zředí se na asi 100 ml vybraným sterilním rozpouštědlem, v každém případě se však použije nejméně množství předepsané v tabulce 2.6.1-2 a ihned se zfiltruje. Membránový filtr se nejméně třikrát stejnou rychlostí promyje vybraným sterilním rozpouštědlem, jehož množství je stejné jako při validační zkoušce. Membránový filtr se přenese do živné půdy nebo se asepticky rozdělí na dvě stejné části a každá z nich se přenese do vhodné půdy. Užije se stejný objem půdy jako při validační zkoušce. Lze též nalít půdu na membránu v přístroji. Pokud není předepsáno jinak, inkubují se půdy určené zejména k průkazu bakterií při teplotě 32,5 °C ± 2,5 °C a půdy určené zejména k průkazu hub při 22,5 °C ± 2,5 °C a to vždy nejméně 14 dní.
Rozpustné pevné látky. Na každou živnou půdu se použije nejméně podle tabulky 2.6.1-2 určené množství zkoušené látky, které se rozpustí ve vhodném rozpouštědle, jako např. neutrální roztok masového nebo kaseinového peptonu (1g/l), a dále se postupuje stejně jako u vodných roztoků za použití membránového filtru vhodného pro zvolené rozpustidlo.
Oleje a olejové roztoky. Na každou živnou půdu se použije nejméně podle tabulky 2.6.1-2 určené množství zkoušené látky. Oleje a olejové roztoky s dostatečně nízkou viskozitou se bez ředění filtrují přímo suchým membránovým filtrem. Viskózní oleje se mohou zředit vhodným sterilním ředidlem, jako je isopropylmyristat, u něhož je prokázáno, že v podmínkách zkoušky nemá protimikrobní účinky. Olej se nechá proniknout membránovým filtrem vlastní tíhou a tlak nebo sání se nastavuje postupně. Membránový filtr se promyje nejméně třikrát stejnou rychlostí asi 100 ml vhodného sterilního roztoku, jako je např. neutrální roztok masového nebo kaseinového peptonu (1g/l), obsahující 1 g/l (p-terc.oktylfenoxy)polyoxyethanol nebo 10 g/l polysorbátu 80. Membránový filtr nebo filtry se přenesou do živné půdy nebo živných půd nebo naopak se k nim půda přidá, jak je uvedeno u vodných roztoků, a inkubují se při stejných teplotách po stejnou dobu.
Masti a krémy. Na každou živnou půdu se použije množství přípravku uvedené v tabulce 2.6.1-2. Masti s hydrofobním základem a emulze typu v/o se mohou ředit až na 1% koncentraci isopropylmyristatem, jak je popsáno výše, a zahřívat, pokud je to nutné, na nejvýše 40 °C. Výjimečně je lze, pokud je to nutné, zahřát až na 44 °C. Zfiltruje se tak rychle, jak je to jen možné, a postupuje se, jak je popsáno u olejů a olejových roztoků.
Přímé očkování do živných půd
Do živné půdy se dá takové množství zkoušeného přípravku, jak je předepsáno v tabulce 2.6.1-2 tak, aby objem vzorku nečinil více než 10 % objemu živné půdy, není-li předepsáno jinak.
Olejové kapaliny. Použijí se živné půdy, k nimž se přidá roztok polysorbátu 80 (10 g/l) nebo (p-terc.oktylfenoxy)polyoxyethanol (1 g/l) nebo jiné emulgující látky ve vhodné koncentraci, u níž bylo prokázáno, že v podmínkách zkoušky nemá protimikrobní účinek.
Masti a krémy. Zředí se v poměru 1 : 10 vhodným emulgátorem ve sterilním rozpouštědle, např. neutrálním roztoku masového nebo kaseinového peptonu (1 g/l). Zředěný přípravek se očkuje do živné půdy, která neobsahuje emulgující látku.
Má-li zkoušený přípravek protimikrobní účinky, provede se zkouška po neutralizaci vhodnou neutralizační látkou nebo po zředění dostatečným množstvím živné půdy. Je-li nutné použít větší objem přípravku, lze dát přednost použití koncentrované živné půdy připravené tak, aby se dosáhlo potřebného zředění. V některých případech lze koncentrovanou živnou půdu přímo přidat k přípravku v jeho obalu.
Pokud není předepsáno jinak, inkubují se naočkované půdy nejméně 14 dní při teplotách uvedených v tabulce 2.6.1-1. V průběhu inkubace se půdy několikrát prohlížejí. Půdy s olejovými přípravky se každý den opatrně protřepou. Pokud se však použije k důkazu anaerobů thioglykolanová nebo jí podobná půda, je nutno omezit třepání nebo míchání na minimum, aby byly zachovány anaerobní podmínky.
Odečítání a hodnocení výsledků
V živných půdách se v průběhu a na závěr inkubace makroskopicky zjišťuje případný růst mikrobů. Jestliže zkoušený přípravek způsobí zakalení živné půdy, takže nelze určit přítomnost nebo absenci mikrobiálního růstu vizuálně po 14 dnech od začátku inkubace, přenese se vhodná část živné půdy do nové nádobky se stejnou živnou půdou. Pokračuje se v inkubaci původního i nového vzorku nejméně 14 + 7 dní od původního očkování.
Jestliže není pozorován žádný růst, vyhovuje zkoušený přípravek zkoušce na sterilitu. Je-li zjištěn růst, přípravek nevyhovuje zkoušce na sterilitu, pokud nelze jasně prokázat, že zkouška byla neplatná z důvodů, jež se nevztahují na zkoušený přípravek. Zkouška může být považována za neplatnou, je-li splněna jedna nebo více z následujících podmínek:
- a) údaje o mikrobiologické kontrole prostředí, ve kterém jsou prováděny zkoušky na sterilitu, odhalí chybu,
- b) prověření testovacího postupu užitého během předmětné zkoušky odhalí chybu,
- c) mikrobiální růst se objeví v negativních kontrolách,
- d) po identifikaci mikroorganismů izolovaných zkouškou může být růst tohoto nebo těchto druhů jednoznačně připsán chybám materiálu nebo metody užitých při provádění zkoušky na sterilitu.
Je-li zkouška prohlášena za neplatnou, opakuje se se stejným množstvím jednotek jako původní zkouška.
Jestliže při opakování zkoušky není pozorován žádný růst, vyhovuje zkoušený přípravek zkoušce na sterilitu. Je-li při opakované zkoušce zjištěn růst, přípravek nevyhovuje zkoušce na sterilitu.
Postup zkoušky pro parenterální, oční a jiné neinjekční přípravky, u nichž je požadována sterilita
Pokud se použije metoda membránové filtrace, zkouší se, pokud možno, celý obsah nádoby, ale nejméně množství uvedené v tabulce 2.6.1-2. Je-li třeba, zředí se asi na 100 ml vhodným sterilním roztokem, např. neutrálním roztokem masového nebo kaseinového peptonu (1 g/l). Celkový objem filtrovaný jedním filtrem nepřesahuje 1000 ml, není-li uvedeno a schváleno jinak.
Použije-li se metoda přímého očkování do živné půdy, očkuje se množství podle tabulky 2.6.1-2. Zkoušky na bakteriální a houbovou sterilitu se provádějí se stejným vzorkem zkoušeného přípravku. Pokud objem nebo množství v jedné nádobě nestačí k provedení obou zkoušek, použije se obsah dvou nebo více nádob k naočkování různých půd.
Je-li obsah přípravku v obalu větší než 100 ml, použije se membránová metoda, není-li uvedeno a schváleno jinak
Tab. 2.6.1-2 Zkouška na sterilitu – množství zkoušeného přípravku
Metoda A Metoda B Tab. 2.5.5-1 Zařízení Pracovní postup Ověření správnosti Opatření proti mikrobiálnímu znečištění Živné půdy Validační zkouška Membránová filtrace Tab. 2.6.1-1 Mikroorganismy vhodné pro růstovou a validační zkoušku Přímé očkování Zkouška na sterilitu zkoušeného přípravku Membránová filtrace Přímé očkování do živných půd Odečítání a hodnocení výsledků Postup zkoušky pro parenterální, oční a jiné neinjekční přípravky, u nichž je požadována sterilita Tab. 2.6.1-2 Zkouška na sterilitu – množství zkoušeného přípravku Typ přípravku Množství v obalu Minimální množství, které se použije pro každou půdu, není-li uvedeno a schváleno jinak Parenterální přípravky Tekutiny - méně než 1 ml celý obsah obalu polovina obalu, ale nejvýše 20 ml - 1 ml a více Pevé látky - méně než 50 mg celý obsah obalu - více než 50 mg, ale méně než 300 mg polovina obalu 150 mg - 300 mg a více Oční přípravky, ostatní neinjekční přípravky Vodné roztoky celý obsah jednoho nebo více obalů, nejméně 2,5 ml Ostatní přípravky rozpustné ve vodě nebo isopropylmyristatu celý obsah jednoho nebo více obalů, nejméně 0,25 g Nerozpustné přípravky, krémy a masti, jež je nutno suspendovat nebo emulgovat celý obsah jednoho nebo více obalů, nejméně 0,25 g Pokyny k použití zkoušky na sterilitu
Účel zkoušky na sterilitu, jako ostatně všech lékopisných zkoušek, je poskytnout nezávislému kontrolujícímu analytikovi prostředky k ověření, že jednotlivý materiál splňuje požadavky lékopisu. Výrobci nejsou povinni provádět takové zkoušky, ani vyloučit užití modifikací nebo alternativ popsaných metod za předpokladu, že jsou přesvědčeni o tom, že bude-li přípravek zkoušen oficiálními metodami, vyhoví požadavkům lékopisu.
Pokyny pro výrobce
Stupeň jistoty získaný uspokojivým výsledkem zkoušky na sterilitu (nepřítomnost kontaminovaných jednotek ve vzorku) a vztažený na kvalitu celé šarže, je funkcí stejnorodosti podmínek výroby a efektivnosti přijatého systému odebírání vzorků. Pro účely tohoto textu je šarže definována jako homogenní soubor těsně uzavřených obalů připravených takovým způsobem, že riziko kontaminace je stejné pro každou jednotku v tomto souboru obsaženou.
Pokud se přípravek sterilizuje v uzavřených konečných obalech, vyšší stupeň záruky než provedení zkoušky na sterilitu poskytuje sledování správného průběhu sterilizace celé šarže pomocí měření a automatického zaznamenávání hodnot biologicky opodstatněných fyzikálních parametrů. Podmínky, za kterých může být považováno za vhodné parametrické uvolnění, jsou popsány ve stati 5.1.1-Metody přípravy sterilních přípravků. Pro vyhodnocení postupu aseptické výroby může být použita metoda, při níž se tento postup napodobí za použití živných půd. Nehledě k tomu, že zkouška na sterilitu je jediná analytická metoda použitelná pro přípravky vyrobené v aseptických podmínkách, je to dále v každém případě jediná dostupná analytická metoda pro autority, které mají vzorky přípravků zkoušet na sterilitu.
Pravděpodobnost detekce mikroorganismů zkouškou na sterilitu roste s jejich počtem ve zkoušeném vzorku a kolísá podle schopnosti růstu přítomných mikroorganismů. Pravděpodobnost odhalení velmi nízkého stupně kontaminace, i když je homogenní v celé šarži, je velmi malá. Interpretace výsledků zkoušky na sterilitu se opírá o předpoklad, že obsahy všech obalů v šarži, pokud by byly zkoušeny, daly by stejný výsledek. Jelikož je zřejmé, že každý obal nemůže být zkoušen, je třeba přijmout vhodný plán odběru vzorků. Vodítko pro minimální počet jednotek doporučených ke zkoušení ve vztahu k velikosti šarže je v tabulce 2.6.1-3 a vychází z předpokladu, že přípravek byl vyroben za podmínek určených k vyloučení kontaminace. Aplikace doporučení musí brát ohled na objem přípravku v obalu, na validaci sterilizační metody a na jiné speciální zřetele týkající se sterility přípravku.
Tab. 2.6.1.-3 Doporučený nejmenší počet jednotek pro zkoušku na sterilitu
Metoda A Metoda B Tab. 2.5.5-1 Zařízení Pracovní postup Ověření správnosti Opatření proti mikrobiálnímu znečištění Živné půdy Validační zkouška Membránová filtrace Tab. 2.6.1-1 Mikroorganismy vhodné pro růstovou a validační zkoušku Přímé očkování Zkouška na sterilitu zkoušeného přípravku Membránová filtrace Přímé očkování do živných půd Odečítání a hodnocení výsledků Postup zkoušky pro parenterální, oční a jiné neinjekční přípravky, u nichž je požadována sterilita Tab. 2.6.1-2 Zkouška na sterilitu – množství zkoušeného přípravku Pokyny k použití zkoušky na sterilitu Pokyny pro výrobce Tab. 2.6.1.-3 Doporučený nejmenší počet jednotek pro zkoušku na sterilitu Počet jednotek v šarži Nejmenší počet jednotek pro zkoušku na sterilitu pro každou půdu (*) Parenterální přípravky - nejvýše 100 obalů 10 % nebo 4 obaly – podle toho, co je více - více než 100, méně než 500 obalů 10 obalů - více než 500 obalů 2 % nebo 20 obalů – podle toho, co je méně Oční přípravky a ostatní neinjekční přípravky - nejvýše 200 obalů 5 % nebo 2 obaly – podle toho, co je více - více než 200 obalů 10 obalů Je-li přípravek v jednodávkovém obalu, použije se tabulka pro parenterální přípravky Nerozplněné pevné přípravky - do 4 obalů každý obal - více než 4, méně než 50 obalů 20 % nebo 4 obaly – podle toho, co je více - více než 50 obalů 2 % nebo 10 obalů – podle toho, co je více - (*) Stačí-li obsah jednoho obalu k inokulaci dvou půd, pak tento sloupec udává počet obalů potřebných pro obě půdy dohromady
Metoda A Metoda B Tab. 2.5.5-1 Zařízení Pracovní postup Ověření správnosti Opatření proti mikrobiálnímu znečištění Živné půdy Validační zkouška Membránová filtrace Tab. 2.6.1-1 Mikroorganismy vhodné pro růstovou a validační zkoušku Přímé očkování Zkouška na sterilitu zkoušeného přípravku Membránová filtrace Přímé očkování do živných půd Odečítání a hodnocení výsledků Postup zkoušky pro parenterální, oční a jiné neinjekční přípravky, u nichž je požadována sterilita Tab. 2.6.1-2 Zkouška na sterilitu – množství zkoušeného přípravku Pokyny k použití zkoušky na sterilitu Pokyny pro výrobce Tab. 2.6.1.-3 Doporučený nejmenší počet jednotek pro zkoušku na sterilitu 2.6.2 Mykobakterie Podstata zkoušky. Nepřítomnost mykobakterií se zjišťuje kultivací ve vhodných živných půdách.
Postup zkoušky. Je-li zkoušený vzorek kontaminován jinými mikroorganismy, než jsou mykobakterie, ošetří se vhodným dekontaminačním roztokem, jako je např. roztok acetylcysteinu s hydroxidem sodným nebo roztok laurylsíranu sodného.
Na dvě vhodné pevné půdy (za vhodnou se považuje Löwenstein-Jensenova půda a Middle-brookova 7H10 půda) se trojmo naočkuje po 0,2 ml vzorku a dále se do vhodné tekuté půdy trojmo naočkuje po 0,5 ml vzorku. Všechny půdy se inkubují 56 dnů při 37 °C.
Růstové vlastnosti živných půd v přítomnosti zkoušeného přípravku se ověří naočkováním vhodného kmene Mycobacterium tuberculosis, jako je např. BCG, a je-li třeba, použije se vhodná neutralizační látka.
Jestliže v prvních osmi dnech inkubace vyrostou kolonie kontaminujících mikroorganismů, zkouška se opakuje a zároveň se provede bakteriologická zkouška na sterilitu.
Přípravek vyhovuje zkoušce, jestliže se na konci inkubační doby nezjistí nárůst mykobakterií v žádné zkumavce
Metoda A Metoda B Tab. 2.5.5-1 Zařízení Pracovní postup Ověření správnosti Opatření proti mikrobiálnímu znečištění Živné půdy Validační zkouška Membránová filtrace Tab. 2.6.1-1 Mikroorganismy vhodné pro růstovou a validační zkoušku Přímé očkování Zkouška na sterilitu zkoušeného přípravku Membránová filtrace Přímé očkování do živných půd Odečítání a hodnocení výsledků Postup zkoušky pro parenterální, oční a jiné neinjekční přípravky, u nichž je požadována sterilita Tab. 2.6.1-2 Zkouška na sterilitu – množství zkoušeného přípravku Pokyny k použití zkoušky na sterilitu Pokyny pro výrobce Tab. 2.6.1.-3 Doporučený nejmenší počet jednotek pro zkoušku na sterilitu 2.6.7 Zkouška na mykoplazmata Tam, kde je předepsána zkouška na mykoplazmata pro banku základních buněk, banku pracovních buněk, výchozí kulturu viru nebo kontrolní buňky, použije se metoda kultivační a metoda imunofluorescence v buněčné kultuře. Tam, kde je předepsána zkouška na mykoplazmata pro virovou sklizeň ve vakcíně před rozplněním nebo v šarži, použije se kultivační metoda. Metoda imunofluorescence v buněčné kultuře se může také použít, je-li třeba, k ověření půd.
KULTIVAČNÍ METODA
Výběr kultivačních půd
Zkouška se provádí za použití dostatečného počtu jak pevných, tak tekutých živných půd, aby se za vybraných podmínek inkubace zajistil růst malých počtů mykoplazmat, která mohou být přítomna ve zkoušeném přípravku.
Tekuté živné půdy obsahují fenolovou červeň. Vybrané druhy živných půd mají prokazatelně dostatečné živné vlastnosti nejméně pro organismy uvedené dále. Živné vlastnosti každé nové šarže živné půdy jsou ověřovány pro příslušné organismy uvedené na seznamu.
Acholeplasma laidlawii (vakcíny pro humánní a veterinární použití, při jejichž výrobě byla použita antibiotika)
Mycoplasma gallisepticum (kde se při výrobě použil materiál ptačího původu nebo kde vakcína je určena pro drůbež)
Mycoplasma hyorhinis (neaviární veterinární vakcíny)
Mycoplasma orale (vakcíny pro humánní a veterinární užití)
Mycoplasma pneumoniae (vakcíny pro humánní užití) nebo jiný vhodný druh, fermentující glukózu
Mycoplasma synoviae (kde se při výrobě použil materiál ptačího původu nebo kde vakcína je určena pro drůbež)
Zkušební kmeny jsou izoláty z terénu, které neprošly více než patnácti subkultivacemi a jsou uchovávány zmrazené nebo v lyofilizovaném stavu.
Po klonování se kmeny identifikují jako požadované druhy vhodnou metodou, porovnáním se sbírkovými kulturami např.:
Metoda A Metoda B Tab. 2.5.5-1 Zařízení Pracovní postup Ověření správnosti Opatření proti mikrobiálnímu znečištění Živné půdy Validační zkouška Membránová filtrace Tab. 2.6.1-1 Mikroorganismy vhodné pro růstovou a validační zkoušku Přímé očkování Zkouška na sterilitu zkoušeného přípravku Membránová filtrace Přímé očkování do živných půd Odečítání a hodnocení výsledků Postup zkoušky pro parenterální, oční a jiné neinjekční přípravky, u nichž je požadována sterilita Tab. 2.6.1-2 Zkouška na sterilitu – množství zkoušeného přípravku Pokyny k použití zkoušky na sterilitu Pokyny pro výrobce Tab. 2.6.1.-3 Doporučený nejmenší počet jednotek pro zkoušku na sterilitu KULTIVAČNÍ METODA Výběr kultivačních půd Acholeplasma laidlawii NCTC 10116 CIP 75,27 ATCC 23206 Mycoplasma gallisepticum NCTC 10115 CIP 104967 ATCC 19610 Mycoplasma hyorhinis NCTC 10130 CIP 104968 ATCC 17981 Mycoplasma orale NCTC 10112 CIP 104969 ATCC 23714 Mycoplasma pneumoniae NCTC 10119 CIP 103766 ATCC 15531 Mycoplasma synoviae NCTC 10124 CIP 104970 ATCC 25204 Inkubační podmínky
Naočkovaná živná půda se rozdělí na dvě stejné části a jedna část se inkubuje za aerobních a druhá část za mikroaerofílních podmínek; pevné živné půdy se udržují v atmosféře s patřičnou vlhkostí, aby se zamezilo vysychání povrchu půd. Za aerobních podmínek se inkubuje v atmosféře vzduchu s odpovídající vlhkostí a obsahující pro pevné půdy 5 % až 10 % oxidu uhličitého. Za mikroaerofilních podmínek se inkubuje v dusíkové atmosféře, obsahující pro pevné půdy 5 % až 10 % oxidu uhličitého.
Živné vlastnosti
S každou novou šarži živé půdy se provede zkouška živných vlastnosti. Vybraná živná půda se naočkuje vhodnými zkušebními mikroorganismy; použije se nejvýše 100 jednotek vytvářejících kolonie na misku o průměru 60 mm obsahující 9 ml pevné živné půdy a nejvýše 40 jednotek vytvářejících kolonie pro 100ml nádobu s odpovídající tekutou půdou; pro každý druh organismu se použije samostatná plotna a nádoba. Živné půdy se inkubují za podmínek, které budou použity ke zkoušce zkoušeného výrobku (aerobní, mikroaerofilní nebo obojí, v závislosti na požadavcích zkušebního organismu). Půdy vyhovují zkoušce na živné vlastnosti, dojde-li k přiměřenému růstu zkušebních organismů doprovázenému příslušnou barevnou změnou v tekutých živných půdách.
Inhibiční látky
Zkouška na živné vlastnosti se provede v přítomnosti zkoušeného přípravku. Je-li růst zkušebních organismů zřetelně menší než ten, který byl zjištěn bez přítomnosti zkoušeného přípravku, přípravek obsahuje inhibiční látky, které se před provedením zkoušky na mykoplazmata neutralizují (nebo se jejich účinek vyloučí jinak např. ředěním). Účinnost neutralizace nebo jiného postupu se kontroluje opakováním zkoušky na inhibiční látky po neutralizaci.
Zkouška na mykoplazmata ve zkoušeném přípravku
Pro pevné živné půdy se použijí misky o průměru 60 mm a obsahující 9 ml půdy. Každá z nejméně dvou misek s každou pevnou půdou se naočkuje 0,2 ml zkoušeného přípravku a 100 ml každé tekuté půdy se naočkuje 10 ml zkoušeného přípravku. Inkubuje se 21 dní při 35 °C až 38 °C za aerobních a mikroaerofilních podmínek a současně se jako kontrola inkubuje nenaočkovaná dávka 100 ml každé tekuté živné půdy. Objeví-li se po přidání zkoušeného přípravku jakékoliv významné změny pH, původní hodnota pH se obnoví přidáním roztoku bud’ hydroxidu sodného, nebo kyseliny chlorovodíkové. První, druhý nebo třetí den po naočkování se vyočkuje po 0,2 ml z každé tekuté půdy na dvě misky s každou pevnou půdou a inkubuje se nejméně 21 dní při 35 °C až 38 °C za aerobních a mikroaerofilních podmínek. Postup se opakuje šestý, sedmý nebo osmý den a znovu třináctý nebo čtrnáctý den zkoušky. Tekuté živné půdy se prohlížejí každý druhý nebo třetí den, a objeví-li se změna barvy, okamžitě se přeočkují. Pevné živné půdy se prohlížejí jednou týdně.
Jestliže jsou tekuté živné půdy kontaminovány bakteriemi nebo houbami, zkouška se opakuje. Jestliže nejdříve za sedm dní po naočkování je nejvýše jedna miska v každé části zkoušky náhodně kontaminována bakteriemi nebo houbami nebo zničena, vyloučí se tato miska za předpokladu, že se při bezprostředním vyšetření neprokáže růst mykoplazmat. Pokud je v kterékoliv části v průběhu zkoušky více než jedna miska náhodně kontaminována bakteriemi nebo houbami nebo rozbita, je zkouška neplatná a opakuje se.
Do zkoušky se zařadí pozitivní kontrola připravená naočkováním nejvýše 100 jednotek vytvářejících kolonie vhodného druhu, jako M. orale a M. pneumoniae.
Na konci inkubační doby se všechny pevné naočkované půdy mikroskopicky vyšetří na přítomnost mykoplazmat.
Přípravek vyhovuje zkoušce, nezjistí-li se růst mykoplazmat v žádné z naočkovaných půd. Zjistí-li se růst mykoplazmat, zkouška se může opakovat s použitím dvojnásobného množství inokula, půd a misek. Nezjistí-li se růst mykoplazmat, přípravek vyhovuje zkoušce. Zkouška není platná, jestliže pozitivní kontrola neprokáže růst zkušebního mikroorganismu.
Metoda imunofluorescence v buněčné kultuře
Buněčné kultury se obarví fluorescenčním barvivem, které se váže na DNK. Mykoplazmata se zjistí pomocí fluorescence jejich charakteristických částic nebo nitkovitých útvarů na povrchu buněk, a jestliže je kontaminace silná, i v okolním prostředí.
Ověření substrátu
Jako substrát se použije kultura buněk Vero, předem odzkoušená pomocí inokula, které neobsahuje více než 100 jednotek vytvářejících kolonie kmene rostoucího dobře v tekuté nebo pevné půdě a dokáže se schopnost metody prokázat případnou kontaminaci mykoplazmaty, např. vhodnými kmeny Mycoplasma hyorhinis a Mycoplasma orale. Mohou se použít různé buněčné substráty, např. produkční buněčná linie, jestliže se prokázalo, že poskytne přinejmenším stejnou citlivost pro důkaz možné kontaminace mykoplazmaty.
Zkušební metoda
