Vyhláška Ministerstva zdravotnictví, kterou se mění vyhláška Ministerstva zdravotnictví č. 1/1998 Sb., kterou se stanoví požadavky na jakost, postup při přípravě, zkoušení, uchovávání a dávkování léčiv (Český lékopis 1997)

Na vrstvu se nanese po 10 μl každého roztoku a vyvíjí se směsí objemových dílů amoniaku 26% R, ethylacetatu R, vody R a 1-propanolu R (5+ 10+10 + 75) po dráze 15 cm. Vrstva se usuší v proudu teplého vzduchu a potom se postříká jodobismutitanem draselným zředěným RS. Na chromatogramu zkoušeného roztoku (a) žádná skvrna, kromě hlavní skvrny, není intenzivnější než skvrna na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) (0,2 %). Zkoušku lze hodnotit, jestliže na chromatogramu porovnávacího roztoku (c) jsou dvě zřetelně oddělené skvrny.

Ztráta sušením (2.2.32). Nejvýše 1,0 %; 1,000 g se suší v sušárně při 100 °C až 105 °C.

Síranový popel (2.4.14). Nejvýše 0,1 %; stanoví se s 1,00 g zkoušené látky.

Stanovení obsahu

0,300 g se rozpustí ve směsi 5,0 ml kyseliny chlorovodíkové 0,01 mol/l KS a 50 ml lihu 96% R a titruje se hydroxidem sodným 0,1 mol/l VS za potenciometrické indikace bodu ekvivalence (2.2.20) do druhé inflexe.

1 ml hydroxidu sodného 0,1 mol/l VS odpovídá 34,60 mg C₁₉H₃₆ClNO₂.

Uchovávání

V dobře uzavřených obalech.

Separandum.

Nečistoty

1. A. kyselina 1-bicyklohexylkarboxylová.

Diethylenglycoli monoethylicum etherum

Diethylenglykolmonoethylether

Synonymum. Diethylenglycoli monoethylicum aetherum

Je to 2-(2-ethoxyethoxy)ethanol. Obsahuje 99,0 % až 101,0 % sloučeniny C₆H₁₄O₃. Vyrábí se kondenzací ethylenoxidu s ethanolem a následnou destilací.

Vlastnosti

Čirá bezbarvá hygroskopická kapalina. Je mísitelný s vodou, s acetonem a s liliem 96%, v určitých poměrech s rostlinnými oleji, nemísitelný s minerálními oleji.

Relativní hustota je asi 0,991.

Zkoušky totožnosti

1. A. Index lomu (2.2.6). 1,426 až 1,428.
2. B. Infračervené absorpční spektrum (2.2.24) zkoušené látky se shoduje se spektrem diethylenglykolmonoethyletheru CRL. Zkoušená látka i referenční látka se měří mezi dvěma destičkami z bromidu draselného R.
3. C. Hodnotí se chromatogramy získané ve Stanovení obsahu. Retenční čas a velikost hlavního píku na chromatogramu zkoušeného roztoku se shodují s hlavním píkem na chromatogramu porovnávacího roztoku.

Zkoušky na čistotu

Číslo kyselosti (2.5.1). Nejvýše 0,1; 30,0 ml se rozpustí ve 30 ml lihu 96% R předem zneutralizovaného hydroxidem draselným 0,1 mol/l VS za použití fenolftaleinu RS jako indikátoru. Titruje se hydroxidem draselným v lihu 0,01 mol/l VS.

Číslo peroxidové (2.5.5). Nejvýše 8,0; stanoví se s 2,00 g zkoušené látky.

Ethoxyethanol, ethylenglykol a diethylenglykol. Nejvýše 0,20 % ethoxyethanolu a nejvýše 0,50 % součtu obsahů ethylenglykolu a diethylenglykolu. Stanoví se plynovou chromatografií (2.2.28), popsanou ve Stanovení obsahu.

Nastříkne se 0,1 μl porovnávacího roztoku (a). Při zaznamenání chromatogramů za předepsaných podmínek jsou retenční časy: ethoxyethanolu asi 1 min, ethylenglykolu asi 7 min a diethylenglykolu asi 14 min.

Nastříkne se 0,1 μl zkoušeného roztoku. Vypočte se obsah ethoxyethanolu, ethylenglykolu a diethylenglykolu v procentech metodou vnitřní normalizace.

Zbytkový ethylenoxid (2.4.25). Nejvýše 1 μg/g.

Voda, semimikrostanovení (2.5.12). Nejvýše 0,1 %; stanoví se s 10,00 g zkoušené látky.

Stanovení obsahu

Provede se plynová chromatografie (2.2.28).

Zkoušený roztok. Zkoušená látka.

Porovnávací roztok (a). 0,10 g diethylenglykolu R, 0,10 g ethylenglykolu R a 0,10 g ethoxyethanolu R se rozpustí v methanolu R a zředí se jím na 100,0 ml.

Porovnávací roztok (b). Diethylenglykolmonoethylether CRL.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

1. - křemenné kapilární kolony délky 15 m a vnitřního průměru 0,53 mm, s vnitřními stěnami pokrytými 0,5 μm vrstvou makrogolu 20 000 2-nitrotereftalatu R,
2. - dusíku pro chromatografii R jako nosného plynu při průtokové rychlosti 2 ml/min,
3. - plamenoionizačního detektoru.

Teplota kolony se zvyšuje z 60 °C na 200 °C rychlostí 5 °C/min, teplota nástřikového prostoru se udržuje na 240 °C a teplota detektoru na 250 °C.

Nastříkne se 0,1 μl zkoušeného roztoku a z ploch píků na získaném chromatogramu se vypočte metodou vnitřní normalizace obsah C₆H₁₄O₃.

Uchovávání

Ve vzduchotěsných obalech v atmosféře inertního plynu a při teplotě nepřevyšující 35 °C.

Označování

V označení na obalu se uvede, že látka je uchovávána v atmosféře inertního plynu.

†† Digitoxinum

Digitoxin

Je to 3β-[(0-2,6-dideoxy-β-D-ribo-hexapyranosyl-(1→4)-O-2,6-dideoxy-β-D-ribo-hexapyrano- syl-(1→4)-2,6-dideoxy-β-D-ribo-hexapyranosyl)oxy]-14-hydroxy-5β,14β-kard-20(22)-enolid. Počítáno na vysušenou látku, obsahuje 95,0 % až 103,0 % sloučeniny C₄₁H₆₄O₁₃.

Vlastnosti

Bílý nebo téměř bílý prášek. Je prakticky nerozpustný ve vodě, snadno rozpustný ve směsi stejných objemových dílů chloroformu a methanolu, těžce rozpustný v lihu 96% a v methanolu.

Zkoušky totožnosti

Základní sestava zkoušek: A.

Alternativní sestava zkoušek: B, C a D, viz Obecné zásady (1.2).

1. A. Infračervené absorpční spektrum (2.2.24) zkoušené látky se shoduje se spektrem digitoxinu CRL.
2. B. Hodnotí se chromatogramy získané ve zkoušce Příbuzné látky, viz Zkoušky na čistotu. Hlavní skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku odpovídá polohou, barvou a velikostí hlavní skvrně na chromatogramu porovnávacího roztoku (a).
3. C. Asi 0,5 mg se suspenduje v 0,2 ml lihu 60% (V/V) R. Přidá se 0,1 ml kyseliny dinitrobenzoové RS a 0,1 ml hydroxidu sodného zředěného RS; vzniká fialové zbarvení.
4. D. Asi 0,5 mg se rozpustí opatrným zahřátím v 1 ml kyseliny octové ledové R, nechá se ochladit a přidá se 0,05 ml chloridu železitého RS1. Na tento roztok se opatrně navrství 1 ml kyseliny sírové R tak, aby nedošlo k promíchání obou vrstev, a nechá se stát. Na styku obou tekutin vznikne hnědý prstenec, který stáním přechází na zelené a pak na modré zbarvení, jež prolínají do horní vrstvy.

Zkoušky na čistotu

Vzhled roztoku. 50 mg se rozpustí ve směsi stejných objemových dílů chloroformu R a methanolu R a zředí se stejnou směsí na 10 ml. Roztok je čirý (2.2.1) a bezbarvý (2.2.2, Metoda I).

Specifická optická otáčivost (2.2.7). +16,0° až +18,5°; měří se roztok připravený rozpuštěním 0,25 g v chloroformu R a zředěním stejným rozpouštědlem na 10,0 ml.

Příbuzné látky. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití vrstvy silikagelu G R.

Zkoušený roztok. 20 mg se rozpustí ve směsi stejných objemových dílů chloroformu R a methanolu R a zředí se stejnou směsí na 2 ml.

Porovnávací roztok (a). 20 mg digitoxinu CRL se rozpustí ve směsi stejných objemových dílů chloroformu R a methanolu R a zředí se stejnou směsí na 2 ml.

Porovnávací roztok (b). 0,5 ml porovnávacího roztoku (a) se zředí směsí stejných objemových dílů chloroformu R a methanolu R na 50 ml.

Porovnávací roztok (c). 10 mg gitoxinu CRL se mícháním rozpustí ve směsi stejných objemových dílů chloroformu R a methanolu R a zředí se stejnou směsí na 50 ml.

Porovnávací roztok (d). 1 ml porovnávacího roztoku (b) se zředí směsí stejných objemových dílů chloroformu R a methanolu R na 2 ml.

Porovnávací roztok (e). 1 ml porovnávacího roztoku (a) a 1 ml porovnávacího roztoku (c) se smíchají.

Na vrstvu se odděleně nanese po 5 μl každého roztoku a ihned se vyvíjí směsí objemových dílů methanolu R, cyklohexanu R a chloroformu R (15 + 40 + 90) po dráze 15 cm. Vrstva se suší 5 min v proudu studeného vzduchu a vyvíjení se opakuje. Vrstva se 5 min suší v proudu studeného vzduchu, postříká se směsí objemových dílů kyseliny sírové R a lihu 96% R (1+9), 15 min se zahřívá při 130 °C a pozoruje se v denním světle.

Gitoxin. Skvrna odpovídající gitoxinu na chromatogramu zkoušeného roztoku není intenzivnější než skvrna na chromatogramu porovnávacího roztoku (c) (2,0 %).

Jiné glykosidy. Žádná skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku, kromě hlavní skvrny a skvrny odpovídající gitoxinu, není intenzivnější než skvrna na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) (1 %).

Zkoušku lze hodnotit, jestliže na chromatogramu porovnávacího roztoku (e) jsou zřetelně oddělené skvrny odpovídající digitoxinu, gitoxinu a jiným glykosidům a skvrna na chromatogramu porovnávacího roztoku (d) je zřetelně viditelná.

Ztráta sušením (2.2.32). Nejvýše 1,5 %; 0,500 g se suší 2 h v sušárně při 100 °C až 105 °C.

Síranový popel (2.4.14). Nejvýše 0,1 %; stanoví se se zbytkem získaným ve zkoušce Ztráta sušením.

Stanovení obsahu

40,0 mg se rozpustí v lihu 96% R a zředí se jím na 50,0 ml. 5,0 ml tohoto roztoku se zředí lihem 96% R na 100,0 ml. Současně za stejných podmínek se připraví porovnávací roztok za použití 40,0 mg digitoxinu CRL. K 5,0 ml obou roztoků se přidají 3,0 ml trinitrofenolatu sodného RS a nechá se 30 min stát za chránění před světlem. Měří se absorbance (2.2.25) obou roztoků v maximu při 495 nm proti současně připravenému kontrolnímu roztoku, kterým je směs 5,0 ml lihu 96% R a 3,0 ml trinitrofenolatu sodného RS.

Obsah C₄₁H₅₄O₁₃ se vypočítá ze zjištěných absorbancí a koncentrací roztoků.

Uchovávání

V dobře uzavřených obalech, chráněn před světlem.

Venenum.

† Dihydralazini sulfas dihemihydricus

Dihemihydrát dihydralaziniumsulfatu

Synonymum. Dihydralazini sulfas hydricus

Je to dihemihydrát 2,2̕-(1,4-ftalazmdiyl)di[hydrazinium(1+)]sulfatu. Počítáno na vysušenou látku, obsahuje 98,0 % až 102,0 % sloučeniny C₃H₁₂N₆O₄S.

Vlastnosti

Bílý nebo slabě žlutý krystalický prášek. Je těžce rozpustný ve vodě, prakticky nerozpustný v ethanolu. Rozpouští se ve zředěných minerálních kyselinách.

Zkoušky totožnosti

1. A. Infračervené absorpční spektrum (2.2.24) zkoušené látky se shoduje s referenčním spektrem Ph. Eur. pro dihemihydrát dihydralaziniumsulfatu.
2. B. Asi 50 mg se rozpustí v 5 ml kyseliny chlorovodíkově zředěné RS. Roztok vyhovuje zkoušce (a) na sírany (2.3.1).

Zkoušky na čistotu

Vzhled roztoku. 0,20 g se rozpustí v kyselině dusičné zředěné RS a zředí se jí na 10 ml. Roztok je čirý (2.2.1) a není zbarven intenzivněji než porovnávací barevný roztok HŽ₆ (2.2.2, Metoda II).

Příbuzné látky. Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29).

Roztoky se připraví bezprostředně před použitím.

Zkoušený roztok. 50,0 mg se rozpustí v roztoku kyseliny octové ledové R (6 g/l) a zředí se jím na 50,0 ml.

Porovnávací roztok (a). 1,0 ml zkoušeného roztoku se zředí mobilní fází obsahující edetan disodnýR (0,5 g/l) na 100,0 ml. 1,0 ml tohoto roztoku se zředí mobilní fází obsahující edetan disodnýR (0,5 g/l) na 10,0 ml.

Porovnávací roztok (b). 10,0 mg dihydralazinu nečistoty A CRL se rozpustí v mobilní fázi obsahující edetan disodný R (0,5 g/l) a zředí se jí na 50,0 ml. 2,0 ml tohoto roztoku se zředí mobilní fází obsahující edetan disodný R (0,5 g/l) na 20,0 ml.

Porovnávací roztok (c). 2 ml zkoušeného roztoku se zředí mobilní fází obsahující edetan disodný R (0,5 g/l) na 10 ml. 1 ml tohoto roztoku se zředí porovnávacím roztokem (b) na 10 ml.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

1. - nerezové ocelové kolony délky 0,25 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné silikagelem nitrilovaným pro chromatografii R (5 μm až 10 μm),
2. - mobilní fáze, která je směsí objemových dílů acetonitrilu R a roztoku obsahujícího laurylsíran sodný R (1,44 g/l) a tetrabutylamoniumbromid R (0,75 g/l) (22 + 78), pH se upraví na hodnotu 3,0 kyselinou sírovou 0,05 mol/l RS; průtoková rychlost je 1,5 ml/min,
3. - spektrofotometrického detektoru, 230 nm.

Nastříkne se 20 μl porovnávacího roztoku (c). Citlivost systému se nastaví tak, aby výška dvou píků na chromatogramu byla alespoň 50 % celé stupnice zapisovače. Pokud je chromatogram zaznamenáván za předepsaných podmínek, je relativní retenční čas nečistoty A vzhledem k dihydralazinu přibližně 0,8. Zkoušku lze hodnotit, pokud na chromatogramu je rozlišení mezi píky nečistoty A a dihydralazinu nejméně 2,0. Nastříkne se 20 μl zkoušeného roztoku a chromatogram se zaznamenává po dobu odpovídající dvojnásobku retenčního času dihydralazinu. Nastříkne se 20 μl porovnávacího roztoku (a) a porovnávacího roztoku (b). Na chromatogramu zkoušeného roztoku není plocha píku nečistoty A větší než plocha píku nečistoty A na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) (2 %); plocha žádného píku, kromě hlavního píku a píku nečistoty A, není větší než plocha hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) (0,1 %); součet ploch těchto píků není větší než pětinásobek plochy hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) (0,5 %). Nepřihlíží se k pikům s plochou menší než 0,1násobek plochy hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (a).

Hydrazin. Provede se kapalinovou chromatografií (2.2.29),

Roztoky se připraví bezprostředně před použitím.

Zkoušený roztok 40,0 mg hydraziniumsulfatu R se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 100,0 ml. 1,0 ml tohoto roztoku se zředí vodou R na 25,0 ml. K 0,50 ml tohoto roztoku se přidá 0,200 g zkoušené látky a rozpustí se v 6 ml kyseliny chlorovodíkové zředěné RS a pak se zředí vodou R na 10,0 ml. Do centrifugační zkumavky se zabroušenou zátkou se ihned přenese 0,50 ml tohoto roztoku a 2,0 ml roztoku benzaldehydu R (60 g/l) ve směsi stejných objemových dílů methanolu R a vody R. Třepe se 90 s. Přidá se 1,0 ml vody R a 5,0 ml heptanu R. Třepe se 1 min a odstředí se. Použije se horní vrstva.

Porovnávací roztok 40,0 mg hydraziniumsulfatu R se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 100,0 ml. 1,0 ml tohoto roztoku se zředí vodou R na 25,0 ml. K 0,50 ml tohoto roztoku se přidá 6 ml kyseliny chlorovodíkové zředěné RS a pak se zředí vodou R na 10,0 ml. Do centrifugační zkumavky se zabroušenou zátkou se přenese 0,50 ml tohoto roztoku a 2,0 ml roztoku benzaldehydu R (60 g/l) ve směsi stejných objemových dílů methanolu R a vody R. Třepe se 90 s. Přidá se 1,0 ml vody R a 5,0 ml heptanu R. Třepe se 1 min a odstředí se. Použije se horní vrstva.

Kontrolní roztok. Připraví se stejným způsobem jako porovnávací roztok, ale 0,50 ml roztoku hydraziniumsulfatu se nahradí 0,50 ml vody R.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

1. - nerezové ocelové kolony délky 0,25 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné silikagelem oktadecylsilanizovaným pro chromatografií R (5 μm),
2. - mobilní fáze, kterou je směs objemových dílů roztoku edetanu disodného R (0,3 g/l) a acetonitrilu R (30 + 70), s průtokovou rychlostí 1 ml/min,
3. - spektrofotometrického detektoru, 305 nm.

Nastříkne se po 20 μl zkoušeného roztoku, porovnávacího roztoku a kontrolního roztoku. Srovnáním chromatogramů porovnávacího roztoku a kontrolního roztoku se identifikuje pík benzaldehydazinu (benzalazinu) odpovídající hydrazinu s relativním retenčním časem vzhledem k hlavnímu píku (benzaldehydu) asi 1,8. Na chromatogramu zkoušeného roztoku není plocha píku benzaldehydazinu větší než dvojnásobek plochy odpovídajícího píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (10 μg hydrazinu/g).

Železo (2.4.9). Ke zbytku získanému ve zkoušce Síranový popel se přidá 0,2 ml kyseliny sírové R a opatrně se zahřívá, dokud se kyselina téměř úplně neodpaří. Nechá se ochladit a zbytek se za zahřívání rozpustí v 5,5 ml kyseliny chlorovodíkové RS. Horký roztok se zfiltruje přes filtr, který byl předtím třikrát promyt kyselinou chlorovodíkovou zředěnou RS. Kelímek a filtr se propláchnou 5 ml vody R. Filtrát a promývací voda se spojí a neutralizují se přibližně 3,5 ml hydroxidu sodného koncentrovaného RS, pH se upraví na hodnotu 3 až 4 kyselinou octovou R a roztok se zředí vodou R na 20 ml. Roztok vyhovuje limitní zkoušce na železo (20 μg/g). Porovnávací roztok se připraví za použití 5 ml základního roztoku železa (2 μg Fe/ml) a 5 ml vody R.

Ztráta sušením (2.2.32). 13,0% až 15,0%; 1,000 g se suší 5h v sušárně při 50 °C za tlaku nepřevyšujícího 0,7 kPa.

Síranový popel (2.4.14). Nejvýše 0,1 %; stanoví se s 1,0 g zkoušené látky.

Stanovení obsahu

60,0 mg se rozpustí ve 25 ml vody R. Přidá se 35 ml kyseliny chlorovodíkové R a pomalu se titruje jodičnanem draselným 0,05 mol/l VS za potenciometrické indikace bodu ekvivalence (2.2.20) s použitím kalomelové referenční elektrody a platinové indikační elektrody.

1 ml jodičnanu draselného 0,05 mol/l VS odpovídá 7,208 mg C₈H₁₂N₆O₄S.

Uchovávání

Separandum.

Nečistoty

1. A. 4-hydrazinoftalazin-l-amin

1. B. hydrazin,

1. C. (1-ftalazinyl)hydrazin (hydralazin).

Dimeticonum

Dimetikon

Synonyma. Dimethylsiloxanum, silikonový olej

Je to poly(dimethylsiloxan) získaný hydrolýzou a polykondenzací dichlordimethylsilanu a chlortrimethylsilanu. Existují různé druhy rozlišení číslem, které udává deklarovanou viskozitu a je uvedeno za názvem.

Jejich stupeň polymerizace (n = 20 až 400) odpovídá kinematickým viskozitám v rozmezí 20 mm².s^-1 až 1300 mm².s^-1.

Dimetikony s nominální viskozitou 50 mm² .s^-1 nebo nižší jsou určeny jen pro vnější použití.

Vlastnosti

Čirá bezbarvá kapalina o různé viskozitě. Je prakticky nerozpustný ve vodě, velmi těžce rozpustný až prakticky nerozpustný v ethanolu, mísitelný s ethylacetatem, s 2-butanonem a s toluenem.

Zkoušky totožnosti

1. A. Zkouška Viskozita, viz Zkoušky na čistotu, je zároveň zkouškou totožnosti (kinematická viskozita při 25 °C).
2. B. Infračervené absorpční spektrum (2.2.24) vykazuje maxima při 2964 cm^-1 až 2905 cm^-1, 1412 cm^-1, 1260 cm^-1, 1020 cm^-1. Získané spektrum se shoduje se spektrem materiálu zvoleného podle typu zkoušeného vzorku.
3. C. 0,5 g se zahřívá ve zkumavce nad malým plamenem, dokud se nezačnou objevovat bílé páry. Zkumavka se převrátí nad druhou zkumavku obsahující 1 ml roztoku kyseliny chromotropové sodně soli R (1 g/l) v kyselině sírové R tak, aby páry dosáhly roztoku. Druhá zkumavka se protřepává asi 10 s a zahřívá se 5 min na vodní lázni; roztok se zbarví fialově.
4. D. V platinovém kelímku se připraví síranový popel (2.4.14) za použití 50 mg. Vzniklý bílý prášek vyhovuje zkoušce na křemičitany (2.3.1).

Zkoušky na čistotu

Kysele reagující látky. K 2,0 g se přidá 25 ml směsi stejných objemových dílů ethanolu R a etheru R, předem neutralizované na 0,2 ml modři bromthymolové RS1, a protřepe se. Ke změně zbarvení indikátoru na modré se spotřebuje nejvýše 0,15 ml hydroxidu sodného 0,01 mol/l VS.

Viskozita (2.2.9). Stanoví se kinematická viskozita při 25 °C; hodnota kinematické viskozity je 90 % až 110 % deklarované hodnoty uvedené v označení na obalu.

Minerální oleje. 2 g se pozorují ve zkumavce v ultrafialovém světle při 365 nm. Fluorescence není intenzivnější než fluorescence roztoku, který obsahuje 0,1 μg chininiumsulfatu R v 1 ml kyseliny sírové 0,005 mol/l RS a pozoruje se za stejných podmínek.

Fenylované sloučeniny. 5,0 g se rozpustí za protřepávání v 10 ml cyklohexanu R. Absorbance (2.2.25) tohoto roztoku měřená při 250 nm až 270 nm není větší než 0,2.

Těžké kovy. 1,0 g se smíchá s dichlormethanem R a zředí se jím na 20 ml. Přidá se 1,0 ml roztoku dithizonu R (0,02 g/l) v dichlormethanu R připraveného těsně před přidáním, 0,5 ml vody R a 0,5 ml směsi objemových dílů amoniaku zředěného RS2 a roztoku hydroxylamoniumchloridu R (2 g/l) (1+9). Současně se připraví porovnávací roztok takto: ke 20 ml dichlormethanu R se přidá 1,0 ml roztoku dithizonu R (0,02 g/l) v dichlormethanu R, připraveného těsně před přidáním, 0,5 ml základního roztoku olova (10 μg Pb/ml) a 0,5 ml směsi objemových dílů amoniaku zředěného RS2 a roztoku hydroxylamoniumchloridu R (2 g/l) (1+9). Ihned se oba roztoky intenzivně protřepávají po dobu 1 min. Případné červené zbarvení zkoušeného roztoku není intenzivnější než zbarvení porovnávacího roztoku (5 μg/g).

Těkavé látky. Nejvýše 0,3 % těkavých látek pro dimetikony s deklarovanou viskozitou větší než 50mm².s^-1; 1,00 g se zahřívá 2 h na misce o průměru 60 mm a hloubce 10 mm v sušárně při 150 °C.

Označování

V označení na obalu se uvede:

1. - deklarovaná viskozita jako číslo za názvem látky,
2. - kde je to vhodné, uvede se, že produkt je určen jen pro vnější použití.

† Dinoprostonum

Dinoproston

Je to kyselina (Z)-7-{(1R,2R,3R,)-3-hydroxy-2-[(E)-(3S)-3-hydroxyokt-1-enyl]-5-oxocyclopentyl}hept-5-enová (PGE₂). Počítáno na bezvodou látku, obsahuje 95,0 % až 102,0 % sloučeniny C₂₀H₃₂O₅.

Vlastnosti

Bílý nebo téměř bílý krystalický prášek nebo bezbarvé krystalky. Je prakticky nerozpustný ve vodě, velmi snadno rozpustný v methanolu, snadno rozpustný v lihu 96%. Při pokojové teplotě se rozkládá.

Zkoušky totožnosti

1. A. Specifická optická otáčivost (2.2.7) čerstvě připraveného roztoku je –82° až –90°, počítáno na bezvodou látku. Měří se roztok připravený rozpuštěním 50,0 mg v lihu 96% R a zředěním stejným rozpouštědlem na 10,0 ml.
2. B. Infračervené absorpční spektrum (2.2.24) zkoušené látky se shoduje se spektrem dinoprostonu CRL.

Zkoušky na čistotu

Roztoky se připravují těsně před použitím.

Příbuzné látky. Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29) způsobem popsaným ve Stanovení obsahu.

Nastříkne se 20 μl porovnávacího roztoku (b). Citlivost systému se nastaví tak, aby výška píku dinoprostonu byla nejméně 20 % celé stupnice zapisovače.

Nastříkne se odděleně 20 μl zkoušeného roztoku (a), 20 μl porovnávacího roztoku (b) a 20 μl porovnávacího roztoku (c). Při zaznamenávání chromatogramů za předepsaných podmínek jsou retenční časy jednotlivých látek: dinoprostonu asi 18 min; 5-trans-PGE₂ (nečistota C) asi 21 min; PGA₂ (nečistota D) asi 33 min a PGB₂ (nečistota E) asi 36 min.

Limity

Korekční faktory:

Nečistota C

Nejvýše trojnásobek plochy hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) (1,5%).

Nečistota D (korigovaná plocha)

Nejvýše dvojnásobek plochy hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) (1,0%).

Nečistota E (korigovaná plocha)

Nejvýše velikost plochy hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) (0,5 %).

Ostatní nečistoty

Nejvýše velikost plochy hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) (0,5 %). Celkový obsah ostatních nečistot

Nejvýše dvojnásobek plochy hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) (1,0%).

Nepřihlíží se k pikům mobilní fáze nebo rozpouštědla ani k pikům s plochou menší než 0,1 násobek plochy hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) (0,05 %).

Je-li plocha píku s relativním retenčním časem vztaženým k dinoprostonu 0,8 větší než 0,5 % nebo je-li obsah ostatních nečistot větší než 1,0 %, nastříkne se 20 μl zkoušeného roztoku (a) při nastavení detektoru na 230 nm. Je-li plocha píku při 230 nm dvojnásobná než plocha píku při 210 nm, vynásobí se plocha píku při 210 nm korekčním faktorem pro nečistotu F.

Voda, semimikrostanovení (2.5.12). Nejvýše 0,5 %; stanoví se s 0,500 g zkoušené látky.

Stanovení obsahu

Roztoky se připraví těsně před použitím.

Stanoví se kapalinovou chromatografií (2.2.29).

Zkoušený roztok (a). 10,0 mg se rozpustí v roztoku methanoluR2 58% (V/V) a zředí se jím na 2,0 ml.

Zkoušený roztok (b). 20,0 mg se rozpustí v roztoku methanolu R2 58 % (V/V) a zředí se jím na 20,0 ml.

Porovnávací roztok (a). 1 mg dinoprostonu CRL a 1 mg dinoprostonu nečistoty C CRL se rozpustí v roztoku methanolu R2 58% (V/V) a zředí se jím na 10,0 ml. 4,0 ml tohoto roztoku se zředí roztokem methanolu R2 58 % (V/V) na 10,0 ml.

Porovnávací roztok (b). 0,5 ml zkoušeného roztoku (a) se zředí roztokem methanolu R2 (58% V/V) na 10,0 ml. 1,0 ml tohoto roztoku se zředí roztokem methanolu R2 58 % (V/V) na 10,0 ml.

Porovnávací roztok (c). Rozklad dinoprostonu na nečistotu D a nečistotu E pro zkoušku totožnosti. 1 mg dinoprostonu se rozpustí ve 100 μl hydroxidu sodného 1 mol/l RS (roztok změní barvu na hnědočervenou), počká se 4 min, přidá se 150 μl kyseliny octové 1 mol/l RS (žlutobílý opalizující roztok) a zředí se roztokem methanolu R2 58 % (V/V) na 5,0 ml.

Porovnávací roztok (d). 20 mg dinoprostonu CRL se rozpustí v roztoku methanolu R2 58 % (V/V) a zředí se jím na 20,0 ml.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

1. - nerezové ocelové kolony délky 0,25 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné sililcagelem oktadecylsilanizovaným deaktivovaným s odstíněnými koncovými skupinami pro chromatografií R,
2. - .mobilní fáze, kterou je směs objemových dílů roztoku kyseliny octové R 0,2 % (V/V) a methanolu R (42 + 48), s průtokovou rychlostí 1,0 ml/min,
3. - spektrofotometrického detektoru, 210 nm.

Teplota kolony se udržuje na 30 °C.

Nastříkne se 20 μl porovnávacího roztoku (a). Při zaznamenávání chromatogramů za předepsaných podmínek jsou retenční časy: dinoprostonu asi 18 min a nečistoty C asi 21 min. Zkoušku pro stanovení obsahu a příbuzných látek lze hodnotit, jestliže je rozlišení mezi píky dinoprostonu a nečistoty C nejméně 3,8. V případě potřeby se upraví koncentrace roztoku kyseliny octové a/nebo methanolu (se stoupající koncentrací roztoku kyseliny octové rostou retenční časy dinoprostonu a nečistoty C, se stoupající koncentrací methanolu se retenční časy obou látek zkracují).

Nastříkne se 20 μl porovnávacího roztoku (d). Citlivost systému se nastaví tak, aby výška hlavního píku byla nejméně 50 % celé stupnice zapisovače.

Zkoušku lze hodnotit, je-li relativní směrodatná odchylka pro dinoproston na chromatogramu porovnávacího roztoku (d) nejvýše 2,0 %.

Nastříkne se 20 μl zkoušeného roztoku (b). Vypočítá se procentuální obsah dinoprostonu.

Uchovávání

V dobře uzavřených obalech, při teplotě nepřesahující –15 °C.

Separandum.

Nečistoty

1. A. kyselina (Z)-7-{(R,2R,3R,)-3-hydroxy-2-[(E)-(3R)-3-hydroxyokt-1-enyl]-5-oxocyklopen-tyl} hept-5-enová (15-epiPGE₂; (15R)-PGE₂),

1. B. kyselina (Z)-7-{(1S,2R,3R)-3-hydroxy-2-[(E)-(3S)-3-hydroxyokt-1-enyl]-5-oxocyklopen-tyl} hept-5-enová (8-epiPGE₂; (8S)-PGE₂),

1. C. kyselina (E)-7- {(1R,2R,3R)-3-hydroxy-2-[(E)-(3S)-3-hydroxyokt-1-enyl]-5-oxocyklopentyl} hept-5-enová (5-trans-PGE₂; (5E)-PGE₂),

1. D. kyselina (Z)-7-{(1R,2S)-2-[(E)-(3S)-3-hydroxyokt-1-enyl]-5-oxocyklopent-3-enyl}hept-5-enová(PGA₂),

1. E. kyselina (Z)-7- {2-(E)-(3S)-3-hydroxyokt-1-enyl]-5-oxocyklopent-1-enyl]hept-5-enová (PGB₂),

1. F. kyselina (Z)-7- {(1R,2R,3R,)-3-hydroxy-2-[(E)-3-oxookt-1-enyl]-5-oxocyklopentyl} hept-5-enová (15-oxo-PGE₂, 15-keto-PGE₂).

† Dinoprostum trometamoli

Dinoprosttrometamol

Je to 1,3-dihydroxy-2-hydroxymethylpropan-2-ylamonium-(Z;-7-{(1R,2R,3R,5S)-3,5-dihydroxy-2-[(E)-(3S)-3-hydroxyokt-1-enyl]cyklopentyl} hept-5-enoat (trometamol PGF_2a). Počítáno na bezvodou látku, obsahuje nejméně 96,0 % až 102,0 % sloučeniny C₂₄H₄₅NO₈.

Vlastnosti

Bílý nebo téměř bílý krystalický prášek. Je velmi snadno rozpustný ve vodě, snadno rozpustný v lihu 96%, prakticky nerozpustný v acetonitrilu.

Zkoušky totožnosti

1. A. Specifická optická otáčivost (2.2.7) je +19° až +26°, počítáno na bezvodou látku. Měří se roztok připravený rozpuštěním 0,100 g v lihu 96% R a zředěním stejným rozpouštědlem na 10,0 ml.
2. B. Infračervené absorpční spektrum (2.2.24) zkoušené látky se shoduje se spektrem dinoprosttrometamolu CRL.

Zkoušky na čistotu

Příbuzné látky. Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29).

Zkoušený roztok. 10,0 mg se rozpustí ve směsi objemových dílů acetonitrilu R a vody R (23 + 77) a zředí se stejnou směsí na 10,0 ml.

Porovnávací roztok (a). Rozklad dinoprosttrometamolu na nečistotu B. 1 mg se rozpustí v 1 ml mobilní fáze a zahřívá se 5 min na vodní lázni při 85 °C. Potom se ochladí.

Porovnávací roztok (b). 2,0 ml zkoušeného roztoku se zředí směsí objemových dílů acetonitrilu R a vody R (23 + 77) na 20,0 ml. 2,0 ml tohoto roztoku se zředí stejnou směsí na 20,0 ml.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

1. - nerezové ocelové kolony délky 0,15 m a vnitřního průměru 3,9 mm naplněné silikagelem oktadecylsilanizovaným pro chromatografii R1 (5 μm),
2. - mobilní fáze, která se připraví následujícím způsobem: 2,44 g dihydrogenfosforečnanu sodného R se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 1000 ml; pH se upraví pomocí kyseliny fosforečné R (asi 0,6 ml) na hodnotu 2,5; 770 ml tlumivého roztoku se smíchá s 230 ml acetonitrilu R1; průtoková rychlost je 1 ml/min,
3. - spektrofotometrického detektoru, 200 nm.

Nastříkne se 20 μl porovnávacího roztoku (b) a nastaví se citlivost systému tak, aby výška hlavního píku byla 25 % až 50 % celé stupnice zapisovače.

Nastříkne se porovnávací roztok (a). Při zaznamenání chromatogramů za předepsaných podmínek jsou retenční časy: (15R)-PGF_2a (nečistota B) asi 55 min; 5,6-trans-PGF_2a (nečistota A) asi 60 min a dinoprostu asi 66 min. Chromatogram se zaznamenává po dobu 2,5násobku retenčního času hlavního píku (k eluování píků rozkladných produktů, vzniklých během nahřívání) Zkoušku lze hodnotit, jestliže je rozlišení mezi píky nečistoty A a nečistoty B nejméně 1,5 a rozlišení mezi píky nečistoty A a dinoprostu nejméně 2,0; faktor symetrie píků nečistoty A a nečistoty B je nejvýše 1,2. V případě potřeby se upraví složení mobilní fáze. Přídavkem acetonitrilu se zkrátí retenční časy.

Nastříkne se odděleně 20 μl zkoušeného roztoku a 20 μl porovnávacího roztoku (b). Chromatogram zkoušeného roztoku se zaznamenává ještě 10 min po eluci hlavního píku. Na chromatogramů zkoušeného roztoku není plocha píku nečistoty A větší než dvojnásobek plochy hlavního píku na chromatogramů porovnávacího roztoku (b) (2 %); plocha žádného dalšího píku, kromě hlavního píku a píku nečistoty A, není větší než 1,5násobek plochy píku na chromatogramů porovnávacího roztoku (b) (1,5 %) a plocha nejvýše jednoho takového píku je větší než plocha hlavního píku na chromatogramů porovnávacího roztoku (b) (0,5 %). Součet ploch všech píků, kromě hlavního píku a píku nečistoty A, není větší než dvojnásobek plochy hlavního píku na chromatogramů porovnávacího roztoku (b) (2 %). Nepřihlíží se k píku mobilní fáze a píku trometamolu (retenční čas asi 1,5 min) ani k pikům s plochou menší než 0,05násobek plochy hlavního píku na chromatogramů porovnávacího roztoku (b).

Voda, semimikrostanovení (2.5.12). Nejvýše 1,0 %, stanoví se s 0,500 g zkoušené látky.

Stanovení obsahu

Stanoví se kapalinovou chromatografií (2.2.29).

Zkoušený roztok. 10,0 mg se rozpustí ve směsi objemových dílů acetonitrilu R a vody R (23 + 77) a zředí se jí na 10,0 ml.

Porovnávací roztok. 10,0 mg dinoprosttrometamolu CRL se rozpustí ve směsi objemových dílů acetonitrilu R a vody R (23 + 77) a zředí se stejnou směsí na 10,0 ml.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

1. - nerezové ocelové kolony délky 0,15 m a vnitřního průměru 3,9 mm naplněné silikagelem oktadecylsilanizovaným pro chromatografií R1 (5 μm),
2. - mobilní fáze, která se připraví takto: 2,44 g dihydrogenfosforečnanu sodného R se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 1000 ml; pH se upraví pomocí kyseliny fosforečné R (asi 0,6 ml) na hodnotu 2,5; 730 ml tlumivého roztoku se smíchá s 270 ml acetonitrilu R1; průtoková rychlost je 1 ml/min,
3. - spektrofotometrického detektoru, 200 nm.

Nastříkne se 20 μl porovnávacího roztoku a nastaví se citlivost systému tak, aby výška hlavního píku byla 70 % až 90 % celého rozsahu zapisovače. Při zaznamenání chromatogramů za předepsaných podmínek je retenční čas dinoprostu asi 23 min.

Porovnávací roztok se nastříkne šestkrát. Zkoušku lze hodnotit, jestliže je relativní směrodatná odchylka nejvýše 2,0 %. Nastříkne se 20 μl zkoušeného roztoku. Vypočítá se obsah dinoprosttrometamolu v procentech.

Uchovávání

V dobře uzavřených obalech.

Separandum.

Nečistoty

1. A. kyselina (E)-7-{(1R,2R,3R,5S)-3,5-dihydroxy-2-[(E)-(3S)-3-hydroxyokt-1-enyl]cyklopentyl}hept-5-enová; [(5E)-PGF_2α; 5,6-trans-PGF_2α),

1. B. kyselina (Z)-7-{(1R,2R,3R,5S)-3,5-dihydroxy-2-[(E)-(3R)-3-hydroxyokt-1-enyl]cyklopentyl} hept-5-enová; [(15R)-PGF_2α; 15-epiPGF_2α),

1. C. kyselina (Z)-7-{(1S,2R,3R,5S)-3,5-dihydroxy-2-[(E)-(35)-3-liydroxyokt-1-enyl]cyklopentyl} hept-5-enová; [(8S)-PGF_2α; 8-epiPGF_2α),

1. D. kyselina (2)-7-{(1R,2R,3S,5S)-3,5-dihydroxy-2-[(E)-(35)-3-hydroxyokt-1-enyl]cyklopentyl} hept-5-enová; (11β-PGF_2α; 11-epiPGF_2α).

† Dipyridamolum

Dipyridamol

Je to 2,2՛,2՛՛,2՛՛՛-̕{[4,8-bis(1-piperidyl)pyrimido[5,4-d/]pyrirnidm-2,6-diyl]dmitrilo}tetraethanol. Počítáno na vysušenou látku, obsahuje 98,5 % až 101,5 % sloučeniny C₂₄H₄₀N₈O₄.

Vlastnosti

Jasně žlutý krystalický prášek. Je prakticky nerozpustný ve vodě, snadno rozpustný v acetonu, dobře rozpustný v ethanolu a prakticky nerozpustný v etheru. Rozpouští se ve zředěných roztocích minerálních kyselin.

Zkoušky totožnosti

Základní sestava zkoušek: C.

Alternativní sestava zkoušek: A, B a D, viz Obecné zásady (1.2).

1. A. Teplota tání (2.2.14). 162 °C až 168 °C.
2. B. 10 mg se rozpustí ve směsi objemových dílů kyseliny chlorovodíkové 0,1 mol/l RS a methanolu R (1 + 9) a zředí se stejnou směsí na 50,0 ml. 5,0 ml tohoto roztoku se zředí směsí objemových dílů kyseliny chlorovodíkové 0,1 mol/l RS a methanolu R (1 + 9) na 100,0 ml. Měří se absorbance roztoku (2.2.25) při 220 nm až 350 nm; roztok vykazuje dvě absorpční maxima při 232 nm a 284 nm. Poměr absorbance naměřené v maximu při 284 nm k absorbanci naměřené v maximu při 232 nm je 1,25 až 1,45.
3. C. Infračervené absorpční spektrum (2.2.24) tablety zkoušené látky se shoduje se spektrem tablety dipyridamolu CRL. Tablety se připraví za použití bromidu draselného R.
4. D. Asi 5 mg se rozpustí ve směsi 0,1 ml kyseliny dusičné R a 2 ml kyseliny sírové R; vznikne intenzivní fialové zbarvení.

Zkoušky na čistotu

Příbuzné látky. Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29).

Zkoušený roztok. 10,0 mg se rozpustí v mobilní fázi a zředí se jí na 20,0 ml.

Porovnávací roztok (a). 1,0 ml zkoušeného roztoku se zředí mobilní fází na 20,0 ml. 1,0 ml tohoto roztoku se zředí mobilní fází na 10,0 ml.

Porovnávací roztok (b). 10,0 mg diltiazemiumchloridu CRL se rozpustí v mobilní fázi a zředí se jí na 10,0 ml. 1,0 ml tohoto roztoku se zředí porovnávacím roztokem (a) na 20,0 ml.

Chromatograflcký postup se obvykle provádí za použití:

1. - nerezové ocelové kolony délky 0,25 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné silikagelem oktylsilanizovaným pro chromatografii R (5 μm),
2. - mobilní fáze s průtokovou rychlostí 1,3 ml/min, která je směsí připravenou následujícím způsobem: 0,504 g dihydrogenfosforečnanu draselného R se rozpustí v 370 ml vody R a upraví se hodnota pH na 3,0 kyselinou fosforečnou R; přidá se 80 ml acetonitrilu R a 550 ml methanolu R,
3. - spektrofotometrického detektoru, 290 nm.

Teplota kolony se udržuje na 30 °C.

Nastříkne se po 20 μl každého roztoku. Chromatogram zkoušeného roztoku se zaznamenává po dobu odpovídající 9násobku retenčního času dipyridamolu. Zkoušku lze hodnotit, jestliže na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) rozlišení mezi píky diltiazemu a dipyridamolu je nejméně 2,0. Na chromatogramu zkoušeného roztoku: plocha žádného píku, kromě hlavního píku, není větší než plocha píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) (0,5 %); součet ploch všech píků, kromě hlavního píku, není větší než dvojnásobek plochy hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) (1 %). Nepřihlíží se k pikům, jejichž plocha je menší než 0,1 násobek plochy píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (a).

Chloridy (2.4.4). K 0,250 g se přidá 10 ml vody R a důkladně se protřepe. Zfiltruje se, filtr se promyje 5 ml vody R a zředí se jí na 15 ml. Spojené filtráty vyhovují limitní zkoušce na chloridy (200 μg/g).

Ztráta sušením (2.2.32). Nejvýše 0,5 %; 1,000 g se suší v sušárně při 100 °C až 105 °C.

Síranový popel (2.4.14). Nejvýše 0,1 %; stanoví se s 1,00 g zkoušené látky.

Stanovení obsahu

0,400 g se rozpustí v 70 ml methanolu R a titruje se kyselinou chloristou 0,1 mol/l VS za potenciometrické indikace bodu ekvivalence (2.2.20).

1 ml kyseliny chloristě 0,1 mol/l VS odpovídá 50,46 mg C₂₄H₄₀N₈O₄.

Uchovávání

V dobře uzavřených obalech, chráněn před světlem.

Separandum.

Nečistoty

1. A. R = R՛ = NC₅H₁₀: 2,2՛-{[4,6,8-tri(l-piperidyl)pyrimido[5,4-d]pyriimdin-2-yl]mtrilo}diethanol,
2. B. R = R՛ = N(CH₂–CH₂OH): 2,2՛,2՛՛,2՛՛՛,2՛՛՛՛,2՛՛՛՛՛-{[8-(1-piperidyl)pyrimido[5,4-d]pyrimidin-2,4,6-triyl] trinitrilo} hexaethanol,
3. C. R = NC₅H₁₀, R՛ = Cl: 2,2՛-{[2-chlor-4,8-bis(1-piperidyl)pyrimido[5,4-d]pyrimidin-6-yljnitrilo} diethanol.

† Dirithromycinum

Dirithromycin

Je to (1R,2S,3R,6R,7S,8S,9R,10R,12R,13S,15R,17S-9-{[3-dimethylamino)-3,4,6-trideoxy-β-D-xylo-hexopyranosyl]oxy}-3-ethyl-2,10-dihydroxy-15-[(2-methoxyethoxy)methyl]-2,6,8,10,12,-17-hexamethyl-7-[(3-C-methyl-3-O-methyl-2,6-dideoxy-α-L-ribo-hexopyranosyl)oxy]-4,16-dioxa-14-azabicyklo[11,3,1]heptadekan-5-on (nebo (9S)-9,11-{imino[(1R)-2-(2-methoxyethoxy)ethyliden]oxy}-9-deoxo-11-deoxyerythromycin). Počítáno na bezvodou látku, součet obsahů sloučeniny C₄₂H₇₈N2O_{14 a} 15S-epimeru dirithromycinu je 96,0 % až 102,0 %.

Vlastnosti

Bílý nebo téměř bílý prášek. Je velmi těžce rozpustný ve vodě, velmi snadno rozpustný v methanolu a v dichlormethanu.

Vykazuje polymorfismus.

Zkoušky totožnosti

1. A. Infračervené absorpční spektrum (2.2.24) tablety zkoušené látky se shoduje se spektrem tablety dirithromycinu CRL.
2. B. Hodnotí se chromatogramy ze zkoušky Stanovení obsahu. Retenční čas a velikost hlavního píku na chromatogramu zkoušeného roztoku (a) odpovídá retenčnímu času a velikosti hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (a).

Zkoušky na čistotu

Příbuzné látky. Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29) způsobem popsaným ve Stanovení obsahu.

Nastříkne se 10 μl porovnávacího roztoku (b). Citlivost systému se nastaví tak, aby výška hlavního píku byla nejméně 50% celé stupnice zapisovače. Nastříkne se 10 μl zkoušeného roztoku (b) a chromatogram se zaznamenává po dobu odpovídající trojnásobku retenčního času hlavního píku. Na chromatogramu zkoušeného roztoku (b): plocha píku nečistoty A není větší než 0,75násobek plochy hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) (1,5 %); plocha žádného píku, kromě hlavního píku, píku nečistoty A a píku 15S-epimeru, není větší než polovina plochy hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) (1 %).

Dirithromycin 15S-epimer. Nejvýše 1,5 %; stanoví se kapalinovou chromatografií (2.2.29) způsobem popsaným ve Stanovení obsahu.

Nastříkne se 10 μl porovnávacího roztoku (b). Citlivost systému se nastaví tak, aby výška hlavního píku byla nejméně 50 % celé stupnice zapisovače. Porovnávací roztok (b) se nastříkne šestkrát. Zkoušku lze hodnotit, jestliže je relativní směrodatná odchylka ploch píku dirithromycinu nejvýše 5,0 %. Střídavě se nastřikuje zkoušený roztok (b) a porovnávací roztok (b). Vypočítá se procentuální obsah dirithromycinu 15S-epimeru s použitím chromatogramu porovnávacího roztoku (b).

Acetonitril (2.4.24, systém A). Nejvýše 0,1 %.

Roztoky se připraví s použitím dimethylformamidu R místo vody R.

Roztok vzorku. 0,200 g se rozpustí v dimethylformamidu R a zředí se jím na 20,0 ml.

Postup head-space metodou se obvykle provádí za použití:

1. - teploty pro ustavení rovnováhy: 120 °C,
2. - doby ustavování rovnováhy: 60 min,
3. - teploty přechodové kapiláry: 125 °C.

Těžké kovy (2.4.8). 1,0 g se rozpustí ve 20 ml směsi stejných objemových dílů methanolu R a vody R. 12 ml tohoto roztoku vyhovuje limitní zkoušce B na těžké kovy (20 μg/g). Porovnávací roztok se připraví za použití roztoku olova (1 μgPb/ml) získaného zředěním základního roztoku olova (100 μgPb/ml) směsí stejných objemových dílů methanolu R a vody R.

Voda, semimikrostanovení (2.5.12). Nejvýše 1,0 %; stanoví se s 1,00 g zkoušené látky.

Síranový popel (2.4.14). Nejvýše 0,1 %; stanoví se s 1,00 g zkoušené látky.

Stanovení obsahu

Provede se kapalinovou chromatografií (2.2.29).

Směs rozpouštědel. Připraví se směs objemových dílů methanolu R a acetonitrilu R (30 + 70).

Zkoušený roztok (a). 20,0 mg se rozpustí ve směsi rozpouštědel a zředí se stejnou směsí na 10,0 ml.

Zkoušený roztok (b). 0,10 g se rozpustí ve směsi rozpouštědel a zředí se stejnou směsí na 10,0 ml.

Porovnávací roztok (a). 20,0 mg dirithromycinu CRL se rozpustí ve směsi rozpouštědel a zředí se stejnou směsí na 10,0 ml.

Porovnávací roztok (b). 5,0 ml porovnávacího roztoku (a) se zředí směsí rozpouštědel na 50,0 ml. Porovnávací roztok (c). 20 mg dirithromycinu CRL se rozpustí v mobilní fázi a zředí se stejnou směsí na 10 ml. Před použitím se nechá stát 24 h.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

1. - nerezové ocelové kolony délky 0,25 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné silikagelem oktadecylsilanizovaným pro chromatografii R (5 pm),
2. - mobilní fáze, která je směsí objemových dílů vody R, methanolu R, roztoku obsahujícího 1,9 g/1 dihydrogenfosforečnanu draselného R a 9,1 g/l hydrogenfosforečnanu draselného R, jehož pH je v případě potřeby upraveno na hodnotu 7,5 roztokem hydroxidu draselného R (100 g/l), a acetonitrilu R (9 + 19 + 28 + 44), s průtokovou rychlostí 2,0 ml/min,
3. - spektrofotometrického detektoru, 205 nm.

Teplota kolony se udržuje na 40 °C. Nastříkne se 10 μl porovnávacího roztoku (a). Citlivost systému se nastaví tak, aby výška hlavního píku na získaném chromatogramu byla nejméně 50 % celé stupnice zapisovače.

Nastříkne se 10 μl porovnávacího roztoku (c). Při zaznamenání chromatogramu za předepsaných podmínek jsou relativní retenční časy látek vztažené k dirithromycinu: nečistoty A asi 0,7, 15S-epimeru asi 1,1. Zkoušku lze hodnotit, jestliže na chromatogramu porovnávacího roztoku (c) je rozlišení mezi píky dirithromycinu a 15S-epimeru nejméně 2,0 (v případě potřeby se upraví složení mobilní fáze). Nastříkne se šestkrát porovnávací roztok (a). Zkoušku lze hodnotit, jestliže je relativní směrodatná odchylka pro pík odpovídající dirithromycinu nejvýše 1,0 %. Střídavě se nastřikuje zkoušený roztok (a) a porovnávací roztok (a).

Uchovávání

Separandum.

Nečistoty

1. A. (9S)-9-amino-9-deoxoerythromycin,
2. B. R = H: (9S)-9-amino-3-de(2,6-dideoxy-3-C-methyl-3-O-methyl-α-L-ribo-hexopyranosyl)-9- -deoxyerythromycin,

1. C. R = CH₂-O-CH₂-CH₂-O-CH₃, R¹ = H, R²= H, R³ = CH₃: (9S)-9,11 -{imino[(1RS)-2-(2-methoxyethoxy)ethyliden]oxy}-9-deoxo-11,12-dideoxyerythromycin (dirithromycin B),
2. D. R = CH₂-O-CH₂-CH₂-O-CH₃, R¹ = H, R² = OH, R³ = H: (9S)-9,11-{imino[(1RS)-2-(2-methoxyethoxy)ethyliden]oxy}-3՛-O-demethyl-9-deoxo-11-deoxyerythromycin (dirithro-mycin C),
3. E. R = CH₃, R¹ = CH₃, R²= OH, R³ = CH₃: 9,11-[imino(l-methylethyliden)oxy]-9-deoxo-11-deoxyerythromycin).

† Dobutamini hydrochloridum

Dobutaminiumchlorid

Je to (RS)-N-{2-[4-(4-hydroxyfenyl)]butyl}-2-(3,4-dihydroxyfenyl)ethylamoniumchlorid. Počítáno na vysušenou látku, obsahuje 98,5 % až 101,0 % sloučeniny C₁₈H₂₄CINO₃.

Vlastnosti

Bílý nebo téměř bílý krystalický prášek. Je mírně rozpustný ve vodě, dobře rozpustný v methanolu a mírně rozpustný v lihu 96%.

Zkoušky totožnosti

Základní sestava zkoušek: C a E.

Alternativní sestava zkoušek: A, B, D a E, viz Obecné zásady (1.2).

1. A. Teplota tání (2.2.14) je 189 °C až 192 °C.
2. B. 20,0 mg se rozpustí v methanolu R a zředí se jím na 100,0 ml. 10,0 ml tohoto roztoku se zředí methanolem R na 100,0 ml. Měří se absorbance roztoku (2.2.25) při 220 nm až 300 nm; roztok vykazuje dvě absorpční maxima, při 223 nm a 281 nm. Poměr absorbance naměřené v maximu při 281 nm k absorbanci naměřené v maximu při 223 nm je 0,34 až 0,36.
3. C. Infračervené absorpční spektrum (2.2.24) tablety zkoušené látky se shoduje se spektrem tablety dobutaminiumchloridu CRL.
4. D. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití vrstvy silikagelu G R.

   Zkoušený roztok. 10,0 mg se rozpustí ve směsi stejných objemových dílů kyseliny octové ledové R a methanolu R a zředí se stejnou směsí na 10 ml.

   Porovnávací roztok (a). 10,0 mg dobutaminiumchloridu CRL se rozpustí ve směsi stejných objemových dílů kyseliny octové ledové R a methanolu R a zředí se stejnou směsí na 10 ml.

   Porovnávací roztok (b). 5,0 mg dopaminiumchloridu CRL se rozpustí v 5,0 ml zkoušeného roztoku.

   Na vrstvu se nanese odděleně po 10 jíl každého roztoku a vyvíjí se směsí objemových dílů vody R, kyseliny octové ledové R, etheru R a 1-butanolu R (5 + 15 + 30 + 45) po dráze 15 cm. Vrstva se usuší na vzduchu a postříká se roztokem manganistanu draselného R (1 g/l). Hlavní skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku se polohou, barvou a velikostí shoduje s hlavní skvrnou na chromatogramu porovnávacího roztoku (a). Zkoušku lze hodnotit, jestliže na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) jsou dvě zřetelně oddělené skvrny.

1. E. Vyhovuje zkoušce (a) na chloridy (2.3.1). Použije se směs stejných objemových dílů methanolu R a vody R.

Zkoušky na čistotu

Kysele nebo zásaditě reagující látky. 0,1 g se rozpustí ve vodě R za mírného zahřátí a zředí se jí na 10 ml, přidá se 0,1 ml methylčerveně RS a 0,2 ml hydroxidu sodného 0,01 mol/l VS; vznikne žluté zbarvení, které se přidáním 0,4 ml kyseliny chlorovodíkové 0,01 mol/l VS změní na červené.

Optická otáčivost (2.2.7). -0,05° až +0,05°; 0,50 g se rozpustí v methanolu R a zředí se jím na 10,0 ml.

Absorbance (2.2.25). 0,5 g se rozpustí ve směsi stejných objemových dílů methanolu R a vody R, je-li třeba, zahřeje se na 30 °C až 35 °C, zředí se stejnou směsí na 25 ml a rychle se zchladí. Absorbance měřená ihned při 480 nm není vyšší než 0,04.

Příbuzné látky. Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29).

Zkoušený roztok. 0,10 g se rozpustí ve směsi objemových dílů mobilní fáze B a mobilní fáze A (35 + 65) a zředí se stejnou směsí na 20,0 ml.

Porovnávací roztok (a). 4,0 ml zkoušeného roztoku se zředí roztokem anisaldehydu R (0,05 g/l)

ve směsi objemových dílů mobilní fáze B a mobilní fáze A (35 + 65) na 100,0 ml. 1,0 ml tohoto roztoku se zředí stejnou směsí mobilních fází na 10,0 ml.

Porovnávací roztok (b). 5,0 ml zkoušeného roztoku se zředí směsí objemových dílů mobilní fáze B a mobilní fáze A (35 + 65) na 100,0 ml. 1,0 ml tohoto roztoku se zředí stejnou směsí mobilních fází na 10,0 ml.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

1. - nerezové ocelové kolony délky 0,15 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné silikagelem oktadecylsilanizovaným pro chromatografii R (5 μm),
2. - mobilní fáze s průtokovou rychlostí 1 ml/min:
3. - mobilní fáze A - 2,60 g oktansulfonanu sodného R se rozpustí v 1000 ml vody R a přidají se 3 ml triethylaminu R; pH se upraví na hodnotu 2,5 kyselinou fosforečnou R,
4. - mobilní fáze B - směs objemových dílů acetonitrilu R a methanolu R (18 + 82),
5. - spektrofotometrického detektoru, 280 nm.

Nastříkne se 20 μl porovnávacího roztoku (a). Zkoušku lze hodnotit, jestliže na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) rozlišení mezi píky dobutaminiumchloridu a anisaldehydu je nejméně 4,0. Nastříkne se 20 μl zkoušeného roztoku a 20 μl porovnávacího roztoku (b). Na chromatogramu zkoušeného roztoku: plocha žádného píku, kromě hlavního píku, není větší než plocha hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) (0,5 %); součet ploch všech píků, kromě hlavního píku, není větší než dvojnásobek plochy hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) (1 %). Nepřihlíží se k pikům rozpouštědel a k pikům, jejichž plocha je menší než 0,lnásobek plochy hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b).

Těžké kovy (2.4.8). 2,0 g vyhovují limitní zkoušce C na těžké kovy (10 μg/g). Porovnávací roztok se připraví za použití 2 ml základního roztoku olova (10 μg Pb/ml).

Ztráta sušením (2.2.32). Nejvýše 0,5 %; 1,000 g se suší v sušárně při 100 °C až 105 °C.

Síranový popel (2.4.14). Nejvýše 0,1 %; stanoví se s 1,00 g zkoušené látky.

Stanovení obsahu

Aby nedošlo k přehřátí, titrace se ukončí ihned po dosažení bodu ekvivalence.

0,250 g se rozpustí v 10 ml kyseliny mravenčí bezvodé R. Přidá se 50 ml acetanhydridu R a titruje se kyselinou chloristou 0,1 mol/l VS za potenciometrické indikace bodu ekvivalence (2.2.20).

1 ml kyseliny chloristé 0,1 mol/l VS odpovídá 33,79 mg C₁₈H₂₄ClNO₃.

Uchovávání

V dobře uzavřených obalech, chráněn před světlem.

Separandum.

Nečistoty

1. A. dopamin,

1. B. 4-(4-hydroxyfenyl)-2-butanon,

1. C. (RS)-N-{2-[4-(4-methoxyfenyl)]butyl}-2-(3,4-dimethoxyfenyl)ethylamin.

† Dosulepini hydrochloridum

Dosulepiniumchlorid

Synonymum. Dosulepinium chloratum

Je to (E)-[3-(6,11-dihydrodibenzo[b,e]thiepin-11-yliden)propyl]dimethylamoniumchlorid. Počítáno na vysušenou látku, obsahuje 98,0 % až 101,0 % sloučeniny C₁₉H₂₂CINS.

Vlastnosti

Bílý nebo slabě žlutý krystalický prášek. Je snadno rozpustný ve vodě, v lihu 96% a dichlormethanu.

Zkoušky totožnosti

Základní sestava zkoušek: B a D.

Alternativní sestava zkoušek: A, C a D, viz Obecné zásady (1.2).

1. A. 25,0 mg se rozpustí v roztoku kyseliny chlorovodíkové R (1 g/l) v methanolu R a zředí se stejnou směsí na 100,0 ml. 2,0 ml tohoto roztoku se zředí roztokem kyseliny chlorovodíkové R (1 g/l) v methanolu R na 50,0 ml. Měří se absorbance (2.2.25) při 220 nm až 350 nm. Roztok vykazuje dvě absorpční maxima, při 231 nm a 306 nm, a prodlevu při asi 260 nm. Specifická absorbance v maximu při 231 nm je 660 až 730.
2. B. Infračervené absorpční spektrum (2.2.24) tablety zkoušené látky se shoduje se spektrem tablety dosulepiniumchloridu CRL.
3. C. Asi 1 mg se rozpustí v 5 ml kyseliny sírové R; vznikne tmavě červené zbarvení.
4. D. Vyhovuje zkoušce (b) na chloridy (2.3.1).

Zkoušky na čistotu

Z-izomer a příbuzné látky. Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29). Roztoky se připravují těsně před použitím.

Zkoušený roztok. 50,0 mg se rozpustí v 5 ml methanolu R a zředí se mobilní fází na 50,0 ml.

Porovnávací roztok (a). 12,5 mg dosulepinu nečistoty A CRL se rozpustí v 5 ml methanolu R a zředí se mobilní fází na 50,0 ml. 1,0 ml tohoto roztoku se zředí mobilní fází na 100,0 ml.

Porovnávací roztok (b). 20,0 mg dosulepiniumchloridu CRL se rozpustí v 5 ml methanolu R a zředí se mobilní fází na 20,0 ml.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

1. - nerezové ocelové kolony 0,25 m dlouhé a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné silikagelem nitrilovaným pro chromatografii R1 (5 μm),
2. - mobilní fáze, kterou je směs objemových dílů kyseliny fosforečné R, roztoku butansulfonanu sodného R (10 g/l), methanolu R a vody R (0,2 + 10 + 35 + 55), průtoková rychlost je 1 ml/min,
3. - spektrofotometrického detektoru, 229 nm.

Teplota kolony se udržuje na 35 °C.

Nastříkne se 20 μl porovnávacího roztoku (b). Při zaznamenání chromatogramu za předepsaných podmínek je relativní retenční čas Z-izomeru vzhledem k hlavnímu píku (E-izomer) asi 0,9. Nastaví se citlivost systému tak, aby výška píku odpovídajícího Z-izomeru činila nejméně 50 % celé stupnice zapisovače. Zkoušku lze hodnotit, jestliže rozlišení mezi píky odpovídajícími Z-izomeru a E-izomeru je nejméně 1,0.

Nastříkne se odděleně 20 μl zkoušeného roztoku a 20 μl porovnávacího roztoku (a). Na chromatogramu zkoušeného roztoku: plocha píku odpovídajícího dosulepinu nečistotě A není větší než plocha hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) (0,25 %); plocha píku odpovídajícího Z-izomeru není větší než 5 % součtu ploch píků obou izomeru; plocha žádného píku, kromě hlavního píku, píku odpovídajícího dosulepinu nečistotě A a píku odpovídajícího Z-izomeru, není větší než 0,4násobek plochy hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) (0,1 %).

Těžké kovy (2.4.8). 1,0 g vyhovuje limitní zkoušce C na těžké kovy (10 μg/g). Porovnávací roztok se připraví za použití 1 ml základního roztoku olova (10 μg Pb/ml).

Ztráta sušením (2.2.32). Nejvýše 0,5 %; 1,000 g se suší v sušárně při 100 °C až 105 °C.

Síranový popel (2.4.14). Nejvýše 0,1 %; stanoví se s 1,00 g zkoušené látky.

Stanovení obsahu

0,250 g se rozpustí ve směsi 5 ml kyseliny octové bezvodé R a 35 ml acetanhydridu R a titruje se kyselinou chloristou 0,1 mol/l VS za potenciometrické indikace bodu ekvivalence (2.2.20).

1 ml kyseliny chloristé 0,1 mol/l VS odpovídá 33,19 mg C₁₉H₂₂CINS.

Uchovávání

Chráněn před světlem.

Separandum.

Nečistoty

1. A. (E)-11-(3-dimethylaminopropyliden)-6,11l-dihydrodibenzo[b,e]thiepin-5-oxid,

1. B. 6,11-dihydrodibenzo[b,e]thiepin-11-on,

1. C. (RS)-11-(3-dimethylaminopropyl)-6,11-dihydrodibenzo[b,e]thiepin-11-ol,

1. D. (E)-11-(3-dimethylaminopropyliden)-6,11-dihydrodibenzo[b,e]thiepin-5,5-dioxid,

1. E. (Z)-[3-(6,11-dihydrodibenzo[b,e]thiepin-11-yliden)propyl]dimethylamin.

† Doxaprami hydrochloridum monohydricum

Monohydrát doxapramiumchloridu

Synonymum. Doxaprami hydrochloridum

Je to monohydrát (RS)-1-ethyl-3,3-difenyl-4-(2-morfolinoethyl)pyrrolidin-2-on-hydrochloridu. Počítáno na vysušenou látku, obsahuje 98,0 % až 100,5 % sloučeniny C₂₄H₃₁CIN₂O₂P.

Vlastnosti

Bílý nebo téměř bílý krystalický prášek. Je mírně rozpustný ve vodě, v lihu 96% a v dichlormethanu.

Zkoušky totožnosti

Základní sestava zkoušek: A a C.

Alternativní sestava zkoušek: B a C, viz Obecné zásady (1.2).

1. A. Infračervené absorpční spektrum (2.2.24) tablety zkoušené látky se shoduje se spektrem tablety doxapramiumchloridu CRL. Tablety se připraví za použití chloridu draselného R.
2. B. Provede se tenkovrstvá chromatografíe (2.2.27) za použití vrstvy vhodného silikagelu.

   Zkoušený roztok. 10 mg se rozpustí v methanolu R a zředí se jím na 10 ml.

   Porovnávací roztok. 10 mg doxapramiumchloridu CRL se rozpustí v methanolu R a zředí se jím na 10 ml.

   Na vrstvu se nanese odděleně po 10 μl každého roztoku a vyvíjí se směsí objemových dílů roztoku amoniaku R (17 g/l) a 2-propanolu R (20 + 80) po dráze 15 cm. Vrstva se usuší na vzduchu, postříká se jodobismutitanem draselným zředěným RS a ihned se pozoruje. Hlavní skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku se polohou, barvou a velikostí shoduje s hlavní skvrnou na chromatogramu porovnávacího roztoku.

1. C. Vyhovuje zkoušce (a) na chloridy (2.3.1).

Zkoušky na čistotu

Roztok S. 2,500 g se rozpustí ve vodě prosté oxidu uhličitého R a zředí se jí na 50,0 ml.

Vzhled roztoku. 10 ml roztoku S se zředí vodou R na 25 ml. Roztok je čirý (2.2.1) a bezbarvý (2.2.2, Metoda II).

Hodnota pH (2.2.3). 3,5 až 5,0; měří se roztok připravený zředěním 5 ml roztoku S vodou prostou oxidu uhličitého R na 25 ml.

Optická otáčivost (2.2.7). –0,10° až +0,10°; měří se roztok S.

Příbuzné látky. Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29).

Zkoušený roztok. 10,0 mg se rozpustí v mobilní fázi a zředí se jí na 10,0 ml.

Porovnávací roztok (a). 1,0 ml zkoušeného roztoku se zředí mobilní fází na 100,0 ml.

Porovnávací roztok (b). 1,0 ml porovnávacího roztoku (a) se zředí mobilní fází na 5,0 ml.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

1. - nerezové ocelové kolony délky 0,25 m a vnitřního průměru 4,6 mm, naplněné silikagelem oktadecylsilanizovaným pro chromatografii R (5 μm),
2. - mobilní fáze, která je směsí objemových dílů acetonitrilu R, roztoku dihydrogenfosforečnanu amonného R (1,1 g/l), jehož pH je upraveno na hodnotu 4,5 kyselinou fosforečnou zředěnou RS a methanolu R (15 + 20 + 25), s průtokovou rychlostí 1,5 ml/min,
3. - spektrofotometrického detektoru, 214 nm.

Nastříkne se 20 μl porovnávacího roztoku (b). Nastaví se citlivost detektoru tak, aby výška hlavního píku na chromatogramu byla nejméně 50 % celé stupnice zapisovače. Při zaznamenání chromatogramu za předepsaných podmínek je retenční čas doxapramiumchloridu asi 10 min. Nastříkne se 20 μl zkoušeného roztoku a chromatogram se zaznamenává po dobu odpovídající dvojnásobku retenčního času doxapramiumchloridu. Na chromatogramu zkoušeného roztoku: plocha žádného píku, kromě hlavního píku, není větší než plocha hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) (0,2 %); součet ploch všech píků, kromě hlavního píku, není větší než plocha hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) (1 %). Nepřihlíží se k pikům rozpouštědel a k pikům, jejichž plocha je menší než 0,025násobek plochy hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (a).

Těžké kovy (2.4.8). 2,0 g se rozpustí ve směsi objemových dílů vody R a methanolu R (3 + 17) a zředí se stejnou směsí na 20 ml. 12 ml tohoto roztoku vyhovuje limitní zkoušce B na těžké kovy (20 μg/g). Porovnávací roztok olova (2 μg Pb/ml) se připraví zředěním základního roztoku olova (100 μg Pb/ml) směsí objemových dílů vody R a methanolu R (3 + 17).

Ztráta sušením (2.2.32). 3,0 % až 4,5 %; 1,000 g se suší v sušárně při 100 °C až 105 °C.

Síranový popel (2.4.14). Nejvýše 0,1 %; stanoví se s 1,00 g zkoušené látky.

Stanovení obsahu

0,300 g se rozpustí ve směsi 10,0 ml kyseliny chlorovodíkové 0,01 mol/l VS a 50 ml lihu 96% R. Titruje se hydroxidem sodným 0,1 mol/l VS za potenciometrické indikace bodu ekvivalence (2.2.20) do druhé inflexe. Odečítá se spotřeba mezi dvěma body inflexe.

1 ml hydroxidu sodného 0,1 mol/l VS odpovídá 41,50 mg C₂₄H₃₁CIN₂O₂.

Uchovávání

V dobře uzavřených obalech.

Separandum.

Nečistoty

1. A. R = Cl:1-ethyl-3,3-difenyl-4-(2-chlorethyl)-2-pyrrolidon,
2. B. R = NH-CH₂-CH₂OH: 1-ethyl-3,3’difenyl-4-{2-[(2-hydroxyethyl)amino]ethyl}-2-pyrrolidon.

†† Doxazosini mesilas

Doxazosiniummesilat

Je to 1-(4-amino-6,7-dimethoxy-2-chinazolinyl)-4-[(2,3-dihydro-1,4-benzodioxin-2-yl)karbo-nyl]piperaziniummethansulfonat. Počítáno na bezvodou látku, obsahuje 98,5 % až 101,5 % sloučeniny C₂₄H₂₉N₅O₈S.

Vlastnosti

Bílý nebo téměř bílý krystalický prášek. Je nerozpustný ve vodě, snadno rozpustný v dimethylsulfoxidu, mírně rozpustný v methanolu.

Vykazuje polymorfismus.

Teplota tání je asi 276 °C.

Zkoušky totožnosti

Základní sestava zkoušek: A a C.

Alternativní sestava zkoušek: B a C, viz Obecné zásady (1.2).

1. A. Infračervené absorpční spektrum (2.2.24) zkoušené látky se shoduje se spektrem doxazosiniummesilatu CRL.
2. B. Hodnotí se chromatogramy získané ve zkoušce Příbuzné látky, viz Zkoušky na čistotu. Retenční čas hlavního píku na chromatogramu zkoušeného roztoku odpovídá retenčnímu času hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (c).
3. C. 0,5 g se důkladně protřepe s 30 ml vody R a směs se zfiltruje. K 10 ml čirého filtrátu se přidá 0,2 ml kyseliny octové RS a 1 ml chloridu barnatého RS2; vznikne bílá sraženina.

Zkoušky na čistotu

Příbuzné látky. Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29).

Zkoušený roztok. 25,0 mg se rozpustí ve směsi objemových dílů methanolu R a vody R (7 + 3) a zředí se stejnou směsí na 25,0 ml.

Porovnávací roztok (a). 2,0 ml zkoušeného roztoku se zředí směsí objemových dílů methanolu R a vody R (7 + 3) na 100,0 ml.

Porovnávací roztok (b). 5,0 ml porovnávacího roztoku (a) se zředí směsí objemových dílů methanolu R a vody R (7 + 3) na 50,0 ml.

Porovnávací roztok (c). 25,0 mg doxazosiniummesilatu CRL se rozpustí ve směsi objemových dílů methanolu R a vody R (7 + 3) a zředí se jí na 25,0 ml.

Porovnávací roztok (d). Ke 20,0 ml porovnávacího roztoku (c) se přidá 0,25 mg doxazosiniummesilatu nečistoty C (2-chlor-6,7-dimethoxy-4-chinazolinylaminu R), rozpustí se a zředí směsí objemových dílů methanolu R a vody R (7 + 3) na 25,0 ml.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

1. - nerezové ocelové kolony délky 0,25 m a vnitřního průměru 4,0 mm naplněné silikagelem nitrilovaným pro chromatografii R (5 μm), např. Lichrospher 100CN,
2. - mobilní fáze s průtokovou rychlostí 0,8 ml/min s následujícím gradientovým programem:

   Stanovení obsahu Uchovávání Nečistoty Diethylenglycoli monoethylicum etherum Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání Označování †† Digitoxinum Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání † Dihydralazini sulfas dihemihydricus Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání Nečistoty Dimeticonum Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Označování † Dinoprostonum Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání Nečistoty † Dinoprostum trometamoli Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání Nečistoty † Dipyridamolum Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání Nečistoty † Dirithromycinum Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání Nečistoty † Dobutamini hydrochloridum Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání Nečistoty † Dosulepini hydrochloridum Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání Nečistoty † Doxaprami hydrochloridum monohydricum Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání Nečistoty †† Doxazosini mesilas Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu

   Čas (min)	Mobilní fáze A % (V/V)	Mobilní fáze B % (V/V)	Mobilní fáze C % (V/V)
   0	78	1	15
   10	60	20	20
   20	30	20	50
   24	30	20	50

   1. - mobilní fáze A se připraví takto - k 900 ml vody R se přidá 3,96 g hydrogenfosforečnanu amonného R, po rozpuštění se pH upraví na hodnotu 3,0 kyselinou fosforečnou zředěnou RS a doplní se vodou R na objem 1000 ml,
   2. - mobilní fáze B - acetonitril pro chromatografii R,
   3. - mobilní fáze C - methanol R,

1. - spektrofotometrického detektoru s následujícím detekčním programem:

   Stanovení obsahu Uchovávání Nečistoty Diethylenglycoli monoethylicum etherum Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání Označování †† Digitoxinum Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání † Dihydralazini sulfas dihemihydricus Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání Nečistoty Dimeticonum Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Označování † Dinoprostonum Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání Nečistoty † Dinoprostum trometamoli Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání Nečistoty † Dipyridamolum Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání Nečistoty † Dirithromycinum Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání Nečistoty † Dobutamini hydrochloridum Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání Nečistoty † Dosulepini hydrochloridum Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání Nečistoty † Doxaprami hydrochloridum monohydricum Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání Nečistoty †† Doxazosini mesilas Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu

   Čas (min)	Detekce (nm)
   0 - 5	254
   5 - 7,5	220
   7,5 - 30	254

Teplota kolony se udržuje na 30 °C. Před každou analýzou se kolona promývá do ustavení rovnováhy mobilní fází počátečního složení.

Nastříkne se 10 μl porovnávacího roztoku (d). Při zaznamenání chromatogramů za předepsaných podmínek jsou retenční časy: doxazosiniummesilatu 14 min a doxazosiniummesilatu nečistoty C 9 min. Zkoušku lze hodnotit, jestliže rozlišení mezi pikem doxazosiniummesilatu a doxazosiniummesilatu nečistoty C je nejméně 15.

Nastříkne se 10 μl zkoušeného roztoku a 10 μl porovnávacího roztoku (b). Na chromatogramu zkoušeného roztoku plocha píku nečistoty A, plocha píku nečistoty B, plocha píku nečistoty C a plocha píku nečistoty D nejsou větší než plocha hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) (0,2 %), přičemž plocha píku nečistoty B se násobí odezvovým faktorem 3 a plocha píku nečistoty D se násobí odezvovým faktorem 0,7; plocha žádného dalšího píku, kromě hlavního píku, není větší než 0,5násobek plochy píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) (0,1 %); součet ploch všech píků, kromě hlavního píku, není větší než 2,5násobek plochy hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) (0,5%). Nepřihlíží se k píkům, jejichž plocha je menší než 0,1násobek plochy hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b).

Těžké kovy (2.4.8). 1,0 g vyhovuje limitní zkoušce C na těžké kovy (20 μg/g). Porovnávací roztok se připraví za použití 2 ml základního roztoku olova (10 μg Pb/ml).

Voda, semimikrostanovení (2.5.12). Nejvýše 1,0 %; stanoví se s 0,500 g zkoušené látky.

Síranový popel (2.4.14). Nejvýše 0,1 %; stanoví se s 1,00 g zkoušené látky.

Stanovení obsahu

0,500 g se rozpustí zahřátím ve 170 ml směsi stejných objemových dílů kyseliny octové bezvodé R a acetanhydridu R a titruje se kyselinou chloristou 0,1 mol/l VS za potenciometrické indikace (2.2.20) bodu ekvivalence.

1 ml kyseliny chloristé 0,1 mol/l VS odpovídá 54,76 mg C₂₄H₂₉N₅O₈S.

Uchovávání

V dobře uzavřených obalech.

Venenum.

Nečistoty

1. A. 6,7-dimethoxy-2-(1-piperazinyl)-4-chinazolinylamin,

1. B. (2,3-dihydro-1,4-benzodioxin-2-yl)-1-piperazinylketon,

1. C. 2-chlor-6,7-dimethoxy-4-chinazolinylamin,

1. D. 1,4-bis(4-amino-6,7-dimethoxy-2-chinazolinyl)piperazin.

Obr. 1. Vzorový chromatogram ke zkoušce Příbuzné látky

† Enoxaparinum natricum

Sodná sůl enoxaparinu

n = 1 až 21, R = H nebo SO₃Na, R¹ = H nebo SO₃Na nebo COCH₃

R²= H a R³= COONa nebo R² = COONa a R³ = H

Je to sodná sůl nízkomolekulárního heparinu, která se získává alkalickou depolymerizací benzylesterového derivátu heparinu z prasečí střevní sliznice. Většina složek má na neredukujícím konci svého řetězce strukturu uronatu 4-enolpyranosy.

Sodná sůl enoxaparinu vyhovuje požadavkům článku Heparina massae moleculaňs minoris s následujícími změnami a doplňky.

Průměrná molekulová hmotnost je v rozmezí 3500 až 5500 s charakteristickou hodnotou asi 4500.

Stupeň sulfatace je asi 2 % na disacharidovou jednotku.

Počítáno na vysušenou látku, účinnost je 90 m.j. až 125 m.j. účinnosti protifaktoru Xa v miligramu. Poměr účinnosti protifaktoru Xa k účinnosti protifaktoru Ha je 3,3 až 5,3.

Zkoušky totožnosti

Provede se zkouška totožnosti C uvedená v článku Heparina massae molecularis minoris s následujícími požadavky.

Průměrná molekulová hmotnost je v rozmezí 3500 až 5500. Podíl s molekulovou hmotností nižší než 2000 je 12,0% až 20,0 %. Podíl s molekulovou hmotností 2000 až 8000 je 68,0 % až 88,0 %.

Zkoušky na čistotu

Vzhled roztoku. 1,0 g se rozpustí v 10 ml vody R. Roztok je čirý (2.2.1) a není zbarven intenzivněji než stupeň 5 nej podobnějšího porovnávacího barevného roztoku (2.2.2, Metoda II).

Absorbance (2.2.25). 50,0 mg se rozpustí ve 100 ml kyseliny chlorovodíkové 0,01 mol/l RS. Specifická absorbance při 231 nm je 14,0 až 20,0, počítáno na vysušenou látku.

Benzylalkohol. Nejvýše 0,1 %. Stanoví se kapalinovou chromatografií (2.2.29).

Roztok vnitřního standardu. Připraví se roztok 3,4-dimethy (fenolu R (1 g/l) v methanolu R.

Zkoušený roztok. 0,500 g se rozpustí v 5,0 ml hydroxidu sodného 1 mol/l RS a nechá se 1 h stát. Pak se přidá 1,0 ml kyseliny octové ledové R a 1,0 ml roztoku vnitřního standardu a zředí se vodou R na 10,0 ml.

Porovnávací roztok. Připraví se roztok benzylalkoholu R (0,25 g/l) ve vodě R. 0,50 ml tohoto roztoku se smíchá s 1,0 ml roztoku vnitřního standardu a zředí se vodou R na 10,0 ml.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

1. - nerezové ocelové kolony délky 0,15 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné silikagelem oktylsilanizovaným pro chromatografii R (5 μm) a opatřené předkolonou délky 20 mm a vnitřního průměru 4,6 mm naplněnou stejnou látkou,
2. - mobilní fáze, která je směsí objemových dílů methanolu R, acetonitrilu R a vody R (5 + 15 + 80), s průtokovou rychlostí 1 ml/min,
3. - spektrofotometrického detektoru, 256 nm.

Z chromatogramu porovnávacího roztoku se vypočítá poměr (R₁) výšky píku benzylalkoholu k výšce píku vnitřního standardu. Z chromatogramu zkoušeného roztoku se vypočítá poměr (R₂) výšky píku benzylalkoholu k výšce píku vnitřního standardu.

Obsah benzylalkoholu v procentech se vypočítá podle vzorce:

v němž značí:

1. m - navážku zkoušené látky v gramech.

Sodík. 11,3 % až 13,5 %, počítáno na vysušenou látku. Stanoví se atomovou absorpční spektrometrií (2.2.23, Metoda I).

Uchovávání

Separandum.

† Erythropoietini solutio concentrata

Koncentrovaný roztok erytropoetinu

Je to roztok obsahující skupinu blízce příbuzných glykoproteinů, které nejsou rozlišitelné od přirozeného lidského erythropoetinu (urinární erythropoetin), co se týká pořadí 165 aminokyselin a jejich průměrného profilu glykosylace, v koncentraci 0,5 mg/ml až 10mg/ml. Může také obsahovat tlumivé soli a jiné pomocné látky. Má účinnost nejméně 100 000 m.j. v miligramu; stanoveno za podmínek uvedených v odstavcích Stanovení účinnosti a Bílkoviny.

Vyhovuje požadavkům článku Producta ab ADN recombinante.

Výroba

Erytropoetin se připravuje in vitro v buňkách hlodavců metodou založenou na rekombinaci DNK.

Před propuštěním se na každé šarži provedou následující zkoušky, pokud oprávněná autorita neudělí výjimku.

Bílkoviny hostitelské buňky. Požadavek stanoví oprávněná autorita.

DNK hostitelské buňky a vektoru. Požadavek stanoví oprávněná autorita.

Vlastnosti

Čirý nebo slabě opalizující bezbarvý roztok.

Zkoušky totožnosti

1. A. Při zkoušce za podmínek popsaných v odstavci Stanovení účinnosti dává příslušné odezvy.
2. B. Provede se izoelektrická fokusace.

   Zkoušený roztok. Zkoušený přípravek se odsolí vhodným postupem, např. se zředí vodou R tak, aby se získala koncentrace 1 mg/ml. Vhodný objem zředěného roztoku se přenese do systému membránové filtrace pro odsolení bílkovin a vzorek se odsolí podle návodu výrobce. Odsolený vzorek se zředí na původní objem vodou R.

   Porovnávací roztok (a). Erytropoetin BRP se rozpustí ve vodě R tak, aby získaná koncentrace byla 1 mg/ml. Provede se odsolení způsobem uvedeným pro zkoušený roztok.

   Porovnávací roztok (b). Připraví se roztok pro kalibraci izoelektrického bodu o rozmezí pH 2,5 až 6,5 podle návodu výrobce.

   Izoelektrická fokusace se provede na tenké vrstvě polyakrylamidového gelu o tloušťce vrstvy 0,5 mm obsahujícího amfolyty pokrývající pH v rozmezí 3 až 5, které se připraví následujícím způsobem. V lahvi s postranním tubusem se smíchá 9g močoviny R, 6,0 ml akrylamidu-bisakrylamidu (36,5:1) 30% RS, 1,05 ml amfolytu (o pH3 až 5), 0,45 ml amfolytu (o pH 3 až 10) a 13,5 ml vody R. Po odplynění se přidá 15 μI tetramethylethylendiaminu R a 0,3 ml čerstvě připraveného roztoku peroxodisíranu diamonného R (100 g/l).

   Gel se nalije do vhodného gelového rámečku o velikosti 15 cm x 15 cm x 0,05 cm, vloží se vhodný hřeben na vytváření jamek pro vzorky a nechá se polymerovat.

   Jako anodický roztok se použije anolyt pro izoelektrickou fokusaci o pH 3 až 5 R a jako katodický roztok se použije katolyt pro izoelektrickou fokusaci o pH 3 až 5 R. Prefokusace probíhá 1 h při konstantním výkonu 10 W s nastaveným nejvyšším napětím 2000 V a proudem 100 mA.

   Na vrstvu gelu se nanese odděleně po 15 μl každého roztoku. Fokusace pokračuje za stejných podmínek dalších 30 min. Gel se vyjme z fokusační komory a umístí se do 200 ml roztoku obsahujícího kyselinu sulfosalicylovou R (35 g/l) a kyselinu trichloroctovou R (100 g/l) v odbarvovacím roztoku RS. Za mírného pohybu se odbarvuje 30 min při pokojové teplotě. Roztok se odstraní a přidá se opět 200 ml odbarvovacího roztoku RS. Za pohybu se odbarvuje 1 h a pak se gel vysuší a přidá se 200 ml barvicího roztoku modři kyselé RS, nechá se stát 30 min a pak se odbarvuje pasivní difúzí v odbarvovacím roztoku RS, dokud nejsou dobře zřetelné zóny na čirém pozadí.

   Zkoušku lze hodnotit, jestliže rozdělení zón na elektroforeogramú; porovnávacího roztoku (b) odpovídá požadavkům výrobce na kalibraci izoelektrického bodu a elektroforeogram porovnávacího roztoku (a) odpovídá referenčnímu elektroforeogramú Ph. Eur. izoforem erytropoetinu. Je-li to nutné, nastavování a trvání napětí se může měnit tak, aby došlo k optimálnímu rozdělení izoforem. Identifikují se zóny odpovídající izoformám 2 až 7.

   Rozsah pH pásů na elektroforeogramu zkoušeného roztoku odpovídá elektroforeogramu porovnávacího roztoku (a). Hlavní zóny odpovídají izoformám 4, 5 a 6. Slabší zóny odpovídající izoformám 2, 3 a 7 mohou být též přítomny. Jiné zóny mohou být přítomny ve stopovém množství.

1. C. Provede se elektroforéza na polyakrylamidovém gelu (2.2.31) a imunoblot (2.7.1).

   Zkouška se provede na polyakrylamidovém gelu o síle 0,75 mm a ploše asi 16 cm². Rámeček na gel se složí podle návodu výrobce.

   Separační gel. V lahvi s postranním tubusem se smíchá 8,0 ml akrylamidu-bisakrylamidu (29 : 1) 30% RS, 5 ml tlumivého roztoku trometamolového o pH 8,8 (1,5 mol/l), 6,6 ml vody R a 0,2 ml roztoku laurylsíranu sodného R (100 g/l). Po odplynění se přidá 8 μl tetramethylethylendiaminu R a 0,2 ml čerstvě připraveného roztoku peroxodisíranu diamonného R (100 g/l).

   Separační gel se nanese do sestaveného zařízení a nechá se dostatečný prostor pro zaostřovací gel. Gelový roztok se překryje 2-propanolem R a nechá se zpolymerovat.

   Zaostřovací gel V lahvi s postranním tubusem se smíchá 1,0 ml akrylamidu-bisakrylamidu (29 : 1) 30% RS, 0,75 ml tlumivého roztoku trometamolového o pH 6,8 (1 mol/l), 4,1 ml vody R a 0,06 ml roztoku laurylsíranu sodného R (100 g/l). Po odplynění se přidá 6 pl tetramethyle- thylendiaminu R a 0,06 ml čerstvě připraveného roztoku peroxodisíranu diamonného R (100 g/l).

   2-propanol R se odstraní ze zpolymerovaného separačního gelu a na separační gel se naleje roztok zaostřovacího gelu. Dobře se uzavře a nechá se polymerovat.

   Roztok pro vzorky. Smíchají se stejné objemové díly SDS-PAGE koncentrovaného roztoku pro vzorky RS a vody R.

   Zkoušený roztok (a). Zkoušený přípravek se zředí ve vodě R tak, aby výsledná koncentrace byla 1,0 mg/ml. K jednomu objemovému dílu tohoto roztoku se přidá stejný objemový díl SDS-PAGE koncentrovaného roztoku pro vzorky RS.

   Zkoušený roztok (b). K 0,1 ml zkoušeného roztoku (a) se přidá 0,9 ml roztoku pro vzorky. Porovnávací roztok (a). Obsah jedné ampule erytropoetinu BRP se rozpustí v 0,25 ml vody R. Přidá se stejný objemový díl SDS-PAGE koncentrovaného roztoku pro vzorky RS.

   Porovnávací roztok (b). K 0,1 ml porovnávacího roztoku (a) se přidá 0,9 ml roztoku pro vzorky.

   Porovnávací roztok (c). Použije se roztok standardů molekulových hmotností vhodných pro kalibraci SDS-polyakrylamidové gelové elektroforézy v rozmezí 10 kD do 70 kD.

   Porovnávací roztok (d). Použije se roztok předbarvených standardů molekulových hmotností vhodných pro kalibraci SDS-polyakrylamidové gelové elektroforézy v rozmezí 10 kD až 70 kD a vhodných pro přenos elektronů na vhodnou membránu.

   Připravený gel se vloží do přístroje a přidá se přiměřený objem SDS-PAGE elektrodového roztoku RS. Zkoušené a porovnávací roztoky uchovávané v dobře uzavřených zkumavkách se na 2 min vloží do vroucí vodní lázně. Po 20 jíl každého roztoku se nanese do jamek zaostřovacího gelu v následujícím pořadí: porovnávací roztok (c), porovnávací roztok (a), zkoušený roztok (a), prázdná jamka, porovnávací roztok (b), zkoušený roztok (b), porovnávací roztok (d).

   Elektroforéza probíhá za podmínek doporučených výrobcem zařízení. Na konci separace se vyjme rámeček a gel se rozdělí na dvě části. První část obsahuje porovnávací roztok (c), porovnávací roztok (a) a zkoušený roztok (a); druhá část obsahuje porovnávací roztok (b), zkoušený roztok (b) a porovnávací roztok (d).

   První část gelu se umístí do barvicího roztoku modři kyselé RS a pohybuje se jim 1 h. Pak se gel přenese do odbarvovacího roztoku RS a nechá se v něm odbarvovat za pohybu, dokud nejsou zřetelně viditelné zóny bílkoviny na čirém pozadí. Zkoušku lze hodnotit, jestliže bílkoviny standardů molekulových hmotností jsou rozděleny do zřetelně oddělených zón, s přibližně

   lineární závislostí vzdálenosti migrace na log₁₀ molekulové hmotnosti. Elektroforeogram zkoušeného roztoku (a) ukazuje jedinou difuzní zónu odpovídající polohou a intenzitou jediné zóně na elektroforeogramu porovnávacího roztoku (a).

   Druhá část gelu se vloží na membránu, která slouží k imobilizaci bílkovin, použije se komerčně dostupné zařízení pro elektroblot a postupuje se podle návodu výrobce. Po elektroblotu se membrána inkubuje 1 h až 2 h v neutrálním izotonickém tlumivém roztoku obsahujícím vhodné srážecí činidlo, např. sušené mléko (50 g/l) nebo fetální telecí sérum 10% (V/V), a poté následuje inkubace 1 h až 14 h ve stejném srážecím roztoku s vhodně naředěnou polyklonální nebo monoklonální anti-erytropoetinovou protilátkou. Erytropoetin vázaný na protilátku se deteguje za použití vhodné protilátky značené enzymem nebo radioaktivně vázaným zkoumadlem (např. alkalická fosfatasa konjugovaná s druhou protilátkou). Přesné detaily o srážecích činidlech, koncentracích a inkubačních dobách by se měly optimalizovat za použití základních údajů popsaných v Imunochemických metodách (2.7.1).

   Zkoušku lze hodnotit, jestliže jsou na elektroforeogramu porovnávacího roztoku (d) rozděleny zóny standardů molekulových hmotností do přesných zón, s přibližně lineární závislostí vzdálenosti migrace na log₁₀ molekulové hmotnosti.

   Elektroforeogram zkoušeného roztoku (b) tvoří jedinou difuzní zónu odpovídající polohou a intenzitou zóně na elektroforeogramu porovnávacího roztoku (b).

1. D. Provede se peptidové mapování.

   Zkoušený roztok. Zkoušený přípravek se zředí tlumivým roztokem trisacetatovým o pH 8,5 na koncentraci 1,0mg/ml. Rovnováha roztoku se upraví za použití tlumivého roztoku trisacetatového o pH 8,5 vhodným postupem (např. dialýza do tlumivého roztoku trisacetatového o pH 8,5 nebo membránová filtrace, která je popsána v odstavci Zkoušky totožnosti B, ale odsolený vzorek se rozpustí v tlumivém roztoku trisacetatovém o pH 8,5). Dialyzovaný roztok se převede do polypropylenové zkumavky na odstřeďování. 5 μl čerstvě připraveného roztoku trypsinu pro peptidové mapování R (1 mg/ml) ve vodě R se přidá k 0,25 ml zkoušeného roztoku. Zkumavka se uzavře a vloží se na 18 h do vodní lázně 37 °C teplé. Potom se vzorek vyjme z vodní lázně a reakce se ihned přeruší zmrazením.

   Porovnávací roztok. Obsah jedné ampule erythropoetinu BRP se rozpustí v 0,25 ml vody R. Dále se tento roztok zpracovává současně stejnými postupy a za stejných podmínek jako zkoušený roztok.

   Oba enzymaticky štěpené roztoky se zkouší kapalinovou chromatografií (2.2.29). Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

   1. - nerezové ocelové kolony délky 0,25 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné silikagelem butylsilanizovaným pro chromatografii R (5 Jim až 10 (μm),
   2. - mobilních fází:
      1. - mobilní fáze A - roztok kyseliny trifluoroctové R 0,06 % (V/V),
      2. - mobilní fáze B - ke 100 ml vody R se přidá 0,6 ml kyseliny trifluoroctové R a zředí se acetonitrilem pro chromatografii R na 1000 ml,
   1. - elučních podmínek, které jsou uvedeny v následující tabulce (je-li nutné, gradient může být změněn, aby se zlepšilo rozdělení hydrolyzátu):

      Stanovení obsahu Uchovávání Nečistoty Diethylenglycoli monoethylicum etherum Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání Označování †† Digitoxinum Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání † Dihydralazini sulfas dihemihydricus Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání Nečistoty Dimeticonum Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Označování † Dinoprostonum Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání Nečistoty † Dinoprostum trometamoli Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání Nečistoty † Dipyridamolum Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání Nečistoty † Dirithromycinum Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání Nečistoty † Dobutamini hydrochloridum Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání Nečistoty † Dosulepini hydrochloridum Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání Nečistoty † Doxaprami hydrochloridum monohydricum Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání Nečistoty †† Doxazosini mesilas Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání Nečistoty † Enoxaparinum natricum Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Uchovávání † Erythropoietini solutio concentrata Výroba Vlastnosti Zkoušky totožnosti

      Čas (min)	Průtoková rychlost (ml/min)	Mobilní fáze A % (V/V)	Mobilní fáze B % (V/V)	Poznámka
      0 - 10	0,75	100	0	izokraticky
      10 - 125	0,75	100 → 39	0 → 61	lineární gradient
      125 - 135	1,25	39 → 17	31 → 83	lineární gradient
      135 - 145	1,25	17 → 0	83 → 100	lineární gradient
      145 - 150	1,25	100	0	ustalování

   1. - spektrofotometrického detektoru, 214 nm.

   Kolona se nejméně 15 min ustaluje za počátečních podmínek. Provede se slepá zkouška za výše zmíněného gradientu.

   Nastříkne se 50 μ zkoušeného roztoku a 50 μl porovnávacího roztoku. Zkoušku lze hodnotit, jestliže chromatogramy jednotlivých roztoků kvalitativně odpovídají referenčnímu chromatogramu Ph. Eur. enzymaticky štěpeného erythropoetinu. Chromatografický profil zkoušeného roztoku odpovídá chromatogramu porovnávacího roztoku.

1. E. Provede se N-terminální sekvenční analýza.

   Provede se Edmanovo odbourávání za použití automatického sekvetátoru v pevné fázi v souladu s návodem výrobce.

   Odsolí se množství odpovídající 50 μg erytropoetinu, např. zředí se takový objemový díl zkoušeného přípravku odpovídající 50 μg účinné látky v 1 ml roztoku kyseliny trifluoroctové R 0,1% (V/V). Nejdříve se promyje preparativní kolona C18 reverzní fází podle doporučení výrobce a ustálí se v kyselině trifluoroctové R 0,1% (V/V). Přidá se vzorek na kolonu a promývá se postupně řadou směsí kyseliny trifluoroctové R 0,1% (V/V) s acetonitrilem R (0% (V/V), 10% (V/V) a 50% (V/V)) podle doporučení výrobce. 50% acetonitrilový eluát se lyofilizuje.

   Odsolený vzorek se opět rozpustí v 50 μl kyseliny trifluoroctové R 0,1% (V/V) a převede se do dělicí kolony podle návodu výrobce. Nechá se probíhat 15 cyklů rozdělování, při druhém a třetím cyklu se použijí reakční podmínky pro prolin.

   Při každém rozdělovacím cyklu se provede zkouška totožnosti aminokyselin uvolněných fenylthiohydantoinem (dále PTH-aminokyselin) reverzně fázovou kapalinovou chromatografií. Postup může být proveden za použití kolon a zkoumadel doporučených výrobcem zařízení na separaci PTH-aminokyselin.

   Separační postup by měl být kalibrován za použití:

   1. - směsi PTH-aminokyselin dodávaných výrobcem za podmínek gradientu nastavených, jak je uvedeno, k optimálnímu rozlišení všech aminokyselin,
   2. - vzorku získaného ze slepého separačního cyklu podle doporučení výrobce zařízení.

   Prvních 15 aminokyselin je:

   1. alanin - prolin - prolin - arginin - leucin - isoleucin - (nereprodukovatelný pík) - kyselina asparagová - serin - arginin - valin - leucin - kyselina glutamová - arginin - tyrosin.

Zkoušky na čistotu

Bílkoviny. Stanoví se absorpční spektrofotometru v ultrafialové oblasti (2.2.25).

Zkoušený roztok. Zkoušený přípravek se zředí roztokem hydrogenuhličitanu amonného R (4 g/l) na výslednou koncentraci 1 mg/ml.

Měří se absorbance při 250 nm až 400 nm. Roztok vykazuje absorpční maximum při 276 nm až 280 nm. Pro korekci možného rozptylu světla se měří zákal při 400 nm. Koncentrace erytropoetinu se vypočítá s použitím specifické absorbance, jejíž hodnota je 7,43. Koncentrace erytropoetinu je 80 % až 120 % deklarované koncentrace.

Dimery a příbuzné látky s vyšší molekulovou hmotností. Provede se vylučovací chromatografie (2.2.30).

Zkoušený roztok. Zkoušený přípravek se zředí mobilní fází na koncentraci 0,2 mg/ml.

Porovnávací roztok. K 0,02 ml zkoušeného roztoku se přidá 0,98 ml mobilní fáze.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

1. - nerezové ocelové kolony délky 0,6 m a vnitřního průměru 7,5 mm naplněné silikagelem hydro- filním pro c hro máto g rafii R, jakosti vhodné pro dělení globulárních bílkovin o molekulové hmotnosti 20 000 až 200 000,
2. - mobilní fáze připravené následujícím způsobem: 1,15 g hydrogenfosforečnanu sodného bezvodého R, 0,2 g dihydrogenfosforečnanu draselného R a 23,4 g chloridu sodného R se rozpustí v 11 vody R [dihydrogenfosforečnan draselný (1,5mmol/l), hydrogenfosforečnan sodný (8,1 mmol/l), chlorid sodný (0,4 mol/l), pH 7,4], je-li nutno, pH se upraví na hodnotu 7,4; průtoková rychlost je 0,5 ml/min
3. - spektrofotometrického detektoru, 214 nm.

Nastříkne se 100 μl zkoušeného roztoku a 100 μl porovnávacího roztoku. Chromatogram se zaznamenává nejméně 1 h. Na chromatogramu zkoušeného roztoku součet ploch píků eluováných před hlavním píkem není větší než plocha hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (2 %). Zkoušku lze hodnotit, jestliže plocha hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku je 1,5 % až 2,5 % plochy hlavního píku na chromatogramu zkoušeného roztoku.

Kyselina sialová.

Zkoušený roztok (a). Zkoušený přípravek se zředí mobilní fází, která byla použita ve zkoušce Dimery a příbuzné látky s vyšší molekulovou hmotností, na koncentraci 0,3 mg/ml.

Zkoušený roztok (b). K 0,5 ml zkoušeného roztoku (a) se přidá 0,5 ml mobilní fáze, která byla použita ve zkoušce Dimery a příbuzné látky s vyšší molekulovou hmotností.

Porovnávací roztok (a). Vhodné množství kyseliny sialové R se rozpustí ve vodě R na koncentraci 0,1 mg/ml.

Porovnávací roztok (b). K 0,8 ml porovnávacího roztoku (a) se přidá 0,2 ml vody R.

Porovnávací roztok (c). K 0,6 ml porovnávacího roztoku (a) se přidá 0,4 ml vody R.

Porovnávací roztok (d). K 0,4 ml porovnávacího roztoku (a) se přidá 0,6 ml vody R.

Porovnávací roztok (e). K 0,2 ml porovnávacího roztoku (a) se přidá 0,8 ml vody R.

Porovnávací roztok (f). Použije se voda R.

Provede se trojí stanovení. Převede se 100 μl každého zkoušeného a porovnávacího roztoku do 10ml skleněných zkumavek. Do každé zkumavky se přidá 1,0 ml zkoumadla resorcinolového R. Zkumavky se uzavřou a nechají se 30 min při teplotě 100 °C. Po ochlazení ledem se do každé zkumavky přidají 2,0 ml směsi objemových dílů butanolu R a octanu butylnatého R (12 + 48). Intenzivně se promíchá a nechají se oddělit dvě fáze. Pokud je horní fáze zcela čirá, opatrně se oddělí spodní fáze a odstraní se. Měří se absorbance (2.2.25) všech roztoků při 580 nm. Z kalibrační křivky vytvořené porovnávacími roztoky se stanoví obsah kyseliny sialové v obou zkoušených roztocích a vypočítá se průměrná hodnota. Při výpočtu počtu molů kyseliny sialové v 1 molu erytropoetinu se bere v úvahu, že:

1. - molekulová hmotnost erytropoetinu je 30 600,
2. - molekulová hmotnost kyseliny sialové je 309.

Zkoušený přípravek obsahuje nejméně 10 mol kyseliny sialové v 1 molu erytropoetinu. Zkoušku lze hodnotit, jestliže jednotlivé stanovení je v rozsahu ±10 % a pokud hodnota porovnávacího roztoku (a) je 1,5násobek až 2,5násobek zkoušeného roztoku (a).

Bakteriální endotoxiny (2.6.14). Nejvýše 20 m.j. endotoxinu v objemu obsahujícím 100 000 m.j. erytropoetinu.

Stanovení účinnosti

Účinnost přípravku se porovnává s účinností erytropoetinu BRP a vyjadřuje se v mezinárodních jednotkách (m.j.).

Stanovená účinnost je 80 % až 125 % deklarované účinnosti. Meze spolehlivosti stanovené účinnosti (P = 0,95) jsou 64 % až 156 % deklarované účinnosti.

Stanovení účinnosti se provede metodou A nebo B.

1. A. Na polycytémických myších

   Účinnost přípravku se stanoví v daných podmínkách hodnocením jeho působení na stimulaci příjmu ⁵⁹Fe červených krvinek myší, které byly vystaveny sníženému atmosférickému tlaku a staly se polycytémickými.

   Následující plán, užívající podtlakovou komoru, se ukázal být vhodným.

   Polycytémie se vyvolá u samic myší stejného kmene a hmotnosti 16 g až 18 g. Samice myší se umístí do podtlakové komory o tlaku 0,6 atm. Po 3 dnech při 0,6 atm se tlak sníží na 0,4 atm až 0,5 atm, při kterém se zvířata nechají dalších 11 dní. (Částečné vakuum je denně přerušeno na maximálně 1 h okolo 11.00 h k zajištění úklidu klecí a potravy pro zvířata.) Po skončení tohoto specifického období se myši vrátí do normálních atmosférických podmínek. Namátkově se rozdělí do klecí po šesti zvířatech a označí se.

   Zkoušený roztok (a). Zkoušený přípravek se rozpustí v tlumivém roztoku fosforečnan-albuminovém o pH 7,2 (1) na koncentraci 0,2 m.j./ml.

   Zkoušený roztok (b). Smíchají se stejné objemové díly zkoušeného roztoku (a) a tlumivého roztoku fosforečnan-albuminového o pH 7,2 (1).

   Zkoušený roztok (c). Smíchají se stejné objemové díly zkoušeného roztoku (b) a tlumivého roztoku fosforečnan-albuminového o pH 7,2 (1).

   Porovnávací roztok (a). Erytropoetin BRP se rozpustí v tlumivém roztoku fosforečnan-albuminovém o pH 7,2 (1) na koncentraci 0,2 m.j./ml.

   Porovnávací roztok (b). Smíchají se stejné objemové díly porovnávacího roztoku (a) a tlumivého roztoku fosforečnan-albuminového o pH 7,2 (1).

   Porovnávací roztok (c) Smíchají se stejné objemové díly porovnávacího roztoku (b) a tlumivého roztoku fosforečnan-albuminového o pH 7,2 (1).

   Radioaktivně značený roztok chloridu železitého (koncentrovaný) ⁵⁹Fe. Použije se vyráběný ⁵⁹Fe-chlorid železitý (o specifické aktivitě 100 MBq až 1000 MBq na miligram Fe).

   Radioaktivně značený roztok chloridu železitého ⁵⁹Fe. Radioaktivně značený koncentrovaný roztok chloridu železitého se zředí tlumivým roztokem citronanovým o pH 7,8 na aktivitu 3,7 x 10⁴Bq/ml.

   Koncentrace zkoušených roztoků a porovnávacích roztoků se mohou změnit podle odezvy použitých zvířat.

   Tři dny po návratu zvířat do atmosférického tlaku se každému zvířeti podkožně vstříkne 0,2 ml jednoho roztoku. Ze šesti zvířat v každé kleci se každému zvířeti podá jeden ze šesti různých roztoků (3 zkoušené roztoky a 3 porovnávací roztoky) a pořadí injekcí by mělo být pro každou klec náhodně určeno. Nejméně se doporučuje n = osm (osm klecí).

   Dva dny po injekci zkoušeného nebo porovnávacího roztoku se každému zvířeti intraperitonálně vstříkne 0,2 ml radioaktivně značeného roztoku chloridu železitého ⁵⁹Fe. Pořadí injekcí je stejné jako při podání erytropoetinu a doba mezi podáním erytropoetinu a radioaktivně značeného roztoku chloridu železitého je pro každé zvíře stejná.

   Za dalších 48 h se každé zvíře uspí injekcí vhodného anestetika, zaznamená se tělesná hmotnost a z rozvětvení aorty se odeberou vzorky krve (0,65 ml) do hematokritových kapilár. Po určení objemu sražených buněk se změří radioaktivita každého vzorku.

   Pro každou myš se vypočítá odezva (% ⁵⁹Fe v celkovém krevním oběhu) podle vztahu:

   v němž značí:

   1. A_s - radioaktivitu vzorku,
   2. A_t - celkovou podanou aktivitu,
   3. 7,5 - celkový objem krve v procentech tělesné hmotnosti,
   4. M - tělesnou hmotnost v gramech,
   5. V_s - objem vzorku.

   Účinnost se vypočítá obvyklými statistickými metodami vhodnými pro model rovnoběžnosti. Z výpočtu se vyloučí zvíře, jehož objem sražených buněk je méně než 54 % nebo tělesná hmotnost je více než 24 g.

1. B. Na normocytémických myších

   Zkouška je založena na měření stimulace tvorby retikulocytů u normocytémických myší. Zkouška se může provést následujícím postupem:

   Zkoušený roztok (a). Zkoušený přípravek se zředí tlumivým roztokem fosforečnan-albuminovým o pH 7,2 (1) na koncentraci 80 m.j./ml.

   Zkoušený roztok (b). Smíchají se stejné objemové díly zkoušeného roztoku (a) a tlumivého roztoku fosforečnan-albuminového o pH 7,2 (1).

   Zkoušený roztok (c). Smíchají se stejné objemové díly zkoušeného roztoku (b) a tlumivého roztoku fosforečnan-albuminového o pH 7,2 (1).

   Porovnávací roztok (a). Erytropoetin BRP se rozpustí v tlumivém roztoku fosforečnan-albuminovém o pH 7,2 (1) na koncentraci 80 m.j./ml.

   Porovnávací roztok (b). Smíchají se stejné objemové díly porovnávacího roztoku (a) a tlumivého roztoku fosforečnan-albuminového o pH 7,2 (1).

   Porovnávací roztok (c). Smíchají se stejné objemové díly porovnávacího roztoku (b) a tlumivého roztoku fosforečnan-albuminového o pH 7,2 (1).

   Přesné koncentrace zkoušených roztoků a porovnávacích roztoků se mohou změnit podle odezvy použitých zvířat.

   Na začátku zkoušení se náhodně rozdělí myši vhodného věku a kmene (jsou vhodné 8 týdnů staré myši B6D2F1) do šesti klecí. Doporučuje se nejméně n = 8 (počet myší v kleci). Každému zvířeti se podkožně vstříkne 0,5 ml příslušného roztoku (1 roztok na klec) a zvíře se umístí v nové kleci. Myši se střídají tak, aby každá klec obsahovala šest myší, z nichž každé byl podán jiný roztok (tj. jeden ze tří zkoušených nebo tří porovnávacích roztoků).

   Za 4 dny po injekci se odeberou vzorky krve zvířat a stanoví se počet retikulocytů vhodným způsobem. Může se použít následující metoda:

   Objem krve, postup ředění a fluorescenční látka mohou být změněny k dosažení maximální a stabilní fluorescence.

   Barvicí roztok (koncentrovaný). Použije se roztok thiazolové oranže vhodné pro stanovení retikulocytů. Připraví se dvojnásobná koncentrace, než je třeba pro analýzu.

   Provádí se následující ředění. Plná krev se 500krát zředí tlumivým roztokem použitým k přípravě barvicího roztoku. Tento roztok se koncentrovaným barvicím roztokem zředí na dvojnásobný objem. Po 3 min až 10 min barvení se stanoví mikrofluorimetricky počet retikulocytů v průtokovém cytometru. Procento retikulocytů se určí použitím biparametrického histogramu: počet buněk a červená fluorescence F1 (620 nm).

   Účinnost se vypočítá obvyklými statistickými metodami pro model rovnoběžnosti.

Uchovávání

Uchovává se ve vzduchotěsných obalech při teplotě pod –20 °C. Je třeba se vyvarovat opakovaného zmrazení a rozmražení.

Separandum.

Označování

V označení na obalu se uvede:

1. - obsah erytropoetinu v miligramech na mililitr,
2. - účinnost v mezinárodních jednotkách na mililitr,
3. - název a koncentrace pomocných látek.

†† Estriolum

Estriol

Je to 1,3,5(10)-estratrien-3,16a,17p-triol. Počítáno na vysušenou látku, obsahuje 97,0% až 103,0 % sloučeniny C₁₈H₂₄O₃.

Vlastnosti

Bílý nebo téměř bílý krystalický prášek. Je prakticky nerozpustný ve vodě, mírně rozpustný v lihu 96%.

Taje při asi 282 °C.

Zkoušky totožnosti

1. A. Infračervené absorpční spektrum (2.2.24) zkoušené látky se shoduje se spektrem estriolu CRL.
2. B. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití vrstvy vhodného silikagelu.

   Zkoušený roztok. 10 mg se rozpustí v methanolu R a zředí se jím na 10 ml.

   Porovnávací roztok (a). 10 mg estriolu CRL se rozpustí v methanolu R a zředí se jím na 10 ml.

   Porovnávací roztok (b). 5 mg estradiolu hemihydrátu CRL se rozpustí v porovnávacím roztoku (a) a zředí se jím na 5 ml.