Vyhláška Ministerstva zdravotnictví, kterou se mění vyhláška Ministerstva zdravotnictví č. 1/1998 Sb., kterou se stanoví požadavky na jakost, postup při přípravě, zkoušení, uchovávání a dávkování léčiv (Český lékopis 1997)

Podíl mastných kyselin. Provede se zkouška Cizí oleje v mastných olejích plynovou chromatografií (2.4.22). Podíl mastných kyselin v oleji má následující složení:

1. - kyselina palmitová: 4,0 % až 9,0 %,
2. - kyselina stearová: 1,0 % až 7,0 %,
3. - kyselina olejová: 14,0 % až 40,0 %,
4. - kyselina linolová: 48,0 % až 74,0 %.

Uchovávání

Ve zcela naplněných, vzduchotěsných obalech, chráněn před světlem.

Označování

V označení na obalu se uvede:

1. - název a množství přidaného antioxidantu,
2. - zda byl olej získán lisováním nebo extrakcí.

Hexetidinum

Hexetidin

Je to 1,3-bis(2-ethylhexyl)-5-methylhexahydropyrimidin-5-amin. Obsahuje 98,0 % až 102,0 % sloučeniny C₂₁H₄₅N₃.

Vlastnosti

Bezbarvá nebo slabě nažloutlá olejovitá kapalina. Je velmi těžce rozpustný ve vodě, velmi snadno rozpustný v acetonu, v lihu 96% a v dichlormethanu. Rozpouští se ve zředěných minerálních kyselinách.

Zkoušky totožnosti

Základní sestava zkoušek: A.

Alternativní sestava zkoušek: B, C a D, viz Obecné zásady (1.2).

1. A. Infračervené absorpční spektrum (2.2.24) zkoušené látky se shoduje se spektrem hexetidinu CRL.
2. B. Hodnotí se chromatogramy ze zkoušky Příbuzné látky, viz Zkoušky na čistotu. Hlavní skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku (b) se polohou, barvou a velikostí shoduje s hlavní skvrnou na chromatogramu porovnávacího roztoku (a).
3. C. K 0,2 ml se přidají 2 ml kyseliny sírové R a 2 mg kyseliny chromotropové sodné soli R a zahřívá se ve vodní lázni při 60 °C; vzniká fialové zbarvení.
4. D. 0,2 ml se rozpustí v 1 ml dichlormethanu R. Přidá se 0,5 ml síranu měďnatého RS, 0,05 ml kyseliny sírové v lihu 0,25 mol/l RS a 5 ml vody R, protřepe se a nechá se stát; spodní vrstva má tmavě modré zbarvení.

Zkoušky na čistotu

Vzhled. Zkoušená látka je čirá (2.2.1) a není zbarvena intenzivněji než porovnávací barevné roztoky Ž₅ nebo ZŽ₅ (2.2.2, Metoda II).

Relativní hustota (2.2.5). 0,864 až 0,870.

Index lomu (2.2.6). 1,461 až 1,467.

Optická otáčivost (2.2.7). – 0,10° až +0,10°; měří se roztok připravený rozpuštěním 1,0 g v ethanolu R a zředěním stejným rozpouštědlem na 10,0 ml.

Absorbance (2.2.25). 0,50 g se rozpustí v heptanu R a zředí se jím na 50,0 ml. Absorbance roztoku měřená při 270 nm až 350 nm není větší než 0,1.

Příbuzné látky. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití vrstvy silikagelu H R.

Roztoky se připravují bezprostředně před použitím.

Zkoušený roztok (a). 2,0 g se rozpustí v heptanu R a zředí se jím na 20 ml.

Zkoušený roztok (b). 1 ml zkoušeného roztoku (a) se zředí heptanem R na 10 ml.

Porovnávací roztok (a). 20 mg hexetidinu CRL se rozpustí v heptanu R a zředí se jím na 2 ml. Porovnávací roztok (b). 1 ml zkoušeného roztoku (a) se zředí heptanem R na 100 ml.

Porovnávací roztok (c). 5 ml porovnávacího roztoku (b) se zředí heptanem R na 10 ml. Porovnávací roztok (d). 10 mg dehydrohexetidinu CRL se rozpustí ve zkoušeném roztoku (a) a zředí se jím na 10 ml.

Na vrstvu se nanese odděleně po 1 μl každého roztoku. Na dno chromatografické komory se umístí odpařovací miska obsahující amoniak 32% R. Suchá deska se umístí do komory, komora se uzavře a na vrstvu se 15 min nechají působit páry amoniaku. Deska se vyjme a nechá se odvětrat v proudu vzduchu do vymizení pachu rozpouštědel. Vyvíjí se směsí objemových dílů methanolu R a toluenu R (20 + 80) po dráze 15 cm. Vrstva se nechá uschnout na vzduchu a vystaví se na 30 min působení jodových par. Na chromatogramu zkoušeného roztoku (a) žádná skvrna, kromě hlavní skvrny, není intenzivnější než skvrna na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) (1 %) a nejvýše dvě skvrny jsou intenzivnější než skvrna na chromatogramu porovnávacího roztoku (c) (0,5 %). Zkoušku lze hodnotit, jestliže na chromatogramu porovnávacího roztoku (d) jsou dvě zřetelně oddělené skvrny.

Těžké kovy (2.4.8). 2,0 g se rozpustí ve směsi objemových dílů vody R a acetonu R (15 + 85) a zředí se jí na 20 ml. 12 ml tohoto roztoku vyhovuje limitní zkoušce B na těžké kovy (10 μg/g). Porovnávací roztok olova 1 μgPb/ml) se připraví zředěním základního roztoku olova (100 μg Pb/ml) směsí objemových dílů vody R a acetonu R (15 + 85).

Síranový popel (2.4.14). Nejvýše 0,1 %; stanoví se s 1,00 g zkoušené látky.

Stanovení obsahu

0,150 g se rozpustí v 80 ml kyseliny octové bezvodé R a titruje se kyselinou chloristou 0,1 mol/l VS za potenciometrické indikace bodu ekvivalence (2.2.20).

1 ml kyseliny chloristé 0,1 mol/l VS odpovídá 16,98 mg C₂₁H₄₅N₃.

Uchovávání

V dobře uzavřených obalech, chráněn před světlem.

Nečistoty

1. A. 2-ethyl-N-{[ -(2-ethylhexyl)-4-methyl-4,5-dihydro-1H-imidazol-4-yl]methyl} hexan-1-amin (dehydrohexetidin),

1. B. N,Nˊ-bis (2-ethylhexyl)-2-methylpropan-1,2,3-triamin (triamin),

1. C. 2,6-bis(2-ethylhexy)-7a-methylhexahydro-1H-imidazo[1,5-c]imidazol(hexedin),

1. D. Kyselina 1,5-naftalendisulfonova

† Histidini hydrochloridum monohydricum¹)

Monohydrát histidiniumchloridu

Je to monohydrát (S)-4-(2-amino-2-karboxyethyl)imidazoliumchloridu. Počítáno na vysušenou látku, obsahuje 98,5 % až 101,0 % sloučeniny C₆H₁₀ClN₃O₂.

Výroba

Je-li vyráběn fermentací, vyhovuje požadavkům článku Producta fermentationis.

Vlastnosti

Bílý krystalický prášek nebo bezbarvé krystaly. Je snadno rozpustný ve vodě, těžce rozpustný v lihu 96%, prakticky nerozpustný v etheru.

Zkoušky totožnosti

Základní sestava zkoušek: A, B, C a F.

Alternativní sestava zkoušek: A, B, D, E a F, viz Obecné zásady (1.2).

1. A. Zkouška Specifická optická otáčivost, viz Zkoušky na čistotu, je zároveň zkouškou totožnosti.
2. B. Zkouška Hodnota pH, viz Zkoušky na čistotu, je zároveň zkouškou totožnosti.
3. C. Infračervené absorpční spektrum (2.2.24) tablety zkoušené látky se shoduje se spektrem tablety monohydrátu histidiniumchloridu CRL.
4. D. Hodnotí se chromatogramy získané ve zkoušce Látky reagující s ninhydrinem, viz Zkoušky na čistotu. Hlavní skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku (b) odpovídá polohou, zbarvením a velikostí hlavní skvrně na chromatogramu porovnávacího roztoku (a).
5. E. Asi 0,1 g se rozpustí v 7 ml vody R a přidají se 3 ml roztoku hydroxidu sodného R (200 g/l) (roztok 1). 50 mg kyseliny sulfanilové R se rozpustí ve směsi 0,1 ml kyseliny chlorovodíkové R a 10 ml vody R a přidá se 0,1 ml dusitanu sodného RS (roztok 2). Roztok 2 se přidá k roztoku 1 a promíchá se; vzniká oranžově červené zbarvení.
6. F. Asi 20 mg vyhovuje zkoušce (a) na chloridy (2.3.1).

Zkoušky na čistotu

Roztok S. 2,5 g se rozpustí ve vodě prosté oxidu uhličitého R připravené z vody destilované R a zředí se jí na 50 ml.

Vzhled roztoku. Roztok S je čirý (2.2.1) a není zbarven intenzivněji než porovnávací barevný roztok HŽ₆ (2.2.2, Metoda II).

Hodnota pH (2.2.3). 3,0 až 5,0; měří se roztok S.

Specifická optická otáčivost (2.2.7). +9,2° až +10,6°, počítáno na vysušenou látku; měří se roztok připravený rozpuštěním 2,75 g ve 12,0 ml kyseliny chlorovodíkové RS1 a zředěním vodou R na 25,0 ml.

Látky reagující s ninhydrinem. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití desky s vrstvou silikagelu pro TLC R.

Zkoušený roztok (a). 0,10 g se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 10 ml.

Zkoušený roztok (b). 1 ml zkoušeného roztoku (a) se zředí vodou R na 50 ml.

Porovnávací roztok (a). 10 mg monohydrátu histidiniumchloridu CRL se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 50 ml.

Porovnávací roztok (b). 5 ml zkoušeného roztoku (b) se zředí vodou R na 20 ml.

Porovnávací roztok (c). 10 mg monohydrátu histidiniumchloridu CRL a 10 mg prolinu CRL se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 25 ml.

Na vrstvu se odděleně nanese po 5 μl každého roztoku, vysuší se v proudu vzduchu a vyvíjí se směsí objemových dílů kyseliny octové ledové R, vody R a 1-butanolu R (20 + 20 + 60) po dráze 15 cm. Vrstva se vysuší na vzduchu, postříká se ninhydrinem RS a zahřívá se 15 min při 100 °C až 105 °C. Žádná skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku (a), kromě hlavní skvrny, není intenzivnější než skvrna na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) (0,5 %). Zkoušku lze hodnotit, jestliže na chromatogramu porovnávacího roztoku (c) jsou dvě zřetelně oddělené skvrny.

Sírany (2.4.13). 10 ml roztoku S se zředí vodou destilovanou R na 15 ml. Tento roztok vyhovuje limitní zkoušce na sírany (300 μg/g).

Amonium. Připraví se dvě hodinová sklíčka o průměru 60 mm a umístí se vedle sebe. Na vnitřní stěnu horního sklíčka se přilepí čtvereček papíru lakmusového červeného R o straně 5 mm a zvlhčí

se několika kapkami vody R. 50 mg jemně upráškované zkoušené látky se umístí na spodní hodinové sklíčko a rozpustí se v 0,5 ml vody R. K roztoku se přidá 0,30 g oxidu horečnatého těžkého R a rychle se zamíchá skleněnou tyčinkou. Sklíčko s lakmusovým papírem se překlopí na sklíčko se zkoušenou látkou a vzniklá komůrka se zahřívá 15 min při 40 °C. Lakmusový papír není zbarven intenzivněji modře než lakmusový papír u porovnávacího vzorku připraveného současně stejným způsobem za použití 0,1 ml základního roztoku amonia (100 μg NH₄/ml), 0,5 ml vody R a 0,30 g oxidu horečnatého těžkého R (200 μg/g).

Železo (2.4.9). 1,0 g se rozpustí v dělicí nálevce v 10 ml kyseliny chlorovodíkové zředěné RS a vytřepává se třikrát po 3 min vždy s 10 ml isobutylmethylketonu R1. Ke spojeným organickým vrstvám se přidá 10 ml vody R a třepe se 3 min. Vodná vrstva vyhovuje limitní zkoušce na železo (10 μg/g).

Těžké kovy (2.4.8). 2,0 g se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 20 ml. 12 ml tohoto roztoku vyhovuje limitní zkoušce A na těžké kovy (10 μg/g). Porovnávací roztok se připraví za použití základního roztoku olova (1 μg Pb/ml).

Ztráta sušením (2.2.32). 7,0 % až 10 %; 1,000 g se suší v sušárně při 145 °C až 150 °C.

Síranový popel (2.4.14). Nejvýše 0,1 %; stanoví se s 1,00 g zkoušené látky.

Stanovení obsahu

0,160 g se rozpustí v 50 ml vody prosté oxidu uhličitého R a titruje se hydroxidem sodným 0,1 mol/l VS za potenciometrické indikace bodu ekvivalence (2.2.20).

1 ml hydroxidu sodného 0,1 mol/l VS odpovídá 19,16 mg C₆H₁₀C1N₃O₂.

Uchovávání

V dobře uzavřených obalech, chráněn před světlem.

Separandum.

† Histidinum¹)

Histidin

Je to kyselina (S)-2-amino-3-(4-imidazolyl)propionová. Počítáno na vysušenou látku, obsahuje 98,5 % až 101,0 % sloučeniny C₆H₉N₃O₂.

Výroba

Je-li vyráběn fermentací, vyhovuje požadavkům článku Producta fermentationis.

Vlastnosti

Bílý krystalický prášek nebo bezbarvé krystaly. Je dobře rozpustný ve vodě, velmi těžce rozpustný v lihu 96%, prakticky nerozpustný v etheru.

Zkoušky totožnosti

Základní sestava zkoušek: A a B.

Alternativní sestava zkoušek: A, C a D, viz Obecné zásady (1.2).

1. A. Zkouška Specifická optická otáčivost, viz Zkoušky na čistotu Je zároveň zkouškou totožnosti.
2. B. Infračervené absorpční spektrum (2.2.24) tablety zkoušené látky se shoduje se spektrem tablety histidinu CRL. Jestliže se spektrum zkoušené látky liší od spektra referenční látky, rozpustí se odděleně obě látky v co nejmenším množství vody R, odpaří se při 60 °C do sucha a se získanými zbytky se zaznamenají nová spektra.
3. C. Hodnotí se chromatogramy získané ve zkoušce Látky reagující s ninhydrinem, viz Zkoušky na čistotu. Hlavní skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku (b) odpovídá polohou, zbarvením a velikostí hlavní skvrně na chromatogramu porovnávacího roztoku (a).
4. D. Asi 0,1 g se rozpustí v 7 ml vody R a přidají se 3 ml roztoku hydroxidu sodného R (200 g/l) (roztok 1). 50 mg kyseliny sulfanilové R se rozpustí ve směsi 0,1 ml kyseliny chlorovodíkové R a 10 ml vody R a přidá se 0,1 ml dusitanu sodného RS (roztok 2). Roztok 2 se přidá k roztoku 1 a promíchá se; vzniká oranžově červené zbarvení.

Zkoušky na čistotu

Roztok S. 2,5 g se rozpustí zahřátím ve vodní lázni ve vodě destilované R a zředí se jí na 50 ml.

Vzhled roztoku. Roztok S je čirý (2.2.1) a není zbarven intenzivněji než porovnávací barevný roztok HŽ₇ (2.2.2, Metoda II).

Specifická optická otáčivost (2.2.7). +11,8° až +12,8°, počítáno na vysušenou látku; měří se roztok připravený rozpuštěním 2,75 g ve 12,0 ml kyseliny chlorovodíkové RS a zředěním vodou R na 25,0 ml.

Látky reagující s ninhydrinem. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití desky s vrstvou silikagelu pro TLC R.

Zkoušený roztok (a). 0,10 g se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 10 ml.

Zkoušený roztok (b). 1 ml zkoušeného roztoku (a) se zředí vodou R na 50 ml.

Porovnávací roztok (a). 10 mg histidinu CRL se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 50 ml. Porovnávací roztok (b). 5 ml zkoušeného roztoku (b) se zředí vodou R na 20 ml.

Porovnávací roztok (c). 10 mg histidinu CRL a 10 mg prolinu CRL se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 25 ml.

Na vrstvu se odděleně nanese po 5 μl každého roztoku, vysuší se v proudu vzduchu a vyvíjí se směsí objemových dílů kyseliny octové ledové R, vody R a 1-butanolu R (20 + 20 + 60) po dráze 15 cm. Vrstva se vysuší na vzduchu, postříká se ninhydrinem RS a zahřívá se 15 min při 100 °C až 105 °C. Žádná skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku (a), kromě hlavní skvrny, není intenzivnější než skvrna na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) (0,5 %). Zkoušku lze hodnotit, jestliže na chromatogramu porovnávacího roztoku (c) jsou dvě zřetelně oddělené skvrny.

Chloridy (2.4.4). 5 ml roztoku S zředěného vodou R na 15 ml vyhovuje limitní zkoušce na chloridy (200 μg/g).

Sírany (2.4.13). 10 ml roztoku S se zředí vodou destilovanou R na 15 ml. Tento roztok vyhovuje limitní zkoušce na sírany (300 μg/g).

Amonium. Připraví se dvě hodinová sklíčka o průměru 60 mm a umístí se vedle sebe. Na vnitřní stěnu horního sklíčka se přilepí čtvereček papíru lakmusového červeného R o straně 5 mm a zvlhčí se několika kapkami vody R. 50 mg jemně upráškované zkoušené látky se umístí na spodní hodinové sklíčko a rozpustí se v 0,5 ml vody R. K roztoku se přidá 0,30 g oxidu horečnatého těžkého R a rychle se zamíchá skleněnou tyčinkou. Sklíčko s lakmusovým papírem se překlopí na sklíčko se zkoušenou látkou a vzniklá komůrka se zahřívá 15 min při 40 °C. Lakmusový papír není zbarven intenzivněji modře než lakmusový papír u porovnávacího vzorku připraveného současně stejným způsobem za použití 0,1 ml základního roztoku amonia (100 μg NH₄/ml), 0,5 ml vody R a 0,30 g oxidu horečnatého těžkého R (200 μg/g).

Železo (2.4.9). 1,0 g se rozpustí v dělicí nálevce v 10 ml kyseliny chlorovodíkové zředěné RS a vytřepává se třikrát po 3 min vždy s 10 ml isobutylmethylketonu R1. Ke spojeným organickým vrstvám se přidá 10 ml vody R a třepe se 3 min. Vodná vrstva vyhovuje limitní zkoušce na železo (10 μg/g).

Těžké kovy (2.4.8). 2,0 g vyhovují limitní zkoušce D na těžké kovy (10 μg/g). Porovnávací roztok se připraví za použití 2 ml základního roztoku olova (1 μg Pb/ml).

Ztráta sušením (2.2.32). Nejvýše 0,5 %; 1,000 g se suší v sušárně při 100 °C až 105 °C.

Síranový popel (2.4.14). Nejvýše 0,1 %; stanoví se s 1,00 g zkoušené látky.

Stanovení obsahu

0,130 g se rozpustí v 50 ml vody R a titruje se kyselinou chlorovodíkovou 0,1 mol/l VS za potenciometrické indikace bodu ekvivalence (2.2.20).

1 ml kyseliny chlorovodíkové 0,1 mol/l VS odpovídá 15,52 mg C₆H₉N₃O₂.

Uchovávání

V dobře uzavřených obalech, chráněn před světlem.

Separandum.

† Hydrocortisonum

Hydrokortison

Je to 11β,I7,21-trihydroxy-4-pregnen-3,20-dion. Počítáno na vysušenou látku, obsahuje 97,0 % až 103,0 % sloučeniny C₂₁H₃₀O₅.

Vlastnosti

Bílý nebo téměř bílý krystalický prášek. Je prakticky nerozpustný ve vodě, mírně rozpustný v acetonu a v lihu 96%, těžce rozpustný v dichlormethanu.

Vykazuje polymorfismus.

Zkoušky totožnosti

Základní sestava zkoušek: A a B.

Alternativní sestava zkoušek: C a D, viz Obecné zásady (1.2).

1. A. Infračervené absorpční spektrum (2.2.24) zkoušené látky se shoduje se spektrem hydrokortisonu CRL. Jestliže spektrum zkoušené látky a spektrum referenční látky v tuhém stavu vykazují rozdíly, rozpustí se obě látky odděleně v co nejmenším množství acetonu R, odpaří se do sucha na vodní lázni a se zbytky se znovu zaznamenají spektra látek.
2. B. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití vhodného silikagelu s fluorescenčním indikátorem pro detekci při 254 nm.

   Zkoušený roztok. 10 mg se rozpustí ve směsi objemových dílů methanolu R a dichlormethanu R (1 + 9) a zředí se stejnou směsí na 10 ml.

   Porovnávací roztok (a). 20 mg hydrokortisonu CRL se rozpustí ve směsi objemových dílů methanolu R a dichlormethanu R (1 + 9) a zředí se stejnou směsí na 20 ml.

   Porovnávací roztok (b). 10 mg prednisolonu CRL se rozpustí v porovnávacím roztoku (a) a zředí se jím na 10 ml.

   Na vrstvu se odděleně nanese po 5 μl každého roztoku a vyvíjí se mobilní fází připravenou přidáním směsi objemových dílů vody R a methanolu R (1,2 + 8) do směsi objemových dílů etheru R a dichlormethanu R (15 + 77) po dráze 15 cm. Potom se vrstva podruhé vyvíjí směsí objemových dílů 1-butanolu R nasyceného vodou R, toluenu R a etheru R (5 + 15 + 80) po dráze 15 cm. Vrstva se usuší na vzduchu a pozoruje se v ultrafialovém světle při 254 nm. Hlavní skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku odpovídá polohou a velikostí hlavní skvrně na chromatogramu porovnávacího roztoku (a). Vrstva se postříká kyselinou sírovou v lihu RS a zahřívá se 10 min nebo do objevení skvrn při 120 °C. Po ochlazení se vrstva pozoruje v denním světle a v ultrafialovém světle při 365 nm. Hlavní skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku odpovídá polohou, zbarvením v denním světle a fluorescencí v ultrafialovém světle při 365 nm a velikostí hlavní skvrně na chromatogramu porovnávacího roztoku (a). Zkoušku lze hodnotit, jestliže na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) jsou dvě zřetelně oddělené skvrny.

1. C. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití vhodného silikagelu s fluorescenčním indikátorem pro detekci při 254 nm.

   Zkoušený roztok (a). 25 mg se rozpustí v methanolu R a zředí se jím na 5 ml (tento roztok se použije také k přípravě zkoušeného roztoku (b)). 2 ml tohoto roztoku se zředí dichlormet- hanem R na 10 ml.

   Zkoušený roztok (b). 0,4 ml roztoku získaného při přípravě zkoušeného roztoku (a) se přenesou do skleněné zkumavky 100 mm dlouhé a o průměru 20 mm opatřené skleněnou nebo polytetrafluorethylenovou zátkou. Rozpouštědlo se odpaří za mírného zahřátí pod proudem dusíku R. Přidají se 2 ml roztoku kyseliny octové ledové R 15% (V/V) a 50 mg bismutičnanu sodného R. Zkumavka se uzavře a 1 h se třepe na mechanické třepačce za chánění před světlem. Přidají se 2 ml roztoku kyseliny octové ledové R 15% (V/V), směs se zfiltruje do 50ml dělicí nálevky a filtr se promyje dvakrát 5 ml vody R. Čirý filtrát se protřepe s 10 ml dichlormethanu R, organická vrstva se promyje 5 ml hydroxidu sodného 1 mol/l RS, dvakrát 5 ml vody R a vysuší se síranem sodným bezvodým R.

   Porovnávací roztok (a). 25 mg hydrokortisonu CRL se rozpustí v methanolu R a zředí se jím na 5 ml (tento roztok se použije také k přípravě porovnávacího roztoku (b)). 2 ml tohoto roztoku se zředí dichlormethanem R na 10 ml.

   Porovnávací roztok (b). 0,4 ml roztoku získaného při přípravě porovnávacího roztoku (a) se přenesou do skleněné zkumavky 100 mm dlouhé a o průměru 20 mm opatřené skleněnou nebo polytetrafluorethylenovou zátkou. Rozpouštědlo se odpaří za mírného zahřátí pod proudem dusíku R. Přidají se 2 ml roztoku kyseliny octové ledové R 15% (V/V) a 50 mg bismutičnanu sodného R. Zkumavka se uzavře a 1 h se třepe na mechanické třepačce za chránění před světlem. Přidají se 2 ml roztoku kyseliny octové ledové R 15% (V/V), směs se zfiltruje do 50ml dělicí nálevky a filtr se promyje dvakrát 5 ml vody R. Čirý filtrát se protřepe s 10 ml dichlormethanu R, organická vrstva se promyje 5 ml hydroxidu sodného 1 mol/l RS, dvakrát 5 ml vody R a vysuší se síranem sodným bezvodým R.

   Na vrstvu se odděleně nanese 5 μl zkoušeného roztoku (a), 5 μl porovnávacího roztoku (a), 25 μl zkoušeného roztoku (b) a 25 μl porovnávacího roztoku (b); poslední dva roztoky se nanášejí po malých množstvích do malých skvrn. Vyvíjí se mobilní fází připravenou přidáním směsi objemových dílů vody R a methanolu R (1,2 + 8) do směsi objemových dílů etheru R a dichlormethanu R (15 + 77) po dráze 15 cm. Potom se vrstva podruhé vyvíjí směsí objemových dílů 1-butanolu R nasyceného vodou R, toluenu R a etheru R (5 + 15 + 80) po dráze 15 cm. Vrstva se usuší na vzduchu a pozoruje se v ultrafialovém světle při 254 nm. Hlavní skvrna na chromatogramech zkoušených roztoků odpovídá polohou a velikostí hlavní skvrně na chromatogramu odpovídajícího porovnávacího roztoku. Vrstva se postříká kyselinou sírovou v lihu RS a zahřívá se 10 min nebo do objevení skvrn při 120 °C. Po ochlazení se vrstva pozoruje v denním světle a v ultrafialovém světle při 365 nm. Hlavní skvrna na chromatogramech zkoušených roztoků odpovídá polohou, zbarvením v denním světle, fluorescencí v ultrafialovém světle při 365 nm a velikostí hlavní skvrně na chromatogramu odpovídajícího porovnávacího roztoku. Hlavní skvrny na chromatogramu zkoušeného roztoku (b) a porovnávacího roztoku (b) mají hodnotu R_F zřetelně vyšší než hlavní skvrny na chromatogramu zkoušeného roztoku (a) a porovnávacího roztoku (a).

1. D. Asi 2 mg se přidají ke 2 ml kyseliny sírové R a třepe se do rozpuštění; do 5 min vznikne intenzivní hnědočervené zbarvení se zelenou fluorescencí, která je intenzivní v ultrafialovém světle při 365 nm. Roztok se přidá k 10 ml vody R a promíchá se; zbarvení zmizí a zůstane čirý roztok. Fluorescence v ultrafialovém světle zůstává.

Zkoušky na čistotu

Specifická optická otáčivost (2.2.7). +150° až +156°; počítáno na vysušenou látku. Měří se roztok připravený rozpuštěním 0,250 g v dioxanu R a zředěním stejným rozpouštědlem na 25,0 ml.

Příbuzné látky. Stanoví se kapalinovou chromatografií (2.2.29). Roztoky se připraví bezprostředně před použitím.

Zkoušený roztok. 25,0 mg se rozpustí ve 2 ml tetrahydrofuranu R a zředí se vodou R na 10,0 ml.

Porovnávací roztok (a). 2 mg hydrokortisonu CRL a 2 mg prednisolonu R se rozpustí v mobilní fázi a zředí se jí na 100,0 ml.

Porovnávací roztok (b). 1,0 ml zkoušeného roztoku se zředí mobilní fází na 100,0 ml.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

1. - nerezové ocelové kolony délky 0,25 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné silikagelem oktadecylsilanizovaným deaktivovaným pro chromatografii bazických látek s odstíněnými silanolovými skupinami R (5 μm),
2. - mobilní fáze, kterou je směs připravená takto: v 1000ml odměrné baňce se smíchá 220 ml tetrahydrofuranu R a 700 ml vody R a nechá se ustálit; zředí se na 1000 ml vodou R a znovu se promíchá, průtoková rychlost je 1 ml/min,
3. - spektrofotometrického detektoru, 254 nm.

Teplota kolony se udržuje na 45 °C.

Kolona se ustálí promýváním mobilní fází po dobu 30 min při průtokové rychlosti 1 ml/min. Nastříkne se 20 μl porovnávacího roztoku (b) a nastaví se citlivost systému tak, aby výška hlavního píku byla nejméně 50 % celé stupnice zapisovače.

Nastříkne se 20 μl porovnávacího roztoku (a). Při zaznamenání chromatogramu za předepsaných podmínek jsou retenční časy prednisolonu asi 14 min a hydrokortisonu asi 15,5 min. Zkoušku lze hodnotit, jestliže rozlišení mezi píky prednisolonu a hydrokortisonu je nejméně 2,2. Je-li třeba, upraví se koncentrace tetrahydrofuranu R v mobilní fázi.

Nastříkne se odděleně 20 μl směsi rozpouštědel použitých pro zkoušený roztok jako slepá zkouška, 20 μl zkoušeného roztoku a 20 μl porovnávacího roztoku (b) Chromatogram zkoušeného roztoku se zaznamenává po dobu odpovídající čtyřnásobku retenčního času hlavního píku. Na chromatogramu zkoušeného roztoku plocha žádného píku, kromě hlavního píku, není větší než polovina plochy hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) (0,5 %); součet ploch všech píků, kromě hlavního píku, není větší než l,5násobek plochy hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) (1,5 %). Nepřihlíží se k pikům, jejichž plocha je menší než 0,05násobek plochy hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) a k pikům získaným při slepé zkoušce.

Ztráta sušením (2.232). Nejvýše 1,0 %; 0,500 g se suší v sušárně při 100 °C až 105 °C. Stanovení obsahu

0,100 g se rozpustí v lihu 96% R a zředí se jím na 100,0 ml. 2,0 ml tohoto roztoku se zředí lihem 96% R na 100,0 ml. Měří se absorbance (2.2.25) v maximu při 241,5 nm.

Obsah C₂₁H₃₀O₅ se vypočítá za použití specifické absorbance, která má hodnotu 440.

Uchovávání

Chráněn před světlem.

Separandum.

Nečistoty

1. A. prednisolon,
2. B. kortison,
3. C. hydrokortisonacetat,

1. D. 6β,11β, 17,21-tetrahydroxy-4-pregnen-3,20-dion (6β-hydroxyhydrokortison),

1. E. 11β,17,21-trihydroxy-4,6-pregnadien-3,20-dion (Δ⁶-hydrokortison),

1. F. 17,21-dihydroxy-4-pregnen-3,20-dion (Reichsteinova látka),

1. G. 11β,17-dihydroxy-3,20-dioxo-4-pregnen-21-al.

Hydroxyethylis salicylas

Hydroxyethylsalicylat

Je to 2-hydroxyethyl-2-hydroxybenzoat. Obsahuje 98,0 % až 102,0 % sloučeniny C₉H₁₀O₄.

Vlastnosti

Olejovitá bezbarvá nebo téměř bezbarvá kapalina. Je mírně rozpustný ve vodě, velmi snadno rozpustný v acetonu, v etheru a v dichlormethanu, snadno rozpustný v lihu 96%.

Zkoušky totožnosti

Základní sestava zkoušek: A a B.

Alternativní sestava zkoušek: A, C, D a E, viz Obecné zásady (1.2).

1. A. Zkouška Index lomu, viz Zkoušky na čistotu, je zároveň zkouškou totožnosti.
2. B. Infračervené absorpční spektrum (2.2.24) tenkého filmu zkoušené látky se shoduje se spektrem tenkého filmu hydroxyethylsalicylatu CRL.
3. C. Hodnotí se chromatogramy ze zkoušky Příbuzné látky, viz Zkoušky na čistotu. Hlavní skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku (b) se polohou a velikostí shoduje s hlavní skvrnou na chromatogramu porovnávacího roztoku (a).
4. D. K 1 ml roztoku S, viz Zkoušky na čistotu, se přidá 1 ml vody R a 0,2 ml chloridu železitého RS2; vznikne fialovočervené zbarvení, které zmizí ihned po přidání 2 ml kyseliny octové zředěné RS. Může zůstat velmi slabé fialové zbarvení.
5. E. 1 g se smíchá ve zkumavce 160 mm dlouhé se 2,0 g jemně rozetřeného síranu manganatého R. Do zkumavky se vloží 2 cm hluboko proužek filtračního papíru impregnovaného čerstvě připravenou směsí objemových dílů roztoku diethanolaminu R 20 % (V/V) a roztoku nitroprussidu sodného R (50 g/l) (1 + 11), jehož pH bylo upraveno kyselinou chlorovodíkovou 1 mol/l RS na hodnotu 9,8. Zkumavka se 1 min až 2 min zahřívá nad otevřeným plamenem. Filtrační papír zmodrá.

Zkoušky na čistotu

Roztok S. 2,5 g se rozpustí ve 40 ml lihu 96% R a zředí se vodou destilovanou R na 50 ml.

Vzhled roztoku. Roztok S je čirý (2.2.1) a bezbarvý (2.2.2, Metoda II).

Kysele nebo zásaditě reagující látky. Ke 2 ml roztoku S se přidá 0,1 ml červeně methylové RS a 0,2 ml hydroxidu sodného 0,01 mol/l VS; roztok se zbarví žlutě. Přidá se 0,3 ml kyseliny chlorovodíkové 0,01 mol/l VS; roztok se zbarví červeně.

Relativní hustota (2.2.5). 1,252 až 1,257.

Index lomu (2.2.6). 1,548 až 1,551.

Příbuzné látky. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití vrstvy vhodného silikagelu s fluorescenčním indikátorem pro detekci při 254 nm.

Zkoušený roztok (a). 0,50 g se rozpustí v methanolu R a zředí se jím na 10 ml.

Zkoušený roztok (b). 2 ml zkoušeného roztoku (a) se zředí methanolem R na 50 ml.

Porovnávací roztok (a). 50,0 mg hydroxyethylsalicylatu CRL se rozpustí v methanolu R a zředí se jím na 25 ml.

Porovnávací roztok (b). 2,5 ml zkoušeného roztoku (b) se zředí methanolem R na 10 ml. Porovnávací roztok (c). 0,10 g ethylenglykolu R se rozpustí v methanolu R a zředí se jím na 50 ml. 1,25 ml tohoto roztoku se zředí methanolem R na 10 ml.

Na vrstvu se nanese odděleně po 10 pl každého roztoku a vyvíjí se směsí objemových dílů kyseliny octové ledové R, ethylacetatu R a cyklohexanu R (20 + 20 + 60) po dráze 15 cm. Vrstva se suší v proudu chladného vzduchu a pak se pozoruje v ultrafialovém světle při 254 nm.

Na chromatogramu zkoušeného roztoku (a) žádná skvrna, kromě hlavní skvrny, není intenzivnější než skvrna na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) (1 %). Vrstva se postříká vanadičnanem amonným RS, 10 min se zahřívá při 100 °C a po 10 min chladnutí se pozoruje v denním světle.

Na chromatogramu zkoušeného roztoku (a) žádná skvrna, odpovídající ethylenglykolu, není intenzivnější než skvrna na chromatogramu porovnávacího roztoku (c) (0,5 %) a žádná skvrna, kromě hlavní skvrny a skvrny odpovídající ethylenglykolu, není intenzivnější než skvrna na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) (1 %). Zkoušku lze hodnotit, jestliže na chromatogramu porovnávacího roztoku (c) je zřetelně viditelná skvrna.

Chloridy (2.4.4). 10 ml roztoku S se zředí vodou R na 15 ml. Roztok vyhovuje limitní zkoušce na chloridy (100 μg/g).

Sírany (2.4.13). 12 ml roztoku S se zředí vodou destilovanou R na 15 ml. Roztok vyhovuje limitní zkoušce na sírany (250 μg/g).

Síranový popel (2.4.14). Nejvýše 0,1 %, stanoví se s 1,00 g zkoušené látky.

Stanovení obsahu

0,125 g se rozpustí ve 30 ml kyseliny octové ledové R v baňce se zabroušenou zátkou. Přidá se 10 ml kyseliny sírové zředěné RS, 1,5 g bromidu draselného R a 50,0 ml bromičnanu draselného 0,02 mol/l VS. Baňka se ihned uzavře a ponechá se stát 15 min za ochrany před světlem. Ihned po otevření baňky se přidá 1,5 g jodidu draselného R a titruje se thiosíranem sodným 0,1 mol/l VS. Před ukončením titrace se přidá 1 ml škrobu RS. Provede se slepá zkouška.

1 ml bromičnanu draselného 0,02 mol/l VS odpovídá 5,466 mg C₉H₁₀O₄.

Uchovávání

V dobře uzavřených obalech, chráněn před světlem.

Nečistoty

1. A. kyselina salicylová,

1. B. 1,2-ethandiol (ethylenglykol).

Imipenemum

Imipenem

Je to monohydrát kyseliny (5R,6S)-6-[(R)-1-hydroxyethyl]-3-{[2-[(iminomethyl)amino]ethyl]-thio}-7-oxo-1-azabicyklo[3,2,0]hept-2-en-2-karboxylové. Počítáno na bezvodou látku, obsahuje 98,0 % až 101,0 % sloučeniny C₁₂H₁₇N₃O₄S.

Vlastnosti

Bílý téměř bílý nebo světle žlutý prášek. Je mírně rozpustný ve vodě, těžce rozpustný v methanolu.

Zkoušky totožnosti

Infračervené absorpční spektrum (2.2.24) zkoušené látky se shoduje se spektrem imipenemu CRL.

Zkoušky na čistotu

Vzhled roztoku. 0,500 g se rozpustí v tlumivém roztoku fosforečnanovém o pH 7,0 (3) a zředí se jím na 50 ml. Roztok neopalizuje intenzivněji než porovnávací suspenze II (2.2.1) a není zbarven intenzivněji než nejpodobnější porovnávací barevný roztok intenzity 6 (2.2.2, Metoda II).

Hodnota pH (2.2.3). 4,5 až 7,0; měří se roztok připravený rozpuštěním 0,500 g ve vodě prosté oxidu uhličitého R a zředěním stejným rozpouštědlem na 100,0 ml.

Specifická optická otáčivost (2.2.7). +84° až+89°, počítáno na bezvodou látku a měřeno při 25 °C; měří se roztok připravený rozpuštěním 0,125 g v tlumivém roztoku fosforečnanovém o pH 7,0 (3) a zředěním stejným rozpouštědlem na 25,0 ml.

Příbuzné látky. Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29) popsaná ve zkoušce Stanovení obsahu.

Nastříkne se 20 μl porovnávacího roztoku (b). Nastaví se citlivost detektoru tak, aby výška hlavního píku na chromatogramu byla nejméně 50 % celé stupnice zapisovače. Nastříkne se 20 μl zkoušeného roztoku a chromatogram se zaznamenává po dobu odpovídající dvojnásobku retenčního času hlavního píku. Na chromatogramu zkoušeného roztoku plocha píku thienamycinu není větší než plocha hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) (1 %), plocha žádného píku, kromě hlavního píku a píku thienamycinu, není větší než 0,3násobek plochy hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) (0,3 %), součet ploch všech píků, kromě hlavního píku a píku thienamycinu, není větší než plocha hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) (1 %). Nepřihlíží se k pikům, jejichž plocha je menší než 0,lnásobek plochy hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b).

Aceton a 2-propanol. Celkem nejvýše 0,25 %; stanoví se head-space plynovou chromatografií (2.2.28).

Zkoušený roztok. 0,100 g zkoušené látky a 1,0 g síranu sodného bezvodého R se rozpustí ve 20ml lahvičce ve vodě R a zředí se jí na 5,0 ml, uzavře se a 10 min se protřepává.

Porovnávací roztok. 0,250 g acetonu R a 0,250 g 2-propanolu R se zředí vodou R na 50,0 ml. 1,0 ml tohoto roztoku se zředí vodou R na 100,0 ml (odpovídá 0,25% acetonu a 0,25% 2- propanolu). 5,0 ml tohoto roztoku se převede do 20ml lahvičky a přidá se 1,0 g síranu sodného bezvodého R, uzavře se a 10 min se protřepává.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

1. - křemenné kapilární kolony délky 30 m a vnitřního průměru 0,53 mm s vnitřním povrchem porytým 1,5|im filmem makro gólu 20 000 R,
2. - helia pro chromatografií R jako nosného plynu,
3. - plamenoionizačního detektoru.

Teplota kolony se udržuje po dobu 7 min na 60 °C, pak se zvyšuje rychlostí 15 °C/min na teplotu 240 °C, při níž se udržuje 20 min, teplota nástřikového prostoru se udržuje při 140 °C a teplota detektoru při 260 °C. Lahvičky se zahřívají 60 min při 85 °C. Nastříkne se po 1 ml plynné fáze každého roztoku.

Voda, semimikrostanovení (2.5.12). 5 % až 8 %, stanoví se s 0,200 g zkoušené látky. Použije se jodosiřičité činidlo obsahující imidazol místo pyridinu a ke každému stanovení čistá nádobka.

Síranový popel (2.4.14). Nejvýše 0,2 %; stanoví se s 1,00 g zkoušené látky.

Sterilita (2.6.1). Pokud je látka určena k výrobě parenterálních přípravků bez dalšího vhodného sterilizačního postupu, vyhovuje zkoušce na sterilitu.

Bakteriální endotoxiny (2.6.14). Pokud je látka určena k výrobě parenterálních přípravků bez dalšího vhodného postupu odstraňujícího bakteriální endotoxiny, vyhovuje zkoušce na bakteriální endotoxiny, obsahuje-li nejvýše 0,17 m.j. endotoxinu v miligramu.

Stanovení obsahu

Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29).

Roztoky se uchovávají v ledové lázni a použijí se do 8 h od přípravy.

Zkoušený roztok. 40,0 mg se rozpustí v mobilní fázi a zředí se jí na 100,0 ml.

Porovnávací roztok (a). 40,0 mg imipenemu CRL se rozpustí v mobilní fázi a zředí se jí na 100,0 ml.

Porovnávací roztok (b). 1,0 ml zkoušeného roztoku se zředí mobilní fází na 100,0 ml.

Porovnávací roztok (c). 20 ml zkoušeného roztoku se 5 min zahřívá při 80 °C, pH roztoku bylo předem upraveno na hodnotu 10 hydroxidem sodným RS.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

1. - nerezové ocelové kolony délky 0,25 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné silikagelem oktadecylsilanizovaným pro chromatografii R (5 puť),
2. - mobilní fáze, která je směsí objemových dílů acetonitrilu R a roztoku hydrogenfosforečnanu draselného R (8,7 g/l), předem zneutralizovaného kyselinou fosforečnou zředěnou RS na hodnotu pH 7,3 (0,7 + 99,3), při průtokové rychlosti 1,0 ml/min,
3. - spektrofotometrického detektoru, 254 nm.

Nastříkne se 20 μl porovnávacího roztoku (a). Citlivost detektoru se nastaví tak, aby výška hlavního píku na chromatogramu byla nejméně 50 % celé stupnice zapisovače. Nastříkne se 20 μl porovnávacího roztoku (c). Při zaznamenání chromatogramů za předepsaných podmínek je retenční čas imipenemu asi 9 min a relativní retenční čas thienamycinu vztažený k imipenemu asi 0,8. Zkoušku lze hodnotit, jestliže rozlišení mezi píkem imipenemu a píkem thienamycinu je nejméně 3,5. Nastříkne se šestkrát po 20 μl porovnávacího roztoku (a). Zkoušku lze hodnotit, jestliže relativní směrodatná odchylka plochy píku imipenemu je nejvýše 1,0%. Nastřikuje se střídavě zkoušený roztok a porovnávací roztok (a).

Uchovávání

Ve vzduchotěsných obalech, při teplotě 2 °C až 8 °C. Pokud je látka sterilní, uchovává se ve sterilních vzduchotěsných zabezpečených obalech.

Označování

V označení na obalu se uvede, zda je látka:

1. - sterilní,
2. - prostá bakteriálních endotoxinů.

Nečistoty

1. A. kyselina (5R,6S)-3-[(2-aminoethyl)thio]-6-[(R)-1-hydroxyethyl]-7-oxo-1-azabicyklo[3,2,0]hept-2-en-2-karboxylová (thienamycin).

† Insulinum

Insulin

Je to čištěná přírodní antidiabetická látka získaná z hovězí nebo prasečí slinivky břišní. Počítáno na vysušenou látku, obsahuje 93,0% až 105,0% prasečího insulinu C₂₅₆H₃₈₁N₆₅O₇₆S₆ nebo hovězího insulinu C₂₅₄H₃₇₇N₆₅O₇₅S₆ a odpovídajícího příslušného A21 deamidoinsulinu.

1 m.j. insulinu odpovídá 0,0345 mg prasečího insulinu a 0,0342 mg hovězího insulinu.

Výroba

Zvířata, ze kterých je insulin získáván, musí splňovat požadavky oprávněné autority, které se kladou na zvířata určená pro humánní konzumaci. Navíc tyto tkáně nesmí obsahovat specifický rizikový materiál, který je definován odpovídajícími mezinárodními, nebo kde je to vhodné, národními požadavky.

Vlastnosti

Bílý nebo téměř bílý prášek. Je prakticky nerozpustný ve vodě, v ethanolu a v etheru. Rozpouští se ve zředěných minerálních kyselinách a za rozkladu ve zředěných alkalických hydroxidech.

Zkoušky totožnosti

1. A. Hodnotí se chromatogramy získané ve zkoušce Stanovení obsahu. Retenční čas hlavního píku na chromatogramu zkoušeného roztoku odpovídá retenčnímu času hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) nebo, kde je to vhodné, porovnávacímu roztoku (c).
2. B. Provede se peptidové mapování.

   Zkoušený roztok. Připraví se roztok zkoušené látky v kyselině chlorovodíkové 0,01 mol/l RS tak, aby obsahoval 2,0 mg/ml insulinu a 500 μl tohoto roztoku se převede do čisté zkumavky. Přidají se 2,0 ml tlumivého roztoku HEPES opH7,5 a 400 μl roztoku proteasy kmene V8 zlatého stafylokoka R (1 mg/ml). Zkumavka se uzavře a inkubuje se 6 h při 25 °C. Reakce se zastaví přidáním 2,9 ml tlumivého roztoku síranového o pH 2,0.

   Porovnávací roztok. Připraví se současně stejným způsobem jako zkoušený roztok za použití hovězího insulinu CRL nebo prasečího insulinu CRL, co je vhodné, místo zkoušené látky. Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29).

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

1. - nerezové ocelové kolony délky 0,1 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné silikagelem oktadecylsilanizovaným pro chromatografii R (3 μm),
2. - mobilní fáze s průtokovou rychlostí 1 ml/min:
   1. - mobilní fáze A - smíchá se 100 ml acetonitrilu pro chromatografii R, 700 ml vody R a 200 ml tlumivého roztoku síranového o pH 2,0, směs se zfiltruje a odplyní.
   2. - mobilní fáze B - smíchá se 400 ml acetonitrilu pro chromatografii R, 400 ml vody R a 200 ml tlumivého roztoku síranového o pH 2,0, směs se zfiltruje a odplyní.

   Eluční podmínky jsou popsány v níže uvedené tabulce (pokud je třeba, upraví se gradient k dělení enzymaticky štěpeného insulinu):

   Uchovávání Označování Hexetidinum Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání Nečistoty † Histidini hydrochloridum monohydricum1) Výroba Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání † Histidinum1) Výroba Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání † Hydrocortisonum Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Uchovávání Nečistoty Hydroxyethylis salicylas Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání Nečistoty Imipenemum Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání Označování Nečistoty † Insulinum Výroba Vlastnosti Zkoušky totožnosti

   Čas (min)	Mobilní fáze A % (V/V)	Mobilní fáze B % (V/V)	Poznámka
   0 - 60	90 → 30	10 → 70	lineární gradient
   60 - 65	30 → 0	70 → 100	lineární gradient
   65 - 70	0	100	izokraticky

1. - spektrofotometrického detektoru, 214 nm.

Teplota kolony se udržuje na 40 °C.

Kolona se ustaluje při počátečních podmínkách nejméně 15 min. Provede se slepá zkouška za výše uvedeného gradientu.

Nastříkne se 50 μl zkoušeného roztoku a 50μpl porovnávacího roztoku. Zkoušku lze hodnotit, jestliže chromatogram obou roztoků kvalitativně odpovídá referenčnímu chromatogramu Ph. Eur. enzymaticky štěpeného hovězího insulinu nebo referenčnímu chromatogramu Ph Eur. enzymaticky štěpeného prasečího insulinu, jak je třeba. Na chromatogramu porovnávacího roztoku se určí totožnost píků štěpením vzniklých fragmentů I, II a III. Faktor symetrie píků fragmentu II a III je nejvýše 1,5 a rozlišení mezi dvěma píky je nejméně 1,9.

Chromatografický profil zkoušeného roztoku odpovídá chromatogramu porovnávacího roztoku. Poznámka: Retenční čas fragmentu I prasečího insulinu je stejný jako pro lidský insulin. Retenční čas fragmentu II je stejný pro všechny insuliny. Retenční čas fragmentu III hovězího insulinu je stejný jako pro prasečí insulin.

Zkoušky na čistotu

Nečistoty s molekulovou hmotností větší než insulin. Provede se vylučovací chromatografie (2.2.30).

Zkoušený roztok. 4 mg se rozpustí v 1,0 ml kyseliny chlorovodíkové 0,01 mol/l RS.

Roztok pro rozlišení. Použije se roztok insulinu (asi 4 mg/ml), který obsahuje více než 0,4 % vysokomolekulárních bílkovin. Mohou být použity injekční přípravky insulinu, roztok nebo suspenze, které se vyčeří dostatečným množstvím kyseliny chlorovodíkové 6 mol/l RS obsahující určité procento vysokomolekulárních bílkovin, nebo roztoky připravené z insulinu rozpuštěním v kyselině chlorovodíkové 0,01 mol/l RS. Insulin obsahující určité procento vysokomolekulárních bílkovin může být připraven tak, že se prášek insulinu asi 10 dní nechá stát při pokojové teplotě.

Roztoky se udržují při teplotě 2 °C až 10 °C a použijí se do 7 dnů. Při použití automatického dávkovače se jeho teplota nastaví na 2 °C až 10 °C.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

1. - kolony délky 0,3 m a vnitřního průměru nejméně 7,5 mm naplněné silikagelem hydrofilním pro chromatografii R (5 μm až 10 μm), vhodného stupně pro separaci monomerního insulinu z dimeru a polymerů,
2. - mobilní fáze, kterou je zfiltrovaná a odplyněná směs objemových dílů kyseliny octové ledové R, acetonitrilu R a roztoku argininu R (1,0 g/1) (15 + 20 + 65), s průtokovou rychlostí 0,5 ml/min,
3. - spektrofotometrického detektoru, 276 nm.

Ustalování kolony. Před použitím nové kolony pro chromatografickou analýzu se ustaluje kolona opakovaným nástřikem roztoku insulinu obsahujícího vysokomolekulární bílkoviny. Nejméně třikrát se nastříkne roztok pro rozlišení. Kolona je ustálena, když výsledky dvou po sobě následujících nástřiků jsou opakovatelné.

Nastříkne se 100 μl roztoku pro rozlišení. Při zaznamenání chromatogramu za předepsaných podmínek retenční časy jsou: polymerní komplex insulinu 13 min až 17 min, kovalentní dimer insulinu asi 17,5 min, monomerní insulin asi 20 min, soli asi 22 min. Zkoušku lze hodnotit, jestliže rozlišení, definované poměrem výšky píku dimeru k výšce minima mezi píky monomeru a dimeru, je nejméně 2,0.

Nastříkne se 100 μl zkoušeného roztoku. Chromatogram se zaznamenává asi 35 min. Na získaném chromatogramu součet ploch píků s retenčním časem kratším než retenční čas hlavního píku není větší než 1,0 % celkové plochy píků. Nepřihlíží se k žádnému píku s retenčním časem delším než retenční čas píku insulinu.

Příbuzné bílkoviny. Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29) způsobem popsaným ve zkoušce Stanovení obsahu, s elučními podmínkami popsanými v následující tabulce:

Roztoky se udržují při 2 °C až 10 °C a použijí se do 24 h. Zkontroluje se způsobilost systému (rozlišení, linearita) způsobem popsaným ve zkoušce Stanovení obsahu. Pokud je třeba, upraví se relativní poměry mobilních fází tak, aby se zajistila úplná eluce prasečího A21 deamidoinsulinu před začátkem gradientu. Profil gradientu může být upraven tak, aby se zajistila eluce všech příbuzných nečistot insulinu.

Nastříkne se 20 μl porovnávacího roztoku (b) nebo, kde je to vhodné, porovnávacího roztoku (c) a 20 μI zkoušeného roztoku. Je-li třeba, upraví se nastřikovaný objem na objem mezi 10 μl a 20 μl v souladu s výsledky získanými pro zkoušku linearity popsanou ve Stanovení obsahu. Chromatogramy se zaznamenávají asi 50 min. Na chromatogramu každého porovnávacího roztoku A21 se objeví deamidoinsulin jako malý pík za hlavním píkem s relativním retenčním časem asi 1,3 vzhledem k hlavnímu píku. Na chromatogramu zkoušeného roztoku plocha píku A21 deamidoinsulinu není větší než 3,0 % z celkové plochy píku; součet ploch všech píků, kromě příslušného insulinu a A21 deamidoinsulinu, není větší než 3,0 % z celkové plochy píků.

Imunoreaktivita proinsulinu (PLI). Nejvýše 10 μg/g; počítáno na vysušenou látku. Imunoreaktivita proinsulinu se zkouší vhodnou, dostatečně citlivou imunochemickou metodou (2.7.7), jako je radioimunoanalýza za použití mezinárodní referenční látky pro prasečí nebo, kde je to vhodné, pro hovězí pro insulin ke kalibraci metody.

Zinek. Nejvýše 1,0 %, počítáno na vysušenou látku; stanoví se atomovou absorpční spektrometrií (2.2.23, Metoda I).

Zkoušený roztok. 50,0 mg se rozpustí v kyselině chlorovodíkové 0,01 mol/l RS a zředí se jí na 25,0 ml. Je-li třeba, zředí se kyselinou chlorovodíkovou 0,01 mol/l RS na koncentraci např. 0,4 μg Zn/ml až 1,6 μg Zn/ml.

Porovnávací roztoky. Připraví se roztoky obsahující 0,40 μg Zn/ml, 0,80 μg Zn/ml, 1,00 μg Zn/ml, 1,20 μg Zn/ml, 1,60 μg Zn/ml za použití čerstvě připraveného základního roztoku zinku (5 mg Zn/ml) zředěním kyselinou chlorovodíkovou 0,01 mol/l RS.

Měří se absorbance při 213,9 nm za použití zinkové lampy s dutou katodou jako zdroje záření a plamene vzduch-acetylen vhodného složení (např. 1 l vzduchu/min a 2 l acetylenu/min).

Ztráta sušením (2.2.32). Nejvýše 10,0 %; 0,200 g se suší 24 h v sušárně při 100 °C až 105 °C.

Síranový popel (2.4.14). Nejvýše 2,5%, počítáno na vysušenou látku; stanoví se s 0,200 g zkoušené látky.

Bakteriální endotoxiny (2.6.14). Pokud je látka určena k výrobě parenterálních přípravků bez dalšího postupu odstraňujícího bakteriální endotoxiny, vyhovuje zkoušce na bakteriální endotoxiny, obsahuje-li nejvýše 10 m.j. endotoxinu v miligramu.

Stanovení obsahu

Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29).

Zkoušený roztok. 40,0 mg se rozpustí v kyselině chlorovodíkové 0,01 mol/l RS a zředí se jí na 10,0 ml.

Porovnávací roztok (a). Obsah lahvičky lidského insulinu CRL se rozpustí v kyselině chlorovodíkové 0,01 mol/l RS a zředí se jí tak, aby výsledný roztok obsahoval 4,0 mg/ml.

Porovnávací roztok (b). Obsah lahvičky prasečího insulinu CRL se rozpustí v kyselině chlorovodíkové 0,01 mol/l RS a zředí se jí tak, aby výsledný roztok obsahoval 4,0 mg/ml.

Porovnávací roztok (c). Jestliže je zkoušená látka hovězí insulin, rozpustí se 40,0 mg hovězího insulinu CRL v 10,0 ml kyseliny chlorovodíkové 0,01 mol/l RS.

Porovnávací roztok (d). 1,0 ml porovnávacího roztoku (b) se zředí kyselinou chlorovodíkovou 0,01 mol/l RS na 10,0 ml.

Porovnávací roztok (e). 1,0 ml porovnávacího roztoku (c) se zředí kyselinou chlorovodíkovou 0,01 mol/l RS na 10,0 ml.

Roztok pro rozlišení. 1,0 ml porovnávacího roztoku (a) se smíchá s 1,0 ml porovnávacího roztoku (b).

Roztoky se udržují při teplotě 2 °C až 10 °C a použijí se do 48 h. Při použití automatického dávkovače se teplota udržuje při 2 °C až 10 °C.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

1. - ocelové nerezové kolony délky 0,25 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné silikagelem oktadecylsilanizovaným pro chromatografii R (5 μm);
2. - mobilní fáze, kterou jsou následující roztoky připravené a uchovávané při teplotě nejméně 20 °C; průtoková rychlost je 1 ml/min;
   1. - mobilní fáze A - 28,4 g síranu sodného bezvodého R se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 1000 ml. Přidá se 2,7 ml kyseliny fosforečné R, je-li třeba, upraví se pH na hodnotu 2,3 ethanolaminem R, zfiltruje se a roztok se odplyní;
   2. - mobilní fáze B - 550 ml mobilní fáze A se smíchá s 450 ml acetonitrilu R. Roztok se zahřeje na teplotu nejméně 20 °C, aby se předešlo srážení (smíchání mobilní fáze A s acetonitrilem je endotermická reakce). Zfiltruje se a roztok se odplyní;

1. - spektrofotometrického detektoru, 214 nm.

Teplota kolony se udržuje na 40 °C.

Kolona se promývá směsí objemových dílů mobilní fáze A a mobilní fáze B (42 + 58). V případě potřeby se upraví složení mobilní fáze.

Nastříkne se 20 μl roztoku pro rozlišení a 20 μl porovnávacího roztoku (b). Zaznamená se chromatogram roztoku pro rozlišení až pík odpovídající hlavnímu píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) je zřetelně viditelný. Na chromatogramu roztoku pro rozlišení se určí totožost píků prasečího insulinu a lidského insulinu. Zkoušku lze hodnotit, jestliže rozlišení mezi píky odpovídající lidskému insulinu a prasečímu insulinu je nejméně 1,2. Je-li třeba, upraví se koncentrace acetonitrilu v mobilní fázi tak, aby bylo dosaženo předepsaného rozlišení.

Nastříkne se 20 μl zkoušeného roztoku a pro prasečí insulin po 20 μl porovnávacího roztoku (b) a (d), nebo pro hovězí insulin po 20 μl porovnávacího roztoku (c) a (e). Zkoušku lze hodnotit, jestliže plocha hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) nebo (c) je (10 ± 0,5)násobkem plochy hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (d) nebo (e). Pokud je tato zkouška neúspěšná, upraví se nastřikovaný objem na 10 μl až 20 μl, aby byl lineární rozsah detektoru.

Vypočítá se obsah insulinu (C₂₅₆H₃₈₁N₆₅07₆S₆ nebo C₂₅₄H₃₇₇N₆₅O₇₅S₆) a odpovídajícího A21 deamidoinsulinu z plochy hlavního píku a plochy píku A21 deamidoinsulinu na chromatogramu zkoušeného roztoku a vhodného porovnávacího roztoku a deklarovaného obsahu prasečího insulinu aA21 deamidoinsulinu v prasečím insulinu CRL nebo hovězího insulinu a A21 deamidoinsulinu hovězího insulinu v hovězím insulinu CRL, jak je třeba.

Uchovávání

Ve vzduchotěsných obalech, chráněn před světlem, při –20 °C do uvolnění pro výrobu. Po rozpuštění se insulin uchovává při (5 ± 3) °C po krátkou dobu, než bude použit pro výrobu přípravku. Při vážení je třeba insulin chránit před vzdušnou vlhkostí, insulin musí mít pokojovou teplotu. Separandum.

Označování

V označení na obalu se uvede:

1. - druh zvířete, z kterého byla látka získána,
2. - zda je látka prostá bakteriálních endotoxinů.

† Insulinum humanum

Lidský insulin

Je to protein se strukturou antidiabetického hormonu produkovaného lidskou slinivkou břišní. Počítáno na vysušenou látku, obsahuje 95,0 % až 105,0 % lidského insulinu C₂₅₇H₃₈₃N₆₅O₇₇S₆ a lidského A21 deamidoinsulinu. 1 m.j. insulinu odpovídá 0,0347 mg lidského insulinu.

Výroba

Lidský insulin je vyráběn za podmínek minimalizujících mikrobiální znečištění. Vyrábí se buď enzymatickou přeměnou a vhodným čištěním insulinu získaného z prasečí slinivky břišní, nebo metodou založenou na rekombinantní DNK (rDNK) technologii. Lidský insulin vyráběný rDNK technologií odpovídá článku Producta ab ADN recombinante.

U lidského insulinu vyráběného enzymatickou přeměnou insulinu získaného z prasečí slinivky se ve validovaném výrobním procesu odstraňuje zbytková proteolytická účinnost. Oprávěná autorita může požadovat dodatečné zkoušky.

U lidského insulinu vyráběného rDNK technologií se neprovádí následující zkouška u každé šarže konečného výrobku, pokud oprávněná autorita neudělila výjimku.

Bílkoviny hostitelské buňky. Nejvýše 10 μg/g; stanoví se postupem uvedeným v článku Producta ab ADN recombinante.

Vlastnosti

Bílý nebo téměř bílý prášek. Je prakticky nerozpustný ve vodě, v ethanolu a v etheru. Rozpouští se ve zředěných minerálních kyselinách a za rozkladu ve zředěných alkalických hydroxidech.

Zkoušky totožnosti

1. A. Hodnotí se chromatogramy získané ve zkoušce Stanovení obsahu. Retenční čas hlavního píku na chromatogramu zkoušeného roztoku odpovídá retenčnímu času hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (a).
2. B. Provede se peptidové mapování.

   Zkoušený roztok. Připraví se roztok zkoušené látky v kyselině chlorovodíkové 0,01 mol/l RS tak, aby obsahoval 2,0 mg/ml lidského insulinu a 500 μl tohoto roztoku se převede do čisté zkumavky. Přidají se 2,0 ml tlumivého roztoku HEPES o pH 7,5 a 400 μl roztoku proteasy kmene V8 zlatého stafylokoka R (1 mg/ml). Zkumavka se uzavře a inkubuje se 6 h při 25 °C. Reakce se zastaví přidáním 2,9 ml tlumivého roztoku síranového o pH 2,0.

   Porovnávací roztok. Připraví se současně stejným způsobem jako zkoušený roztok za použití lidského insulinu CRL místo zkoušené látky.

   Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29).

   Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

   1. - nerezové ocelové kolony délky 0,1 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné silikagelem oktadecylsilanizovaným pro chromatograjU R (3 μm),
   2. - mobilní fáze s průtokovou rychlostí 1 ml/min:
      1. - mobilní fáze A - smíchá se 100 ml acetonitrilu pro chromatografii R, 700 ml vody R a 200 ml tlumivého roztoku síranového o pH 2,0, směs se zfiltruje a odplyní,
      2. - mobilní fáze B - smíchá se 400 ml acetonitrilu pro chromatografii R, 400 ml vody R a 200 ml tlumivého roztoku síranového o pH 2,0, směs se zfiltruje a odplyní,

      Eluční podmínky jsou popsány v níže uvedené tabulce (pokud je třeba, upraví se gradient k dělení enzymaticky štěpeného insulinu):

      Uchovávání Označování Hexetidinum Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání Nečistoty † Histidini hydrochloridum monohydricum1) Výroba Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání † Histidinum1) Výroba Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání † Hydrocortisonum Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Uchovávání Nečistoty Hydroxyethylis salicylas Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání Nečistoty Imipenemum Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání Označování Nečistoty † Insulinum Výroba Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání Označování † Insulinum humanum Výroba Vlastnosti Zkoušky totožnosti

      Čas (min)	Mobilní fáze A % (V/V)	Mobilní fáze B % (V/V)	Poznámka
      0 - 60	90 → 30	10 → 70	lineární gradient
      60 - 65	30 → 0	70 → 100	lineární gradient
      65 - 70	0	100	izokraticky

   1. - spektrofotometrického detektoru, 214 nm.

   Teplota kolony se udržuje na 40 °C.

   Kolona se ustaluje při počátečních podmínkách nejméně 15 min. Provede se slepá zkouška za výše uvedeného gradientu.

   Nastříkne se 50 μl zkoušeného roztoku a 50 μl porovnávacího roztoku. Zkoušku lze hodnotit, jestliže chromatogram obou roztoků kvalitativně odpovídá referenčnímu chromatogramu Ph. Eur. enzymaticky štěpeného lidského insulinu. Na chromatogramu porovnávacího roztoku se určí totožnost píku štěpením vzniklých fragmentů I, II a III. Faktor symetrie píků fragmentu II a III je nejvýše 1,5 a rozlišení mezi dvěma píky je nejméně 3,4.

   Chromatografický profil zkoušeného roztoku odpovídá chromatogramu porovnávacího roztoku.

3. Poznámka: Retenční čas fragmentu I prasečího insulinu je stejný jako pro lidský insulin. Retenční čas fragmentu II je stejný pro všechny insuliny. Retenční čas fragmentu III hovězího insulinu je stejný jako pro prasečí insulin.

Zkoušky na čistotu

Nečistoty s molekulovou hmotností větší než insulin. Provede se vylučovací chromatografie (2.2.30).

Zkoušený roztok. 4 mg se rozpustí v 1,0 ml kyseliny chlorovodíkové 0,01 mol/l RS.

Roztok pro rozlišení. Použije se roztok insulinu (asi 4 mg/ml), který obsahuje více než 0,4 % vysokomolekulárních bílkovin. Mohou být použity injekční přípravky insulinu, roztok nebo suspenze, která se vy čeří dostatečným množstvím kyseliny chlorovodíkové 6 mol/l RS, obsahující určité procento vysokomolekulárních bílkovin, nebo roztoky připravené z insulinu rozpuštěním v kyselině chlorovodíkové 0,01 mol/l RS. Insulin obsahující určité procento vysokomolekulárních bílkovin může být připraven tak, že se prášek insulinu asi 10 dní nechá stát při pokojové teplotě.

Roztoky se udržují při teplotě 2 °C až 10 °C a použijí se do 7 dnů. Při použití automatického dávkovače se jeho teplota nastaví na 2 °C až 10 °C.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

1. - kolony délky 0,3 m a vnitřního průměru nejméně 7,5 mm naplněné silikagelem hydrofilním pro chromatografii R (5 μm až 10 μm), vhodného stupně pro separaci monomerního insulinu z dimeru a polymerů,
2. - mobilní fáze, kterou je zfiltrovaná a odplyněná směs objemových dílů kyseliny octové ledové R, acetonitrilu R a roztoku argininu R (1,0 g/1) (15 + 20 + 65), průtoková rychlost je 0,5 ml/min,
3. - spektrofotometrického detektoru, 276 nm.

Ustalování kolony. Před použitím nové kolony pro chromatografickou analýzu se ustaluje rovnováha opakovaným nástřikem roztoku insulinu obsahujícího vysokomolekulární bílkoviny. Nejméně třikrát se nastříkne roztok pro rozlišení. Kolona je ustálená, když výsledky dvou po sobě následujících nástřiků jsou opakovatelné.

Nastříkne se 100 μl roztoku pro rozlišení. Při zaznamenání chromatogramu za předepsaných podmínek retenční časy jsou: polymerní komplex insulinu 13 min až 17 min, kovalentní dimer insulinu asi 17,5 min, monomerní insulin asi 20 min, soli asi 22 min. Zkoušku lze hodnotit, jestliže rozlišení, definované poměrem výšky píku dimeru k výšce minima mezi píky monomeru a dimeru, je nejméně 2,0.

Nastříkne se 100 μl zkoušeného roztoku. Chromatogram se zaznamenává asi 35 min. Na získaném chromatogramu součet ploch píku s retenčním časem kratším než retenční čas hlavního píku není větší než 1,0 % celkové plochy píků. Nepřihlíží se k píku s retenčním časem delším než retenční čas píku insulinu.

Příbuzné bílkoviny. Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29) způsobem popsaným ve zkoušce Stanovení obsahu, s elučními podmínkami popsanými v následující tabulce:

Roztoky se udržují při 2 °C až 10 °C a použijí se do 24 h. Zkontroluje se způsobilost systému (rozlišení, linearita) způsobem popsaným ve zkoušce Stanovení obsahu. Pokud je třeba, upraví se relativní poměry mobilních fází tak, aby se zajistila úplná eluce prasečího A21 deamidoinsulinu před začátkem gradientu. Profil gradientu může být upraven tak, aby se zajistila eluce všech příbuzných nečistot insulinu.

Nastříkne se 20 μl porovnávacího roztoku (a), 20 μl porovnávacího roztoku (b), 20 μl porovnávacího roztoku (c) a 20 μl zkoušeného roztoku. Je-li třeba, upraví se nastřikovaný objem na objem mezi 10 μl a 20 μl v souladu s výsledky získanými pro zkoušku linearity popsanou ve Stanovení obsahu. Chromatogramy se zaznamenávají asi 50 min. Na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) se objeví lidský A21 deamidoinsulin jako malý pík za hlavním píkem s relativním retenčním časem asi 1,3 vzhledem k hlavnímu píku. Na chromatogramu zkoušeného roztoku plocha píku lidského A21 deamidoinsulinu není větší než 2,0 % z celkové plochy píků; součet ploch všech píků, kromě lidského insulinu a lidského A21 deamidoinsulinu, není větší než 2,0 % z celkové plochy píků. Pouze pro semisyntetický lidský insulin: na chromatogramu zkoušeného roztoku plocha píku odpovídající hlavnímu píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) není větší než plocha odpovídajícího píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (c) (1,0 % prasečího insulinu v lidském insulinu).

Imunoreaktivita proinsulinu (PLI). Nejvýše 10 μg/g; počítáno na vysušenou látku. Imunoreaktivita proinsulinu se zkouší vhodnou imunochemickou, dostatečně citlivou metodou (2.7.1), např. radioimunoanalýza. Pro lidský insulin vyráběný enzymatickou přeměnou prasečího insulinu se ke kalibraci metody použije mezinárodní referenční látka pro prasečí proinsulin. Pro lidský insulin vyráběný rDNA technologií se ke kalibraci metody použije mezinárodní referenční látka pro lidský proinsulin.

Zinek. Nejvýše 1,0 %, počítáno na vysušenou látku; stanoví se atomovou absorpční spektrometrií (2.2.23, Metoda I).

Zkoušený roztok. 50,0 mg se rozpustí v kyselině chlorovodíkové 0,01 mol/l RS a zředí se jí na 25,0 ml. Je-li třeba, zředí se kyselinou chlorovodíkovou 0,01 mol/l RS na koncentraci např. 0,4 μg Zn/ml až 1,6 μg Zn/ml.

Porovnávací roztoky. Připraví se roztoky obsahující 0,40 μg Zn/ml, 0,80 μg Zn/ml, 1,00 μg Zn/ml, 1,20 μg Zn/ml, 1,60 μg Zn/ml za použití čerstvě připraveného základního roztoku zinku (5 mg Zn/ml) zředěním kyselinou chlorovodíkovou 0,01 mol/l RS.

Měří se absorbance při 213,9 nm za použití zinkové lampy s dutou katodou jako zdroje záření a plamene vzduch-acetylen vhodného složení (např. 1 1 vzduchu/min a 2 1 acetylenu/min).

Ztráta sušením (2.2.32). Nejvýše 10,0 %; 0,200 g se suší 24 h v sušárně při 100 °C až 105 °C.

Síranový popel (2.4.14). Nejvýše 2,5%, počítáno na vysušenou látku; stanoví se s 0,200 g zkoušené látky.

Bakteriální endotoxiny (2.6.14). Pokud je látka určena k výrobě parenterálních přípravků bez dalšího postupu odstraňujícího bakteriální endotoxiny, vyhovuje zkoušce na bakteriální endotoxiny, obsahujeli nejvýše 10 m.j. endotoxinu v miligramu.

Stanovení obsahu

Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29).

Zkoušený roztok. 40,0 mg se rozpustí v kyselině chlorovodíkové 0,01 mol/l RS a zředí se jí na 10,0 ml.

Porovnávací roztok (a). Obsah lahvičky lidského insulinu CRL se rozpustí v kyselině chlorovodíkové 0,01 mol/l RS a zředí se jí tak, aby výsledný roztok obsahoval 4,0 mg/ml.

Porovnávací roztok (b). Obsah lahvičky prasečího insulinu CRL se rozpustí v kyselině chlorovodíkové 0,01 mol/l RS a zředí se jí tak, aby výsledný roztok obsahoval 4,0 mg/ml. Porovnávací roztok (c). 1,0 ml porovnávacího roztoku (b) se zředí kyselinou chlorovodíkovou 0,01 mol/l RS na 50,0 ml. K 1,0 ml tohoto roztoku se přidá 1,0 ml porovnávacího roztoku (a). Porovnávací roztok (d). 1,0 ml porovnávacího roztoku (a) se zředí kyselinou chlorovodíkovou 0,01 mol/l RS na 10,0 ml.

Roztok pro rozlišení. 1,0 ml porovnávacího roztoku (a) se smíchá s 1,0 ml porovnávacího roztoku (b).

Roztoky se udržují při teplotě 2 °C až 10 °C a použijí se do 48 h. Při použití automatického dávkovače se jeho teplota nastaví na 2 °C až 10 °C.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

1. - ocelové nerezové kolony délky 0,25 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné silikagelem oktadecylsilanizovaným pro chromatografii R (5 lim);
2. - mobilní fáze, kterou jsou následující roztoky připravené a uchovávané při teplotě nejméně 20 °C, průtoková rychlost je 1 ml/min;
   1. - mobilní fáze A - 28,4 g síranu sodného bezvodého R se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 1000 ml. Přidá se 2,7 ml kyseliny fosforečné R a, je-li třeba, upraví se pH na hodnotu 2,3 ethanolaminem R, zfiltruje se a roztok se odplyní;
   2. - mobilní fáze B - 550 ml mobilní fáze A se smíchá s 450 ml acetonitrilu R. Roztok se zahřeje na teplotu nejméně 20 °C, aby se předešlo srážení (smíchání mobilní fáze A s acetonitrilem je endotermická reakce). Zfiltruje se a roztok se odplyní;

1. - spektrofotometrického detektoru, 214 nm.

Teplota kolony se udržuje na 40 °C.

Kolona se promývá směsí objemových dílů mobilní fáze A a mobilní fáze B (42 + 58). V případě potřeby se upraví složení mobilní fáze.

Nastříkne se 20 μl roztoku pro rozlišení a 20 μl porovnávacího roztoku (b). Zaznamená se chromatogram roztoku pro rozlišení až pík odpovídající hlavnímu píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) je zřetelně viditelný. Na chromatogramu roztoku pro rozlišení se určí totožnost píku prasečího insulinu a lidského insulinu. Zkoušku lze hodnotit, jestliže rozlišení mezi píky odpovídající lidskému insulinu a prasečímu insulinu je nejméně 1,2. Je-li třeba, upraví se koncentrace acetonitrilu v mobilní fázi tak, aby bylo dosaženo předepsaného rozlišení.

Nastříkne se 20 μl zkoušeného roztoku, 20 μl porovnávacího roztoku (a) a 20 μl porovnávacího roztoku (d). Zkoušku lze hodnotit, jestliže plocha hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) je (10 ± 0,5)násobekem plochy hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (d). Pokud je tato zkouška neúspěšná, upraví se nastřikovaný objem na 10 μl až 20 μl, aby byl lineární rozsah detektoru.

Vypočítá se obsah lidského insulinu C₂₅₇H₃₈₃N₆₅O₇₇S₆ a lidského A21 deamidoinsulinu z plochy hlavního píku a plochy píku lidského A21 deamidoinsulinu na chromatogramu zkoušeného roztoku a porovnávacího roztoku (a) a deklarovaného obsahu lidského insulinu a lidského A21 deamidoinsulinu v lidském insulinu CRL.

Uchovávání

Ve vzduchotěsných obalech, chráněn před světlem, při –20 °C do uvolnění pro výrobu. Po rozpuštění se insulin uchovává při (5 ± 3) °C po krátkou dobu, než bude použit pro výrobu přípravku. Při vážení je třeba insulin chránit před vzdušnou vlhkostí, insulin musí míti pokojovou teplotu.

Separandum.

Označování

V označení na obalu se uvede:

1. - zda byla látka vyrobena enzymatickou přeměnou prasečího insulinu nebo rDNK technologií,
2. - zda je látka prostá bakteriálních endotoxinů.

† Iohexolum

Johexol

Je to 5-[N-(2,3-dihydroxypropyl)acetamido]-N,N'-bis(2,3-dihydroxypropyl)-2,4,6-trijodbenzen-1,3-dikarboxamid. Počítáno na bezvodou látku, obsahuje 98,0% až 101,0% sloučeniny C₁₉H₂₆I₃N₃O₉.

Vlastnosti

Bílý nebo šedobílý hygroskopický prášek. Je velmi snadno rozpustný ve vodě, snadno rozpustný v methanolu, prakticky nerozpustný v etheru a v dichlormethanu. Látka je směsí diastereoizomerů a atropizomerů.

Zkoušky totožnosti

1. A. Infračervené absorpční spektrum (2.2.24) tablety zkoušené látky se shoduje se spektrem tablety johexolu CRL. Tablety se připraví za použití bromidu draselného R.
2. B. Hodnotí se chromatogramy ze zkoušky A Příbuzné látky, viz Zkoušky na čistotu. Retenční čas a velikost hlavních píků na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) jsou přibližně stejné jako retenční čas a velikost píků odpovídajících johexolu na chromatogramu porovnávacího roztoku (a).

Zkoušky na čistotu

Roztok S. 5,0 g se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 50,0 ml.

Vzhled roztoku. Roztok S je čirý (2.2.1) a není zbarven intenzivněji než porovnávací barevný roztok Ž₇ (2.2.2, Metoda II).

Příbuzné látky.

1. A. Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29).
2. Poznámka: Vzhledem k endo-exoizomerii jsou na chromatogramu dva nerozdělené píky johexolu. Kromě toho se na počátku prvního hlavního píku obvykle objevuje malý pík náležící rovněž johexolu. Retenční čas tohoto malého píku je asi o 1,2 min menší než retenční čas prvního hlavního píku.

Zkoušený roztok. 0,150 g se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 100,0 ml.

Porovnávací roztok (a). 15,0 mg johexolu CRL a 15,0 mg johexolu nečistoty A CRL se rozpustí ve směsi jedné až dvou kapek hydroxidu sodného zředěného RS a 10 ml vody R a zředí se vodou R na 100,0 ml. 1,0 ml tohoto roztoku se zředí vodou R na 10,0 ml.

Porovnávací roztok (b). 1,0 ml zkoušeného roztoku se zředí vodou R na 100,0 ml.

Chromatograflcký postup se obvykle provádí za použití:

1. - nerezové ocelové kolony délky 0,25 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné vhodným silikagelem oktadecylsilanisovaným pro chromatografii R (5 μm),
2. - mobilní fáze, která je směsí objemových dílů acetonitrilu R a vody R (1 + 99) na počátku eluce a (13 + 87) na konci eluce, při průtokové rychlosti 1 ml/min a lineární gradientově eluci 60 min,
3. - spektrofotometrického detektoru, 254 nm.

Kolona se promývá mobilní fází o počátečním složení do ustavení rovnováhy po dobu nejméně 10 min. Nastaví se citlivost detektoru tak, aby výška hlavního píku po nástřiku 10 μl porovnávacího roztoku (b) byla nejméně 50 % celé stupnice zapisovače.

Odděleně se nastříkne 10 μl vody R jako kontrolního roztoku a 10 μl porovnávacího roztoku (a). Při zaznamenání chromatogramu za předepsaných podmínek jsou retenční časy johexolu nečistoty A asi 17 min a obou píku johexolu (odpovídajích endo/exoizomerním formám) asi 20 min. Zkoušku lze hodnotit, jestliže rozlišení mezi píkem odpovídajícím johexolu nečistotě A a druhým větším píkem odpovídajícím johexolu je nejméně 5. V případě potřeby se upraví konečná koncentrace acetonitrilu v mobilní fázi nebo se upraví program lineární gradientové eluce.

Odděleně se nastříkne po 10 μl zkoušeného roztoku a porovnávacího roztoku (b). Na chromatogramu zkoušeného roztoku není plocha žádného píku, kromě píků johexolu (viz výše), větší než polovina plochy hlavních píků johexolu na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) (0,5 %) a součet ploch všech píků, kromě hlavních píků johexolu (viz výše), není větší než 1,5násobek plochy hlavních píků na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) (1,5%). Nepřihlíží se k žádnému píku odpovídajícímu kontrolnímu roztoku.

1. B. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití vrstvy silikagelu GF₂s4 R.

   Zkoušený roztok. 1,0 g se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 10,0 ml.

   Porovnávací roztok (a). 50 mg johexolu nečistoty J CRL a 50 mg johexolu CRL se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 10,0 ml.

   Porovnávací roztok (b). 1,0 ml zkoušeného roztoku se zředí vodou R na 10,0 ml. 1,0 ml tohoto roztoku se zředí stejným rozpouštědlem na 50,0 ml.

   Vrstva se promyje mobilní fází, která je směsí objemových dílů amoniaku 26% R, methanolu R, 2-propanolu R a acetonu R (20 + 20 + 35 + 50), suší se 30 min při pokojové teplotě a pak 1 h při 90 °C.

   Na vrstvu se odděleně nanese po 10 μl každého roztoku a vyvíjí se výše uvedenou směsí po dráze 10 cm. Vrstva se pozoruje v ultrafialovém světle při 254 nm. Na chromatogramu zkoušenéμho roztoku není žádná skvrna, kromě hlavní skvrny, intenzivnější než skvrna na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) (0,2 %). Zkoušku lze hodnotit, jestliže na chromatogramu porovnávaμcího roztoku (a) jsou dvě zřetelně oddělené skvrny.

   3-Chlorpropan-1,2-diol. Nejvýše 100 μg/g. Stanoví se plynovou chromatografií (2.2.28). Zkoušený roztok. 1,0 g se rozpustí ve 2,0 ml vody R. Tento roztok se postupně čtyřikrát protřepe vždy 2 ml methylacetatu R. Spojené horní vrstvy se vysuší síranem sodným bezvodým R, zfiltrují se a zahustí na 2 ml.

   Porovnávací roztok. 0,50 g 3-chlorpropan-1,2-diolu R se rozpustí ve 100,0 ml methylacetatu R. 1,0 ml tohoto roztoku se zředí stejným rozpouštědlem na 100,0 ml.

   Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

   1. - křemenné kolony délky 25 m a vnitřního průměru 0,33 mm s vnitřním povrchem potaženým po- lyfenylmethylsiloxanem R (tlouštka filmu 1 μm),
   2. - helia pro chromatografií R jako nosného plynu při průtokové rychlosti 1 ml/min,
   3. - plamenoionizačního detektoru.

   Teplota kolony se udržuje 2 min na 80 °C, pak se zvyšuje rychlostí 15 °C/min až na 170 °C, při níž se udržuje 2 min. Teplota nástřikového prostoru je 230 °C a detektoru 250 °C.

   Odděleně se nastříkne po 2 μl každého roztoku (bez děliče se nastřikuje po dobu 30 s). Při zaznamenání chromatogramů za předepsaných podmínek je retenční čas 3-chlorpropan-1,2-diolu asi 8 min.

   Vypočte se obsah 3-chlorpropan-1,2-diolu.

Methanol, methoxyethanol a 2-propanol. Nejvýše 50 μg/g methanolu a nejvýše po 100 μg/g methoxyethanolu a 2-propanolu. Stanoví se plynovou chromatografií (2.2.28) head-space metodou a metodou standardního přídavku za použití 2-butanolu R jako vnitřního standardu.

Roztok vnitřního standardu. 0,50 g 2-butanolu R se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 500,0 ml. 5,0 ml tohoto roztoku se zředí vodou R na 100,0 ml.

Zkoušený roztok (a). 6,25 g se rozpustí ve vodě R, přidá se 5,0 ml roztoku vnitřního standardu a zředí se vodou R na 25,0 ml.

Zkoušený roztok (b). 5,0 ml zkoušeného roztoku (a) a 1,0 ml vody R se převedou do 1,0 ml lahvičky a lahvička se ihned uzavře.

Zkoušený roztok c). 5,0 ml zkoušeného roztoku (a) a 1,0 ml porovnávacího roztoku (b) se převedou do 10ml lahvičky a lahvička se ihned uzavře (odpovídá standardnímu přídavku 10 μg methanolu R, 20 μg 2-propanolu R a 20 μg methoxyethanolu R na 1 g zkoušené látky).

Zkoušený roztok (d). 5,0 ml zkoušeného roztoku (a) a 1,0 ml porovnávacího roztoku (c) se převedou do 10 ml lahvičky a lahvička se ihned uzavře (odpovídá standardnímu přídavku 25 μg methanolu R, 50 μg 2-propanolu R a 50 μg methoxyethanolu R na 1 g zkoušené látky).

Zkoušený roztok (e). 5,0 ml zkoušeného roztoku (a) a 1,0 ml porovnávacího roztoku (d) se převedou do 10ml lahvičky a lahvička se ihned uzavře (odpovídá standardnímu přídavku 50 μg methanolu R, 100 μg 2-propanolu R a 100 μg methoxyethanolu R na 1 g zkoušené látky).

Porovnávací roztok (a). 0,625 g methanolu R, 1,250 g 2-propanolu R a 1,250 g methoxyethanolu R se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 1000,0 ml. Mezi přídavky jednotlivých složek se vždy směs přiměřeně naředí vodou R.

Porovnávací roztok (b). 10,0 ml porovnávacího roztoku (a) se zředí vodou R na 50,0 ml. 10,0 ml tohoto roztoku se zředí stejným rozpouštědlem na 100,0 ml.

Porovnávací roztok (c). 5,0 ml porovnávacího roztoku (a) se zředí vodou R na 100,0 ml.

Porovnávací roztok (d). 10,0 ml porovnávacího roztoku (a) se zředí vodou R na 100,0 ml.

Porovnávací roztok (e). 10,0 ml porovnávacího roztoku (d) se přidá k 10,0 ml roztoku vnitřního standardu a zředí se vodou R na 50,0 ml. 6,0 ml tohoto roztoku se převede do 10ml lahvičky a lahvička se ihned uzavře.

Postup head-space metodou se obvykle provádí za podmínek:

1. - teploty 95 °C v komoře s řízenou teplotou,
2. - doby ustavování rovnováhy 15 min,
3. - teploty spojovacího vedení 140 °C,
4. - doby tlakování 30 s,
5. - doby plnění smyčky 10 s,
6. - doby nástřiku 10 s.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

1. - křemenné kolony délky 30 m a vnitřního průměru 0,54 mm s vnitřním povrchem potaženým zesítěným póly[(kyanopropyl)(methyl)][(fenyl)methyl)siloxanem R o tloušťce filmu 3 μm,
2. - helia pro chromatografií R jako nosného plynu při průtokové rychlosti asi 14 ml/min,
3. - plamenoionizačního detektoru.

Teplota kolony se udržuje 5 min na 40 °C, pak se zvyšuje rychlostí 10 °C/min na 100 °C, při níž se udržuje 1 min. Teplota nástřikového prostoru je 140 °C a teplota detektoru 250 °C.

Zaznamenají se chromatogramy zkoušených roztoků (b), (c), (d) a(e) a porovnávacího roztoku (e). Při zaznamenání chromatogramů za předepsaných podmínek jsou retenční časy methanolu asi 1,2 min, 2-propanolu asi 1,8 min, 2-butanolu asi 3,5 min a methoxyethanolu asi 4,5 min. Zkoušku lze hodnotit, jestliže rozlišení mezi píky methanolu a 2-propanolu na chromatogramu porovnávacího roztoku (e) je nejméně 2,5.

Z chromatogramů zkoušených roztoků se vypočte poměr plochy píku k ploše píku vnitřního standardu pro každou stanovovanou látku, zjištěné hodnoty se zpracují lineární regresní analýzou a vypočtou se koncentrace stanovovaných složek ve zkoušené látce.

Alternativní možnost. Poměry ploch píku se vynesou proti přidanému množství dané stanovované látky na 1 g zkoušené látky. Křivka spojující jednotlivé body se extrapoluje až k průsečíku s osou koncentrace. Délka úsečky mezi tímto průsečíkem a průsečíkem obou os je hledanou koncentrací stanovované látky ve zkoušené látce (v μg/g).

Volné aromatické aminy. Nejvýše 0,05 %; stanoví se absorpční spektrofotometru (2.2.25).

Zkoušený roztok. 0,200 g se v 25ml odměrné baňce rozpustí v 15,0 ml vody R.

Porovnávací roztok. 10,0 ml roztoku obsahujícího 10 μg/ml johexolu nečistoty J CRL se převede do 25ml odměrné baňky, přidá se 5,0 ml vody R a promíchá se.

Kontrolní roztok. 15,0 ml vody R se převede do 25ml odměrné baňky.

V průběhu dalšího postupu jsou baňky umístěny ve vodě s ledem a pracuje se za ochrany před světlem pokud možno až do okamžiku, kdy jsou přidána všechna zkoumadla.

Baňky obsahující zkoušený roztok, porovnávací roztok a kontrolní roztok se umístí do vody s ledem a ponechají se za ochrany před světlem 5 min. Pak se přidá po 1,5 ml kyseliny chlorovodíkové RS, promíchá se, přidá se po 1,0 ml roztoku dusitanu sodného R (20 g/l), promíchá se a nechá se stát 4 min. Přidá se po 1,0 ml roztoku kyseliny amidosírové R (40 g/l) a mírně se promíchává až do ukončení vývinu plynů a nechá se stát 1 min. (Upozornění: v baňkách vzniká přetlak). Pak se přidá 1,0 ml čerstvě připraveného roztoku naftylethylendiamoniumdichíóridu R (3 g/l) ve směsi objemových dílů vody R a propylenglykolu R (30 + 70) a promíchá se. Baňky se vyjmou z vody s ledem, zředí se vodou R na 25 ml, promíchá se a nechá se 5 min stát. Absorbance zkoušeného roztoku a porovnávacího roztoku se změří souběžně při vlnové délce 495 nm v tlouštce vrstvy 5 cm proti kontrolnímu roztoku.

Vypočte se obsah volných aromatických aminů.

Jodidy. Nejvýše 20 μg/g. Provede se potenciometrická titrace (2.2.20). 6,000 g se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 20 ml. Přidají se 2,0 ml jodidu draselného 0,001 mol/l VS a titruje se dusičnanem stříbrným 0,001 mol/l VS za použití stříbrné elektrody jako indikační a vhodné referenční elektrody.

Provede se slepá zkouška; 2,0 ml jodidu draselného 0,001 mol/l VS se zředí vodou R na 20 ml. Z rozdílu spotřeb se vypočte obsah jodidů.

1 ml dusičnanu stříbrného 0,001 mol/l VS odpovídá 126,9 μg jodidu.

Iontové sloučeniny. Nejvýše 0,05 %, počítáno jako chlorid sodný. Provede se stanovení měrné vodivosti (2.2.38).

Veškeré potřebné laboratorní sklo se před použitím pětkrát promyje vodou destilovanou R. Zkoušený roztok. 1,0 g se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 50,0 ml.

Porovnávací roztok. 10,0 mg chloridu sodného R se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 100,0 ml. 10,0 ml tohoto roztoku se zředí vodou R na 100,0 ml.

Na vhodném konduktometru se změří měrná vodivost zkoušeného roztoku a porovnávacího roztoku. Měrná vodivost zkoušeného roztoku není větší než měrná vodivost porovnávacího roztoku.

Těžké kovy (2.4.8). 12 ml roztoku S vyhovuje limitní zkoušce A na těžké kovy (10 μg/g). Porovnávací roztok se připraví za použití základního roztoku olova (1 μg Pb/ml).

Voda, semimikrostanovení (2.5.12). Nejvýše 4,0 %; stanoví se s 1,000 g zkoušené látky.

Stanovení obsahu

0,500 g se v 250ml baňce s kulovitým dnem smíchá s 25 ml hydroxidu sodného koncentrovaného RS, 20 ml vody R, 1 g zinku práškového R a přidá se několik skleněných varných kuliček. Vaří se pod zpětným chladičem 30 min. Pak se nechá vychladnout a chladič se promyje 20 ml vody R, které se přidají do baňky. Obsah baňky se zfiltruje přes filtr ze slinutého skla, filtr se promyje několika podíly vody R, které se spojí s filtrátem. Přidá se 5 ml kyseliny octové ledové R a ihned se titruje dusičnanem stříbrným 0,1 mol/l VS za potenciometrické indikace (2.2.20) bodu ekvivalence. Vhodným elektrodovým systémem je použití stříbrné a merkurosulfátové elektrody.

1 ml dusičnanu stříbrného 0,1 mol/l VS odpovídá 27,37 mg C₉H₂₆I₃N₃O₉.

Uchovávání

Ve vzduchotěsných obalech, chráněn před světlem a vlhkostí.

Separandum.

Nečistoty

1. A. 5-acetylamino-N,N՛-bis(2,3-dihydroxypropyl)-2,4,6-trijodbenzen-1,3-clikarboxamid,

1. B. 5-[N-(2,6,7-trihydroxy-4-oxaheptyl)acetamido]-N,N՛-bis(2,3-clihydroxypropyl)-2,4,6-trijod-benzen-1,3-dikarboxamid,

1. C. N,N-bis(2,3-dihydroxypropyl)-5-[N-(5,6-dihydroxy-2-hydroxymethyl-3-oxahexyl)acetamido]-2,4,6-trijodbenzen-1,3-dikarboxamid,

1. D. 5-[N-(2,3-dihydroxypropyl)acetamido]-N-(2,3-dihydroxypropyl)-N՛-(2,6,7-trihydroxy-4-oxaheptyl)-2,4,6-trijodbenzen-1,3-dikarboxamid,

1. E. 5-[N-(2,3-dihydroxypropyl)acetamido]-N-(5,6-dihydroxy-2-hydroxymethyl-3-oxahexyl)-N՛-(2,3-dihydroxypropyl)-2,4,6-trijodbenzen-1,3-dikarboxamid,
2. F. 5-amino-N,N՛-bis(2,3-dihydroxypropyl)dijodbenzen-1,3-dikarboxamid,
3. G. 5-acetamido-N,N՛-bis(2,3-dihydroxypropyl)dijodbenzen-1,3-dikarboxamid,
4. H. 5-[N-(2,3-dihydroxypropyl)acetamido]-N,N՛-bis(2,3-dihydroxypropyl)dijodbenzen-1,3-dikar-boxamid,

1. I. 2-hydroxymethyl-N,N՛-bis(2,3-dihydroxypropyl)-5,7-dijod-2,3-dihydro-4H-1,4-benzoxazin-6,8-dikarboxamid,

1. J. 5-amino-N,N՛-bis(2,3-dihydroxypropyl)-2,4,6-trijodbenzen-1,3-dikarboxarnid.

† Iopamidolum

Jopamidol

Je to (S)-N,Nˈ-bis[2-hydroxy-1-(hydroxymethyl)ethyl]-5-(2-hydroxypropionamido)-2,4,6-trijod- benzen-1,3-dikarboxamid. Počítáno na vysušenou látku, obsahuje 98,0 % až 101,0 % sloučeniny C₁₇H₂₂I₃N₃O₈.

Vlastnosti

Bílý nebo téměř bílý prášek. Je snadno rozpustný ve vodě, velmi těžce rozpustný v methanolu, prakticky nerozpustný v lihu 96 % a dichlormethanu.

Zkoušky totožnosti

1. A. Infračervené absorbční spektrum (2.2.24) zkoušené látky se shoduje se spektrem jopamidolu CRL.
2. B. Zkouška Ztráta sušením, viz Zkoušky na čistotu, je zároveň zkouškou totožnosti.
3. C. Zkouška Specifická optická otáčivost, viz Zkoušky na čistotu, je zároveň zkouškou totožnosti.

Zkoušky na čistotu

Vzhled roztoku. 1 g se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 50 ml. Roztok je čirý (2.2.1) a bezbarvý (2.2.2, Metoda II).

Kysele nebo zásaditě reagující látky. 10,0 g se rozpustí ve vodě prosté oxidu uhličitého R a zředí se jí na 100 ml. K dosažení hodnoty pH7,0 (2.2.3) se spotřebuje nejvýše 0,75 ml kyseliny chlorovodíkové 0,01 mol/l VS nebo 1,4 ml hydroxidu sodného 0,01 mol/l VS.

Specifická optická otáčivost (2.2.7). –4,6° až –5,2°, počítáno na vysušenou látku. Měří se při 436 nm. Tento roztok: 10,0 g se rozpustí ve vodě R, je-li třeba zahřátím, a zředí se stejným rozpouštědlem na 25,0 ml.

Příbuzné látky. Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29).

Zkoušený roztok. 0,50 g se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 50,0 ml.

Porovnávací roztok (a). 1,0 ml zkoušeného roztoku se zředí vodou R na 20,0 ml. 1,0 ml tohoto roztoku se zředí vodou R na 20,0 ml.

Porovnávací roztok (b). 25 mg jopamidolu nečistoty B CRL se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 100 ml. 0,5 ml tohoto roztoku se zředí porovnávacím roztokem (a) na 5 ml.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

1. - nerezové ocelové kolony délky 0,25 m a vnitřního průměru 4 mm naplněné silikagelem oktadecylsilanisovaným pro chromatografii R (5 pm),
2. - mobilní fáze, která je směsí vody R (mobilní fáze A) a roztoku methanolu R 25% (V/V) (mobilní fáze B), s průtokovou rychlostí 1,5 ml/min a s gradientovou elucí podle níže uvedené tabulky:

   Uchovávání Označování Hexetidinum Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání Nečistoty † Histidini hydrochloridum monohydricum1) Výroba Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání † Histidinum1) Výroba Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání † Hydrocortisonum Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Uchovávání Nečistoty Hydroxyethylis salicylas Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání Nečistoty Imipenemum Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání Označování Nečistoty † Insulinum Výroba Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání Označování † Insulinum humanum Výroba Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání Označování † Iohexolum Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Příbuzné látky. Stanovení obsahu Uchovávání Nečistoty † Iopamidolum Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu

   Čas (min)	Mobilní fáze A %(V/V)	Mobilní fáze B %(V/V)
   0	92,5	7,5
   6	92,5	7,5
   18	65	35
   30	8	92
   34	8	92
   36	92,5	7,5

1. - spektrofotometrického detektoru, 240 nm.

Teplota kolony se udržuje na 35 °C.

Nastříkne se 20 μl porovnávacího roztoku (b). Nastaví se citlivost detektoru tak, aby výšky obou píků na chromatogramu byly nejméně 50 % celé stupnice zapisovače. Zkoušku lze hodnotit, jestliže na získaném chromatogramu rozlišení mezi píkem jopamidolu nečistoty B a jopamidolu je nejméně 5,0.

Nastříkne se odděleně 20 μl zkoušeného roztoku a 20 μ porovnávacího roztoku (a). Na chromatogramu zkoušeného roztoku není součet ploch všech píků, kromě hlavního píku, větší než je plocha hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) (0,25 %). Nepřihlíží se k žádnému píku, jehož plocha je menší než 0,02násobek plochy hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (a).

Volné aromatické aminy. V průběhu zkoušky jsou roztoky a zkoumadla umístěny ve vodě s ledem, pracuje se za ochrany před světlem.

Zkoušený roztok. 0,500 g se v 25ml odměrné baňce rozpustí v 20,0 ml vody R.

Porovnávací roztok. 4,0 ml roztoku jopamidolu nečistoty A CRL (25,0 mg/l) se smíchá ve 25ml odměrné baňce se 16,0 ml vody R.

Kontrolní roztok. 20,0 ml vody R se převede do 25ml odměrné baňky.

Všechny tři baňky se umístí do vody s ledem a ponechají se 5 min za ochrany před světlem. Pak se přidá po 1,0 ml kyseliny chlorovodíkové R, obsahy baněk se promíchají a ponechá se 5 min stát. Přidá se po 1,0 ml roztoku dusitanu sodného R (20 g/l) připraveného těsně před použitím, promíchá se a opět se ponechá 5 min stát. Přidá se po 1,0 ml roztoku amidosíranu amonného R (120 g/l), mírně se promíchává, dokud unikají plyny. (Upozornění: v baňkách vzniká přetlak). Po 5 min se přidá po 1,0 ml čerstvě připraveného roztoku naftylethylendiamoniumdichloridu R (1 g/l) a promíchá se. Baňky se vyjmou z vody s ledem a nechají se stát 10 min. Pak se obsahy zředí vodou R na 25,0 ml, promíchá se a ihned se měří absorbance (2.2.25) zkoušeného a porovnávacího roztoku proti kontrolnímu roztoku při 500 nm.

Absorbance zkoušeného roztoku není větší než absorbance porovnávacího roztoku (200 pg/g).

Volný jod. Do kyvety pro odstřeďování opatřené zátkou se naváží 2,0 g a rozpustí se v 25 ml vody R. Přidá se 5 ml toluenu R a 5 ml kyseliny sírové zředěné RS. Obsah se protřepe a pak odstředí. V horní vrstvě nevznikne červené zbarvení.

Jodidy. Nejvýše 10 μg/g. Stanoví se potenciometrickou titrací (2.2.20). 6,000 g se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 20 ml. Přidají se 2,0 ml jodidu draselného 0,001 mol/l VS a titruje se dusičnanem stříbrným 0,001 mol/l VS za použití stříbrné elektrody jako indikační a vhodné referenční elektrody. Provede se slepá zkouška za použití 20 ml vody R a 2,0 ml jodidu draselného 0,001 mol/l VS a z rozdílu spotřeb odměrného roztoku se vypočte obsah jodidů.

1 ml dusičnanu stříbrného 0,001 mol/l VS odpovídá 126,9 μg jodidu.

Těžké kovy (2.4.8). 2,0 g vyhovují limitní zkoušce C na těžké kovy (10 μg/g). Porovnávací roztok se připraví za použití 2 ml základního roztoku olova (10 μg Pb/ml).

Ztráta sušením (2.2.32). Nejvýše 0,5 %; 1,000 g se suší v sušárně při 100 °C až 105 °C.

Síranový popel (2.4.14). Nejvýše 0,1 %; stanoví se s 1,00 g zkoušené látky.

Sterilita (2.6.1). Pokud je látka určena k výrobě parenterálních přípravků bez dalšího vhodného sterilizačního postupu, vyhovuje zkoušce na sterilitu.

Bakteriální endotoxiny (2.6.14). Pokud je látka určena k výrobě parenterálních přípravků bez dalšího postupu odstraňujícího bakteriální endotoxiny, vyhovuje zkoušce na bakteriální endotoxiny, obsahuje-li nejvýše 1,4 m.j. endotoxinu v gramu.

Stanovení obsahu

0,300 g v 250ml baňce s kulatým dnem se smíchá s 5 ml hydroxidu sodného koncentrovaného RS, 20 ml vody R, 1 g zinku práškovaného R a přidá se několik skleněných varných kuliček. Vaří se 30 min pod zpětným chladičem. Pak se nechá vychladnout, chladič se promyje 20 ml vody R a promývací kapalina se přidá do baňky.

Obsah baňky se zfiltruje filtrem ze slinutého skla, který se promyje několika podíly vody R. Filtrát se spojí s promývací tekutinou, přidá se 5 ml kyseliny octové ledové R a ihned se titruje dusičnanenm stříbrným 0,1 mol/l VS za potenciometrické indikace (2.2.20) bodu ekvivalence a za použití vhodného elektrodového systému jakým je stříbrná a merkurosulfátová elektroda.

1 ml dusičnanu stříbrného 0,1 mol/l VS odpovídá 25,90 mg C₁₇H₂₂I₃N₃O₈.

Uchovávání

V dobře uzavřených obalech, chráněn před světlem. Pokud je látka sterilní, uchovává se ve sterilních vzduchotěsných zabezpečených obalech.

Separandum.

Označování

V označení na obalu se uvede:

1. - zda je látka sterilní,
2. - zda je látka prostá bakteriálních endotoxinů.

Nečistoty

1. A. R¹ = NHCH(CH₂OH)₂; R² = H: 5-amino-A,A’-bis[2-hydroxy-1-(hydroxymethyl)ethyl]-2,4,6-trijodbenzen-1,3-dikarboxamid,
2. B. R¹ = NHCH(CH₂OH)₂; R² = COCH₂OH: N,N’-bis[2-hydroxy-1-(hydroxymethyl)ethyl]-5-(2-hydroxyacetamido)-2,4,6-trijodbenzen-1,3-dikarboxamid,
3. C. R¹ = NHCH(CH₂OH)₂; R² = COCH₃: N,N’-bis[2-hydroxy-1-(hydroxymethyl)ethyl]-5-acetamido-2,4,6-trijodbenzen-1,3-dikarboxamid,
4. D. R¹ = OH; R²= COCHOHCH₃: kyselina 3-{N-[2-hydroxy-l-(hydroxymethyl)ethyl]karbamoyl}-5-(2-hydroxypropionamido)-2,4,6-trijodbenzoová,
5. E. R¹ = NHCH(CH₂OH)₂; R²= COCH(CH₃)OCOCH₃: 5-(2-acetoxypropionamido)-N,N’-bis[2-hydroxy-1-(hydroxymethyl)ethyl]-2,4,6-trijodbenzen-1,3-dikarboxamid,
6. F. R¹ = N(CH₃)₂; R²= COCHOHCH3: N-[2-hydroxy-1-(hydroxymethyl)ethyl]-5-(2-hydroxypropionamido)-N’-dimethy 1-2,4,6-trij odbenzen-1,3-dikarboxamid,
7. G. R¹ = NHCH₂-CHOH-CH₂OH; R² = COCHOHCH₃: 5-(2-hydroxypropionamido)-N-[2-hydroxy-1-(hydroxymelhyl)ethyl]-N’-(2,3-dihydroxypropyl-2,4,6-trijodbenzcn-1,3-dikarboxamid.

Isoleucinum¹)

Isoleucin

Synonymum. L-Isoleucinum

Je to kyselina (2S,3S)-2-amino-3-methylvalerová. Počítáno na vysušenou látku, obsahuje 98,5 % až 101,0 % sloučeniny C₆H₁₃NO₂.

Výroba

Je-li vyráběn fermentací, vyhovuje požadavkům článku Producta fermentationis.

Vlastnosti

Bílý nebo téměř bílý krystalický prášek nebo vločky. Je mírně rozpustný ve vodě, těžce rozpustný v lihu 96%, prakticky nerozpustný v etheru. Rozpouští se ve zředěných minerálních kyselinách a ve zředěných roztocích alkalických hydroxidů.

Zkoušky totožnosti

Základní sestava zkoušek: A a C.

Alternativní sestava zkoušek: A, B a D, viz Obecné zásady (1.2).

1. A. Zkouška Specifická optická otáčivost, viz Zkoušky na čistotu, je zároveň zkouškou totožnosti.
2. B. 0,5 g se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 25 ml; roztok je pravotočivý.
3. C. Infračervené absorpční spektrum (2.2.24) tablety zkoušené látky se shoduje se spektrem tablety isoleucinu CRL.
4. D. Hodnotí se chromatogramy získané ve zkoušce Látky reagující s ninhydrinem, viz Zkoušky na čistotu. Hlavní skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku (b) odpovídá polohou, zbarvením a velikostí hlavní skvrně na chromatogramu porovnávacího roztoku (a).

Zkoušky na čistotu

Vzhled roztoku. 0,5 g se rozpustí v kyselině chlorovodíkové 1 mol/RS RS a zředí se jí na 10 ml. Roztok je čirý (2.2.1) a není zbarven intenzivněji než porovnávací barevný roztok HŽ₆ (2.2.2, Metoda II).

Specifická optická otáčivost (2.2.7). +39,0° až +42,0°, počítáno na vysušenou látku; měří se roztok připravený rozpuštěním 1,00 g v kyselině chlorovodíkové RS a zředěním stejnou kyselinou na 25,0 ml.

Látky reagující s ninhydrinem. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití desky s vrstvou silikagelu pro TLC R.

Zkoušený roztok (a). 0,10 g se rozpustí v kyselině chlorovodíkové 0,1 mol/l RS a zředí se jí na 10 ml. Zkoušený roztok (b). 1 ml zkoušeného roztoku (a) se zředí vodou R na 50 ml.

Porovnávací roztok (a). 10 mg isoleucinu CRL se rozpustí v kyselině chlorovodíkové 0,1 mol/l RS a zředí se jí na 50 ml.

Porovnávací roztok (b). 5 ml zkoušeného roztoku (b) se zředí vodou R na 20 ml.

Porovnávací roztok (c). 10 mg isoleucinu CRL a 10 mg valinu CRL se rozpustí v kyselině chlorovodíkové OJ mol/l RS a zředí se jí na 25 ml.

Na vrstvu se odděleně nanese po 5 μl každého roztoku a vyvíjí se směsí objemových dílů kyseliny octové ledové R, vody R a 1-butanolu R (20 + 20 + 60) po dráze 15 cm. Vrstva se usuší na vzduchu a postříká se ninhydrinem RS a zahřívá se 15 min při 100 °C až 105 °C. Žádná skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku (a), kromě hlavní skvrny, není intenzivnější než skvrna na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) (0,5 %). Zkoušku lze hodnotit, jestliže na chromatogramu porovnávacího roztoku (c) jsou dvě zřetelně oddělené skvrny.

Chloridy (2.4.4). 0,25 g se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 15 ml. Tento roztok vyhovuje limitní zkoušce na chloridy (200 μg/g).

Sírany (2.4.13). 0,5 g se rozpustí ve 3 ml kyseliny chlorovodíkové zředěné RS a zředí se vodou destilovanou R na 15 ml. Tento roztok vyhovuje limitní zkoušce na sírany (300 μ/g).

Amonium. Připraví se dvě hodinová sklíčka o průměru 60 mm a umístí se těsně vedle sebe. Na vnitřní stěnu horního sklíčka se přilepí čtvereček papíru lakmusového červeného R o velikosti strany 5 mm a zvlhčí se několika kapkami vody R. 50 mg upráškované zkoušené látky se umístí na spodní sklíčko a rozpustí se nebo suspenduje v 0,5 ml vody R. K roztoku nebo suspenzi se přidá 0,30 g oxidu horečnatého těžkého R a rychle se promíchá skleněnou tyčinkou. Sklíčko s papírem lakmusovým se ihned překlopí na sklíčko se zkoušenou látkou a vzniklá komůrka se zahřívá 15 min při 40 °C. Lakmusový papír není zbarven intenzivněji modře než lakmusový papír u porovnávacího vzorku připraveného současně stejným způsobem za použití 0,1 ml základního roztoku amonia (100 μg NH₄/ml), 0,5 ml vody R a 0,30 g oxidu hořečnatého těžkého R (200 μg/g).

Železo (2.4.9). 1,0 g se rozpustí v dělicí nálevce v 10 ml kyseliny chlorovodíkové zředěné RS a vytřepává se třikrát 3 min vždy s 10 ml isobutylmethylketonu R1. Ke spojeným organickým vrstvám se přidá 10 ml vody R a třepe se 3 min. Vodná vrstva vyhovuje limitní zkoušce na železo (10 μg/g).

Těžké kovy (2.4.8). 2,0 g vyhovují limitní zkoušce D na těžké kovy (10 μg/g). Porovnávací roztok se připraví za použití základního roztoku olova (10 μg Pb/ml).

Ztráta sušením (2.2.32). Nejvýše 0,5 %; 1,000 g se suší v sušárně při 100 °C až 105 °C.

Síranový popel (2.4.14). Nejvýše 0,1 %; stanoví se s 1,00 g zkoušené látky.

Stanovení obsahu

0,100 g se rozpustí ve 3 ml kyseliny mravenčí bezvodé R, přidá se 30 ml kyseliny octové bezvodé R a titruje se kyselinou chloristou 0,1 mol/l VS za použití 0,1 ml naftolbenzeinu RS jako indikátoru do změny hnědožlutého zbarvení na zelené.

1 ml kyseliny chloristé 0,1 mol/l VS odpovídá 13,12 mg C₆H₁₃NO₂.

Uchovávání

V dobře uzavřených obalech, chráněn před světlem.

† Isoprenalini hydrochloridum

Isoprenaliniumchlorid

Je to (RS)-N-isopropyl-[2-hydroxy-2-(3,4-dihydroxyfenyl)ethyl]amoniumchlorid. Počítáno na vysušenou látku, obsahuje 98,0 % až 101,5 % sloučeniny C₁₁H₁₈CINO₃

Vlastnosti

Bílý nebo téměř bílý krystalický prášek. Je snadno rozpustný ve vodě, mírně rozpustný v lihu 96%, prakticky nerozpustný v dichlormethanu.

Zkoušky totožnosti

Základní sestava zkoušek: B, C, E.

Alternativní sestava zkoušek: A, C, D a E, viz Obecné zásady (1.2).

1. A. Teplota tání (2.2.14). 166 °C až 170 °C.
2. B. Infračervené absorpční spektrum (2.2.24) tablety zkoušené látky se shoduje se spektrem tablety isoprenaliniumchloridu CRL.
3. C. Zkouška Optická otáčivost, viz Zkoušky na čistotu, je zároveň zkouškou totožnosti.
4. D. K 0,1 ml roztoku S, viz Zkoušky na čistotu, se přidá 0,05 ml chloridu železitého RS1 a 0,9 ml vody R; vznikne zelené zbarvení. Po kapkách se přidá hydrogenuhličitan sodný RS; vznikne nejprve modré, potom červené zbarvení.
5. E. K 0,5 ml roztoku S se přidá 1,5 ml vody R. Roztok vyhovuje zkoušce (a) na chloridy (2.3.1).

Zkoušky na čistotu

Roztoky se připraví bezprostředně před použitím.

Roztok S. 2,5 g se rozpustí ve vodě prosté oxidu uhličitého R a zředí se jí na 25,0 ml.

Vzhled roztoku. Roztok S je čirý (2.2.1) a není intenzivněji zbarven než porovnávací barevný roztok H₇ nebo HŽ₇ (2.2.2, Metoda II).

Hodnota pH (2.2.3). 4,3 až 5,5; měří se směs 5 ml roztoku S a 5 ml vody prosté oxidu uhličitého R.

Optická otáčivost (2.2.7). -0,10° až +0,10°; měří se roztok S.

Příbuzné látky. Stanoví se kapalinovou chromatografií (2.2.29).

Zkoušený roztok (a). 50,0 mg se rozpustí v mobilní fázi a zředí se jí na 10,0 ml.

Zkoušený roztok (b). 0,5 ml zkoušeného roztoku (a) se zředí mobilní fází na 100,0 ml.

Porovnávací roztok (a). 2,5 mg isoprenaliniumchloridu CRL se rozpustí v mobilní fázi a zředí se jí na 100,0 ml.

Porovnávací roztok (b). 2,5 mg orciprenaliniumsulfatu CRL se rozpustí v mobilní fázi a zředí se jí na 100,0 ml.

Porovnávací roztok (c). K 1,0 ml zkoušeného roztoku (b) se přidá 1,0 ml porovnávacího roztoku (b) a zředí se mobilní fází na 20,0 ml.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

1. - nerezové ocelové kolony délky 0,125 m a vnitřního průměru 4,0 mm naplněné silikagelem oktadecylsilanizovaným pro chromatografii R (5 jim),
2. - mobilní fáze, která je směsí objemových dílů methanolu R a roztoku kyseliny fosforečné R (11,5 g/l) (5 + 95), průtoková rychlost je 1,0 ml/min,
3. - spektrofotometrického detektoru, 280 nm,
4. - injektorové smyčky.

Nastříkne se 20 μl porovnávacího roztoku (a) a citlivost systému se nastaví tak, aby výška hlavního píku na chromatogramu byla nejméně 50 % celé stupnice zapisovače. Upraví se koncentrace methanolu v mobilní fázi tak, aby retenční čas hlavního píku byl asi 3 min. Nastříkne se 20 μl zkoušeného roztoku (a) a 20 μl porovnávacího roztoku (c). Chromatogram zkoušeného roztoku (a) se zaznamenává po dobu odpovídající sedminásobku retenčního času isoprenalinu. Zkoušku lze hodnotit, jestliže na chromatogramu porovnávacího roztoku (c) je rozlišení mezi dvěma hlavními píky nejméně 3 a poměr signálu k šumu píku isoprenalinu je nejméně 3.

Na chromatogramu zkoušeného roztoku (a) není plocha žádného píku, kromě hlavního píku, větší než plocha hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) (0,5 %) a součet ploch takových píků není větší než dvojnásobek plochy hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) (1 %). Nepřihlíží se k pikům, jejichž plocha je menší než 0,05násobek plochy hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (a).

Ztráta sušením (2.2.32). Nejvýše 1,0%. 1,000 g se suší 4h ve vakuové sušárně při 15 °C až 25 °C.

Síranový popel (2.4.14). Nejvýše 0,1 %; stanoví se s 1,00 g zkoušené látky.

Stanovení obsahu

Aby se zabránilo přehřátí reakčního prostředí, důkladně se míchá a titrace se ukončí ihned po dosažení bodu ekvivalence.

0,150 g se rozpustí v 10 ml kyseliny mravenčí bezvodé R a přidá se 50 ml acetanhydridu R. Titruje se kyselinou chloristou 0,1 mol/l VS za potenciometrické indikace bodu ekvivalence (2.2.20).

1 ml kyseliny chloristé 0,1 mol/l VS odpovídá 24,77 mg C₁₁H₁₈ClNO₃.

Uchovávání

Ve vzduchotěsném obalu, chráněn před světlem.

Separandum.

Nečistoty

1. A. (3,4-dihydroxyfenyl)isopropylaminomethylketon.

† Itraconazolum

Itrakonazol

Je to 4-{4-[4-[4-[[cis-2-(2,4-dichlorfenyl)-2-(1H-1,2,4-triazol-1-ylmethyl)-1,3-dioxolan-4-yl]-methoxy]fenyl]piperazin4-yl]fenyl}-2-[(1RS)-1-methylpropyl]-2,4-dihydro-3H-1,2,4-triazol-3-on. Počítáno na vysušenou látku, obsahuje 98,5 % až 101,5 % sloučeniny C₃₅H₃₈CI₂N₈O₄.

Vlastnosti

Bílý nebo téměř bílý prášek. Je prakticky nerozpustný ve vodě, snadno rozpustný v dichlormethanu, mírně rozpustný v tetrahydrofuranu, velmi těžce rozpustný v lihu 96%.

Zkoušky totožnosti

Základní sestava zkoušek: B.

Alternativní sestava zkoušek: A, C, D, viz Obecné zásady (1.2).

1. A. Teplota tání (2.2.14): 166 °C až 170 °C.
2. B. Infračervené absorpční spektrum (2.2.24) tablety zkoušené látky se shoduje se spektrem tablety itrakonazolu CRL.
3. C. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití vrstvy vhodného silikagelu oktadecylsilanizovaného.

   Zkoušený roztok. 30 mg se rozpustí ve směsi stejných objemových dílů methanolu R a dichlormethanu R a zředí se stejnou směsí na 5 ml.

   Porovnávací roztok (a). 30 mg itrakonazolu CRL se rozpustí ve směsi stejných objemových dílů methanolu R a dichlormethanu R a zředí se stejnou směsí na 5 ml.

   Porovnávací roztok (b). 30 mg itrakonazolu CRL a 30 mg ketokonazolu CRL se rozpustí ve směsi stejných objemových dílů methanolu R a dichlormethanu R a zředí se stejnou směsí na 5 ml.

   Na vrstvu se odděleně nanese po 5 μl každého roztoku a vyvíjí se v nenasycené komoře směsí objemových dílů octanu amonného RS, dioxanu R a methanolu R (20 + 40 + 40) po dráze 10 cm. Vrstva se 15 min suší v proudu horkého vzduchu a vystaví se působení par jodu, dokud se neobjeví skvrny. Pozoruje se v denním světle. Hlavní skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku odpovídá polohou, barvou a velikostí hlavní skvrně na chromatogramu porovnávacího roztoku (a). Zkoušku lze hodnotit, pokud na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) jsou dvě zřetelně oddělené skvrny.

1. D. Ke 30 mg se v porcelánovém kelímku přidá 0,3 g uhličitanu sodného bezvodého R. Zahřívá se 10 min nad plamenem. Po ochlazení se zbytek rozpustí v 5 ml kyseliny dusičné zředěné RS a zfiltruje se. K 1 ml filtrátu se přidá 1 ml vody R. Roztok vyhovuje zkoušce (a) na chloridy (2.3.1).

Zkoušky na čistotu

Roztok S. 2,0 g se rozpustí v dichlormethanu R a zředí se jím na 20,0 ml.

Vzhled roztoku. Roztok S je čirý (2.2.1) a není zbarven intenzivněji než porovnávací barevný roztok HŽ₆ (2.2.2, Metoda II).

Optická otáčivost (2.2.7). –0,10° až +0,10°. Měří se roztok S.

Příbuzné látky. Stanoví se kapalinovou chromatografií (2.2.29).

Zkoušený roztok. 0,100 g se rozpustí ve směsi stejných objemových dílů methanolu R a tetrahydrofuranu R a zředí se stejnou směsí na 10,0 ml.

Porovnávací roztok (a). 5,0 mg itrakonazolu CRL a 5,0 mg mikonazolu CRL se rozpustí ve směsi stejných objemových dílů methanolu R a tetrahydrofuranu R a zředí se stejnou směsí na 100,0 ml.

Porovnávací roztok (b). 1,0 ml zkoušeného roztoku se zředí směsí stejných objemových dílů methanolu R a tetrahydrofuranu R na 100,0 ml. 5,0 ml tohoto roztoku se zředí stejnou směsí na 10,0 ml.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

1. - nerezové ocelové kolony délky 0,1 m a vnitřního průměru 4,0 mm naplněné silikagelem oktadecylsilanizovaným deaktivovaným pro chromatografií bazických látek R (3 μm),
2. - mobilní fáze s průtokovou rychlostí 1,5 ml/min a gradientovým programem za následujících podmínek:
   1. - mobilní fáze A - roztok tetrabutylamoniumhydrogensulfatu R (27,2 g/1),
   2. - mobilní fáze B - acetonitril R,

   Uchovávání Označování Hexetidinum Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání Nečistoty † Histidini hydrochloridum monohydricum1) Výroba Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání † Histidinum1) Výroba Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání † Hydrocortisonum Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Uchovávání Nečistoty Hydroxyethylis salicylas Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání Nečistoty Imipenemum Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání Označování Nečistoty † Insulinum Výroba Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání Označování † Insulinum humanum Výroba Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání Označování † Iohexolum Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Příbuzné látky. Stanovení obsahu Uchovávání Nečistoty † Iopamidolum Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání Označování Nečistoty Isoleucinum1) Výroba Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání † Isoprenalini hydrochloridum Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání Nečistoty † Itraconazolum Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu

   Čas (min)	Mobilní fáze A % (V/V)	Mobilní fáze B % (V/V)	Poznámky
   0 - 20	80 →50	20 → 50	lineární gradient
   20 - 25	50	50	izokratická eluce
   25 - 30	80	20	přepnutí na počáteční složení eluentu
   30 = 0	80	20	začátek dalšího gradientu

1. - spektrofotometrického detektoru, 225 nm.

Kolona se ustaluje nejméně 30 min acetonitrilem R při průtokové rychlosti 1,5 ml/min a pak nejméně 5 min eluentem o počátečním složení.

Nastříkne se 10 μl porovnávacího roztoku (b). Citlivost systému se nastaví tak, aby výška hlavního píku byla nejméně 50 % celé stupnice zapisovače.

Nastříkne se 10 μl porovnávacího roztoku (a). Při zaznamenání chromatogramu za předepsaných podmínek jsou retenční časy mikonazolu asi 10,5 min a itrakonazolu asi 11 min. Zkoušku lze hodnotit, jestliže rozlišení mezi píky mikonazolu a itrakonazolu je nejméně 2,0. Je-li třeba, upraví se koncentrace acetonitrilu v mobilní fázi nebo se upraví časový program lineární gradientově eluce.

Nastříkne se odděleně 10 pl směsi stejných objemových dílů methanolu R a tetrahydrofuranu R jako slepá zkouška, 10 μl zkoušeného roztoku a 10 μl porovnávacího roztoku (b). Na chromatogramu zkoušeného roztoku není plocha žádného píku, kromě hlavního píku, větší než plocha hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) (0,5 %) a součet ploch všech píků, kromě hlavního píku, není větší než 2,5násobek plochy hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) (1,25 %). Nepřihlíží se k pikům získaným ve slepé zkoušce a k pikům s plochou menší než 0,1 násobek plochy hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b).

Ztráta sušením (2.2.32). Nejvýše 0,5%. 1,000 g se suší 4h v sušárně při teplotě 100 °C až 105 °C.

Síranový popel (2.4.14). Nejvýše 0,1 %, stanoví se s 1,00 g zkoušené látky.

Stanovení obsahu

0,300 g se rozpustí v 70 ml směsi objemových dílů kyseliny octové ledové R a 2-butanonu R (1+7). Titruje se kyselinou chloristou 0,1 mol/lVS za potenciometrické indikace do druhého inflexního bodu (2.2.20).

1 ml kyseliny chloristé 0,1 mol/l VS odpovídá 35,3 mg C₃₅H₃₈CI₂N₈O₄.

Uchovávání

V dobře uzavřených obalech, chráněn před světlem.

Separandum.

Nečistoty

1. A. 4-{4-[4-(4-methoxyfenyl)piperazin-1-yl]fenyl}-2-[(lRS)-1-methylpropyl]-2,4-dihydro-3 -1,2,4-triazol-3-on,

1. B. 4-{4-[4-[4-[[cis-2-(2,4-dichlorfenyl)-2-(4H-1,2,4-triazol-4-ylmethyl)-1,3dioxolan-4-yl]methoxy]fenyl]piperazin-1-yl]fenyl}-2-[(1RS)-1-methylpropyl]-2,4-dihydro-3H-1,2,4-triazol-3-on,

1. C. 4-{4-[4-[4-[[cis-2-(2,4-dichlorfenyl)-2-(1H-l,2,4-triazol-1-ylmethyl)-1,3-dioxolan-4-yl]met- hoxy]fenyl]piperazin-1-yl]fenyl}-2-(l-propyl)-2,4-dihydro-3H-1,2,4-triazol-3-on,

1. D. 4-{4-[4-[4-[[cis-2-(2,4-dichlorfenyl)-2-(1H-1,2,4-triazol-1-ylmethyl)-1,3-dioxolan-4-yl]met- hoxy]fenyl]piperazin1l-yl]fenyl}-2-isopropyl-2,4-dihydro-3H-1,2,4-triazol-3-on,

1. E. 4-{444-[4-[[tams-2-(2,4-dichlorfenyl)-2-(1H-1,2,4-triazol-1-ylmethyl)-1,3-dioxolan-4-yl]methoxy] feny 1] piperazin-1-yl] fenyl }-2-[(1RS)-1-methylpropyl]-2,4-dihydro-3H-1,2,4-triazol-3-on,

1. F. 2-butyl-4-{4-[4-[4-[[cis-2-(2,4-dichlorfenyl)-2-(1H-l,2,4-triazol-1-ylmethyl)-1,3-dioxolan-4-yl]methoxy]fenyl]piperazin-1-yl]fenyl}-2,4-dihydro-3H-1,2,4-triazol-3-on,

1. G. 4-{4-[4-[4-[[cis-2-(2,4-dichlorfenyl)-2-(1H-1,2,4-triazol-1-ylmethyl)-1,3-dioxolan-4-yl]methoxy] fenyl] piperazin-1-yl] fenyl}-2-{[cis-2-(2,4-dichlorfeny l)-2-(1H-1,2,4-triazol-1-ylmethyl)-1,3-dioxolan-4-yl]methyl}-2,4-dihydro-3H-1,2,4-triazol-3-on.

† Ivermectinum