Vyhláška Ministerstva životního prostředí, kterou se stanoví metody pro zjišťování fyzikálně-chemických a chemických vlastností chemických látek a chemických přípravků a vlastností chemických látek a chemických přípravků nebezpečných pro životní prostředí

PŘÍLOHA 1

Příklad postupu pro kultivaci řas

Obecně

Účelem kultivace dále popsaným postupem je získání řasových kultur pro zkoušky toxicity.

Metody použité k tomuto účelu musí zaručit, aby kultury řad nebyly infikovány bakteriemi (ISO 4833).

Za určitých okolností mohou být žádoucí i axenické kultury, avšak základem jsou jednodruhové kultury.

Aby nemohlo dojít ke kontaminaci bakteriemi a jinými řasami, provádějí se všechny pracovní kroky za sterilních podmínek.

Postupy při získání řasových kultur

Příprava živných roztoků (média)

Médium může být připraveno zředěním koncentrovaných základních roztoků živin. K získání pevného média se přidává 0,8 % agaru. Použité médium by mělo být sterilní. Sterilizace autoklávem může vést ke ztrátě NH₃.

Kmenová kultura

Kmenové kultury jsou malé kultury řas, které se přenášejí pravidelně do čestvého média. Slouží jako výchozí zkušební materiál. Nejsou-li kultury pravidelně používány, vyočkovávají se na šikmý agar a pak se přenášejí nejméně jednou za dva měsíce do čerstvého média.

Kmenové kultury se pěstují v Erlenmayerových baňkách obsahujících vhodné medium (přibližně objem 100 ml). Jsou-li řasy inkubovány při teplotě 20 °C a stálém osvětlení, musí se přenášet každý týden.

Při přeočkování se přenese sterilní pipetou do baňky s čerstvým mediem takové množství „staré“ kultury, aby výchozí koncentrace činila u rychle rostoucího druhu řas asi 1/100 koncentrace kultury staré.

Rychlost růstu daného druhu řas lze odečíst z růstové křivky. Z této růstové křivky lze odhadnout hustotu, při níž musí být kultura přenesena do čerstvého média. K tomu musí dojít před fází odumírání kultury.

Předkultura

Účelem předkultur je poskytnout dostatečné množství řas potřebných pro naočkování zkušebních kultur. Předkultura se inkubuje za zkušebních podmínek a použije se ještě během exponenciálního růstu, to znamená obvykle po třídenní inkubační lhůtě. Obsahují-li kultury řas deformované nebo abnormální buňky, musí se vyhodit.

PŘÍLOHA 2

ISO 8692 - Kvalita vody - Růstová inhibiční zkouška na sladkovodních řasách Scenedesmus subspicatus uvádí výsledky mezilaboratorních zkoušek dichromanu draselného provedených 16 laboratořemi.

1. IV STANOVENÍ SNADNÉ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI
   1. I OBECNÉ ÚVAHY
      1. I. 1 ÚVOD
         1. Je popsáno šest zkušebních metod, které umožňují vyhledávací posouzení snadné biologické rozložitelnosti chemických látek v aerobním vodním prostředí:

            (A) Úbytek rozpuštěného organického uhlíku (DOC)

            (B) Modifikovaná vyhledávací zkouška OECD - úbytek DOC

            (C) Uvolňování oxidu uhličitého (CO₂) (modifikovaná Sturmova zkouška)

            (D) Manometrická respirometrie

            (E) Zkouška v uzavřených lahvičkách

            (F) Zkouška MITI (Ministerstvo zahraničního obchodu a průmyslu - Japonsko)

         Obecné a společné úvahy pro všech šest zkoušek jsou uvedeny v části I metody. Specifické body jednotlivých metod jsou uvedeny v částech II až VII. Přílohy obsahují definice, vzorce a orientační poznámky.

         Mezilaboratorní srovnávací pokus OECD, provedený v roce 1988, ukázal, že uvedené metody poskytují shodné výsledky. V závislosti na fyzikálním charakteru zkoušené látky však může být v daném případě nejvhodnější určitá konkrétní metoda.

      1. I. 2 VÝBĚR VHODNÉ METODY

         Pro volbu nejvhodnější metody jsou nezbytné informace o rozpustnosti, o tenzi par a o adsorpční charakteristice dané chemické látky. Pro výpočet teoretických hodnot a ověření naměřených hodnot parametrů, např. TSK, TCO₂ , DOC, TOC, CHSK (viz přílohy 1 a 2) je nutné znát chemickou strukturu nebo vzorec.

         Zkoušené chemické látky, jejichž rozpustnost ve vodě činí alespoň 100 mg.l_-1, je možné zkoušet všemi metodami za předpokladu, že jsou netěkavé a neadsorbují se. Pro látky málo rozpustné ve vodě, těkavé nebo adsorbovatelné jsou vhodné metody uvedeny v tabulce 1. Způsob, kterým je třeba zacházet s látkami málo rozpustnými ve vodě a těkavými, je popsán v příloze 3. Mírně těkavé látky je možné zkoušet metodou úbytku DOC, pokud ve zkušebních nádobách (které musí být vhodně uzavřeny) existuje dostatečně velký prostor pro plyn. V tomto případě musí být provedena abiotická kontrola pro podchycení případné fyzikální ztráty.

         Pro interpretaci získaných výsledků, zejména pokud jsou výsledky nízké nebo marginální, se vyžadují informace o čistotě nebo relativních podílech hlavních složek zkoušeného materiálu.

         Pro volbu vhodných koncentrací pro zkoušku mohou být velmi užitečné informace o toxicitě zkoušené chemické látky pro bakterie (příloha 4). Tyto informace mohou mít zásadní význam pro správnou interpretaci nízkých hodnot biologického rozkladu.

         Tabulka 1: Použitelnost zkušebních metod

         PŘÍLOHA 2 Tabulka 1: Použitelnost zkušebních metod

         Zkušební metoda	Analytická metoda	Vhodnost pro látky
         		málo rozpustné	těkavé	absorbující
         IV - A	DOC	-	-	+/-
         IV - B	DOC	-	-	+/-
         IV - C	Respirometrie: vývin CO2	+	-	+
         IV - D	Manometrická respirometrie: vývin CO2	+	+/-	+
         IV - E	Respirometrie: rozpuštěný kyslík	+/-	+	+
         IV - F	Respirometrie: spotřeba kyslíku	+	+/-	+

      1. I. 3 REFERENČNÍ LÁTKY

         Pro ověření postupu se zkoušejí souběžně se studovanou látkou referenční chemické látky, které splňují kritéria snadné biologické rozložitelnosti.

         Vhodnými chemickými látkami jsou anilin (čerstvě předestilovaný), octan sodný a benzoan sodný. Tyto referenční chemické látky se uvedenými metodami všechny rozkládají i když se záměrně nepřidá žádné inokulum.

         Bylo navrženo hledat referenční chemickou látku, která by byla pohotově rozložitelná, avšak vyžadovala by přidání inokula. Byl navržen hydrogenftalát draselný. O této látce je třeba ještě získat více údajů, než ji bude možné přijmout jako referenční látku.

         V respirometrických zkouškách mohou příjem kyslíku ovlivnit látky obsahující dusík v důsledku nitrifikace (viz přílohy 2 a 5).

      1. I. 4 PRINCIP ZKUŠEBNÍCH METOD

         Roztok nebo suspenze zkoušené látky v minerálním prostředí se naočkuje a inkubuje v aerobních podmínkách v temnu nebo v difúzním světle. Množství DOC připadající ve zkoušeném roztoku na inokulum je třeba udržovat ve srovnání s DOC připadajícím na zkoušenou látku co nejnižší. Endogenní aktivita inokula se zohlední na základě paralelní slepé zkoušky s inokulem, avšak bez zkoušené látky. Přitom endogenní aktivita buněk v přítomnosti zkoušené látky neodpovídá přesně aktivitě v endogenní kontrolní zkoušce. Za účelem kontroly postupu se provádí souběžně zkouška s referenční látkou.

         Obecně řečeno po rozkladu následuje stanovení parametrů jako DOC, tvorba CO₂ a příjem kyslíku. Měření se provádí v dostatečně častých intervalech, aby bylo možné identifikovat začátek a konec biologického rozkladu. Měření automatickými respirometry je kontinuální. Někdy se měří doplňkově k jinému parametru DOC, avšak obvykle pouze na začátku a na konci zkoušky. Je rovněž možné použít specifickou chemickou analýzu, kterou se vyhodnotí primární rozklad zkoušené látky nebo se stanoví koncentrace kteréhokoli vzniklého meziproduktu (ve zkoušce MITI povinné).

         Zkouška normálně trvá 28 dní. Měření je však možné ukončit před uplynutím 28 dní, tj. jakmile křivka biologického rozkladu dosáhla na základě nejméně tří stanovení fáze vodorovného průběhu. Měření je také možné prodloužit i po 28 dnech, vyplývá-li z křivky, že biologický rozklad začal, avšak že v 28. den nebylo ještě dosaženo vodorovné části křivky.

      1. I. 5 KRITÉRIA KVALITY
         1. I. 5. 1 Reprodukovatelnost

            Vzhledem k charakteru biologického rozkladu a směsných populací bakterií používaných jako inokula je nutné provádět stanovení nejméně dvojmo.

            Je běžnou zkušeností, že čím vyšší je koncentrace mikroorganizmů přidaných na počátku do zkušebního média, tím menší jsou rozdíly mezi replikovanými měřeními. Okružní zkoušky rovněž ukázaly, že mezi výsledky získanými různými laboratořemi mohou být velké rozdíly, avšak u snadno biologicky rozložitelných sloučenin se obvykle dosahuje dobré shody.

         1. I. 5. 2 Platnost zkoušky

            Zkouška se považuje za platnou, je-li rozdíl krajních hodnot výsledků replikovaných měření rozkladu zkoušené látky na vodorovné části křivky, buď na konci zkoušky nebo na konci 10-denního okénka, podle toho, která z těchto eventualit přichází v úvahu, menší než 20 %, a dosáhl-li procentuální stupeň rozkladu referenční látky úrovně snadné biologické rozložitelnosti do 14 dní. Není-li splněna kterákoli z těchto podmínek, je nutné měření opakovat. Vzhledem k náročnosti metod neznamenají nízké hodnoty nutně, že studovaná látka není v podmínkách životního prostředí biologicky rozložitelná, ale ukazují, že k zajištění biologického rozkladu je třeba více práce.

            Jestliže ve zkoušce toxicity, zahrnující jak studovanou látku, tak referenční chemickou látku, došlo během 14 dnů k méně než 35 % rozkladu (na bázi DOC) nebo k méně než 25 % rozkladu (na bázi TSK nebo TCO₂), je možné zkoušené chemické látky považovat za inhibující (viz také přílohu 4. Sérii měření je třeba opakovat, pokud možno s nižší koncentrací studované chemické látky a (nebo) vyšší koncentrací inokula, avšak ne s koncentrací vyšší než 30 mg tuhých látek v litru.

      1. I. 6 VŠEOBECNÉ POSTUPY A PŘÍPRAVY

         Obecné podmínky pro zkoušky jsou přehledně uvedeny v tabulce 2. Aparatury a další experimentální podmínky, specifické pro jednotlivé metody, jsou popsány dále v kapitolách pro tyto příslušné metody.

         1. I. 6. 1 Zřeďovací voda

            Používá se deionizovaná nebo destilovaná voda, prostá inhibujících koncentrací toxických látek (např. iontů Cu^-). Voda smí obsahovat nejvýše 10 % obsahu organického uhlíku, vneseného zkoušenou látkou. Aby se vyloučily vysoké hodnoty ve slepých pokusech je nutná vysoká čistota vody pro zkoušky. Ke kontaminaci může dojít přítomnými nečistotami ze studované látky a z iontoměnných pryskyřic a rozkladnými látkami z bakterií a řas. Pro každou sérii měření je třeba používat pouze jednu šarži vody, která byla předem překontrolována analýzou DOC. Tato kontrola není nutná u zkoušky v uzavřených lahvičkách, spotřeba kyslíku vodou však musí být nízká.

            Tabulka 2: Experimentální podmínky v jednotlivých zkouškách

            PŘÍLOHA 2 Tabulka 1: Použitelnost zkušebních metod Tabulka 2: Experimentální podmínky v jednotlivých zkouškách

            Zkouška	Úbytek DOC	Uvolňování CO2	Manometrická respirometrie	Modifikovaná vyhledávací OECD zkouška	Uzavřené lahvičky	Zkouška MITI (I)
            	C 4. - A	C 4. - C	C 4. - D	C 4. - B	C 4. - E	C 4. - F
            Koncentrace zkoušené látky:
            mg.l-1			100		2 - 10	100
            mg DOC.l-1	10 - 40	10 - 20		10 - 40
            mg ThOD.l-1			50 - 100		5 - 10
            Koncentrace inokula	≤ 30 mg.-1l SL nebo ≤ 100 ml výtoku.l-1			0,5 ml sekund. výtoku.l-1	≤ 5 ml výtoku.l-1	30 mg.l-1 SL
            (buňky.l-1)		(107 - 108)		(105)	(104 - 106)	(107 - 108)
            Koncentrace prvku v minerálním médiu (mg.l-1)
            P	116				11,6	29
            N	1,3				0,13	1,3
            Na	86				8,6	17,2
            K	122				12,2	36,5
            Mg	2,2				2,2	6,6
            Ca	9,9				9,9	29,7
            Fe	0,05 - 0,1				0,05 - 0,1	0,15
            pH	7,4 ± 0,2					nejlépe 7,0
            teplota	22 ± 2 °C					25±1 °C
            DOC = rozpuštěný organický uhlík			SL = suspendované látky
            ThOD = teoretická spotřeba kyslíku

         1. I. 6. 2 Zásobní roztoky minerálních složek

            Pro přípravu zkušebních roztoků se připravují zásobní roztoky o vhodných koncentracích minerálních složek. Níže uvedené zásobní roztoky je možné použít (při různých zřeďovacích faktorech) pro metody úbytku DOC, pro modifikovanou vyhledávací metodu OECD, pro metodu uvolňování CO₂, pro manometrickou respirometrii a pro uzavřené láhvičky.

            Zřeďovací faktory a specifická příprava minerálního media pro zkoušku MITI jsou uvedeny v kapitolách pro jednotlivé zkoušky.

            1. Zásobní roztoky:

               Zásobní roztoky se připravují s použitím činidel analytické čistoty.

               (a) dihydrogenorthofosforečnan draselný, KH₂PO₄ 8,50 g

               1. monohydrogenorthofosforečnan didraselný, K₂ HPO₄, 21,75 g
               2. dihydrátmonohydrogenorthofosforečnan disodný Na₂HPO ₄ .2H₂O 33,40 g
               3. chlorid amonný, NH₄Cl 0,50 g

               Rozpustí se ve vodě a doplní na 1 litr. pH roztoku musí být 7,4.

               (b) chlorid vápenatý bezvodý, CaCl ₂ 27,50 g

               1. nebo dihydrát chloridu vápenatého, CaCl ₂.2H₂O 36,40 g

               Rozpustí se ve vodě a doplní na 1 litr.

               (c) heptahydrát síranu hořečnatého, MgSO₄.7H₂O 22,50 g

               Rozpustí se ve vodě a doplní na 1 litr.

               (d) hexahydrát chloridu železitého, FeCl₃.6H₂O 0,25 g

               Rozpustí se ve vodě a doplní na 1 litr.

            2. Poznámka: Aby nebylo nutné připravovat tento roztok bezprostředně před použitím, přidá se jedna kapka koncentrované kyseliny chlorovodíkové nebo 0,4 g disodné soli kyseliny ethylendiamintetraoctové (EDTA) na 1 litr.
         1. I. 6. 3 Zásobní roztoky chemických látek

            Pokud je rozpustnost vyšší než 1 g.l^-1, rozpustí se například 1 - 10 g (podle potřeby) zkoušené nebo referenční látky v deionizované vodě a doplní se na 1 litr. Jinak se připravují zásobní roztoky v minerálním médiu, nebo se chemická látka přidá přímo do minerálního média. Pokud se týká práce s méně rozpustnými chemickými látkami, viz přílohu 3. Ve zkoušce MITI (metoda IV-F) nelze používat ani rozpouštědla, ani emulgační činidla.

         1. I. 6. 4 Inokula

            Inokulum je možné získat z řady zdrojů: z aktivovaného kalu, ze splaškových vod (nechlorovaných), z povrchových vod a půd, nebo jako jejich směsi. Používá-li se aktivovaný kal ve zkoušce úbytku DOC, uvolňování CO₂ a manometrické respirometrie, je třeba jej odebírat z čistírny nebo z laboratorní jednotky čistící převážně domovní odpadní vody. U inokulí z jiných zdrojů byl zjištěn větší rozptyl výsledků. V modifikované vyhledávací zkoušce OECD a ve zkoušce v uzavřených lahvičkách je třeba zředěnější inokulum bez vloček kalu. Nejvhodnějším zdrojem je voda z druhého stupně čistírny domovních odpadních vod nebo z laboratorní jednotky. Pro zkoušku MITI se inokulum získává ze směsi zdrojů a je popsáno v kapitole o této zkoušce.

            1. I. 6. 4. 1 Inokulum z aktivovaných kalů

               Je třeba odebrat čerstvý vzorek aktivovaného kalu z aerační nádrže čistírny odpadních vod nebo laboratorní jednotky čistící převážně domovní odpadní vody. Je-li třeba, odstraní se hrubé částice filtrací jemným sítem a kal se udržuje v aerobních podmínkách.

               Alternativním způsobem je odsazení nebo zcentrifugování (např. při 1 100 g po dobu 10 min.) po odstranění hrubých částic. Voda nad usazeninou se slije. Kal je možno promýt minerálním médiem. Koncentrovaný kal se suspenduje v minerálním médiu na koncentraci 3 - 5 g suspendovaných tuhých látek na litr a provzdušňuje se až do použití.

               Kal je třeba odebrat z dobře pracující konvenční čistírny. Je-li nutné kal odebrat z čistírny s vysokým prosazením nebo předpokládá-li se, že obsahuje inhibitory, je třeba jej promýt. Znovu suspendovaný kal se po důkladném promíchání nechá usadit nebo se zcentrifuguje, voda nad usazeninou se slije a promytý kal se opět suspenduje v nové dávce minerálního média. Tento postup se opakuje, až se kal považuje za prostý přebytečného substrátu nebo inhibitoru.

               Po dokonalém suspendování nebo z neupravovaného kalu se odebere těsně před použitím vzorek pro stanovení sušiny suspendovaných tuhých látek.

               Další alternativou je homogenizace aktivovaného kalu (3 - 5 g suspendovaných látek v litru). Kal se zpracuje v mechanickém mísiči po dobu 2 min. při střední rychlosti. Promíchaný kal se nechá usadit po dobu 30 min nebo v případě potřeby déle a kapalina se slije pro použití jako inokulum v koncentraci 10 ml.l^-1 minerálního média.

            1. I. 6. 4. 2. Jiné zdroje inokula

               Inokulum je možné získat z výstupu druhého stupně čistírny odpadních vod nebo laboratorní jednotky, pracujících převážně s domovními odpadními vodami. Odebere se čerstvý vzorek a během přepravy se udržuje v aerobních podmínkách. Nechá se po dobu 1 hodiny usadit nebo se zfiltruje přes hrubý filtrační papír a slitá kapalina nebo filtrát se udržuje v aerobních podmínkách až do použití. Tohoto typu inokula je možné použít až 100 ml na 1 litr média. Dalším zdrojem inokula je povrchová voda. V tomto případě se odebere vzorek vhodné povrchové vody, např. říční nebo jezerní, a uchovává se v aerobních podmínkách až do použití. V případě potřeby se inokulum zkoncentruje filtrací nebo zcentrifugováním.

         1. I. 6. 5 Předběžné kondiciování inokula

            Inokula je možné předběžně kondicionovat na experimentální podmínky, ale ne předběžně adaptovat na zkoušenou látku. Předběžná kondicionace spočívá v aeraci aktivovaného kalu v minerálním médiu nebo výstupu z druhého stupně čistírny po dobu 5 - 7 dní při teplotě zkoušky. Předběžné kondicionování někdy zlepší přesnost zkušebních metod snížením hodnot ze slepých pokusů. Předběžně kondicionovat inokulum MITI se nepovažuje za nutné.

         1. I. 6. 6 Abiotické kontrolní zkoušky

            V případě potřeby se kontroluje možný abiotický rozklad zkoušené látky stanovením úbytku DOC, příjmu kyslíku nebo tvorby oxidu uhličitého ve sterilních kontrolních pokusech bez inokula. Sterilizace se provádí filtrací membránou (0,2 - 0,45 µm) nebo přidáním vhodné toxické látky v příslušné koncentraci. Používá-li se membránové filtrace, odebírají se vzorky asepticky za účelem zachování sterility. Pokud nebyla předem vyloučena adsorpce zkoušené látky, musí zkoušky, kterými se sleduje biologický rozklad podle úbytku DOC, zejména při použití inokula z aktivovaného kalu, zahrnovat abiotický kontrolní pokus, který byl naočkován a intoxikován.

         1. I. 6. 7 Počet nasazených baněk

            Počet použitých nádob (nasazených pokusů) v typické zkoušce je uveden v kapitolách pro jednotlivé zkoušky.

            1. Lze používat tyto typy nasazených nádob:
               1. Zkoušená suspenze: obsahuje zkoušenou látku a inokulum
               2. Slepá zkouška s inokulem: obsahuje pouze inokulum
               3. Kontrola postupu: obsahuje referenční látku a inokulum
               4. Abiotická sterilní kontrola: sterilní, obsahuje zkoušenou látku (viz 1.6.6)
               5. Kontrola pro adsorpci: obsahuje zkoušenou látku, inokulum a sterilizační činidlo
               6. Kontrola toxicity: obsahuje zkoušenou látku, referenční látku a inokulum

            Stanovení ve zkoušené suspenzi a slepý pokus s inokulem se musí povinně provádět souběžně. Stanovení v ostatních nádobách se doporučuje provádět rovněž souběžně.

            To však nemusí být vždy možné. Je třeba zajistit, aby se odebíral dostatečný počet vzorků nebo se prováděl dostatečný počet odečtů pro vyhodnocení procenta úbytku v 10-denním okénku.

      1. I. 7 VÝSLEDKY A JEJICH VYHODNOCENÍ

         Při výpočtu D_t , procentního úbytku, se používají střední hodnoty z dvojích měření daného parametru v obou zkušebních nádobách a ze slepého pokusu pro inokulum. Příslušné vzorce jsou uvedeny dále v kapitolách pro jednotlivé zkoušky. Průběh rozkladu se znázorní graficky a označí se 10-denní okénko. Vypočte a uvede se procentní úbytek dosažený na konci 10-denního okénka a hodnota pro vodorovnou část křivky nebo na konci zkoušky podle toho, která z nich je vhodnější.

         V respirometrických zkouškách mohou látky obsahující dusík ovlivnit příjem kyslíku v důsledku nitrifikace (viz příloha 2 a 5).

         1. I. 7. 1 Rozklad zjišťovaný na základě stanovení DOC
            1. Za účelem posouzení platnosti zkoušky (viz I.5.2) se musí v každém časovém okamžiku, ve kterém se odebral vzorek, vypočítat odděleně pro každou nádobu obsahující zkoušenou látku, pomocí středních hodnot dvojic měření DOC, procentní rozklad, D_t,. Vypočte se podle rovnice:
               1. kde:
                  1. D_t = procento rozkladu v čase t,
                  2. C_o = střední počáteční koncentrace DOC v naočkovaném kultivačním médiu obsahujícím zkoušenou látku (mg DOC.l^-1),
                  3. C_t = střední koncentrace DOC v naočkovaném kultivačním médiu obsahujícím zkoušenou látku v čase t (mg DOC.l^-1),
                  4. C_bo = střední počáteční koncentrace DOC ve slepém naočkovaném minerálním médiu (mg DOC.l^-1),
                  5. C_bt = střední koncentrace DOC ve slepém naočkovaném minerálním médiu v čase t (mg DOC.l^-1).

            Všechny koncentrace se zjišťují experimentálně.

         1. I. 7. 2 Rozklad měřený pomocí specifické analýzy
            1. Je-li možné získat specifické analytické údaje, vypočte se primární biologický rozklad z rovnice:
               1. kde:
                  1. D_t = procento rozkladu v čase t, obvykle 28 dní,
                  2. S_a = zbylé množství zkoušené látky v médiu s inokulem na konci pokusu (mg),
                  3. S_b = zbylé množství zkoušené látky ve slepém pokusu s vodou/médiem, do kterých byla přidána pouze zkoušená látka (mg).
         1. I. 7. 3 Abiotický rozklad
            1. Používá-li se abiotická sterilní kontrolní zkouška, vypočte se procentní abiotický rozklad podle rovnice:
               1. kde:
                  1. C_s(o) = koncentrace DOC ve sterilní kontrolní zkoušce v den 0
                  2. C_s(t) = koncentrace DOC ve sterilní kontrolní zkoušce v den t
      1. I. 8 PROTOKOL O ZKOUŠCE
         1. Protokol o zkoušce má obsahovat, je-li to možné, tyto údaje:
            1. - zkoušená a referenční chemická látka, jejich čistota;
            2. - podmínky při zkoušce;
            3. - inokulum: charakter a místo (místa) odběru, koncentrace a předběžná kondicionace;
            4. - podíl a charakter průmyslového odpadu obsaženého v odpadní vodě, jsou-li známy;
            5. - doba trvání zkoušky a teplota;
            6. - v případě málo rozpustných zkoušených látek použitý způsob zacházení;
            7. - použitá metoda zkoušení; je třeba uvést vědecké důvody a vysvětlení pro každou změnu postupu;
            8. - přehled dat;
            9. - veškeré pozorované projevy inhibice;
            10. - jakýkoliv pozorovaný abiotický rozklad;
            11. - analytické údaje o meziproduktech, pokud existují;
            12. - graf procentního rozkladu v závislosti na čase pro zkoušenou a referenční látku; je třeba zřetelně označit fázi zdržení, fázi rozkladu, 10-denní okénko a směrnici (příloha 1). Byla-li při zkoušce splněna kritéria kvality, je možné pro graf použít střední hodnotu procentního rozkladu v baňkách obsahujících zkoušenou látku;
            13. - procentní rozklad po 10-denním okénku, na vodorovné části křivky a na konci zkoušky.

1. IV. A ZKOUŠKA ÚBYTKU DOC
   1. II. 1 PRINCIP METODY

      Změřený objem naočkovaného minerálního média, obsahujícího známou koncentraci zkoušené látky (10 - 40 mg DOC.l^-1 ) jako jmenovitý jediný zdroj organického uhlíku, se provzdušňuje v temnu nebo v difúzním světle při 22 ± 2 °C.

      Rozklad se sleduje v častých intervalech během 28-denního období analýzou DOC. Stupeň biologického rozkladu se vypočítá tak, že se koncentrace rozloženého DOC (opravená na koncentraci v kontrolní zkoušce s inokulem) vyjádří jako procento koncentrace přítomné na začátku. Stupeň primárního biologického rozkladu je rovněž možné vypočítat z doplňkové chemické analýzy, provedené na začátku a na konci inkubace.

   1. II. 2 POPIS METODY
      1. II. 2. 1 Aparatura

         (a) Erlenmeyerovy baňky, např. od 250 ml do 2 l, podle objemu potřebného pro analýzu DOC.

         (b) Třepačka pro umístění Erlenmeyerových baněk, buď s automatickou regulací teploty nebo používaná v místnosti s konstantní teplotou, a s dostatečným výkonem pro udržení aerobních podmínek ve všech baňkách.

         (c) Filtrační aparatura s vhodnými membránami.

         (d) Analyzátor DOC.

         (e) Přístroj pro stanovení rozpuštěného kyslíku.

         (f) Odstředivka.

      1. II. 2. 2 Příprava minerálního média

         Příprava zásobních roztoků viz I. 6. 2.

         Smísí se 10 ml roztoku (a) s 800 ml zřeďovací vody, přidá se 1 ml roztoků (b) až (d) a doplní se na 1 l zřeďovací vodou.

      1. II. 2. 3 Příprava a předběžná kondicionace inokula

         Inokulum je možné získat z řady zdrojů: aktivovaný kal; splaškové odpadní vody; povrchové vody; půda nebo směs z uvedených typů.

         Viz I. 6. 4, I. 6. 4. 1, I. 6. 4. 2 a I. 6. 5.

      1. II. 2. 4 Příprava baněk

         Je například možné naplnit podíly po 800 ml minerálního média do 2 l Erlenmeyerových baněk a do jednotlivých baněk přidat dostatečná množství zásobních roztoků zkoušné a referenční látky tak, aby se získaly koncentrace látky odpovídající 10 - 40 mg DOC.l^-1. Zkontrolují se hodnoty pH a případně se upraví na 7,4. Baňky se naočkují aktivovaným kalem nebo jiným zdrojem inokula (viz I. 6. 4), aby se získala výsledná koncentrace nejvýše 30 mg suspendovaných tuhých látek na litr. Připraví se rovněž kontrolní zkoušky s inokulem v minerálním médiu, avšak bez zkoušené nebo referenční látky.

         V případě potřeby se použije jedna nádoba ke kontrole možného inhibičního efektu zkoušené látky naočkováním roztoku, který v minerálním médiu obsahuje srovnatelná množství jak zkoušené tak referenční látky.

         Je-li třeba, použije se rovněž další, sterilní, baňka s roztokem dané chemické látky bez inokula (viz I. 6. 6) ke kontrole zda je zkoušená chemická látka rozkládána abioticky.

         Existuje-li dále podezření, že se zkoušená látka významně adsorbuje na skle, kalu apod., provede se předběžný odhad pravděpodobného rozsahu adsorpce a tím vhodnosti zkoušky pro danou látku (viz tabulku 1). Použije se baňka obsahující zkoušenou látku, inokulum a sterilizační činidlo.

         Obsah všech baněk se doplní minerálním médiem na 1 l a po promíchání se z každé baňky odebere vzorek pro stanovení počáteční koncentrace DOC (viz příloha 2, odst.4). Ústí baněk se zakryjí např. hliníkovou fólií tak, aby byla možná volná výměna vzduchu mezi baňkami a okolní atmosférou. Pak se nádoby umístí do třepačky a zahájí se zkouška.

      1. II. 2. 5 Počet baněk v typické zkoušce

         Baňka 1 a 2: Zkoušená suspenze

         Baňka 3 a 4: Slepý pokus s inokulem

         Baňka 5: Kontrola postupu

         Pokud možno a je-li třeba:

         Baňka 6: Abiotická sterilní kontrola

         Baňka 7: Kontrola adsorpce

         Baňka 8: Kontrola toxicity

         Viz také bod I. 6. 7.

      1. II. 2. 6 Provedení zkoušky

         Během zkoušky se ve známých časových intervalech stanoví dvojmo koncentrace DOC v každé baňce, a to dostatečně často, aby bylo možné určit začátek 10-denního okénka a procentní úbytek na konci 10-denního okénka. Pro každé stanovení je třeba odebírat pouze minimální nutné množství zkoušené suspenze.

         Před odběrem vzorků se případně nahradí ztráty odpařováním z baněk přidáním potřebného množství zřeďovací vody (I. 6. 1). Před odběrem vzorků je třeba kultivační médium dobře promíchat a zajistit, aby látky ulpělé na stěnách nádob přešly do roztoku nebo suspenze. Ihned po odběru je třeba vzorky zfiltrovat přes membránu nebo zcentrifugovat (viz přílohu 2.4). Zfiltrované resp. zcentrifugované vzorky je třeba analyzovat týž den, jinak je možné je přechovávat nejdéle 48 hodin při 2 - 4 °C nebo po delší dobu při teplotě nižší než - 18 °C.

   1. II. 3 VÝSLEDKY A ZPRÁVA
      1. II. 3. 1 Zpracování výsledků

         Procentní rozklad v čase t se vypočte, jak je uvedeno v bodě I. 7. 1. (stanovení DOC) nebo případně v bodě I. 7. 2. (specifická analýza).

         Všechny výsledky se uvedou na přiložených přehledech dat.

      1. II. 3. 2 Platnost výsledků