Platné znění

Vyhláška, kterou se stanoví základní metody pro zkoušení toxicity chemických látek a chemických přípravků

účinné od 1. 8. 2004Strukturální aberace: změna chromozómové struktury zjistitelná mikroskopickou analýzou buněčného dělení ve stádiu metafáze, pozorovaná jako delece a fragmenty, a intrachromozomální nebo interchromozomální výměny.

  1. účinné od 1. 8. 20041.3 Princip metody

    účinné od 1. 8. 2004Zvířata se vhodným způsobem exponují testované látce a ve vhodnou dobu po působení se usmrtí. Před usmrcením se na ně působí látkou zastavující metafázi (například kolchicinem nebo Colcemidem®). Ze zárodečných buněk se pak připraví preparáty a po obarvení se v metafázích analyzují chromozómové aberace.

  1. účinné od 1. 8. 20041.4 Popis metody
    1. účinné od 1. 8. 20041.4.1 Příprava
      1. účinné od 1. 8. 20041.4.1.1 Výběr živočišného druhu

        účinné od 1. 8. 2004Běžně se používají samci čínských křečků a myší, lze ovšem použít samce jakéhokoliv jiného vhodného savčího druhu. Používají se běžné laboratorní kmeny mladých zdravých dospělých jedinců. Hmotnostní rozdíly by při zahájení studie měly být minimální a u každého pohlaví nemají přesahovat ± 20 % průměrné hmotnosti.

      1. účinné od 1. 8. 20041.4.1.2 Podmínky chovu

        účinné od 1. 8. 2004Všeobecné podmínky chovu jsou uvedeny ve Všeobecném úvodu.

        účinné od 1. 8. 2004Vlhkost by měla být 50 – 60 %.

      1. účinné od 1. 8. 20041.4.1.3 Příprava zvířat

        účinné od 1. 8. 2004Pokusná zvířata jsou vybrána s ohledem na druh, pohlaví, a stáří v souladu s ustanovením § 15 zvláštního právního předpisu10) a označena tak, aby byla možná identifikace jednotlivých zvířat. Dobu navykání stanoví § 10 zvláštního právního předpisu.10) Zdraví mladí dospělí jedinci se náhodně rozdělí do kontrolní a experimentální skupiny.

      1. účinné od 1. 8. 20041.4.1.4 Příprava dávek

        účinné od 1. 8. 2004Je-li testovaná látka v pevném stavu a je-li to možné, látka se před podáním zvířatům rozpustí nebo se připraví její suspenze ve vhodném rozpouštědle nebo vehikulu. Kapalné testované látky se mohou podávat přímo nebo se před podáváním ředí. Je třeba používat čerstvé preparáty, ledaže údaje o stálosti (stabilitě) prokazují, že skladování ji neovlivní.

    1. účinné od 1. 8. 20041.4.2 Podmínky testu
      1. účinné od 1. 8. 20041.4.2.1 Rozpouštědlo/ vehikulum

        účinné od 1. 8. 2004Rozpouštědlo/vehikulum v používaných dávkách nesmí vyvolávat toxické účinky a nesmí s testovanou látkou chemicky reagovat. Používá-li se nepříliš známé rozpouštědlo, musí být jeho použití podpořeno údaji o kompatibilitě s testovanou látkou. Doporučuje se, aby bylo na prvním místě použito vodné rozpouštědlo/ vehikulum.

      1. účinné od 1. 8. 20041.4.2.2 Kontroly

        účinné od 1. 8. 2004Do každého testu je třeba zařadit souběžné pozitivní a negativní (rozpouštědlo/ vehikulum) kontroly. Je třeba zacházet se zvířaty ve všech skupinách stejně.

        účinné od 1. 8. 2004Pozitivní kontroly by měly ve spermatogoniích vykazovat chromozómové aberace in vivo při dávkách kdy lze očekávat jejich detekovatelné zvýšení nad spontánní úroveň.

        účinné od 1. 8. 2004Dávky při pozitivní kontrole se volí tak, aby byly účinky patrné, ale přitom nenapovídaly hodnotiteli totožnost zakódovaného preparátu. Pozitivní kontrolu je možné podávat odlišným způsobem než testovanou látku a vzorek odebírat v jednom časovém intervalu. Kde je to možné, je třeba používat pozitivní kontrolu ze stejné chemické skupiny, jako je testovaná látka. Příklady látek vhodných pro pozitivní kontrolu.

        účinné od 1. 8. 2004
        LátkaCASEINECS
        cyklofosfamid
        monohydrát cyklofosfamidu        		50-18-0
        6055-19-2        		200-015-4
        cyklohexylamin108-91-8203-629-0
        mitomycin C50-07-7200-008-6
        akrylamid monomer79-06-1201-173-7
        triethylenmelamin51-18-3200-083-5

        účinné od 1. 8. 2004Negativní kontroly ovlivněné rozpouštědlem nebo vehikulem a zpracované stejným způsobem jako experimentální skupiny měly by být zařazeny do všech časových intervalů zpracování, pokud nejsou k dispozici přijatelné historické údaje o frekvenci buněk s aberacemi a o interindividuální variabilitě mezi zvířaty. Mimoto je třeba použít i neovlivněných kontrol, ledaže existují historické nebo publikované údaje prokazující, že zvolené rozpouštědlo, nebo vehikulum nevyvolává žádné nepříznivé nebo mutagenní účinky.

  1. účinné od 1. 8. 20041.5 Postup
    1. účinné od 1. 8. 20041.5.1 Počet a pohlaví zvířat

      účinné od 1. 8. 2004V každé zkušební a kontrolní skupině musí být minimálně pět analyzovatelných samců.

    1. účinné od 1. 8. 20041.5.2 Dávkovací schéma

      účinné od 1. 8. 2004Testovaná látka se podává nejlépe jednorázově nebo ve dvou dávkách. Pokud se jedná o objemnou dávku, může se k usnadnění aplikace rozdělit, tj. na dvě dávky za den podané v rozmezí nanejvýše několika hodin. Jiné režimy dávkování musí být vědecky odůvodněné.

      účinné od 1. 8. 2004V případě skupiny s nejvyšší dávkou se vzorky po expozici látce odebírají dvakrát. Jelikož testovaná látka může ovlivňovat kinetiku buněčného dělení, provádí se jeden dřívější a jeden pozdější odběr zhruba 24 a 48 hodin po expozici. U ostatních dávek (tj. mimo dávku nejvyšší) se odběr vzorků provádí po 24 hodinách nebo po 1,5-násobku délky buněčného cyklu po expozici, ledaže je znám vhodnější časový interval pro detekci účinku.5)

      účinné od 1. 8. 2004Kromě toho mohou být použity jiné časové intervaly odběru vzorků. Např. jedná-li se o látku zpomalující pohyb chromozómů během mitósy, nebo látku s účinky nezávislými na S-fázi cyklu, jsou vhodnější dřívější doba odběru vzorku.5)

      účinné od 1. 8. 2004Zda je vhodné nechat látku působit opakovaně, se posuzuje případ od případu. Pokud se provádí aplikace látky opakovaně, usmrcují se zvířata po 24 hodinách (1,5-násobku buněčného cyklu) od poslední aplikace. Odběry lze provádět i v dalších intervalech, považuje-li se to za účelné.

      účinné od 1. 8. 2004Před usmrcením se zvířatům intraperitoneálně injikuje vhodná dávka Colcemidu® nebo kolchicinu a následně se z nich ve vhodném intervalu odeberou vzorky. U myší je tento interval zhruba 3–5 hodin, u čínských křečků zhruba 4–5 hodin.

    1. účinné od 1. 8. 20041.5.3 Dávkování

      účinné od 1. 8. 2004Provádí-li se studie ke zjištění rozpětí toxicity, protože nejsou k dispozici žádné vhodné údaje, je třeba ji provádět v téže laboratoři za použití stejného živočišného druhu, kmene a pokusného režimu, jaké se použijí v hlavní studii.5) Při zjištění toxicity se užívají pro první časový interval odběru vzorků tři dávky tak, aby pokrývaly rozmezí od maximální toxicity k toxicitě nízké nebo nulové. Pro pozdější čas odběru vzorků je pak třeba použít jenom nejvyšší dávku. Ta je definována jako dávka vyvolávající takové známky toxicity, že při vyšších dávkách ve stejném režimu podávání by účinky byly letální.

      účinné od 1. 8. 2004Látky, jež v nízkých netoxických dávkách vykazují specifickou biologickou aktivitu, jako jsou hormony nebo mitogeny, mohou představovat výjimky z těchto kritérií pro stanovení dávek a vyhodnocují se případ od případu. Nejvyšší dávka může být také definována jako dávka, která vede k určitým známkám toxicity ve spermatogoniích (např. pokles poměru mitóz spermatogonií k první a druhé meiotické metafázi; tento pokles nemá být vyšší než 50 %).

    1. účinné od 1. 8. 20041.5.4 Limitní test

      účinné od 1. 8. 2004Jestliže test při dávce minimálně 2000 mg/kg hmotnosti v jedné dávce nebo ve dvou dávkách podaných v jeden den nevyvolává žádné pozorovatelné toxické účinky a jestliže se na základě údajů o látkách s podobnou chemickou strukturou neočekává genotoxicita, nemusí být provedena celá studie za použití tří dávkových úrovní. Podle očekávané humánní expozice se může použít v limitním testu vyšší dávky.

    1. účinné od 1. 8. 20041.5.5 Aplikace látky

      účinné od 1. 8. 2004Testovaná látka se obvykle vpravuje buď žaludeční sondou, nebo intraperitoneální injekcí. V odůvodněných případech mohou být přijatelné i jiné způsoby expozice. Maximální objem kapaliny, která se dá sondou nebo injekcí najednou vpravit, závisí na velikosti pokusného zvířete a nemá překročit 2 ml/100 g hmotnosti; vyšší dávky musí být zdůvodněné. S výjimkou dráždivých nebo žíravých látek, jež normálně vykazují při vyšších koncentracích horší účinky, je třeba upravit koncentrace látky tak, aby objem byl ve všech dávkových úrovních stejný a minimalizovala se tak objemová variabilita.

    1. účinné od 1. 8. 20041.5.6 Příprava chromozómů

      účinné od 1. 8. 2004Okamžitě po usmrcení zvířete se připraví z jednoho nebo z obou varlat buněčná suspenze, na kterou se působí hypotonickým roztokem a fixuje se. Buněčná suspenze se nakape na podložní sklo a obarví.

    1. účinné od 1. 8. 20041.5.7 Analýza

      účinné od 1. 8. 2004U každého jedince se analyzuje minimálně 100 dobře rozprostřených metafází (tj. minimálně 500 metafází v jedné skupině). Tento počet se dá snížit, je-li počet pozorovaných aberací vysoký. Všechny mikroskopické preparáty (včetně pozitivních a negativních kontrol) se před analýzou nezávisle zakódují. Jelikož fixační postupy často vedou k rozbití určitého podílu metafázických buněk a ztrátě chromozómů, musí být u všech typů buněk počet centromer v hodnocených buňkách roven číslu 2n ± 2.

  1. účinné od 1. 8. 20042 ÚDAJE
    1. účinné od 1. 8. 20042.1 Zpracování výsledků

      účinné od 1. 8. 2004Údaje z jednotlivých zvířat se zapisují do tabulky. Experimentální jednotkou je jedinec. U každého jedince se vyhodnocuje počet buněk se strukturálními chromozómovými aberacemi a počet aberací na jednu buňku. U experimentálních i kontrolních skupin se zaznamenají jednotlivé typy strukturálních chromozómových aberací, jejich počet a četnost. Gapy se zaznamenávají zvlášť, uvádějí se, ale obvykle se do celkové četnosti aberací nezahrnují.

      účinné od 1. 8. 2004Je-li analyzována mitóza i meióza, stanoví se u všech pokusných zvířat i zvířat z negativní kontroly jakožto míra cytotoxicity poměr mitóz spermatogonií k první a druhé meiotické metafázi, a to tak, že se z každého jedince použije 100 dělících se buněk. Je-li analyzována pouze mitóza, stanoví se mitotický index u minimálně 1000 buněk z každého jedince.

    1. účinné od 1. 8. 20042.2 Vyhodnocení a interpretace výsledků

      účinné od 1. 8. 2004Ke zjišťování pozitivního výsledku se používá několik kritérií, například na koncentraci testované látky závislá frekvence buněk s chromozómovými aberacemi, nebo zřetelný nárůst počtu buněk s aberacemi ve skupině ovlivněné jednorázovou dávkou a s jedním časovým intervalem odběru vzorků. Nejprve je třeba uvážit biologickou významnost výsledků. Při vyhodnocování výsledků testu je možno využít statistické metody;5) statistická významnost by však neměla být jediným určujícím faktorem pozitivního výsledku. Nejednoznačné výsledky je třeba vyjasnit dalším testováním, nejlépe za modifikovaných experimentálních podmínek.

      účinné od 1. 8. 2004Testovaná látka, při jejímž použití výsledky nesplňují výše uvedená kritéria, se v tomto systému považuje za nemutagenní.

      účinné od 1. 8. 2004Ačkoliv většina experimentů vykazuje jasně pozitivní, nebo negativní výsledky, ve výjimečných případech získaná data nedovolují jednoznačné posouzení účinku testované látky. Výsledky mohou být nejisté, nebo diskutabilní bez ohledu na počet opakovaných experimentů.

      účinné od 1. 8. 2004Pozitivní výsledky testu ukazují, že testovaná látka vyvolává v zárodečných buňkách příslušného živočišného druhu strukturální chromozómové aberace. Negativní výsledky ukazují, že za daných experimentálních podmínek testovaná látka v zárodečných buňkách příslušného živočišného druhu chromozómové aberace nevyvolává.

      účinné od 1. 8. 2004Je třeba diskutovat, jaká je pravděpodobnost, že testovaná látka nebo její metabolity dosáhnou cílové tkáně.

  1. účinné od 1. 8. 20043 Projekt pokusu, protokol pokusu a ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA

    účinné od 1. 8. 2004V souladu s příslušnými právními předpisy9) musí být zpracován projekt pokusu a o průběhu pokusu je nutno vést protokol.

    1. účinné od 1. 8. 2004Ve zprávě o průběhu pokusu je třeba uvést tyto informace:
      1. účinné od 1. 8. 2004Rozpouštědlo/vehikulum:
        1. účinné od 1. 8. 2004- zdůvodnění volby vehikula,
        2. účinné od 1. 8. 2004- rozpustnost a stabilita testované látky v rozpouštědle/vehikulu, pokud je známa.
      1. účinné od 1. 8. 2004Pokusná zvířata:
        1. účinné od 1. 8. 2004- použitý živočišný druh/kmen,
        2. účinné od 1. 8. 2004- počet a věk zvířat,
        3. účinné od 1. 8. 2004- původ, chovné podmínky, strava apod.,
        4. účinné od 1. 8. 2004- hmotnost jednotlivých zvířat na počátku testu, včetně hmotnostního rozpětí, průměrů a směrodatných odchylek pro jednotlivé skupiny.
      1. účinné od 1. 8. 2004Podmínky pokusu:
        1. účinné od 1. 8. 2004- údaje ze studie pro určení rozpětí toxicity, byla-li provedena,
        2. účinné od 1. 8. 2004- zdůvodnění volby velikosti dávek,
        3. účinné od 1. 8. 2004- zdůvodnění způsobu aplikace látky,
        4. účinné od 1. 8. 2004- podrobnosti o přípravě testované látky,
        5. účinné od 1. 8. 2004- podrobnosti o podávání testované látky,
        6. účinné od 1. 8. 2004- zdůvodnění doby usmrcení zvířat,
        7. účinné od 1. 8. 2004- případný převod koncentrace látky v potravě/pitné vodě (ppm) na faktickou dávku (mg/kg hmotnosti /den),
        8. účinné od 1. 8. 2004- podrobnosti o kvalitě potravy a vody,
        9. účinné od 1. 8. 2004- podrobné schéma podávání testované látky a odběru vzorků,
        10. účinné od 1. 8. 2004- metody zjišťování toxicity,
        11. účinné od 1. 8. 2004- látka blokující metafázi, její koncentrace a délka působení,
        12. účinné od 1. 8. 2004- metody přípravy mikroskopických preparátů
        13. účinné od 1. 8. 2004- kritéria pro hodnocení aberací,
        14. účinné od 1. 8. 2004- počet analyzovaných buněk na jedno zvíře,
        15. účinné od 1. 8. 2004- kritéria, jimiž se studie hodnotí jako pozitivní, negativní nebo nejednoznačná.
      1. účinné od 1. 8. 2004Výsledky:
        1. účinné od 1. 8. 2004- známky toxicity,
        2. účinné od 1. 8. 2004- mitotický index,
        3. účinné od 1. 8. 2004- poměr mitóz spermatogonií k první a druhé meiotické metafázi,
        4. účinné od 1. 8. 2004- typ a počet aberací pro každého jedince zvlášť,
        5. účinné od 1. 8. 2004- celkový počet aberací v dané skupině,
        6. účinné od 1. 8. 2004- počet buněk s aberacemi na jednu skupinu,
        7. účinné od 1. 8. 2004- vztah dávka-odpověď, je-li to možné,
        8. účinné od 1. 8. 2004- statistické analýzy, byly-li provedeny,
        9. účinné od 1. 8. 2004- údaje ze souběžných negativních kontrol,
        10. účinné od 1. 8. 2004- historické údaje z negativních kontrol včetně rozpětí, průměrů a směrodatných odchylek.
        11. účinné od 1. 8. 2004- údaje ze souběžných pozitivních kontrol,
        12. účinné od 1. 8. 2004- případně pozorované změny ploidie.

    účinné od 1. 8. 2004Diskuse výsledků.

    účinné od 1. 8. 2004Závěry.

účinné od 1. 8. 2004B.24 SPOT TEST U MYŠÍ

  1. účinné od 1. 8. 20041 METODA je v souladu s právem Evropských společenství.1)
    1. účinné od 1. 8. 20041.1 Princip metody

      účinné od 1. 8. 2004Je to in vivo test na myších, u kterých jsou vyvíjející se embrya exponována chemickým látkám. Cílovými buňkami u embryí jsou melanoblasty a cílovými geny ty, které kontrolují pigmentaci srsti. Embrya jsou heterozygoti pro řadu genů ovlivňujících barvu srsti. Mutace, nebo ztráty dominantních allel v genech melanoblastů jsou vyjádřeny recesivním fenotypem v dceřiných buňkách vytvářejících skvrny (spots) pozměněné barvy srsti narozených myší. Počet potomků s těmito skvrnami, mutacemi, je zaznamenán a jejich frekvence je srovnávána s frekvencí u potomků z kontrol. Myší spot test detekuje především somatické mutace v embryonálních buňkách.

    1. účinné od 1. 8. 20041.2 Popis metody
      1. účinné od 1. 8. 20041.2.1 Příprava

        účinné od 1. 8. 2004Testované látky jsou rozpuštěny, nebo suspendovány v isotonickém fyziologickém roztoku. Látky nerozpustné ve vodě jsou rozpuštěny, nebo suspendovány ve vhodném rozpouštědle. Použitá rozpouštědla nesmí reagovat s testovanou látkou, nebo vyvolávat toxický efekt. Používají se čerstvě připravené roztoky testované látky.

        1. účinné od 1. 8. 20041.2.1.1 Experimentální zvířata

          účinné od 1. 8. 2004Myši kmene T (nonagouti, a/a; chinchilla, pink eye, c ch p/cch p; brown, b/b; dilute, short ear, d se/d se; piebald spotting, s/s) jsou kříženy buď s kmenem HT (pallid, nonagouti, brachypody, pa a bp/pa a bp; leaden fuzzy, ln fz/ln fz; pearl pe/pe) nebo s kmenem C57 BL (nonagouti, a/a).

          účinné od 1. 8. 2004Mohou být použita i jiná křížení, za předpokladu že budou vznikat nonagouti potomci. Např. křížení mezi kmenem NMRI (nonagouti, a/a; albino, c/c) a DBA (nonagouti, a/a; brown, b/b; dilute d/d).

          účinné od 1. 8. 2004Pokusná zvířata jsou vybrána s ohledem na druh, pohlaví, a stáří v souladu s ustanovením § 15 zvláštního právního předpisu10) a označena tak, aby byla možná identifikace jednotlivých zvířat. Dobu navykání stanoví § 10 zvláštního právního předpisu.10)

        1. účinné od 1. 8. 20041.2.1.2 Počet a pohlaví zvířat

          účinné od 1. 8. 2004Použije se dostatečný počet zabřezlých samic, aby byl zajištěn dostatečný počet živých potomků pro každou použitou dávku. Vhodná velikost vzorku je závislá na počtu skvrn pozorovaných u ovlivněných myší a u kontrolních myší. Negativní výsledky jsou akceptovány pouze v případě, že bylo hodnoceno nejméně 300 potomků samic ovlivněných nejvyšší dávkou.

        1. účinné od 1. 8. 20041.2.1.3 Negativní a pozitivní kontroly

          účinné od 1. 8. 2004Musí být použity kontroly ovlivněné pouze rozpouštědlem (negativní kontroly). Ke zvýšení citlivosti testu mohou být použity kontrolní hodnoty z téže laboratoře za předpokladu, že jsou homogenní. Nedávné údaje z pozitivních kontrol získané v téže laboratoři při expozici látce se známým mutagenním účinkem mohou být v tomto testu použity, jestliže u testované látky nebyla mutagenita detekována.

        1. účinné od 1. 8. 20041.2.1.4 Způsob aplikace

          účinné od 1. 8. 2004Obvykle se používá orální aplikace sondou nebo intraperitoneální injekce březí myši. Je-li to vhodné, je možné použít inhalační, nebo jiný způsob aplikace.

        1. účinné od 1. 8. 20041.2.1.5 Dávkování

          účinné od 1. 8. 2004Používají se nejméně dvě dávky z nichž jedna vyvolává známky toxicity nebo zmenšení velikosti vrhu. U netoxických látek se použije maximální dosažitelná koncentrace.

      1. účinné od 1. 8. 20041.2.2 Popis postupu

        účinné od 1. 8. 2004Zvířata jsou obyčejně ovlivněna testovanou látkou pouze jednou 8., 9., nebo 10. den březosti, přičemž za 1.den březosti se považuje den zjištění vaginální zátky. Tyto dny odpovídají 7.25, 8.25 a 9.25 dnů po koncepci. Opakované ovlivnění látkou lze provést během těchto dnů.

        účinné od 1. 8. 2004Analýza

        1. účinné od 1. 8. 2004U mláďat je počítán a zaznamenáván počet skvrn mezi třetím a čtvrtým týdnem po porodu. Rozlišují se tři třídy skvrn:

          účinné od 1. 8. 2004(a) bílé skvrny v rozsahu 5 mm ve střední ventrální linii o kterých se předpokládá, že vznikly zánikem buněk (WMVS);

          účinné od 1. 8. 2004(b) žluté skvrny typu agouti, se vyskytují v okolí mléčných žláz, genitálií, hrdla, axil, oblasti slabin a uprostřed čela, a předpokládá se, že vznikají v důsledku chybné diferenciace (MDS);

          účinné od 1. 8. 2004(c) zbarvené a bílé skvrny náhodně rozmístěné v srsti jako výsledek somatických mutací (RS).

        účinné od 1. 8. 2004Všechny tři skupiny jsou zaznamenávány, ale pouze poslední, RS, je geneticky relevantní. Obtíže s odlišením mezi MDS a RS je možné vyřešit pozorováním chlupů ve fluorescenčním mikroskopu.

        účinné od 1. 8. 2004Zaznamenávají se nápadné, velké morfologické malformace potomků.

  1. účinné od 1. 8. 20042 ÚDAJE

    účinné od 1. 8. 2004Získaná data jsou uváděna jako celkový počet sledovaných potomků a počet mláďat majících jednu, nebo více skvrn vyvolaných somatickými mutacemi. Údaje získané z kontrolních a exponovaných skupin se porovnávají vhodnými metodami. Údaje jsou také uváděny jako získané hodnoty na vrh.

  1. účinné od 1. 8. 20043 PROJEKT POKUSU, PROTOKOL POKUSU A ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA

    účinné od 1. 8. 2004V souladu s příslušnými právními předpisy9) musí být zpracován projekt pokusu a o průběhu pokusu je nutno vést protokol.

    1. účinné od 1. 8. 2004Zpráva o průběhu pokusu obsahuje informace o:
      1. účinné od 1. 8. 2004- kmeni použitém při křížení,
      2. účinné od 1. 8. 2004- počtu zabřezlých samic v experimentální a v kontrolní skupině,
      3. účinné od 1. 8. 2004- průměrné velikosti vrhu v experimentální a v kontrolní skupině při porodu a při odstavení,
      4. účinné od 1. 8. 2004- dávkových úrovních testované látky,
      5. účinné od 1. 8. 2004- použitém rozpouštědle,
      6. účinné od 1. 8. 2004- ve kterém dni březosti byla testovaná látka aplikována,
      7. účinné od 1. 8. 2004- o způsobu podání testované látky,
      8. účinné od 1. 8. 2004- celkovém počtu sledovaných potomků, a jejich počet s WMVS, MDS a RS v experimentální a kontrolní skupině,
      9. účinné od 1. 8. 2004- hrubých morfologických malformacích,
      10. účinné od 1. 8. 2004- vztahu dávka/odpověď u RS, je-li to možné,
      11. účinné od 1. 8. 2004- statistickém hodnocení.

    účinné od 1. 8. 2004Diskuse výsledků.

    účinné od 1. 8. 2004Závěry.

účinné od 1. 8. 2004B.25 PŘENOSNÉ TRANSLOKACE U MYŠÍ

  1. účinné od 1. 8. 20041 METODA je v souladu s právem Evropských společenství.1)
    1. účinné od 1. 8. 20041.1 Princip metody

      účinné od 1. 8. 2004Test na přenosné translokace u myší detekuje strukturální a numerické chromozómové změny v savčích zárodečných buňkách zachycené v první generaci potomků. Indukované změny jsou reciproké translokace a u samičích potomků ještě ztráty X-chromozómu. Nositelé translokací a XO-samice vykazují sníženou fertilitu, která se využívá pro výběr F1 potomstva pro cytogenetickou analýzu. Úplná sterilita je způsobena některými typy translokací (X-autosom a c-t typ). Translokace jsou analyzovány mikroskopicky v meiotických buňkách samců ze spermatocytů ve stadiu diakinézy-metafáze I, nebo F1 samců či samčích potomků F1 samic. Samice XO jsou cytogeneticky identifikovány přítomností pouze 39 chromozómů v mitózách z kostní dřeně.

    1. účinné od 1. 8. 20041.2 Popis metody
      1. účinné od 1. 8. 20041.2.1 Příprava

        účinné od 1. 8. 2004Testované látky jsou rozpuštěny v isotonickém fyziologickém roztoku. Jestliže jsou nerozpustné, jsou rozpuštěny, nebo suspendovány ve vhodném rozpouštědle. Používají se čerstvě připravené roztoky testované látky. Jestliže bylo použito rozpouštědlo pro usnadnění dávkování látky, nesmí reagovat s testovanou látkou, nebo vyvolávat toxické účinky.

        1. účinné od 1. 8. 20041.2.1.1 Způsob aplikace

          účinné od 1. 8. 2004Aplikuje se obvykle orálně sondou, nebo intraperitoneální injekcí. Mohou být použity i jiné vhodné způsoby aplikace.

        1. účinné od 1. 8. 20041.2.1.2 Experimentální zvířata

          účinné od 1. 8. 2004Pro snadnější křížení a cytologickou verifikaci se pokusy provádí na myších. Nepožaduje se žádný specifický kmen. Průměrná velikost vrhu by měla být větší než osm a měla by být relativně konstantní. Používají se zdravá, pohlavně dospělá zvířata.

          účinné od 1. 8. 2004Pokusná zvířata jsou vybrána s ohledem na druh, pohlaví, a stáří v souladu s ustanovením § 15 zvláštního právního předpisu10) a označena tak, aby byla možná identifikace jednotlivých zvířat. Dobu navykání stanoví § 10 zvláštního právního předpisu.10)

        1. účinné od 1. 8. 20041.2.1.3 Počet zvířat

          účinné od 1. 8. 2004Počet zvířat nutně závisí na frekvenci spontánních translokací a na minimálním počtu indukovaných translokací vyžadovaném pro positivní kontrolu.

          účinné od 1. 8. 2004Test se obvykle provádí analýzou samců F1 potomků. Nejméně 500 samců v F1 generaci je testováno v každé exponované skupině. Jestliže budou analyzovány také samice F1 generace potomků, pak se vyžaduje 300 samců a 300 samic.

        1. účinné od 1. 8. 20041.2.1.4 Negativní a pozitivní kontroly

          účinné od 1. 8. 2004Mohou se použít adekvátní výsledky kontrol získané z předchozích pokusů. Jestliže jsou dostupné přijatelné výsledky pozitivních kontrol z nedávného pokusu z téže laboratoře, mohou být použity.

        1. účinné od 1. 8. 20041.2.1.5 Dávkování

          účinné od 1. 8. 2004Používá se jedna dávka, obyčejně nejvyšší dávka vyvolávající minimální toxický efekt ale bez vlivu na reprodukční chování nebo přežívání. Pro stanovení vztahu dávka/odpověď je třeba dvou dalších, nižších dávek. U netoxických látek se použije nejvyšší dosažitelná dávka.

      1. účinné od 1. 8. 20041.2.2 Popis postupu
        1. účinné od 1. 8. 20041.2.2.1 Expozice a oplodnění

          účinné od 1. 8. 2004Používají se dva způsoby expozice. Nejčastěji se používá jedna aplikace testované látky. Také je možná varianta podávání testované látky sedm dní v týdnu po 35 dnů.

          účinné od 1. 8. 2004Počet oplodnění po expozici je řízen schématem experimentu a musí zajistit, že všechna buněčná stádia zárodečných buněk budou analyzována. Na konci období oplodňování jsou samice samostatně rozděleny do klecí. Po porodu je třeba zaznamenat datum, velikost vrhu a pohlaví mláďat. Po vrhu jsou samčí i samičí potomci odděleni až do doby zařazení do experimentu.

        1. účinné od 1. 8. 20041.2.2.2 Zjišťování translokačních heterozygotů

          účinné od 1. 8. 2004Používá se jedna ze dvou možných metod. Test fertility F1 potomků a následná verifikace možných nositelů translokací cytogenetickou analýzou nebo cytogenetická analýza všech samců F1 generace bez předchozího výběru pomocí testu fertility.

          účinné od 1. 8. 2004(a) Test fertility

          účinné od 1. 8. 2004Snížená fertilita zvířat v F1 generaci se může stanovit z velikosti vrhu a/nebo analýzou obsahu dělohy samic. Kritéria určení normální a snížené fertility musí být stanovena pro každý kmen použitých myší.

          účinné od 1. 8. 2004Velikost vrhu: F1 samci určení k testování jsou odděleni samostatně do klecí se samicemi ze stejného experimentu, nebo stejné skupiny. Klece jsou kontrolovány denně počínaje 18.dnem po oplodnění. Velikost vrhu a pohlaví F2 potomků jsou zaznamenány při porodu, hned poté jsou odděleni. Jestliže jsou testovány F1 samice, F2 potomci malých vrhů jsou uchováváni pro další testy. Samice-nositelky translokací jsou verifikovány cytogenetickou analýzou translokací u jakéhokoliv jejich mužského potomka. X0-samice jsou určeny změnou sex ratio mezi jejich potomky z 1:1 na 1:2 samci vs. samice. V následném kroku jsou normální F1 zvířata vyřazena z dalšího testování jestliže první F2 vrh dosahuje, nebo převyšuje předem určenou normální hodnotu, jinak jsou zaznamenány druhé a třetí vrhy.

          účinné od 1. 8. 2004F1 zvířata která nemohou být klasifikována jako normální po vyhodnocení tří F2 vrhů, jsou dále testována buď analýzou obsahu dělohy, nebo jsou přímo podrobena cytogenetické analýze.

          účinné od 1. 8. 2004Analýzy obsahu dělohy: Redukce velikosti vrhu u nosičů translokací je způsobena smrtí embryí, takže vysoký počet mrtvých implantací indikuje přítomnost translokací u testovaných zvířat. Testovaní F1 samci jsou připouštěni každý ke 2 - 3 samicím. Oplodnění se zjišťuje denní ranní kontrolou vaginální zátky. Samice jsou usmrceny 14. -16. den a jsou zaznamenány živé a mrtvé zárodky.

          účinné od 1. 8. 2004(b) Cytogenetická analýza

          účinné od 1. 8. 2004Metodou air-drying jsou připraveny preparáty z testes. Nosiči translokací jsou určeni na základě přítomnosti multivalentních figur ve stádiu diakinézy - metafáze I v primárních spermatocytech. Nález nejméně dvou buněk s multivalentními asociacemi splňuje požadovaný důkaz, že testované zvíře je nositelem translokace. Jestliže byl proveden výběr no breeding, všichni F1 samci jsou vyšetřeni cytogeneticky. Na každého samce musí být mikroskopicky vyšetřeno nejméně 25 buněk v diakinéze - metafáze I. Analýza mitotických metafází ve spermatogoniích nebo v kostní dřeni se vyžaduje u samců s malými testes a potlačením meiozy před diakinézou, nebo u F1 samic suspektních X0. Přítomnost neobvykle dlouhého a/nebo krátkého chromozómu v každé z 10 buněk je důkazem pro částečnou samčí translokační sterilitu (c-t typ). Některé X-autosomální translokace způsobující samčí sterilitu mohou být identifikovány pouze pruhováním mitotických chromozómů. Přítomnost 39 chromozómů ve všech 10 mitózách je důkazem pro X0 samice.

  1. účinné od 1. 8. 20042 ÚDAJE

    účinné od 1. 8. 2004Získané údaje se zapisují do tabulky.

    účinné od 1. 8. 2004Pro každý interval připouštění je zaznamenána průměrná velikost vrhu a poměr pohlaví (sex ratio) při narození a při odstavení.

    účinné od 1. 8. 2004Pro odhad fertility F1 zvířat se uvádí průměrná velikost vrhu kontroly a individuální velikosti vrhů F1 nosičů translokací. Pro analýzu obsahů dělohy se uvádí průměrný počet živých a mrtvých zárodků v kontrole a individuální počty živých a mrtvých zárodků pro každé připouštění F1 nosičů translokací.

    účinné od 1. 8. 2004Při cytogenetické analýze diakinéze-metafáze I se uvádí počet typů multivalentních figur a celkový počet buněk pro každého nosiče translokací.

    účinné od 1. 8. 2004Pro F1 sterilní jedince se zaznamenává počet a doba připuštění. Dále se uvádí váha testes a podrobnosti o cytogenetické analýze.

    účinné od 1. 8. 2004U X0 samic se uvádí průměrná velikost vrhu, sex ratio F2 potomků a výsledky cytogenetické analýzy.

    účinné od 1. 8. 2004V případě, že pomocí testů fertility byly předběžně vybráni možní nositelé F1 translokací, je třeba v tabulkách uvést informaci o skutečném počtu potvrzených translokačních heterozygotů.

    účinné od 1. 8. 2004Musí být uvedeny údaje o negativních a pozitivních kontrolách.

  1. účinné od 1. 8. 20043 PROJEKT POKUSU, PROTOKOL POKUSU A ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA

    účinné od 1. 8. 2004V souladu s příslušnými právními předpisy9) musí být zpracován projekt pokusu a o průběhu pokusu je nutno vést protokol.

    1. účinné od 1. 8. 2004Zpráva o průběhu pokusu obsahuje tyto informace o:
      1. účinné od 1. 8. 2004- kmenu myší, stáří a váze exponovaných zvířat,
      2. účinné od 1. 8. 2004- počtu rodičovských zvířat pro každé pohlaví v exponovaných a kontrolních skupinách,
      3. účinné od 1. 8. 2004- experimentálních podmínkách, detailní popis ovlivňování zvířat, dávkové hladiny, rozpouštědla a schéma připouštění,
      4. účinné od 1. 8. 2004- počtu a pohlaví mláďat na samici, počet a pohlaví potomků chovaných pro analýzu translokací,
      5. účinné od 1. 8. 2004- době a kritériích analýzy translokací,
      6. účinné od 1. 8. 2004- počet a detailní popis nosičů translokací, včetně údajů o březosti a obsahu dělohy,
      7. účinné od 1. 8. 2004- popis cytogenetické metody a mikroskopické analýzy, včetně obrázků,
      8. účinné od 1. 8. 2004- statistické hodnocení.

    účinné od 1. 8. 2004Diskuse výsledků.

    účinné od 1. 8. 2004Závěry.

účinné od 1. 8. 2004B.26 TEST SUBCHRONICKÉ ORÁLNÍ TOXICITY (90ti-denní studie orální toxicity s opakovanou aplikací hlodavcům)

  1. účinné od 1. 8. 20041 METODA je v souladu s právem Evropských společenství.7)
    1. účinné od 1. 8. 20041.1 Úvod

      účinné od 1. 8. 2004Při posouzení a hodnocení toxických vlastností chemické látky lze stanovení subchronické orální toxicity s opakovanou aplikací po získaní prvních informací o toxicitě z testů akutní toxicity nebo toxicity při 28denní opakované aplikaci. Tato 90denní studie poskytuje informace o možném nebezpečí pro zdraví, které by mohlo nastat vlivem opakované expozice látce v průběhu delšího období, zahrnujícího vývoj po odstavení a růst až do dospělosti. Studie má poskytnout informace o významných toxických účincích, určit cílové orgány a možnou kumulaci a může poskytnout odhad hladiny bez pozorovaného nepříznivého účinku, kterou lze použít při výběru úrovni dávek pro chronické studie a pro stanovení bezpečnostních kritérií pro expozici člověka.

      účinné od 1. 8. 2004Metoda klade dále důraz na neurologické příznaky a naznačuje možné imunologické účinky a účinky na reprodukci. Důraz se klade též na pečlivé klinické pozorování zvířat, s cílem získat co nejvíce informací. Tato studie by měla umožnit identifikaci chemických látek, které by mohly vyvolat neurotoxické či imunologické účinky nebo mít nepříznivý vliv na reprodukční orgány, které by vyžadovaly další hlubší zkoumání.

    1. účinné od 1. 8. 20041.2 Definice

      účinné od 1. 8. 2004Dávka: je podané množství testované látky. Dávka se vyjadřuje buď jako hmotnost (v g, mg), nebo jako hmotnost testované látky na jednotku hmotnosti testovaného zvířete (např. mg/kg) nebo jako konstantní koncentrace v potravě (ppm) nebo v pitné vodě.

      účinné od 1. 8. 2004Dávkování: je obecný termín zahrnující dávku, její četnost a trvání podávání.

      účinné od 1. 8. 2004NOAEL (no observed adverse effect level): je zkratka pro hladinu bez pozorovaného nepříznivého účinku a odpovídá nejvyšší dávce nebo expozici, při které nejsou pozorovány žádné nepříznivé účinky související s podáváním látky.

    1. účinné od 1. 8. 20041.3 Princip metody

      účinné od 1. 8. 2004Testovaná látka se podává denně orálně po 90 dní v odstupňovaných dávkách několika skupinám pokusných zvířat, a to každé skupině jedna úroveň dávky. Během podávání se zvířata pečlivě pozorují, aby se zjistily příznaky toxicity. Zvířata, která uhynou během pokusu nebo jsou utracena, i zvířata, která přežijí konec pokusu, se pitvají.

    1. účinné od 1. 8. 20041.4 Popis metody
      1. účinné od 1. 8. 20041.4.1 Příprava zvířat

        účinné od 1. 8. 2004Pokusná zvířata jsou vybrána s ohledem na druh, pohlaví, a stáří v souladu s ustanovením § 15 zvláštního právního předpisu10) a označena tak, aby byla možná identifikace jednotlivých zvířat. Dobu navykání stanoví § 10 zvláštního právního předpisu.10) Zvířata se náhodně přiřadí do kontrolní a do jednotlivých experimentálních skupin.

      1. účinné od 1. 8. 20041.4.2 Příprava dávek

        účinné od 1. 8. 2004Testovanou látku lze podávat sondou, v potravě nebo v pitné vodě. Způsob orálního podávání závisí na účelu studie a na fyzikálních a chemických vlastnostech testované látky.

        účinné od 1. 8. 2004Pokud je to nezbytné, testovaná látka se rozpustí nebo suspenduje ve vhodném vehikulu. Doporučuje se nejprve zvážit použití vodného roztoku, potom roztoku nebo emulze nebo suspenze v oleji (např. kukuřičném) a pak roztoku v jiném vehikulu. Pro nevodná vehikula je třeba znát jejich toxikologickou charakteristiku. Je třeba stanovit stabilitu testované látky v podmínkách aplikace.

      1. účinné od 1. 8. 20041.4.3 Experimentální podmínky
        1. účinné od 1. 8. 20041.4.3.1 Pokusná zvířata

          účinné od 1. 8. 2004V pokusech se upřednostňují potkani, ale lze použít i jiný druh hlodavců, např. myši. Použijí se mladá zdravá zvířata z běžně užívaných laboratorních kmenů. Samice musí být nulipary a nesmí být březí. Aplikace by měla začít co nejdříve po odstavení a dříve než zvířata dosáhnou stáří devíti týdnů. Na začátku studie má být variační rozpětí hmotnosti zvířat minimální; pro každé pohlaví zvlášť by nemělo překročit ± 20 % střední hodnoty. Je-li studie předběžnou studií pro dlouhodobou studii chronické toxicity, měla by se v obou studiích používat zvířata stejného kmene a stejného původu.

        1. účinné od 1. 8. 20041.4.3.2 Počet a pohlaví

          účinné od 1. 8. 2004Pro každou hladinu dávek se použije nejméně 20 zvířat (10 samic a 10 samců). Pokud se zvířata budou usmrcovat v průběhu studie, je nutno zvýšit celkový počet zvířat o počet zvířat, která budou usmrcena před koncem pokusu. Na základě dřívějších znalostí o testované chemické látce nebo jí blízce příbuzné látce je třeba zvážit i přidání další (satelitní) skupiny zvířat 10 (5 zvířat každého pohlaví) do kontrolní skupiny a do skupiny s nejvyšší dávkou, aby se po ukončení aplikace mohlo posoudit, zda jsou případné účinky vratné nebo trvalé. Trvání tohoto následného pozorování se stanoví s ohledem na pozorované účinky.

        1. účinné od 1. 8. 20041.4.3.3 Úrovně dávek

          účinné od 1. 8. 2004Neprovádí-li se limitní test (viz 1.4.3.4), použijí se nejméně tři úrovně dávek a souběžná kontrola. Úrovně dávek mohou vycházet z výsledků studií při opakované aplikaci nebo orientačních studií zaměřených na zjištění rozsahu účinných dávek a měly by zohledňovat všechny existující toxikologické a toxikokinetické údaje o testované látce nebo o příbuzných látkách. Nebrání-li tomu fyzikálně-chemická povaha či biologické účinky testované látky, má nejvyšší hladina dávky vyvolat toxické účinky, ale nezpůsobit žádné uhynutí nebo velké utrpení. Další hladiny dávek, mají být voleny tak, aby vyvolaly toxické účinky odstupňované podle dávky a aby u nejnižší hladiny nebyly pozorovány nepříznivé účinky (NOAEL). Často je pro odstupňování dávek optimální dvoj- až čtyřnásobný poměr mezi dávkami; je vhodnější přidat čtvrtou experimentální skupinu, než mít intervaly mezi dávkami příliš široké (např. více než 6-10násobek).

          účinné od 1. 8. 2004Kontrolní skupině se nepodává žádná látka nebo, používá-li se vehikulum, je kontrolní skupině podáváno vehikulum. S výjimkou aplikace testované látky se zachází se zvířaty v kontrolní skupině stejně jako s pokusnými. Je-li použito vehikulum, podává se kontrolní skupině v nejvyšším použitém objemu. Podává-li se testovaná látka v potravě a způsobuje-li omezení příjmu potravy, doporučuje se použít paralelně skupinu se stejným omezením potravy, aby se odlišil vliv snížení příjmu potravy nechutenstvím od toxikologických změn.

          účinné od 1. 8. 2004Má se přihlédnout i k následujícím vlastnostem vehikula a ostatních aditiv: vliv na vstřebávání, distribuci, metabolismus nebo retenci testované látky; vliv na chemické vlastnosti testované látky, které mohou změnit její toxicitu; vliv na spotřebu potravy, vody nebo na nutriční stav zvířat.

        1. účinné od 1. 8. 20041.4.3.4 Limitní test

          účinné od 1. 8. 2004Pokud test provedený níže popsanou metodou na dávkové úrovni 1000 mg.kg-1 tělesné hmotnosti nebo vyšší neukáže pozorovatelné nepříznivé účinky a pokud se na základě údajů o látkách s podobnou strukturou nepředpokládá toxicita, není nutné provést kompletní studii se třemi úrovněmi dávek. Tento limitní test se neprovádí, naznačují-li údaje o expozici lidí použití vyšších dávek.

    1. účinné od 1. 8. 20041.5 Postup
      1. účinné od 1. 8. 20041.5.1 Aplikace

        účinné od 1. 8. 2004Testovaná látka se zvířatům aplikuje 7 dní v týdnu po dobu 90 dnů. Jiný režim aplikace, např. 5 dní v týdnu, musí být zdůvodněn. Aplikuje-li se testovaná látka sondou nebo kanylou měla by být aplikace jen v jediné dávce. Maximální objem tekutiny, který lze podat najednou, závisí na tělesné hmotnosti zvířete. Objem by neměl překročit 1 ml na 100 g tělesné hmotnosti, s výjimkou vodných roztoků, kde lze podat až 2 ml na 100 g tělesné hmotnosti. S výjimkou dráždivých nebo leptavých látek, jejichž účinky se zhoršují s koncentrací, je třeba rozdíly podávaných objemů minimalizovat upravením koncentrace tak, aby byl ve všech hladinách dávek podáván týž objem.

        účinné od 1. 8. 2004U látek podávaných potravou nebo v pitné vodě je důležité zajistit, aby množství podávané látky neovlivnilo normální výživu nebo vodní rovnováhu. Podává-li se testovaná látka v potravě, může se použít buď konstantní koncentrace (v ppm nebo mg.kg-1 potravy) nebo konstantní dávkování ve vztahu k tělesné hmotnosti zvířete; použitou alternativu je třeba uvést. Aplikuje-li se látka sondou, mělo by se tak dít každý den ve stejnou dobu; je třeba dávkování upravovat tak, aby bylo konstantní vzhledem k změnám tělesné hmotnosti zvířete. Je-li 90denní studie předběžnou studií k dlouhodobé studii chronické toxicity, má být v obou studiích použita stejná dieta.

      1. účinné od 1. 8. 20041.5.2 Pozorování

        účinné od 1. 8. 2004Doba pozorování je nejméně 90 dní. Zvířata v satelitní skupině určená k následnému pozorování se ponechají po vhodnou dobu bez aplikace, aby se posoudilo, zda nastalo zotavení nebo toxické účinky přetrvávají.

        účinné od 1. 8. 2004Běžné klinické pozorování je třeba provádět nejméně jednou denně, nejlépe vždy ve stejnou denní dobu, v době očekávaného maximálního účinku. Klinický stav zvířat se zaznamenává. Nejméně dvakrát denně, obvykle na začátku a na konci každého dne, se provede prohlídka u všech zvířat za účelem zjištění úmrtí a příznaků onemocnění.

        účinné od 1. 8. 2004Alespoň jednou před první aplikací látky a dále jednou týdně se provede důkladné klinické pozorování všech zvířat za účelem intraindividuálního srovnání. Pozorování je třeba provádět mimo chovnou klec, nejlépe ve standardním pozorovacím prostoru a pokaždé ve stejnou dobu. Výsledky pozorování se pečlivě zaznamenávají, nejlépe s použitím skórovacího systému (včetně doby nástupu, stupně a trvání), standardizovaného v testující laboratoři. Je třeba zajistit, aby se podmínky pozorování měnily minimálně. Pozorování zahrnuje přinejmenším změny kůže, srsti, očí a sliznic, přítomnost sekretů a exkretů a změny autonomních funkcí (slzení, piloerekce, velikost zornic, poruchy dýchání). Zaznamenávají se změny chůze a držení těla, dále reakce na manipulaci, přítomnost klonických nebo tonických pohybů, stereotypů (např. nadměrné čištění, opakované kroužení) nebo bizarní chování (např. sebepoškozování, chůze pozpátku).7)

        účinné od 1. 8. 2004Oftalmologické vyšetření oftalmoskopem nebo rovnocenným přístrojem se má provést před podáváním testované látky a na konci studie, nejlépe u všech zvířat, ale nejméně u skupiny s nejvyšší dávkou a u kontrolní skupiny. Zjistí-li se oční změny, vyšetří se všechna zvířata.

        účinné od 1. 8. 2004Ke konci pokusu, ale ne dříve než v 11. týdnu, se otestují reakce na senzorické podněty7) (např. sluchové, zrakové a proprioceptivní),7) změří se síla úchopu7) a celková motorická aktivita.7) Další podrobné informace o postupech, které je možno k testování použít, jsou uvedeny v příslušné literatuře. Lze však použít i alternativní postupy.

        účinné od 1. 8. 2004Pozorování funkčních poruch lze případně vynechat, jsou-li k dispozici data o funkčních pozorováních z jiných studií a pokud denní klinická pozorování neodhalila žádné funkční poruchy.

        účinné od 1. 8. 2004Výjimečně lze pozorování funkčních poruch vynechat i u skupin vykazujících takové příznaky toxicity, které by při posuzování funkčního stavu vadily.

        1. účinné od 1. 8. 20041.5.2.1 Tělesná hmotnost a spotřeba potravy/vody

          účinné od 1. 8. 2004Všechna zvířata se váží nejméně jednou týdně. Příjem potravy se zjišťuje nejméně jednou týdně. Provádí-li se aplikace v pitné vodě také nejméně jednou týdně se zaznamená spotřeba vody. Ke spotřebě vody je potřeba přihlédnout ve studiích, kdy se podává testovaná látka v potravě nebo sondou, během nichž může dojít ke změně příjmu tekutin.

        1. účinné od 1. 8. 20041.5.2.2 Hematologie a klinická biochemie

          účinné od 1. 8. 2004Krev se odebírá z určeného místa a skladuje se za vhodných podmínek. Na konci testování se vzorky odebírají těsně před utracením nebo při něm.

          účinné od 1. 8. 2004Z odběrů krve na konci testování a během studie se provádí následující hematologická vyšetření: stanovení hematokritu, koncentrace hemoglobinu, počet erytrocytů, celkový a diferenciální počet leukocytů, počet destiček, test na srážlivost krve a stanoví se protrombinový čas.

          účinné od 1. 8. 2004Biochemická analýza zaměřená na posouzení závažných toxických účinků na tkáně - zvláště na ledviny a játra, se provede z krevních vzorků odebraných každému zvířeti těsně před nebo při usmrcení (kromě zvířat uhynulých nebo utracených během pokusu). Podobně jako u hematologických vyšetření lze odebírat vzorky pro biochemickou analýzu i během studie. Před odběrem krve se doporučuje nechat zvířata přes noc nalačno.9) Vyšetření plazmy a séra zahrnuje stanovení sodíku, draslíku, glukózy, celkového cholesterolu, močoviny, dusíku močoviny, kreatininu, celkových proteinů a albuminu, nejméně dva enzymy indikující o hepatocelulární účinky (například alaninaminotransferáza, aspartátaminotransferáza, alkalická fosfatáza, gamaglutamyltranspeptidáza a sorbitoldehydrogenáza). Zahrnout lze také stanovení dalších enzymů (jaterního nebo jiného původu) a žlučových kyselin může v určitých případech poskytnout užitečné informace.

          účinné od 1. 8. 2004Další možnost je časově definovaný sběr a vyšetření moči během posledního týdne studie: hodnotit je možno vzhled, objem, osmolalitu nebo specifickou hmotnost, pH, bílkoviny, glukózu a krev/krvinky.

          účinné od 1. 8. 2004Dále je třeba uvážit stanovení nespecifických indikátorů poškození tkání v séru. Další vyšetření se provádí u látek známých nebo podezřelých z působení na určité metabolické funkce, např. stanovení vápníku, fosforu, triglyceridů nalačno, specifických hormonů, methemoglobinu a cholinesterázy. Účelnost těchto vyšetření se posuzuje podle příslušnosti do určitých skupin látek nebo případ od případu.

          účinné od 1. 8. 2004Obecně je třeba postupovat pružně, brát v úvahu použitý živočišný druh a pozorované či očekávané účinky dané látky.

          účinné od 1. 8. 2004Pokud nejsou k dispozici historické údaje o výchozích hodnotách některých hematologických nebo biochemických proměnných, je třeba zvážit jejich stanovení ještě před začátkem studie; obecně se nedoporučuje, aby se tato data získávala v rámci studie před aplikací.7)

        1. účinné od 1. 8. 20041.5.2.3 Pitva

          účinné od 1. 8. 2004U všech zvířat použitých ve studii se provede podrobná pitva, zahrnující pečlivé vyšetření vnějšího povrchu těla, všech otvorů a lebeční, hrudní a břišní dutiny a jejich obsahu. Játra, ledviny, nadledviny, varlata, nadvarlata, děloha, vaječníky, brzlík, slezina, mozek a srdce všech zvířat (kromě těch, která byla nalezena uhynulá nebo byla usmrcena v průběhu testu) se pečlivě očistí od ulpělých tkání a co nejdříve po sekci se ve vlhkém stavu zváží, aby nedošlo k vyschnutí.

          účinné od 1. 8. 2004Následující tkáně je třeba přechovávat ve vhodném fixačním médiu pro daný typ tkáně a plánovaná následná histopatologická vyšetření: všechny tkáně s makroskopickými lézemi, mozek (reprezentativní oblasti včetně předního mozku, mozečku a prodloužené míchy), mícha (ve třech úrovních: krční, střední hrudní a lumbální), hypofýza, štítná žláza, příštítná tělíska, brzlík, jícen, slinné žlázy, žaludek, tenké a tlusté střevo (včetně Peyerových plátů), játra, slinivka, ledviny, nadledviny, slezina, srdce, průdušnice a plíce (konzervované naplněním fixačním roztokem a následným ponořením), aorta, gonády, děloha, přídatné pohlavní orgány, samičí mléčná žláza, prostata, močový měchýř, žlučník (myš), lymfatické uzliny (přednostně jedna pro oblast aplikace a jedna vzdálená pro pokrytí systémových účinků), periferní nerv (n. ischiadicus nebo n. tibialis) nejlépe v blízkosti svalu, řez kostní dřeně (a/nebo čerstvý nátěr z nasáté kostní dřeně), kůže a oči (byly-li při oftalmologických vyšetřeních pozorovány změny). Podle klinických nebo jiných nálezů je možno zkoumat i další tkáně. Každý orgán, který by mohl být cílovým orgánem pro působení testované látky, je třeba konzervovat.

        1. účinné od 1. 8. 20041.5.2.4 Histopatologická vyšetření

          účinné od 1. 8. 2004U všech zvířat skupiny, které byla podána nejvyšší dávka, a u zvířat kontrolní skupiny je třeba provést histologické vyšetření uchovaných orgánů a tkání. Pokud se v orgánech a tkáních ve skupině s nejvyšší dávkou objeví poškození způsobená testovanou látkou, je nutno provést histologické vyšetření těchto tkání i u všech skupin s nižšími dávkami.

          účinné od 1. 8. 2004Všechny makroskopické léze je třeba vyšetřit.

          účinné od 1. 8. 2004U zvířat satelitních skupin, pokud byly do studie zařazeny, je třeba provést histopatologické vyšetření se zvláštním důrazem na orgány a tkáně, ve kterých se objevily účinky u ostatních exponovaných zvířat.

  1. účinné od 1. 8. 20042 SBĚR A ZÁZNAM ÚDAJŮ
    1. účinné od 1. 8. 20042.1 Údaje

      účinné od 1. 8. 2004K dispozici musí být údaje o každém jednotlivém zvířeti. Veškeré údaje se sumarizují do tabulky, uvádějící u každé testované skupiny počet použitých zvířat na začátku testu, počet zvířat uhynulých v průběhu testu nebo utracených z humánních důvodů, dobu úhynu jednotlivých zvířat nebo humánního utracení; počet zvířat vykazujících příznaky toxicity, popis toxických příznaků včetně doby nástupu, trvání a závažnosti každého příznaku, počet zvířat vykazujících léze, typ lézí a procento zvířat s jednotlivými typy lézí.

      účinné od 1. 8. 2004Výsledky v číselné formě je třeba vyhodnotit vhodnou a uznávanou statistickou metodou. Statistickou metodu je třeba zvolit již při plánování studie.

  1. účinné od 1. 8. 20043 PROJEKT POKUSU, PROTOKOL POKUSU A ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA

    účinné od 1. 8. 2004V souladu s příslušnými právními předpisy9) musí být zpracován projekt pokusu a o průběhu pokusu je nutno vést protokol.

    1. účinné od 1. 8. 2004Zpráva o pokusu obsahuje následující informace:
      1. účinné od 1. 8. 2004Testovaná látka:
        1. účinné od 1. 8. 2004- fyzikální povaha, čistota a fyzikálně-chemické vlastnosti,
        2. účinné od 1. 8. 2004- identifikační údaje
        3. účinné od 1. 8. 2004- vehikulum (je-li použito): zdůvodnění volby vehikula, není-li to voda.
      1. účinné od 1. 8. 2004Pokusná zvířata:
        1. účinné od 1. 8. 2004- použitý druh a kmen,
        2. účinné od 1. 8. 2004- počet, stáří a pohlaví zvířat,
        3. účinné od 1. 8. 2004- původ, podmínky chovu, potrava atd.,
        4. účinné od 1. 8. 2004- hmotnost jednotlivých zvířat na začátku testu.
      1. účinné od 1. 8. 2004Podmínky testu:
        1. účinné od 1. 8. 2004- zdůvodnění výběru hladin dávek,
        2. účinné od 1. 8. 2004- podrobné údaje o úpravě testované látky pro aplikaci, případně o přípravě potravy, o dosažených koncentracích, stabilitě a homogenitě přípravku,
        3. účinné od 1. 8. 2004- podrobné údaje o způsobu aplikace testované látky,
        4. účinné od 1. 8. 2004- přepočet z koncentrace látky v potravě nebo vodě (ppm) na skutečnou denní dávku v mg.kg-1 tělesné hmotnosti (pokud jde o aplikaci v potravě nebo vodě),
        5. účinné od 1. 8. 2004- podrobné údaje o potravě a kvalitě vody.
      1. účinné od 1. 8. 2004Výsledky
        1. účinné od 1. 8. 2004- tělesná hmotnost a její změny,
        2. účinné od 1. 8. 2004- spotřeba potravy a případně vody,
        3. účinné od 1. 8. 2004- údaje o toxických reakcích podle pohlaví a úrovně dávek, včetně popisu příznaků toxicity,
        4. účinné od 1. 8. 2004- povaha, závažnost a trvání klinických nálezů, příp. zda byly vratné nebo nevratné,
        5. účinné od 1. 8. 2004- výsledky oftalmologického vyšetření,
        6. účinné od 1. 8. 2004- posouzení reaktivity na smyslové podněty, úchopové síly a motorické aktivity (pokud byly získány),
        7. účinné od 1. 8. 2004- výsledky hematologického vyšetření s příslušnými výchozími (normálními) hodnotami,
        8. účinné od 1. 8. 2004- výsledky biochemické analýzy s příslušnými výchozími (normálními) hodnotami,
        9. účinné od 1. 8. 2004- tělesná hmotnost na konci studie a hmotnosti orgánů a poměry hmotnosti orgánů k tělesné hmotnosti,
        10. účinné od 1. 8. 2004- pitevní nálezy,
        11. účinné od 1. 8. 2004- podrobný popis všech histopatologických nálezů,
        12. účinné od 1. 8. 2004- údaje o absorpci, pokud byly získány,
        13. účinné od 1. 8. 2004- statistické zpracování číselných výsledků, kde je to možné.

    účinné od 1. 8. 2004Diskuse výsledků.

    účinné od 1. 8. 2004Závěry.

účinné od 1. 8. 2004B.27 TEST SUBCHRONICKÉ ORÁLNÍ TOXICITY

účinné od 1. 8. 2004(90ti-denní studie orální toxicity s opakovanou aplikací hlodavcům)