Platné znění

Vyhláška, kterou se stanoví základní metody pro zkoušení toxicity chemických látek a chemických přípravků

  1. účinné od 1. 8. 20041 METODA je v souladu s právem Evropských společenství.7)
    1. účinné od 1. 8. 20041.1 Úvod

      účinné od 1. 8. 2004Při posouzení a hodnocení toxických vlastností chemické látky lze provést stanovení subchronické orální toxicity s opakovanou aplikací po získaní prvních informací o toxicitě z testů akutní toxicity nebo toxicity při 28denní opakované aplikaci. Tato 90denní studie poskytuje informace o možném nebezpečí pro zdraví, které by mohlo nastat vlivem opakované expozice látce v průběhu delšího období, zahrnujícího vývoj po odstavení a růst až do dospělosti. Studie má poskytnout informace o významných toxických účincích, určit cílové orgány a možnou kumulaci a může poskytnout odhad hladiny bez pozorovaného nepříznivého účinku, kterou lze použít při výběru úrovni dávek pro chronické studie a pro stanovení bezpečnostních kritérií pro expozici člověka.

      účinné od 1. 8. 2004Tato metoda umožňuje zjistit nepříznivé účinky vyvolané chemickou látkou na nehlodavcích a používá se pouze tehdy, když:

      1. účinné od 1. 8. 2004- účinky pozorované v jiných studiích naznačují potřebu objasnit či charakterizovat je na dalším druhu než na hlodavcích nebo když
      2. účinné od 1. 8. 2004- toxikokinetické studie naznačují, že použití specifického druhu nehlodavce je nejvhodnější volbou laboratorního zvířete, nebo když
      3. účinné od 1. 8. 2004- jiné konkrétní důvody zdůvodňují použití nehlodavce.

      účinné od 1. 8. 2004Viz též Všeobecný úvod, Část B.

    1. účinné od 1. 8. 20041.2 Definice

      účinné od 1. 8. 2004Dávka: je podané množství testované látky. Dávka se vyjadřuje buď jako hmotnost (v g, mg), nebo jako hmotnost testované látky na jednotku hmotnosti testovaného zvířete (např. mg/kg) nebo jako konstantní koncentrace v potravě (ppm) nebo v pitné vodě.

      účinné od 1. 8. 2004Dávkování: je obecný termín zahrnující dávku, její četnost a trvání podávání.

      účinné od 1. 8. 2004NOAEL (no observed adverse effect level): je zkratka pro hladinu bez pozorovaného nepříznivého účinku a odpovídá nejvyšší dávce nebo expozici, při které nejsou pozorovány žádné nepříznivé účinky související s podáváním látky.

    1. účinné od 1. 8. 20041.3 Princip metody

      účinné od 1. 8. 2004Testovaná látka se podává denně orálně po 90 dní v odstupňovaných dávkách několika skupinám pokusných zvířat, a to každé skupině jedna úroveň dávky. Během podávání se zvířata pečlivě pozorují, aby se zjistily příznaky toxicity. Zvířata, která uhynou během pokusu nebo jsou utracena, i zvířata, která přežijí konec pokusu, se pitvají.

    1. účinné od 1. 8. 20041.4 Popis metody
      1. účinné od 1. 8. 20041.4.1 Výběr zvířecích druhů

        účinné od 1. 8. 2004Obvykle používaným druhem nehlodavce je pes; je třeba definovat plemeno - často se používá beagle. Lze použít i jiné druhy, např. prasata nebo miniprasata. Primáti se nedoporučují, použijí-li se, musí to být zdůvodněno. Používají se mladá, zdravá zvířata, v případě psů se má s podáváním začít ve věku 4-6 měsíců a ne starším než 9 měsíců. Provádí-li se subchronický orální test jako předběžný test před dlouhodobým testem, v obou studiích se má použít stejný živočišný druh a plemeno.

      1. účinné od 1. 8. 20041.4.2 Příprava zvířat

        účinné od 1. 8. 2004Používají se zdravá zvířata, která dosud nebyla vystavena žádným experimentálním zásahům a která jsou před testem chována v experimentálních podmínkách. Doba aklimatizace závisí na vybraném druhu a na původu zvířat. Doporučuje se nejméně pět dní pro psy či prasata z vlastního chovu a nejméně 2 týdny pro zvířata z externích chovných zařízení. Musí se popsat druh, kmen, původ, pohlaví, hmotnost a/nebo věk. Zvířata se náhodně přiřadí do kontrolní a do jednotlivých experimentálních skupin. Klece by měly být uspořádány tak, aby se vlivy jejich umístění minimalizovaly. Každému zvířeti se přiřadí jedinečné identifikační číslo.

        účinné od 1. 8. 2004Pokusná zvířata jsou vybrána s ohledem na druh, pohlaví, a stáří v souladu s ustanovením § 15 zvláštního právního předpisu10) a označena tak, aby byla možná identifikace jednotlivých zvířat. Dobu navykání stanoví § 10 zvláštního právního předpisu.10)

      1. účinné od 1. 8. 20041.4.3 Příprava dávek

        účinné od 1. 8. 2004Testovanou látku lze podávat v potravě nebo v pitné vodě, sondou nebo v kapslích. Způsob orálního podávání závisí na účelu studie a na fyzikálních a chemických vlastnostech testované látky.

        účinné od 1. 8. 2004Pokud je to nezbytné, testovaná látka se rozpustí nebo suspenduje ve vhodném vehikulu. Doporučuje se nejprve zvážit použití vodného roztoku, potom roztoku nebo emulze nebo suspenze v oleji (např. kukuřičném) a pak roztoku v jiném vehikulu. Pro nevodná vehikula je třeba znát jejich toxikologickou charakteristiku. Je třeba stanovit stabilitu testované látky v podmínkách aplikace.

    1. účinné od 1. 8. 20041.5 Postup
      1. účinné od 1. 8. 20041.5.1 Počet a pohlaví

        účinné od 1. 8. 2004Pro každou hladinu dávek se použije nejméně 8 zvířat (4 samice a 4 samci). Počítá-li se s usmrcováním v průběhu studie, měl by být tento počet zvýšen o počet zvířat, která mají být v průběhu studie usmrcena. Počet zvířat na konci studie musí být dostatečný, aby bylo možno provést smysluplné vyhodnocení toxických účinků. Na základě dřívějších znalostí o testované chemické látce nebo jí blízce příbuzné látce je třeba zvážit i přidání další (satelitní) skupiny zvířat 8 (4 zvířat každého pohlaví) do kontrolní skupiny a do skupiny s nejvyšší dávkou, aby se po ukončení aplikace mohlo posoudit, zda jsou případné účinky vratné nebo trvalé. Trvání tohoto následného pozorování se stanoví s ohledem na pozorované účinky.

        1. účinné od 1. 8. 20041.5.1.1 Úrovně dávek

          účinné od 1. 8. 2004Neprovádí-li se limitní test (viz 1.5.3), použijí se nejméně 3 úrovně dávek a souběžná kontrola. Úrovně dávek mohou vycházet z výsledků studií při opakované aplikaci nebo orientačních studií zaměřených na zjištění rozsahu účinných dávek a měly by zohledňovat všechny existující toxikologické a toxikokinetické údaje o testované látce nebo o příbuzných látkách. Nebrání-li tomu fyzikálně-chemická povaha či biologické účinky testované látky, má nejvyšší hladina dávky vyvolat toxické účinky, ale nezpůsobit žádné uhynutí nebo velké utrpení. Další hladiny dávek, mají být voleny tak, aby vyvolaly toxické účinky odstupňované podle dávky a aby u nejnižší hladiny nebyly pozorovány nepříznivé účinky (NOAEL). Často je pro odstupňování dávek optimální dvoj- až čtyřnásobný poměr mezi dávkami; je vhodnější přidat čtvrtou experimentální skupinu, než mít intervaly mezi dávkami příliš široké (např. více než 6-10násobek).

          účinné od 1. 8. 2004Kontrolní skupině se nepodává žádná látka nebo, používá-li se vehikulum, je kontrolní skupině podáváno vehikulum. S výjimkou aplikace testované látky se se zvířaty v kontrolní skupině zachází stejně jako s pokusnými. Je-li použito vehikulum, podává se kontrolní skupině v nejvyšším použitém objemu. Podává-li se testovaná látka v potravě a způsobuje-li omezení příjmu potravy, doporučuje se použít paralelní skupinu se stejným omezením potravy, aby se odlišil vliv snížení příjmu potravy nechutenstvím od toxikologických změn.

          účinné od 1. 8. 2004Má se přihlédnout i k následujícím vlastnostem vehikula a ostatních aditiv: vliv na vstřebávání, distribuci, metabolismus nebo retenci testované látky; vliv na chemické vlastnosti testované látky, které mohou změnit její toxicita; vliv na spotřebu potravy, vody nebo na nutriční stav zvířat.

        1. účinné od 1. 8. 20041.5.1.2 Limitní test

          účinné od 1. 8. 2004Pokud test provedený níže popsanou metodou na dávkové úrovni 1000 mg.kg-1 tělesné hmotnosti nebo vyšší neukáže pozorovatelné nepříznivé účinky a pokud se na základě údajů o látkách s podobnou strukturou nepředpokládá toxicita, není nutné provést kompletní studii se třemi úrovněmi dávek. Tento limitní test se neprovádí, naznačují-li údaje o expozici lidí použití vyšších dávek.

      1. účinné od 1. 8. 20041.5.2 Aplikace

        účinné od 1. 8. 2004Testovaná látka se zvířatům aplikuje 7 dnů v týdnu po dobu 90 dnů. Jiný režim aplikace, např. 5 dnů v týdnu, musí být zdůvodněn. Aplikuje-li se testovaná látka sondou nebo kanylou měla by být aplikace jen v jediné dávce. Maximální objem tekutiny, který lze podat najednou, závisí na tělesné hmotnosti zvířete. Zpravidla se udržuje co nejnižší objem. S výjimkou dráždivých nebo leptavých látek, jejichž účinky se zhoršují s koncentrací, je třeba rozdíly podávaných objemů minimalizovat upravením koncentrace tak, aby byl ve všech hladinách dávek podáván týž objem.

        účinné od 1. 8. 2004U látek podávaných potravou nebo v pitné vodě je důležité zajistit, aby množství podávané látky neovlivnilo normální výživu nebo vodní rovnováhu. Podává-li se testovaná látka v potravě, může se použít buď konstantní koncentrace (v ppm nebo mg.kg-1 potravy) nebo konstantní dávkování ve vztahu k tělesné hmotnosti zvířete; použitou alternativu je třeba uvést. Aplikuje-li se látka sondou nebo v kapslích, mělo by se podávat každý den ve stejnou dobu; je třeba dávkování upravovat tak, aby bylo konstantní vzhledem k změnám tělesné hmotnosti zvířete. Je-li 90denní studie předběžnou studií k dlouhodobé studii chronické toxicity, má být v obou studiích použita stejná dieta.

      1. účinné od 1. 8. 20041.5.3 Pozorování

        účinné od 1. 8. 2004Doba pozorování je nejméně 90 dní. Zvířata v satelitní skupině určená k následnému pozorování se ponechají vhodnou dobu bez aplikace, aby se posoudilo, zda nastalo zotavení nebo zda toxické účinky přetrvávají.

        účinné od 1. 8. 2004Běžné klinické pozorování je třeba provádět nejméně jednou denně, nejlépe vždy ve stejnou denní dobu, v době očekávaného maximálního účinku. Klinický stav zvířat se zaznamenává. Nejméně dvakrát denně, obvykle na začátku a na konci každého dne, se provede prohlídka u všech zvířat za účelem zjištění úmrtí a příznaků onemocnění.

        účinné od 1. 8. 2004Alespoň jednou před první aplikací látky a dále jednou týdně se provede důkladné klinické pozorování všech zvířat za účelem intraindividuálního srovnání. Pozorování je třeba provádět mimo chovnou klec, nejlépe ve standardním pozorovacím prostoru a pokaždé ve stejnou dobu. Je třeba zajistit, aby se podmínky pozorování měnily minimálně. Příznaky toxicity je třeba pečlivě zaznamenávat, včetně doby nástupu, stupně a trvání. Pozorování zahrnuje přinejmenším změny kůže, srsti, očí a sliznic, přítomnost sekretů a exkretů a změny autonomních funkcí (slzení, piloerekce, velikost zornic, poruchy dýchání). Zaznamenávají se změny chůze a držení těla, dále reakce na manipulaci, přítomnost klonických a/nebo tonických pohybů, stereotypů (např. nadměrné čištění, opakované kroužení) nebo bizarní chování.

        účinné od 1. 8. 2004Oftalmologické vyšetření oftalmoskopem nebo rovnocenným přístrojem se má provést před podáváním testované látky a na konci studie nejlépe u všech zvířat, ale nejméně u skupiny s nejvyšší dávkou a u kontrolní skupiny. Zjistí-li se oční změny, vyšetří se všechna zvířata.

        1. účinné od 1. 8. 20041.5.3.1 Tělesná hmotnost a spotřeba potravy/vody

          účinné od 1. 8. 2004Všechna zvířata se váží nejméně jednou týdně. Příjem potravy se zjišťuje nejméně jednou týdně. Provádí-li se aplikace v pitné vodě také nejméně jednou týdně se zaznamená spotřeba vody. Ke spotřebě vody je potřeba přihlédnout ve studiích, kdy se podává testovaná látka v potravě nebo sondou, během nichž může dojít ke změně příjmu tekutin.

        1. účinné od 1. 8. 20041.5.3.2 Hematologie a klinická biochemie

          účinné od 1. 8. 2004Krev se odebírá z určeného místa a skladuje se za vhodných podmínek. Na konci testování se vzorky odebírají těsně před utracením nebo při něm.

          účinné od 1. 8. 2004Z odběrů krve na počátku testování a pak v měsíčních intervalech nebo v polovině studie a poté i na konci se provádí následující hematologická vyšetření: stanovení hematokritu, koncentrace hemoglobinu, počet erytrocytů, celkový a diferenciální počet leukocytů, počet destiček, test na srážlivost krve, stanoví se protrombinový a trombinový čas.

          účinné od 1. 8. 2004Biochemická analýza zaměřená na posouzení závažných toxických účinků na tkáně, zvláště na ledviny a játra, se provede z krevních vzorků odebraných každému zvířeti na počátku studie a v měsíčních intervalech nebo v polovině studie a na konci studie.

          účinné od 1. 8. 2004Je vhodné stanovit koncentraci elektrolytů, metabolismus cukrů,funkce jater a ledvin. Výběr specifických testů je určen pozorováním mechanizmu účinku látky. Před odběrem krve se doporučuje nechat zvířata nalačno po dobu vhodnou pro daný druh. Doporučuje se stanovení vápníku, fosforu, chloridů sodíku, draslíku, glykémie nalačno, alaninaminotransferázy, aspartátaminotransferázy, ornitindekarboxylázy, gamaglutamyltranspeptidázy, dusíku močoviny, albuminu, kreatininu, celkového bilirubinu a celkové bílkoviny v séru.

          účinné od 1. 8. 2004Minimálně na počátku, v polovině a na konci studie provést vyšetření moči z časově definovaného sběru. Hodnotí se následující parametry: vzhled, objem, osmolalita nebo specifická hmotnost, pH, bílkoviny, glukóza a krev/krvinky. V případě potřeby se mohou použít další analýzy pro studium širšího spektra účinků.

          účinné od 1. 8. 2004Dále je třeba uvážit stanovení nespecifických indikátorů poškození tkání. Mezi další testy, které mohou být potřebné pro úplné toxikologické hodnocení, patří stanovení lipidů, hormonů, acidobazické rovnováhy, methemoglobinu a aktivity cholinesterázy. Je-li zapotřebí na základě pozorovaných účinků rozšířit zkoumání, lze přidat i další klinicko-biochemické testy. Účelnost těchto vyšetření se posuzuje podle příslušnosti do určitých skupin látek nebo případ od případu.

          účinné od 1. 8. 2004Obecně je třeba postupovat pružně, brát v úvahu použitý živočišný druh a pozorované či očekávané účinky dané látky.

        1. účinné od 1. 8. 20041.5.3.3 Pitva

          účinné od 1. 8. 2004U všech zvířat použitých ve studii se provede podrobná pitva, zahrnující pečlivé vyšetření vnějšího povrchu těla, všech otvorů a lebeční, hrudní a břišní dutiny a jejich obsahu. Játra s žlučníkem, ledviny, nadledviny, varlata, nadvarlata, vaječníky, děloha, štítná žláza (s příštítnými tělísky), brzlík, slezina, mozek a srdce všech zvířat (kromě těch, která byla nalezena mrtvá nebo usmrcena průběžně) se pečlivě očistí od ulpělých tkání a co nejdříve po sekci se ve vlhkém stavu zváží, aby nedošlo k vyschnutí.

          účinné od 1. 8. 2004Následující tkáně je třeba přechovávat ve vhodném fixačním médiu pro daný typ tkáně a plánovaná následná histopatologická vyšetření: všechny tkáně s makroskopickými lézemi, mozek (reprezentativní oblasti včetně předního mozku, mozečku a prodloužené míchy), mícha (ve třech úrovních: krční, střední hrudní a lumbální), hypofýza, oči, štítná žláza, příštítná tělíska, brzlík, jícen, slinné žlázy, žaludek, tenké a tlusté střevo (včetně Pleyerových plátů), játra, žlučník, slinivka břišní, ledviny, nadledviny, slezina, srdce, průdušnice a plíce, aorta, pohlavní žlázy, děloha, přídatné pohlavní orgány, samičí mléčná žláza, prostata, močový měchýř, lymfatické uzliny (přednostně jedna pro oblast aplikace a jedna vzdálená pro pokrytí systémových účinků), periferní nerv (n. ischiadicus nebo n. tibialis) nejlépe v blízkosti svalu, řez kostní dřeně (a/nebo čerstvý nátěr z nasáté kostní dřeně) a kůže. Podle klinických nebo jiných nálezů je možno zkoumat i další tkáně. Každý orgán, který by mohl být cílovým orgánem pro působení testované látky, je třeba konzervovat.

        1. účinné od 1. 8. 20041.5.3.4 Histopatologická vyšetření

          účinné od 1. 8. 2004U všech zvířat skupiny, které byla podána nejvyšší dávka, a u zvířat kontrolní skupiny je třeba provést histologické vyšetření uchovaných orgánů a tkání. Pokud se v orgánech a tkáních ve skupině s nejvyšší dávkou objeví poškození způsobená testovanou látkou, je nutno provést histologické vyšetření těchto tkání i u všech skupin s nižšími dávkami.

          účinné od 1. 8. 2004Všechny makroskopické léze je třeba vyšetřit.

          účinné od 1. 8. 2004U zvířat satelitních skupin, pokud byly do studie zařazeny, je třeba provést histopatologické vyšetření se zvláštním důrazem na orgány a tkáně, ve kterých se objevily účinky otravy u ostatních exponovaných zvířat.

  1. účinné od 1. 8. 20042 SBĚR A ZÁZNAM ÚDAJŮ
    1. účinné od 1. 8. 20042.2 Údaje

      účinné od 1. 8. 2004K dispozici musí být údaje o každém jednotlivém zvířeti. Navíc jsou veškeré údaje sumarizovány do tabulkové formy, uvádějící u každé testované skupiny počet použitých zvířat na začátku testu, počet zvířat uhynulých v průběhu testu nebo utracených z humánních důvodů, dobu úhynu nebo úhynu jednotlivých zvířat; počet zvířat vykazujících příznaky toxicity, popis toxických příznaků včetně doby nástupu, trvání a závažnosti každého příznaku, počet zvířat vykazujících léze, typ lézí a procento zvířat s jednotlivými typy lézí.

      účinné od 1. 8. 2004Výsledky v číselné formě je třeba vyhodnotit vhodnou a uznávanou statistickou metodou. Statistickou metodu je třeba zvolit již při plánování studie.

  1. účinné od 1. 8. 20043 PROJEKT POKUSU, PROTOKOL POKUSU A ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA

    účinné od 1. 8. 2004V souladu s příslušnými právními předpisy9) musí být zpracován projekt pokusu a o průběhu pokusu je nutno vést protokol s následujícími údaji.

    1. účinné od 1. 8. 2004Testovaná látka:
      1. účinné od 1. 8. 2004- fyzikální povaha, čistota a fyzikálně-chemické vlastnosti,
      2. účinné od 1. 8. 2004- identifikační údaje
      3. účinné od 1. 8. 2004- vehikulum (je-li použito): zdůvodnění volby vehikula, není-li to voda.
    1. účinné od 1. 8. 2004Pokusná zvířata:
      1. účinné od 1. 8. 2004- použitý druh a kmen,
      2. účinné od 1. 8. 2004- počet, stáří a pohlaví zvířat,
      3. účinné od 1. 8. 2004- původ, podmínky chovu, potrava atd.,
      4. účinné od 1. 8. 2004- hmotnost jednotlivých zvířat na začátku testu.
    1. účinné od 1. 8. 2004Podmínky testu:
      1. účinné od 1. 8. 2004- zdůvodnění výběru hladin dávek,
      2. účinné od 1. 8. 2004- podrobné údaje o úpravě testované látky pro aplikaci, případně o přípravě potravy, o dosažených koncentracích, stabilitě a homogenitě přípravku,
      3. účinné od 1. 8. 2004- podrobné údaje o způsobu aplikace testované látky,
      4. účinné od 1. 8. 2004- přepočet z koncentrace látky v potravě nebo vodě (ppm) na skutečnou denní dávku v mg na kg tělesné hmotnosti (pokud jde o aplikaci v potravě nebo vodě),
      5. účinné od 1. 8. 2004- podrobné údaje o potravě a kvalitě vody.
    1. účinné od 1. 8. 2004Výsledky
      1. účinné od 1. 8. 2004- tělesná hmotnost a její změny,
      2. účinné od 1. 8. 2004- spotřeba potravy a případně vody,
      3. účinné od 1. 8. 2004- údaje o toxických reakcích podle pohlaví a úrovně dávek, včetně popisu příznaků toxicity,
      4. účinné od 1. 8. 2004- povaha, závažnost a trvání klinických nálezů, příp. zda jsou vratné nebo nevratné,
      5. účinné od 1. 8. 2004- výsledky oftalmologického vyšetření,
      6. účinné od 1. 8. 2004- výsledky hematologického vyšetření s příslušnými výchozími (normálními) hodnotami,
      7. účinné od 1. 8. 2004- výsledky biochemického vyšetření s příslušnými výchozími (normálními) hodnotami
      8. účinné od 1. 8. 2004- tělesná hmotnost na konci studie a hmotnosti orgánů a poměry hmotnosti orgánů k tělesné hmotnosti,
      9. účinné od 1. 8. 2004- pitevní nálezy,
      10. účinné od 1. 8. 2004- podrobný popis všech histopatologických nálezů,
      11. účinné od 1. 8. 2004- statistické zpracování číselných výsledků, kde je to možné.

    účinné od 1. 8. 2004Diskuse výsledků.

    účinné od 1. 8. 2004Závěry.

účinné od 1. 8. 2004B.28 SUBCHRONICKÁ TOXICITA DERMÁLNÍ (90ti-denní opakovaná aplikace, studie na hlodavcích)

  1. účinné od 1. 8. 20041 METODA je v souladu s právem Evropských společenství.1)
    1. účinné od 1. 8. 20041.1 Princip testovací metody

      účinné od 1. 8. 2004Testovaná látka se aplikuje denně na kůži po 90 dnů v odstupňovaných dávkách několika skupinám pokusných zvířat, a to každé skupině jedna úroveň dávky. Během období podávání se zvířata denně pozorují, aby se zjistily příznaky toxicity. Zvířata, která uhynou během pokusu, i zvířata, která přežijí do konce pokusu, se pitvají.

    1. účinné od 1. 8. 20041.2 Popis metody
      1. účinné od 1. 8. 20041.2.1 Příprava

        účinné od 1. 8. 2004Pokusná zvířata jsou vybrána s ohledem na druh, pohlaví, a stáří v souladu s ustanovením § 15 zvláštního právního předpisu10) a označena tak, aby byla možná identifikace jednotlivých zvířat. Dobu navykání stanoví § 10 zvláštního právního předpisu.10) Před testem se zdravá mladá zvířata náhodně přiřadí do jednotlivých experimentálních skupin.

        účinné od 1. 8. 2004Krátce před začátkem pokusu se ostříhá srst na zádech pokusných zvířat. Vyholení srsti je rovněž možné, mělo by se však provést cca 24 hodin před experimentem. Ostříhání nebo oholení je potřeba opakovat každý týden. Při střihání nebo holení srsti je třeba dbát na to, aby se nepoškodila kůže (např. abrazí). Pro nanášení se připraví nejméně 10 % povrchu těla. Je třeba vzít v úvahu hmotnost zvířat při rozhodování o velikosti připravované plochy kůže a o velikosti krycího obvazu.

        účinné od 1. 8. 2004Při pokusech s tuhými látkami, které mohou být případně upraveny do práškové formy, je třeba zkoušenou látku dostatečně navlhčit vodou, případně vhodným vehikulem, aby byl zaručen dobrý kontakt s kůží. Testované kapaliny se zpravidla aplikují neředěné. Látka se nanáší denně 5 až 7 dnů v týdnu.

      1. účinné od 1. 8. 20041.2.2 Experimentální podmínky
        1. účinné od 1. 8. 20041.2.2.1 Pokusná zvířata

          účinné od 1. 8. 2004Je možno použít dospělé potkany, králíky nebo morčata, případně i jiné zvířecí druhy, jejich použití však musí být odůvodněné. Na začátku studie by nemělo variační rozpětí hmotnosti zvířat (pro každé pohlaví zvlášť) překročit ± 20 % střední hodnoty. Provádí-li se subchronický dermální test jako předběžný test před dlouhodobým testem, v obou studiích se má použít stejný živočišný druh a kmen.

        1. účinné od 1. 8. 20041.2.2.2 Počet a pohlaví

          účinné od 1. 8. 2004Pro každou úroveň dávek použít nejméně 20 zvířat (10 samic a 10 samců) se zdravou kůží. Samice musí být nullipary a nesmí být březí. Pokud se zvířata budou zabíjet v průběhu studie, je nutno zvýšit celkový počet zvířat o počet zvířat, která budou zabita před koncem pokusu. Mimoto je možno podávat další skupině (satelitní skupině) s 20 zvířaty (10 zvířat každého pohlaví) po dobu 90 dnů nejvyšší dávku a během následujících 28 dnů po podávání sledovat vratnost, přetrvávání nebo zpožděný výskyt toxických účinků.

        1. účinné od 1. 8. 20041.2.2.3 Dávkování

          účinné od 1. 8. 2004Je třeba použít nejméně 3 hladiny dávek a 1 kontrolní skupinu nebo - pokud se použilo vehikula - kontrolní skupinu s aplikací vehikula. Doba expozice má být nejméně 6 hodin denně. Nanášení testované látky by se mělo provádět každý den ve stejnou dobu. V intervalech týdenních nebo čtrnáctidenních je třeba aplikovanou dávku přizpůsobovat tak, aby se udržovala stálá hladina dávky ve vztahu k tělesné hmotnosti zvířete. S výjimkou aplikace testované látky se se zvířaty v kontrolní skupině zachází stejně jako s pokusnými. Používá-li se vehikulum pro usnadnění aplikace, podává se kontrolní skupině stejným způsobem jako pokusným skupinám, a to ve stejném množství, které obdrží skupina, které se aplikuje nejvyšší dávka.

          účinné od 1. 8. 2004Nejvyšší hladina dávky má vyvolat toxické účinky, ale nezpůsobit žádné uhynutí nebo jen v malém počtu. Nejnižší hladina dávky by neměla vyvolat žádné příznaky toxicity. Pokud existují odhady expozice u člověka, má nejnižší dávka tuto hodnotu překračovat. Ideálně by střední hladina dávky měla vyvolat jen toxický účinek na hranicích zjistitelnosti. Aplikují-li se více než 3 hladiny dávek, mají být vmezeřené dávky voleny tak, aby vyvolaly odstupňované toxické účinky. Ve skupině s nízkou a střední hladinou dávky a v kontrolní skupině by počet uhynutí měl být nízký, jinak je vyhodnocení výsledků obtížné.

          účinné od 1. 8. 2004Vede-li aplikace testované látky k těžkému podráždění kůže, je třeba snížit koncentraci, což u vysoké dávkové hladiny může vést k omezení nebo vyloučení ostatních toxických účinků. Došlo-li k těžkému poškození kůže, je dokonce za určitých okolností nutno pokus ukončit a provést jej znova s nižšími koncentracemi.

        1. účinné od 1. 8. 20041.2.2.4 Limitní test

          účinné od 1. 8. 2004Nevyvolá-li při předběžné studii aplikace dávky 1000 mg.kg-1 nebo vyšší dávky, která odpovídá možné expozici člověka, žádné toxické účinky, není další zkouška nutná.

        1. účinné od 1. 8. 20041.2.2.5 Doba pozorování

          účinné od 1. 8. 2004Všechna zvířata je třeba denně pozorovat a zaznamenávat toxické účinky. Je třeba zaznamenat dobu uhynutí a čas, ve kterém se objeví a opět odezní toxické účinky.

      1. účinné od 1. 8. 20041.2.3 Popis postupu

        účinné od 1. 8. 2004Zvířata se chovají v klecích po jednom. Exponují se studované látce nejlépe 7 dnů v týdnu po dobu 90 dnů. Zvířata satelitní skupiny, která jsou určena pro následné pozorování, je třeba chovat po dalších 28 dnů bez expozice, aby se mohla pozorovat reparace toxických účinků nebo jejich přetrvávání. Doba expozice činí nejméně 6 hodin denně.

        účinné od 1. 8. 2004Testovanou látku je třeba nanášet rovnoměrně na celou plochu, která představuje asi 10 % povrchu těla, u vysoce toxických látek může být tato plocha menší. Látkou je třeba pokrýt co největší část pokusné plochy rovnoměrně v co nejtenčí vrstvě.

        účinné od 1. 8. 2004Testovaná látka je po expoziční dobu udržována v kontaktu s kůží pomocí porézního mulového obvazu a nedráždivé náplasti. Testovací plochu je dále třeba vhodným způsobem překrýt, aby se mulový obvaz a testovaná látka fixovaly a aby se zabránilo orálnímu příjmu. K zamezení požití látky je možno použít i prostředků pro omezení volnosti pohybu, úplnou imobilizaci však nelze doporučit.

        účinné od 1. 8. 2004Po uplynutí doby expozice se odstraní zbytky testované látky vodou nebo jiným způsobem vhodným k očištění pokožky.

        účinné od 1. 8. 2004Všechna zvířata je třeba denně pozorovat a zaznamenávat příznaky otravy včetně jejich počátku, stupně a trvání.

        účinné od 1. 8. 2004Pozorování v kleci zahrnuje změny srsti, kůže, očí a sliznic, a také dýchání a krevního oběhu, změny funkce autonomní a centrální nervové soustavy, somatomotorické aktivity a chování. Hmotnosti zvířat se zaznamenávají týdně. Doporučuje se zaznamenávat týdně i spotřebu potravy. Je třeba zajistit pravidelnou kontrolu zvířat, aby pokud možno nedocházelo ke ztrátám zvířat jako například v důsledku kanibalismu, autolýzy tkání nebo chybného zařazení. Po skončení studie se všechna zvířata, která přežila, s výjimkou satelitních skupin, pitvají. Zvířata v agonii, zvířata v těžkém stresu či trpící bolestí je třeba okamžitě vyřadit, humánně utratit a pitvat.

        1. účinné od 1. 8. 2004U všech zvířat včetně kontrolních se běžně provádějí následující vyšetření:

          účinné od 1. 8. 2004(a) Oftalmologické vyšetření oftalmoskopem nebo rovnocenným přístrojem se má provést před podáváním testované látky a na konci studie nejlépe u všech zvířat, ale alespoň u nejvyšší dávky a u kontrolních skupin. Najdou-li se oční změny, vyšetří se všechna zvířata.

          účinné od 1. 8. 2004(b) Na konci pokusu se má provést hematologické vyšetření, které má zahrnovat stanovení hematokritu, koncentrace hemoglobinu, počtu erytrocytů, celkového a diferenciálního počtu leukocytů a testy srážlivosti krve jako například dobu srážlivosti, protrombinový čas (Quickův), trombinový čas či počet trombocytů.

          účinné od 1. 8. 2004(c) Na konci pokusu se má provést biochemická analýza krve. Pro všechny studie je vhodné stanovit koncentraci elektrolytů, metabolismus glycidů, funkci jater a ledvin. Výběr specifických testů je určen pozorováním způsobu účinku látky. Doporučuje se stanovovat vápník, fosfor, chloridy, sodík, draslík, glukózu nalačno (přičemž trvání doby hladovění se volí podle živočišného druhu), alaninaminotransferáza (dříve glutamát- pyruvát transamináza) a aspartátaminotransferáza séra (dříve glutamát-oxalacetáttransamináza), ornithindekarboxyláza, gama-glutamyl transpeptidáza, dusík močoviny, albumin, kreatinin, celkový bilirubin a celkové bílkoviny v séru. Mezi další charakteristiky, které mohou být potřebné pro úplné toxikologické hodnocení, patří stanovení: lipidů, hormonů, acidobazické rovnováhy, methemoglobinu, aktivity cholinesterázy. Další biochemické analýzy mohou být v případě potřeby použity pro studium širšího spektra účinků.

          účinné od 1. 8. 2004(d) Analýza moče se nevyžaduje jako běžný postup, ale jen na podkladě očekávané nebo pozorované toxicity.

        účinné od 1. 8. 2004Pokud nejsou přiměřená historická kontrolní data, má se uvážit stanovení hematologických a biochemických parametrů ještě před začátkem aplikace.

        1. účinné od 1. 8. 20041.2.3.1 Pitva

          účinné od 1. 8. 2004U všech zvířat použitých ve studii se provede pitva zahrnující zevní prohlídku povrchu těla, všech tělních otvorů, lební, hrudní a břišní dutiny včetně jejich obsahu. Játra, ledviny, nadledviny, štítná žláza (s příštítnými tělísky) a varlata se co nejdříve po sekci zváží ve vlhkém stavu, aby se předešlo vysychání.

          účinné od 1. 8. 2004Následující orgány a tkáně je třeba přechovávat ve vhodném médiu s ohledem na možná pozdější histopatologická vyšetření: všechny tkáně s makroskopickým postižením, mozek - v řezech medula/pons, kůra mozku a mozečku, podvěsek mozkový, štítná žláza, příštítná tělíska, tkáň na místě brzlíku, (průdušnice), plíce, srdce, aorta, (slinné žlázy), játra, slezina, ledviny, nadledviny, slinivka břišní, varlata a vaječníky, děloha, přídatné pohlavní orgány, žlučník (je-li přítomen), jícen, žaludek, dvanácterník, tenké, tlusté a slepé střevo, konečník, močový měchýř, representativní lymfatické uzliny, (samičí mléčná žláza), (stehenní sval), periferní nerv, (oči), (hrudní kost s kostní dření), (kost stehenní včetně kloubních ploch), (páteřní mícha ve třech úrovních - krční, střed hrudní a bederní), a (slzné žlázy). Tkáně v závorkách se posuzují pokud je to indikováno podle příznaků toxicity nebo pokud souvisejí s cílovým orgánem.

        1. účinné od 1. 8. 20041.2.3.2 Histopatologická vyšetření

          účinné od 1. 8. 2004(a) Úplné histopatologické vyšetření normální a exponované kůže, orgánů a tkání je třeba provést u všech zvířat skupiny, které byla podána nejvyšší dávka, a u zvířat kontrolní skupiny.

          účinné od 1. 8. 2004(b) Je třeba vyšetřit všechna makroskopická postižení.

          účinné od 1. 8. 2004(c) Je třeba vyšetřit cílové orgány v ostatních dávkových skupinách.

          účinné od 1. 8. 2004(d) Používá-li se potkanů, plíce zvířat ve skupinách s nízkou a střední dávkou se mají histopatologicky vyšetřovat k zjištění příznaků infekce, protože to poskytuje obraz zdravotního stavu zvířat. Další histopatologická vyšetření se u zvířat těchto skupin nemusí provádět rutinně, musí se však provést vždy na orgánech, na kterých bylo zjištěno postižení ve skupině s vysokou dávkou.

          účinné od 1. 8. 2004(e) Používá-li se satelitní skupiny, musí se provést histopatologické vyšetření na tkáních a orgánech, u kterých byly zjištěny účinky u ostatních exponovaných skupin.

  1. účinné od 1. 8. 20042 ÚDAJE

    účinné od 1. 8. 2004Údaje se sestaví do tabulky. Z ní musí být pro každou experimentální skupinu patrný počet zvířat na počátku pokusu a počet zvířat s lézemi a procentuálně počet zvířat s jednotlivými typy lézí. Výsledky je třeba vyhodnotit vhodnou statistickou metodou. Je k tomu možno použít kteroukoliv uznávanou statistickou metodu.

  1. účinné od 1. 8. 20043 PROJEKT POKUSU, PROTOKOL POKUSU A ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA

    účinné od 1. 8. 2004V souladu s příslušnými právními předpisy9) musí být zpracován projekt pokusu a o průběhu pokusu je nutno vést protokol.

    1. účinné od 1. 8. 2004Zpráva o průběhu pokusu má pokud možno obsahovat tyto informace:
      1. účinné od 1. 8. 2004- živočišný druh, kmen, původ, podmínky ustájení, krmení,
      2. účinné od 1. 8. 2004- podmínky pokusu,
      3. účinné od 1. 8. 2004- úrovně dávek (včetně vehikula, pokud se použije) a koncentrace,
      4. účinné od 1. 8. 2004- údaje o toxických odpovědích podle pohlaví a podle dávek,
      5. účinné od 1. 8. 2004- hladina bez účinku, pokud ji lze stanovit,
      6. účinné od 1. 8. 2004- doba uhynutí během experimentu, případně údaj, o přežití zvířat do konce sledování,
      7. účinné od 1. 8. 2004- popis toxických nebo jiných účinků,
      8. účinné od 1. 8. 2004- doba, kdy byly pozorovány jednotlivé abnormální příznaky a jejich další vývoj,
      9. účinné od 1. 8. 2004- spotřeba potravy a vývoj tělesné hmotnosti,
      10. účinné od 1. 8. 2004- oftalmologické nálezy,
      11. účinné od 1. 8. 2004- hematologická vyšetření a jejich výsledky
      12. účinné od 1. 8. 2004- biochemická vyšetření a jejich výsledky ( včetně výsledků případných analýz moči),
      13. účinné od 1. 8. 2004- pitevní nálezy,
      14. účinné od 1. 8. 2004- detailní popis všech histopatologických nálezů,
      15. účinné od 1. 8. 2004- statistické vyhodnocení výsledků, kde je to možné.

    účinné od 1. 8. 2004Diskuse výsledků.

    účinné od 1. 8. 2004Závěry.

účinné od 1. 8. 2004B.29 SUBCHRONICKÁ TOXICITA - INHALAČNÍ (90 denní opakovaná inhalační expozice, studie na hlodavcích)

  1. účinné od 1. 8. 20041 METODA je v souladu s právem Evropských společenství.1)
    1. účinné od 1. 8. 20041.1 Princip testovací metody

      účinné od 1. 8. 2004Několik skupin pokusných zvířat je exponováno studované látce denně po určitou dobu, v odstupňovaných koncentracích, každá skupina jedné koncentraci, a to po 90 dnů. Použije-li se pro dosažení potřebné koncentrace testované látky v atmosféře vehikulum, je třeba použít kontrolní skupinu pro vehikulum. Během trvání pokusu se zvířata denně pozorují a zjišťují se příznaky toxických účinků. Zvířata, která během pokusu uhynou, i ta, která přežijí do konce pokusu, se pitvají.

    1. účinné od 1. 8. 20041.2 Popis metody
      1. účinné od 1. 8. 20041.2.1 Příprava

        účinné od 1. 8. 2004Pokusná zvířata jsou vybrána s ohledem na druh, pohlaví, a stáří v souladu s ustanovením § 15 zvláštního právního předpisu10) a označena tak, aby byla možná identifikace jednotlivých zvířat. Dobu navykání stanoví § 10 zvláštního právního předpisu.10) Před testem se zdravá mladá zvířata náhodně přiřadí do jednotlivých experimentálních skupin. Pokud je třeba, přidá se k testované látce vhodné vehikulum tak, aby v ovzduší vznikla příslušná koncentrace testované látky. Pokud se užije pro usnadnění aplikace vehikulum nebo jiná aditiva, musí být o nich známo, že nemají toxický účinek. Existují-li vhodná historická data, je možno je využít.

      1. účinné od 1. 8. 20041.2.2 Experimentální podmínky
        1. účinné od 1. 8. 20041.2.2.1 Pokusná zvířata

          účinné od 1. 8. 2004V pokusech se upřednostňují potkani, nejsou-li známy důvody proti jejich použití. Pracuje se na mladých zdravých zvířatech z běžně užívaných pokusných kmenů. Na začátku studie nemá variační rozpětí hmotnosti zvířat překročit ± 20 % střední hodnoty. Provádí-li se subchronický inhalační test jako předběžný test před dlouhodobým testem, v obou studiích se má použít stejný druh a kmen.

        1. účinné od 1. 8. 20041.2.2.2 Počet a pohlaví

          účinné od 1. 8. 2004Pro každou úroveň koncentrace je třeba použít nejméně 20 zvířat (10 samic a 10 samců). Samice musí být nullipary a nesmí být březí. Pokud se zvířata budou zabíjet v průběhu studie, je nutno zvýšit celkový počet zvířat o počet zvířat, která budou zabita před koncem pokusu. Mimoto je možno exponovat další skupinu (satelitní skupinu) 20ti zvířat (10 zvířat každého pohlaví) po dobu 90dnů nejvyšší koncentraci a během následujících 28 dnů po ukončení expozic sledovat vratnost, trvání nebo zpožděný výskyt toxických účinků.

        1. účinné od 1. 8. 20041.2.2.3 Expoziční koncentrace

          účinné od 1. 8. 2004Použijí se nejméně 3 skupiny s různou úrovní koncentrace a 1 kontrolní skupina (případně kontrolní skupina s vehikulem - pokud se použije - v koncentraci stejné jako u skupiny s nejvyšší koncentrací testované látky). S výjimkou aplikace testované látky se se zvířaty v kontrolní skupině zachází stejně jako s pokusnými. Nejvyšší koncentrace má vyvolat toxické účinky, ale nezpůsobit žádné uhynutí nebo jen v malém počtu. Pokud existují odhady expozice u člověka, má nejnižší koncentrace tuto hodnotu překračovat. Ideálně by střední koncentrace měla vyvolat toxický účinek na hranicích zjistitelnosti. Aplikují-li se více než 3 úrovně koncentrací, mají být voleny tak, aby vyvolaly odstupňované toxické účinky. Ve skupině s nízkou a střední koncentrací a v kontrolní skupině by počet uhynutí měl být nízký, jinak je vyhodnocení výsledků obtížné.

        1. účinné od 1. 8. 20041.2.2.4 Trvání expozice

          účinné od 1. 8. 2004Zvířata se exponují po dobu 6 hodin od ustavení rovnováhy koncentrace studované látky. V případě specifických požadavků je možné použít i jiných dob expozice.

        1. účinné od 1. 8. 20041.2.2.5 Expoziční zařízení

          účinné od 1. 8. 2004Pro expozici zvířat se používá dynamické inhalační zařízení, které zaručuje proudění vzduchu s výměnou nejméně 12 krát za hodinu, aby byl zaručen přiměřený obsah kyslíku a rovnoměrné rozdělení látky v expoziční atmosféře. Použije-li se expoziční box, je třeba ho konstruovat tak, aby co nejvíce bránil stísněnosti zvířat a aby inhalační expozice testované látce byla co nejvyšší. Pro zajištění stability atmosféry v inhalačním boxu neměl by v zásadě celkový objem pokusných zvířat přesáhnout 5 % objemu boxu. Je možné použít inhalační expozice orálně-nasální, samotné hlavy nebo individuální celotělové expozice; první dva způsoby expozice minimalizují příjem látky jinými cestami.

        1. účinné od 1. 8. 20041.2.2.6 Doba pozorování

          účinné od 1. 8. 2004Pokusná zvířata je třeba denně pozorovat během celého období expozic i zotavení a zaznamenávat toxické účinky. Je třeba zaznamenat dobu uhynutí a čas, ve kterém se objeví a opět odezní toxické účinky.

      1. účinné od 1. 8. 20041.2.3 Popis postupu

        účinné od 1. 8. 2004Zvířata se exponují testované látce denně, 5 - 7 dnů v týdnu, po dobu 90 dnů. Zvířata v satelitních skupinách, která jsou určena k následnému pozorování, jsou pozorována dalších 28 dnů bez aplikace, k posouzení zotavení z otravy nebo přetrvávání toxických účinků. Teplota během experimentu má být 22 °C ± 3 °C. Relativní vlhkost má být mezi 30 % a 70 %, s výjimkou případů, kde to není možné (např. experimenty s aerosoly). Během expozice se nepodává potrava ani voda.

        účinné od 1. 8. 2004Používá se dynamický inhalační systém s vhodnou analytickou kontrolou koncentrace. Doporučuje se provést předběžný pokus pro získání potřebných koncentrací. Rychlost průtoku vzduchu je třeba nastavit tak, aby podmínky v celém expozičním boxu byly stejné. Systém musí zaručovat, že stabilních podmínek expozice bude dosaženo co nejrychleji.

        1. účinné od 1. 8. 2004Měření nebo monitorování podmínek expozice:
          1. účinné od 1. 8. 2004a) Měření průtoku vzduchu (kontinuálně).
          2. účinné od 1. 8. 2004b) Skutečná koncentrace studované látky se měří v dýchací zóně. Během jedné expozice se nemá koncentrace odchylovat od střední hodnoty o více než ±15%.

            účinné od 1. 8. 2004U některých prachů a aerosolů, kde této úrovně regulace není možné dosáhnout, se připouští větší rozsah kolísání. Po celou dobu trvání experimentu mají být koncentrace tak stabilní, jak je to prakticky možné. Při vývoji generátoru aerosolu je třeba analyzovat velikosti částic tak, aby byla získána představa o stabilitě. Během expozic se měří tak často, jak je to potřeba pro posouzení stálosti distribuce velikosti částic.

          1. účinné od 1. 8. 2004c) Teplota a vlhkost vzduchu
          2. účinné od 1. 8. 2004d) Během expozice a po ní se zvířata systematicky pozorují a zjištění se zaznamenávají; každé zvíře má svůj individuální protokol. Všechna zvířata je třeba denně pozorovat na příznaky toxických účinků a zaznamenávat jejich nástup, stupeň a trvání. Pozorování v kleci zahrnuje změny kůže, srsti, očí, sliznic, dýchání a krevního oběhu, změny funkce autonomní a centrální nervové soustavy, somatomotorické aktivity a chování. Hmotnosti zvířat i spotřeba potravy se zaznamenávají týdně. Je třeba zajistit pravidelnou kontrolu zvířat, aby pokud možno nedocházelo ke ztrátám zvířat jako např. v důsledku kanibalismu, autolýzy tkání nebo chybného zařazení. Po skončení studie se všechna zvířata, která přežila, pitvají. Umírající zvířata je třeba vyřadit a pitvat.
        1. účinné od 1. 8. 2004U všech zvířat včetně kontrolních se běžně provádějí následující vyšetření:

          účinné od 1. 8. 2004(a) Oftalmologické vyšetření oftalmoskopem nebo rovnocenným přístrojem se má provést před podáváním testované látky a na konci studie nejlépe u všech zvířat, ale přinejmenším u nejvyšší dávky a u kontrolních skupin. Najdou-li se oční změny, vyšetří se všechna zvířata.

          účinné od 1. 8. 2004(b) Na konci pokusu se provede hematologické vyšetření, které má zahrnovat stanovení hematokritu, koncentrace hemoglobinu, počtu erytrocytů, celkového a diferenciálního počtu leukocytů a testy srážlivosti krve jako například dobu srážlivosti, protrombinový čas (Quickův), trombinový čas či počet trombocytů.

          účinné od 1. 8. 2004(c) Na konci pokusu se provede biochemická analýza krve. Pro všechny studie je vhodné stanovit koncentraci elektrolytů, metabolismus glycidů, funkci jater a ledvin. Výběr specifických testů je určen pozorováním způsobu účinku látky. Doporučuje se stanovovat vápník, fosfor, chloridy, sodík, draslík, glukózu nalačno (trvání doby hladovění se volí podle živočišného druhu a kmene), alaninamino transferáza (dříve glutamát- pyruvát transamináza) a aspartátamino transferáza séra (dříve glutamát-oxalacetát transamináza), ornithin dekarboxyláza, gama-glutamyl transpeptidáza, dusík močoviny, albumin, kreatinin, celkový bilirubin a celkové bílkoviny v séru. Mezi další charakteristiky, které mohou být potřebné pro úplné toxikologické hodnocení, patří stanovení: lipidů, hormonů, acidobazické rovnováhy, methemoglobinu, aktivity cholinesterázy. Další biochemické analýzy mohou být v případě potřeby použity pro rozšíření spektra pozorovaných účinků.

          účinné od 1. 8. 2004(d) Analýza moče se nevyžaduje jako běžný postup, ale jen na podkladě očekávané nebo pozorované toxicity.

        účinné od 1. 8. 2004Pokud nejsou přiměřená dřívější kontrolní data, zváží se stanovení hematologických a biochemických parametrů ještě před začátkem expozic.

        1. účinné od 1. 8. 20041.2.3.1 Pitva

          účinné od 1. 8. 2004U všech zvířat použitých ve studii se provede pitva zahrnující zevní prohlídku povrchu těla, všech tělních otvorů, lební, hrudní a břišní dutiny a jejich obsahu. Játra, ledviny, nadledviny, štítná žláza (s příštítnými tělísky) a varlata se co nejdříve po sekci zváží ve vlhkém stavu, aby se předešlo vysychání.

          účinné od 1. 8. 2004Následující orgány a tkáně je třeba přechovávat ve vhodném médiu s ohledem na možná pozdější histopatologická vyšetření: všechny tkáně s makroskopickým postižením, plíce ( mají se vyjmout neporušeny, zvážit a fixovat vhodným médiem, tak aby se zachovala struktura plic - perfuzní fixace se považuje za vhodnou), tkáň nasofaryngu, mozek - v řezech medula/pons, kůra mozku a mozečku, hypofýza, štítná žláza/příštítná tělíska, tkáň na místě brzlíku, průdušnice, srdce, aorta, slinné žlázy, játra, slezina, ledviny, nadledviny, slinivka břišní, varlata a vaječníky, děloha, (přídatné pohlavní orgány), (kůže), žlučník (je-li přítomen), jícen, žaludek, dvanácterník, tenké, tlusté a slepé střevo, konečník, močový měchýř, reprezentativní lymfatické uzliny, (samičí mléčná žláza), (stehenní sval), periferní nerv, (oči), hrudní kost s kostní dření, (kost stehenní včetně kloubních ploch), (páteřní mícha ve třech úrovních - krční, střed hrudní a bederní). Tkáně v závorkách se posuzují pokud je to indikováno podle příznaků toxicity nebo pokud souvisejí s cílovým orgánem.

        1. účinné od 1. 8. 20041.2.3.2 Histopatologická vyšetření

          účinné od 1. 8. 2004(a) Úplné histopatologické vyšetření respiračního systému a ostatních orgánů a tkání je třeba provést u všech zvířat skupiny, která byla exponována nejvyšší koncentraci, a u zvířat kontrolní skupiny.

          účinné od 1. 8. 2004(b) Je třeba vyšetřit všechny makroskopické léze.

          účinné od 1. 8. 2004(c) Je třeba vyšetřit cílové orgány v ostatních dávkových skupinách.

          účinné od 1. 8. 2004(d) Plíce zvířat ve skupinách s nízkou a střední koncentrací se mají histopatologicky vyšetřovat, protože to poskytuje obraz zdravotního stavu zvířat. Další histopatologická vyšetření se u zvířat těchto skupin nemusí provádět rutinně, musí se však provést vždy na orgánech, na kterých bylo zjištěno postižení ve skupině s vysokou koncentrací.

          účinné od 1. 8. 2004(e) Používají-li se satelitní skupiny, provede se histopatologické vyšetření na tkáních a orgánech, u kterých byly zjištěny účinky u ostatních exponovaných skupin.

  1. účinné od 1. 8. 20042 ÚDAJE

    účinné od 1. 8. 2004Údaje se sestaví do tabulky. Z ní musí být pro každou experimentální skupinu patrný počet zvířat na počátku pokusu a počet zvířat s lézemi, typ leze a procentuálně počet zvířat s jednotlivými typy lézí. Výsledky je třeba vyhodnotit vhodnou statistickou metodou. Je k tomu možno použít kteroukoliv uznávanou statistickou metodu.

  1. účinné od 1. 8. 20043 PROJEKT POKUSU, PROTOKOL POKUSU A ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA

    účinné od 1. 8. 2004V souladu s příslušnými právními předpisy9) musí být zpracován projekt pokusu a o průběhu pokusu je nutno vést protokol.

    1. účinné od 1. 8. 2004Zpráva o průběhu pokusu obsahuje tyto informace:
      1. účinné od 1. 8. 2004- živočišný druh, kmen, původ, podmínky ustájení, potrava,
      2. účinné od 1. 8. 2004- podmínky pokusu:
      3. účinné od 1. 8. 2004- popis expozičního zařízení včetně konstrukce, typu, rozměrů, zdroje vzduchu, systému přípravy částic a aerosolů, klimatizačního systému, popis likvidace odpadního vzduchu a způsobu umístění zvířat v experimentálním boxu, pokud je používán. Popsat přístroje pro měření teploty, vlhkosti vzduchu, popřípadě stability koncentrací a distribuce velikosti částic aerosolu.
      4. účinné od 1. 8. 2004- údaje o expozici se sestaví do tabulky a uvedou spolu s průměrnými hodnotami a charakteristikou variability (např. směrodatnou odchylkou). Mají obsahovat tyto údaje:
        1. účinné od 1. 8. 2004a) rychlost průtoku vzduchu inhalačním zařízením,
        2. účinné od 1. 8. 2004b) teplota a vlhkost vzduchu,
        3. účinné od 1. 8. 2004c) nominální koncentrace (celkové množství testované látky přiváděné do inhalačního zařízení, dělené objemem vzduchu),
        4. účinné od 1. 8. 2004d) povaha vehikula, pokud bylo užito,
        5. účinné od 1. 8. 2004e) skutečné koncentrace v dýchací zóně,
        6. účinné od 1. 8. 2004f) medián velikostí částic (podle možnosti),
      1. účinné od 1. 8. 2004- údaje o toxických odpovědích podle pohlaví a podle koncentrací,
      2. účinné od 1. 8. 2004- úroveň bez účinku, pokud je možné ji stanovit,
      3. účinné od 1. 8. 2004- doba uhynutí během experimentu, případně údaj o přežití zvířat do konce sledování,
      4. účinné od 1. 8. 2004- popis toxických nebo jiných účinků,
      5. účinné od 1. 8. 2004- doba, kdy byly pozorovány jednotlivé abnormální příznaky a jejich další vývoj,
      6. účinné od 1. 8. 2004- spotřeba potravy a vývoj tělesné hmotnosti,
      7. účinné od 1. 8. 2004- oftalmologické nálezy,
      8. účinné od 1. 8. 2004- hematologická vyšetření a jejich výsledky,
      9. účinné od 1. 8. 2004- biochemická vyšetření a jejich výsledky, (včetně výsledků případných analýz moči)
      10. účinné od 1. 8. 2004- pitevní nálezy,
      11. účinné od 1. 8. 2004- detailní popis všech histopatologických nálezů,
      12. účinné od 1. 8. 2004- statistické vyhodnocení výsledků, kde je to možné:

    účinné od 1. 8. 2004Diskuse výsledků.

    účinné od 1. 8. 2004Závěry.

účinné od 1. 8. 2004B.30 TESTOVÁNÍ CHRONICKÉ TOXICITY

  1. účinné od 1. 8. 20041 METODA je v souladu s právem Evropských společenství.1)
    1. účinné od 1. 8. 20041.1 Princip testovací metody

      účinné od 1. 8. 2004Testovaná látka je podávána obvykle 7 dnů v týdnu, vhodnou cestou, několika skupinám pokusných zvířat, jedna dávka na skupinu, po větší část života zvířat. Během a po expozici testované látce jsou zvířata denně pozorována za účelem sledování projevů toxicity.

    1. účinné od 1. 8. 20041.2 Popis testovací metody
      1. účinné od 1. 8. 20041.2.1 Příprava

        účinné od 1. 8. 2004Zvířata jsou chována při podmínkách chovu a krmení v jakých budou během pokusu a aspoň 5 dní před započetím testu. Před testem jsou zdravá, mladá zvířata náhodně rozdělena do exponovaných a kontrolních skupin.

      1. účinné od 1. 8. 20041.2.2 Testovací podmínky
        1. účinné od 1. 8. 20041.2.2.1 Experimentální zvířata

          účinné od 1. 8. 2004Pokusná zvířata jsou vybrána s ohledem na druh, pohlaví, a stáří v souladu s ustanovením § 15 zvláštního právního předpisu10) a označena tak, aby byla možná identifikace jednotlivých zvířat. Dobu navykání stanoví § 10 zvláštního právního předpisu.10) Preferovaným druhem je potkan. Na základě předchozích studií je možno použít i další druhy (hlodavce nebo jiné). Je třeba použít zdravé a mladé jedince běžně chovaných kmenů laboratorních zvířat. Expozice by měla být započata co nejdříve po odstavení mláďat. Na začátku studie by neměl rozdíl ve váze zvířat činit více než ± 20% od průměru. V případě, že vlastní studii předchází test subchronické orální toxicity, je třeba použít stejný druh a kmen v obou studiích.

        1. účinné od 1. 8. 20041.2.2.2 Počet a pohlaví

          účinné od 1. 8. 2004Pro každou úroveň dávky je třeba použít nejméně 40 zvířat (20 samic a 20 samců), stejně i pro kontrolní skupinu. Samice by měly být nullipary a neměly by být březí. Pokud je záměrem utratit některá zvířata před dokončením testu, je třeba použít přiměřeně vyšší počet zvířat.

          účinné od 1. 8. 2004V případě jiných druhů zvířat (nehlodavců) je možné použít menší počet zvířat, ale ne méně než 4 od každého pohlaví ve skupině.

        1. účinné od 1. 8. 20041.2.2.3 Dávky a frekvence expozic

          účinné od 1. 8. 2004Je třeba použít aspoň 3 dávky a 1 kontrolní skupinu. Nejvyšší dávka by měla vyvolat jasné projevy toxicity bez nadměrné úmrtnosti. Nejnižší dávka by neměla vyvolat prokazatelné projevy toxicity. Střední dávky by měly být voleny ve středním pásmu mezi vysokými a nízkými dávkami. Výběr dávek by měl vzít v úvahu výsledky předchozích studií.

          účinné od 1. 8. 2004Obvykle jsou zvířata exponována denně. V případě, že testovaná látka je podávána v pitné vodě nebo v potravě, je třeba zajistit, aby k ní měla zvířata stálý přístup.

        1. účinné od 1. 8. 20041.2.2.4 Kontroly

          účinné od 1. 8. 2004Souběžná kontrolní skupina je identická v každém ohledu k exponované skupině, vyjma expozice testované látce.

          účinné od 1. 8. 2004Ve zvláštních případech, jako jsou inhalační studie s aerosoly nebo použije-li se pro orální aplikaci emulgátoru, jehož biologická aktivita není charakterizována, zařadí se další negativní kontrolní skupina, která není exponována ani vehikulu.

        1. účinné od 1. 8. 20041.2.2.5 Způsob aplikace

          účinné od 1. 8. 2004Dva hlavní způsoby aplikace jsou orální a inhalační. Volba způsobu podání závisí na fyzikálních a chemických charakteristikách testované látky a pravděpodobném způsobu expozice člověka.

          účinné od 1. 8. 2004Použití dermální aplikace vyvolává značné technické problémy. Chronická systémová toxicita v důsledku kožního vstřebání může být normálně odvozena z výsledku orálního testu a znalosti rozsahu kožního vstřebávání, odvozené z předchozích testů kožní toxicity.

          účinné od 1. 8. 2004Orální studie

          účinné od 1. 8. 2004Tam, kde se testovaná látka vstřebává z gastrointestinálního traktu a je-li požití jednou z cest, jimiž může být exponován člověk, dává se přednost orální aplikaci, pokud nejsou proti tomu nějaké důvody. Zvířata mohou dostat testovanou látku v potravě, rozpuštěnu v pitné vodě nebo podanou v tobolce.

          účinné od 1. 8. 2004Ideálně by se měla látka podávat sedm dní v týdnu, protože dávkování 5 dnů v týdnu může vést k vymizení toxicity nebo naopak vyvolat “abstinenční“ příznaky v období bez aplikace, a tudíž ovlivnit výsledky a následné hodnocení. Nicméně, především s ohledem na praktické aspekty, dávkování 5 krát týdně je považováno za přijatelné.

          účinné od 1. 8. 2004Inhalační studie

          účinné od 1. 8. 2004Protože inhalační studie jsou technicky komplikovanější než jiné způsoby aplikace, jsou zde uvedeny podrobněji informace o této cestě podání. Intratracheální instilace může být platnou alternativou v specifických situacích.

          účinné od 1. 8. 2004Dlouhodobé expozice obvykle napodobují předpokládané lidské expozice, takže zvíře je obvykle exponováno po ustálení koncentrace 6 hodin denně po 5 dnů v týdnu (přerušovaná expozice), nebo v návaznosti na možnou expozici v prostředí, 22-24 hodin denně po sedm dní v týdnu (kontinuální expozice), s přibližně 1 hodinou pro krmení zvířat denně ve stejnou dobu dne, použitou i pro čištění expozičního boxu. V obou případech jsou zvířata obvykle exponována fixním koncentracím testované látky. Hlavní rozdíl mezi přerušovanou a stálou expozicí je v tom, že v prvním případě má zvíře 17-18 hodin na ústup účinků denní expozice s ještě delším obdobím během víkendu.

          účinné od 1. 8. 2004Volba přerušované nebo kontinuální expozice závisí na cílech studie a na lidské expozici, která má být simulována. Nicméně, je třeba vzít v úvahu určité technické obtíže. Například, výhody kontinuální expozice pro simulaci podmínek zevního prostředí mohou být narušeny nutností napájení a krmení během expozice a potřebou komplikovanější (a spolehlivé) generace aerosolu nebo určité koncentrace par a technik monitorování.

          účinné od 1. 8. 2004Expoziční komory

          účinné od 1. 8. 2004Zvířata se exponují v inhalačních komorách, jejichž konstrukce zaručuje dynamický proud pro nejméně 12 výměn vzduchu za hodinu, aby byl zajištěn dostatečný přísun kyslíku a rovnoměrná distribuce expoziční atmosféry. Kontrolní a expoziční komory by měly mít identickou konstrukci, tak aby byly expoziční podmínky srovnatelné ve všech aspektech vyjma expozice testované látce. Uvnitř komory se obvykle udržuje mírný podtlak a tím se brání úniku testované látky do okolního prostředí. Komory by měly minimalizovat stísněnost testovaných zvířat. Obecně by v zájmu udržení stabilní atmosféry v komoře objem zvířat neměl přesáhnou 5 % objemu komory.

          1. účinné od 1. 8. 2004Měření nebo monitorování zahrnuje:

            účinné od 1. 8. 2004(a) průtok vzduchu: rychlost průtoku vzduchu komorou by měla být nejlépe kontrolována kontinuálně;

            účinné od 1. 8. 2004(b) koncentrace: během denní expozice by koncentrace testované látky neměla kolísat více než ±15 % střední hodnoty;

            účinné od 1. 8. 2004(c) teplota a vlhkost: pro hlodavce, teplota by měla být udržována v rozmezí 22 ± 2°C a vlhkost v komorách 30 - 70 % vyjma případů, kdy je voda používána k rozptýlení testované látky v atmosféře komory. Oba parametry by měly být kontrolovány průběžně;

            účinné od 1. 8. 2004(d) měření velikosti částic: měla by být stanovena distribuce velikosti částic v atmosféře komor u tekutých nebo pevných aerosolů. Aerosolové částice by měly být v respirabilní velikosti pro použité testovací zvíře. Vzorky atmosféry komor se odebírají z dýchací zóny zvířat. Vzorek vzduchu by měl být reprezentativní pro distribuci částic, kterým je zvíře exponováno, a měl by gravimetricky odpovídat celému suspendovanému aerosolu, i když značná část aerosolu není respirabilní. Analýza velikosti částic by měla být prováděna často během vývoje generujícího systému, aby zajistila stabilitu aerosolu, a poté během expozic tak často, aby bylo možno posoudit stabilitu distribuce částic, kterým jsou zvířata exponována.

        1. účinné od 1. 8. 20041.2.2.6 Trvání studie

          účinné od 1. 8. 2004Expozice látce by měla trvat nejméně 12 měsíců.

      1. účinné od 1. 8. 20041.2.3 Popis postupu
        1. účinné od 1. 8. 20041.2.3.1 Pozorování

          účinné od 1. 8. 2004Pečlivé klinické sledování by mělo být prováděno nejméně jednou denně. Měla by být prováděna i dodatečná pozorování s odpovídajícími zákroky k minimalizaci ztrát. Zvířata je třeba pečlivě sledovat, aby se spolehlivě zachytil začátek a progrese všech toxických účinků, a také za účelem minimalizace ztrát v důsledku nemocí, autolýzy nebo kanibalismu.

          účinné od 1. 8. 2004Registrují se klinické příznaky včetně neurologických a očních změn u všech zvířat, a dále případy uhynutí. Zaznamenává se doba objevení a postup toxických příznaků včetně podezření na tumor.

          účinné od 1. 8. 2004Hmotnost se zaznamenává individuálně u všech zvířat jednou týdně během prvních 13 týdnů období testu a aspoň jednou za 4 týdny po tomto období. Je třeba provádět měření spotřeby potravy (a vody tam, kde je testovaná látka podávána v pitné vodě) týdně během prvních 13 týdnů a pak přibližně ve tříměsíčních intervalech, ledaže by zdravotní stav nebo změny tělesné hmotnosti ukázaly nutnost jiné frekvence sledování.

        1. účinné od 1. 8. 20041.2.3.2 Hematologická vyšetření

          účinné od 1. 8. 2004Hematologická vyšetření (např. obsah hemoglobinu, hematokrit, celkový počet erytrocytů, celkový počet bílých krvinek, krevních destiček, nebo jiné ukazatele srážlivosti) by měla být prováděna za 3 měsíce, 6 měsíců a poté v přibližně šestiměsíčních intervalech, a na konci ve vzorcích krve shromážděných od všech nehlodavců, respektive od 10 potkanů, na pohlaví z každé skupiny. Tam, kde je to možné, by měly být vzorky ve všech intervalech od stejných potkanů. Navíc je potřeba odebrat vzorek před testem od všech nehlodavců.

          účinné od 1. 8. 2004Pokud klinické vyšetření zvířat naznačí zhoršený zdravotní stav zvířat během studie, měl by být stanoven diferenciální obraz bílých krvinek.

          účinné od 1. 8. 2004Diferenciální obraz bílých krvinek se vyšetří ve vzorcích od zvířat ve skupině s nejvyšší dávkou a u kontrol. Pokud tato data, nebo údaje z vyšetření patologických změn naznačí nutnost, vyšetří se i u skupiny s dávkou nejblíže nižší.

        1. účinné od 1. 8. 20041.2.3.3 Analýza moči
          1. účinné od 1. 8. 2004Vzorky moči 10 potkanů každého pohlaví se sbírají pro analýzu pokud možno od stejných zvířat a ve stejných intervalech jako hematologické zkoušky. Následující stanovení jsou provedena buď na vzorcích jednotlivých zvířat nebo na směsném vzorku pro skupiny podle dávek a pohlaví:
            1. účinné od 1. 8. 2004- vzhled moči, objem a hustota u jednotlivých zvířat,
            2. účinné od 1. 8. 2004- proteiny, glukosa, ketolátky, okultní krvácení (semikvantitativně),
            3. účinné od 1. 8. 2004- mikroskopické vyšetření sedimentu (semikvantitativně).
        1. účinné od 1. 8. 20041.2.3.4 Biochemické vyšetření
          1. účinné od 1. 8. 2004V přibližně šestiměsíčních intervalech a na závěr jsou odebrány krevní vzorky pro biochemická měření od všech nehlodavců a 10 potkanů obojího pohlaví v každé skupině, pokud možno od týchž potkanů ve všech intervalech. Od nehlodavců se vedle toho odeberou vzorky před testem. Z těchto vzorků je připravena plasma a jsou provedeny následující zkoušky:
            1. účinné od 1. 8. 2004- celková koncentrace proteinů,
            2. účinné od 1. 8. 2004- koncentrace albuminu,
            3. účinné od 1. 8. 2004- testy na funkci jater (např. aktivita bazické fosfatázy, aktivita glutamát pyruvát transaminázy (nyní známá jako sérová alanin aminotransferáza), glutamát acetát transaminázy (nyní známá jako sérová aspartát aminotransferáza), gama glutamyl transpeptidázy, ornitin dekarboxylázy,
            4. účinné od 1. 8. 2004- metabolismus glycidů, např. krevní glukosa nalačno,
            5. účinné od 1. 8. 2004- testy na funkci ledvin, např. dusík močoviny v krvi.
        1. účinné od 1. 8. 20041.2.3.5 Pitva

          účinné od 1. 8. 2004Kompletní pitva se provede u všech zvířat, včetně těch, která zemřela během pokusu nebo byla utracena v agónii stavu. Před utracením se odeberou vzorky krve všech zvířat pro diferenciální obraz bílých krvinek. Všechny viditelné tumory nebo léze, které by mohly být tumory, je třeba uchovat. Provádí se porovnání anatomicko-patologických změn s mikroskopickými nálezy.

          účinné od 1. 8. 2004Orgány a tkáně se uchovávají pro histopatologické vyšetření. Obvykle se jedná o následující orgány a tkáně: mozek (prodloužené míchy/mostu, mozečkové kory, kory mozkové), podvěsek mozkový, štítnou žlázu a příštítná tělíska, thymus, trachea a plíce, srdce, aortu, slinnou žlázu, jatra, slezinu, ledviny, nadledviny, jícen, žaludek, dvanácterník, jejunum, ileum, slepé střevo, tračník, konečník, močový měchýř, lymfatické uzliny, slinivku, gonády, akcesorní pohlavních orgány, samičí mléčné žlázy, kůži, svalovinu, periferní nervy, míchu (krční, hrudní a bederní), sternum s kostní dření, stehenní kost včetně kloubů, a oči. Naplnění plic a močového měchýře fixativem je optimální cestou ke konzervaci těchto tkání; naplnění plic v inhalačních studiích, je zásadní pro odpovídající histopatologické zkoumání. Ve speciálních studiích jako jsou inhalační studie, má být studován celý respirační trakt včetně nosu, hltanu a hrtanu.

        2. účinné od 1. 8. 2004Poznámka: štítná žláza s příštitnými tělísky ze všech nehlodavců musí být zvážena stejně jako mozek, játra, ledviny, nadledviny a gonády z 10 zvířat na pohlaví a na skupinu u hlodavců a ze všech nehlodavců.

          3. účinné od 1. 8. 2004Byla-li provedena jiná klinická vyšetření, informace získané z těchto procedur by měly být k dispozici před mikroskopickým vyšetřením, protože mohou dát patologovi významné vodítko.

        1. účinné od 1. 8. 20041.2.3.6 Histopatologie
          1. účinné od 1. 8. 2004Všechny viditelné změny, zvláště tumory a jiné léze vyskytující se v kterémkoli orgánu, se zkoumají mikroskopicky. Navíc jsou doporučeny následující postupy:

            účinné od 1. 8. 2004(a) mikroskopické vyšetření všech uchovaných orgánů a tkání s kompletním popisem všech lézí nalezených:

            1. účinné od 1. 8. 20041. u všech zvířat, která uhynula nebo byla utracena během studie,
            2. účinné od 1. 8. 20042. u všech zvířat ze skupiny s vysokou dávkou a kontrolní skupiny

            účinné od 1. 8. 2004(b) orgány či tkáně ukazující abnormity způsobené nebo pravděpodobně způsobené testovanou látkou jsou zkoumány také ve skupinách s nižšími dávkami,

            účinné od 1. 8. 2004(c) tam, kde výsledky svědčí pro významné zkrácení normální délky života zvířat nebo vyvolání účinků, které by mohly ovlivnit toxickou odpověď, skupina s nejblíže nižší dávkou se vyšetří popsaným způsobem,

            účinné od 1. 8. 2004(d) informace o incidenci lézí, které se normálně vyskytují v použitém kmeni zvířat, ve stejných laboratorních podmínkách, tj. historické kontrolní údaje, jsou nezbytné pro správné posouzení významnosti změn pozorovaných u zvířat s aplikovanou látkou.

  1. účinné od 1. 8. 20042 ÚDAJE

    účinné od 1. 8. 2004Údaje se sumarizují v formě tabulkách, ukazujících pro každou testovanou skupinu počet zvířat na začátku testu, počet zvířat vykazujících léze a procento zvířat vykazujících jednotlivé typy lézí. Výsledky by měly být vyhodnoceny odpovídající statistickou metodou. Mohou být použity jakékoliv uznávané statistické metody.

  1. účinné od 1. 8. 20043 PROJEKT POKUSU, PROTOKOL POKUSU A ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA

    účinné od 1. 8. 2004V souladu s příslušnými právními předpisy9) musí být zpracován projekt pokusu a o průběhu pokusu je nutno vést protokol.

    1. účinné od 1. 8. 2004Zpráva o testu bude obsahovat následující informace:
      1. účinné od 1. 8. 2004- živočišný druh, kmen, zdroj, podmínky ustájení, dieta,
      2. účinné od 1. 8. 2004- podmínky testu,
        1. účinné od 1. 8. 2004popis expozičního zařízení včetně konstrukce, typu, rozměrů, zdroje vzduchu, systému pro vytváření částic a aerosolů, metody klimatizace, zneškodňování vzduchu vycházejícího z aparatury a způsobu umístění zvířat v expozičním boxu, pokud se používá. Dále je třeba popsat zařízení pro měření teploty, vlhkosti, a tam, kde je to žádoucí, stability koncentrace nebo velikosti částic aerosolu,
      1. účinné od 1. 8. 2004- údaje o expozici: ve formě tabulky včetně průměrných hodnot a variability (např. standardní odchylka) a měly by zahrnovat:

        účinné od 1. 8. 2004(a) rychlost průtoku vzduchu inhalačním zařízením

        účinné od 1. 8. 2004(b) teplotu a vlhkost vzduchu

        účinné od 1. 8. 2004(c) nominální koncentrace (celkové množství testované látky vstupující do inhalační aparatury děleno objemem vzduchu)

        účinné od 1. 8. 2004(d) povahu vehikula, je-li použito

        účinné od 1. 8. 2004(e) skutečné koncentrace v dýchací zóně

        účinné od 1. 8. 2004(f) mediány velikosti částic (je-li to relevantní)

      1. účinné od 1. 8. 2004- dávkové úrovně (včetně vehikula, je-li užito) a koncentrace,
      2. účinné od 1. 8. 2004- údaje o toxické odpovědi podle pohlaví a dávky,
      3. účinné od 1. 8. 2004- neúčinná (dávková) úroveň,
      4. účinné od 1. 8. 2004- doba úmrtí během studie nebo zda zvířata přežila až do konce,
      5. účinné od 1. 8. 2004- popis toxických a jiných účinků,
      6. účinné od 1. 8. 2004- doba, kdy byl pozorován každý abnormální příznak a jeho další vývoj,
      7. účinné od 1. 8. 2004- data o spotřebě potravy a tělesné hmotnosti,
      8. účinné od 1. 8. 2004- oftalmologické nálezy,
      9. účinné od 1. 8. 2004- použité hematologické testy a výsledky,
      10. účinné od 1. 8. 2004- testy klinické biochemie a všechny výsledky (včetně výsledků analýzy moči),
      11. účinné od 1. 8. 2004- pitevní nálezy,
      12. účinné od 1. 8. 2004- detailní popis všech histopatologických nálezů,
      13. účinné od 1. 8. 2004- statistické zpracování výsledků s popisem použitých metod.

    účinné od 1. 8. 2004Diskuse výsledků.

    účinné od 1. 8. 2004Závěry.

účinné od 1. 8. 2004B.31 STUDIE TERATOGENITY - HLODAVCI A NEHLODAVCI

  1. účinné od 1. 8. 20041 METODA je v souladu s právem Evropských společenství.1)
    1. účinné od 1. 8. 20041.1 Princip testovací metody

      účinné od 1. 8. 2004Testovaná látka se podává v odstupňovaných dávkách nebo koncentracích několika skupinám březích pokusných zvířat, 1 dávka na každou skupinu, alespoň v tom období březosti, ve kterém dochází k organogenezi. Krátce před očekávaným datem porodu jsou březí samice utraceny a jejich děloha i s obsahem je použita k dalšímu studiu. Tato testovací metoda zahrnuje studium embryotoxicity a fetotoxicity.

    1. účinné od 1. 8. 20041.2 Popis testovací metody
      1. účinné od 1. 8. 20041.2.1 Příprava