Vyhláška, kterou se stanoví základní metody pro zkoušení toxicity chemických látek a chemických přípravků, 443/2004 Sb., účinné od 15. 11. 2005

Předchozí stránka

K analýze chromozómových aberací in vitro se mohou použít kultury stabilizovaných buněčných linií, buněčných kmenů nebo primární buněčné kultury. Použité buňky jsou vybrány na základě schopnosti růstu v kultuře, stability karyotypu, počtu chromozómů, jejich diverzity a četnosti spontánních chromozómových aberací.

Testy in vitro vyžadují obecně exogenní zdroj metabolické aktivace. Tento systém metabolické aktivace nedokáže dokonale napodobit podmínky u savců in vivo. Je třeba se vyvarovat podmínek, které by mohly vést k pozitivním výsledkům, jež neodrážejí vnitřní mutagenitu, nýbrž jsou způsobeny změnami pH, osmolality nebo vysokou cytotoxicitou.⁵)

1.2 Definice
Aberace chromatidového typu: strukturální poškození chromozómu, které se projevuje jako zlom jedné, případně obou chromatid, nebo zlom a opětovné spojení mezi chromatidami.
Aberace chromozómového typu: strukturální poškození chromozómu vyjádřená jako zlom respektive jako zlom a opětovné spojení obou chromatid na stejném místě (zahrnuty jsou aberace typu dicentrický chromozóm, prsténčitý chromozóm-ring).
Zlom chromatidy: jako zlom lze hodnotit porušení kontinuity jedné nebo obou chromatid za předpokladu, že vzniklá mezera ve struktuře chromatidy je větší než je šířka poškozené chromatidy. Dále pak v případech, koncový (distální) fragment v místě zlomu je dislokovaný (nebo mimo osu chromatidy), případně jedna chromatida hodnoceného chromozómu je kratší v důsledku delece.
Endoreduplikace: proces, kde po S-fázi replikace DNA nepřechází jádro do mitózy, nýbrž začíná další S-fáze. Výsledkem jsou chromozómy s 4, 8, 16, ... chromatidami.
Gap: achromatická léze menší než šířka jedné chromatidy a s minimálním vybočením chromatid.
Mitotický index: poměr buněk v metafázi dělený celkovým počtem buněk v dané populaci buněk; udává stupeň proliferace této populace.
Numerická aberace: změna počtu chromozómů oproti normálnímu počtu charakteristickému pro použité buňky.
Polyploidie: násobek haploidního počtu chromozómů (n) jiný než diploidní počet (tedy 3n, 4n atd.).
Strukturální aberace: změna chromozómové struktury zjistitelná mikroskopickou analýzou buněčného dělení ve stádiu metafáze, pozorovaná jako delece a fragmenty a výměny.

1.3 Princip metody
Buněčné kultury se vystaví působení testované látky, a to s metabolickou aktivací a bez ní. Ve stanovených intervalech po expozici buněčné kultury testované látce, se metafáze zastaví například Colcemidem® nebo kolchicinem, buňky se sklidí, obarví se a v metafázických buňkách se mikroskopicky zjišťují chromozómové aberace.

1.4 Popis metody

1.4.1 Příprava
1. 1.4.1.1 Buňky
  Je možno použít celou řadu buněčných linií, kmenů nebo primárních buněčných kultur, včetně buněk lidských (například fibroblasty čínského křečka nebo lymfocyty periferní krve člověka či jiného savce).
1. 1.4.1.2 Média a kultivační podmínky
  K udržování kultur je třeba používat vhodná kultivační média a inkubační podmínky (kultivační nádoby, koncentrace CO₂, teplota a vlhkost). U buněčných linií a kmenů je třeba běžným způsobem kontrolovat stabilitu modálního počtu chromozómů a nepřítomnost mykoplasmat v buňkách. V případě kontaminace se buňky nepoužívají. Je třeba znát normální dobu buněčného cyklu a kultivační podmínky.
1. 1.4.1.3 Příprava kultur
  Stabilizované buněčné linie a kmeny: buňky se množí ze zásobních kultur vysetím do kultivačního média v takové hustotě, aby kultury nedosáhly konfluentní vrstvy před dobou sklízení a inkubují se při teplotě 37°C.
  Lymfocyty: ke kultivačnímu médiu obsahujícímu mitogen (např. fytohemoglutinin) se přidá buď plná krev s vhodným antikoagulantem (např. heparinem) nebo separované lymfocyty získané od zdravých jedinců a kultivují se při teplotě 37°C.
1. 1.4.1.4 Metabolická aktivace
  Na buňky se testovanou látkou působí v přítomnosti i v nepřítomnosti vhodného metabolického aktivačního systému. Nejobvyklejší je kofaktory suplementovaná mitochondriální frakce (S9) připravená z jater hlodavců, ovlivněná činidly indukujícími enzymy jako je Aroclor 1254, nebo směs fenobarbitalu a β-naftoflavonu.⁵)
  Konečná koncentrace mitochondriální frakce v médiu činí obvykle 1 – 10 % v/v. Aktivita metabolického aktivačního systému bude záviset na tom, jakého typu je testovaná látka. V některých případech je vhodné použít mitochondriální frakci v několika koncentracích.
  Pro účely endogenní aktivace mohou být použity i geneticky modifikované buněčné linie exprimující specifické aktivační enzymy. Výběr buněčných linií by měl být vědecky ověřen (např. vztahem isoenzymu cytochromu P450 k metabolismu testované látky).
1. 1.4.1.5 Příprava testované látky
  Je-li testovaná látka v pevném stavu, látka se před působením na buňky rozpustí nebo se připraví její suspenze ve vhodném rozpouštědle a případně naředí. Kapalné testované látky se mohou do systému přidávat přímo nebo se předtím ředí. Je třeba používat čerstvé preparáty, ledaže údaje o jejich stabilitě prokazují, že delší skladování neovlivňuje jejich vlastnosti.

1.4.2 Podmínky testu

1.4.2.1 Rozpouštědlo
U zvoleného rozpouštědla nesmí existovat podezření, že by mohlo s testovanou látkou chemicky reagovat, a nesmí narušovat přežívání buněk a aktivitu S9. Používá-li se méně známé rozpouštědlo musí být podpořeno referencemi prokazujícími jeho kompatibilitu. Doporučuje se, aby všude tam, kde je to možné, bylo na prvním místě zvažováno použití jako rozpouštědla vody. Je-li testovaná látka ve vodě nestálá, musí být použité organické rozpouštědlo zcela bezvodé. Voda se dá odstranit molekulárním sítem.

1.4.2.2 Koncentrace
Mezi kritéria, jež se uvažují při stanovování nejvyšší koncentrace, patří cytotoxicita, rozpustnost v systému a změny pH resp. osmolality.
Cytotoxicita se stanoví s metabolickou aktivací i bez ní v hlavním experimentu, přičemž se použije vhodné indikace buněčné integrity a růstu, například stupně konfluence, počet živých buněk, nebo mitotický index. Je vhodné stanovit cytotoxicitu a rozpustnost v předběžných experimentech.
Je třeba použít minimálně tři analyzovatelné koncentrace. Dochází-li k cytotoxicitě, musí tyto koncentrace pokrývat rozsah od maximální do nízké nebo nulové toxicity. To obvykle znamená, že se jednotlivé koncentrace nebudou lišit více než násobkem, který leží mezi hodnotami 2 a √10. V době sklízení buněk musí být při nejvyšší koncentraci pozorován signifikantní pokles konfluentního růstu, počtu buněk, nebo mitotického indexu (vždy o více než 50%). Mitotický index je pouze nepřímou mírou cytotoxických/ cytostatických účinků a je závislý na době uplynulé po expozici testovanou látkou. Je však akceptovatelný pro suspenzní kultury, kde by jiná detekce toxicity byla obtížná a nepraktická. Jako doplňující informace je možno použít také údaje o kinetice buněčného dělení, jako je průměrný generační čas; ten ovšem představuje celkový průměr, který ne vždy odhalí existenci v dělení zpožděných subpopulací buněk. A tak i malé prodloužení průměrného generačního času může znamenat značný odklon od vhodné doby sklízení z hlediska optimálního výtěžku aberací.
U relativně necytotoxických látek činí maximální koncentrace testované látky nejnižší z hodnot 5 μl/ml, 5 mg/ml nebo 0,01 M.
U relativně nerozpustných látek, jež jsou netoxické v koncentracích nižších než je koncentrace při které se již látka nerozpouští, má být nejvyšší použitá koncentrace vyšší než je mez rozpustnosti ve finálním kultivačním médiu na konci kultivace s testovanou látkou. V některých případech – například dochází-li k toxickému účinku při koncentracích vyšších než je nejnižší nerozpustná koncentrace – se doporučuje testovat při několika koncentracích s viditelným srážením. Může být užitečné vyhodnotit rozpustnost na počátku a na konci působení, protože se během expozice může rozpustnost změnit v testovacím systému vlivem přítomnosti buněk, séra, S9 apod. Nerozpustnost se dá zjistit i prostým okem. Sraženina nesmí být na překážku při hodnocení buněk.

1.4.2.3 Negativní a pozitivní kontroly

Do každého experimentu, ať již s metabolickou aktivací nebo bez ní, je třeba zařadit souběžné pozitivní a negativní kontroly (rozpouštědlo, nebo vehikulum). Pokud se aplikuje metabolická aktivace, musí být pozitivní kontrolou látka vyžadující metabolickou aktivaci k vyvolání mutagenního účinku.

Pro pozitivní kontrolu se používá známý klastogen, a to při expozičních úrovních, kde se očekává, že poskytne reprodukovatelný a detekovatelný nárůst aberací nad pozadí, prokazující citlivost testovacího systému.

Koncentrace pro pozitivní kontrolu je třeba zvolit tak, aby účinek byl zřejmý, ale neodhaloval hodnotiteli přímo identitu zakódovaných preparátů. Mezi látky pro pozitivní kontrolu patří například:

Metabolická aktivace	Látka	CAS	EINECS
Ne	methyl methansulfonát	66-27-3	200-625-0
	ethyl methansulfonát	62-50-0	200-536-7
	ethyl nitrosomočovina	759-73-9	212-072-2
	mitomycin C	50-07-7	200-008-6
	4-nitrochinolin-N-oxid	56-57-5	200-281-1
Ano	benz[a]pyren	50-32-8	200-028-5
Ano	Cyklofosfamid monohydrát cyklofosfamidu	50-18-0 6055-19-2	200-015-4

Pro pozitivní kontrolu se mohou použít i jiné vhodné látky. Tam, kde je to možné, je vhodné použít pro pozitivní kontrolu látku ze stejné chemické skupiny.

Pro každý časový interval sklízení kultur je třeba použít i negativní kontrolu, ve které se používá rozpouštědlo nebo vehikulum v kultivačním médiu, zpracované stejným způsobem jako experimentální kultury. Mimoto je rovněž třeba zařadit kontrolu bez jakéhokoliv ovlivnění.

1.4.3 Postup
1. 1.4.3.1 Expozice testovanou látkou
  Na proliferující buňky se působí testovanou látkou za přítomnosti i nepřítomnosti metabolického aktivačního systému. Na lymfocyty je třeba začít působit asi 48 hodin po stimulaci mitogenem.
  Obvykle se pro každou koncentraci používají dvě kultury; a totéž se doporučuje pro negativní kontroly s rozpouštědlem, nebo vehikulem. Pokud lze na základě historických údajů prokázat, že rozdíly mezi duplicitními kulturami jsou minimální, je přijatelné, aby se pro každou koncentraci použila jenom jedna kultura.⁵)
  V případě plynných nebo těkavých látek je třeba uplatnit v testu vhodné postupy, jako je použití neprodyšně uzavřených kultivačních nádob.
1. 1.4.3.2 Doba sklízení kultury
  V prvním experimentu se buňky vystaví testované látce s metabolickou aktivací i bez ní po dobu 3 – 6 hodin a vzorky se odebírají v čase odpovídajícím zhruba 1,5-násobku normální délky buněčného cyklu od začátku expozice.⁵) Pokud jsou při použití aktivačního systému i bez něho výsledky negativní, provádí se další experiment bez aktivace, s kontinuální expozicí až do doby ukončení kultivace odpovídají zhruba 1,5-násobku normálního buněčného cyklu. Některé látky se hodnotí snáze při době expozice delší než je 1,5-násobek délky buněčného cyklu. Negativní výsledky s metabolickou aktivací se posuzují případ od případu. V případech, kdy se potvrzení negativních výsledků nepokládá za nutné, je třeba toto rozhodnutí zdůvodnit.
1. 1.4.3.3 Příprava chromozómů
  Na buněčné kultury se působí Colcemidem® nebo kolchicinem obvykle po dobu 1 – 3 hodin před ukončením kultivace. Každá buněčná kultura se pro přípravu chromozómů zpracovává zvlášť. Příprava chromozómů sestává z ovlivnění buněk hypotonickým roztokem, fixace a obarvení.
1. 1.4.3.4 Analýza
  Všechny preparáty, včetně pozitivních a negativních kontrol, se před mikroskopickou analýzou nezávisle zakódují. Jelikož fixační postupy často vedou k rozbití určitého podílu metafázických buněk a ztrátě chromozómů, musí být u všech typů buněk počet centromer v hodnocených buňkách roven modálnímu číslu ± 2. Pro každou koncentraci a kontrolu je třeba hodnotit minimálně 200 dobře rozprostřených metafází, stejnoměrně z obou kultur, pokud byly použity.V případě, že je počet aberací vysoký, může se počet analyzovaných metafází snížit.
  I když účelem testu je zjistit strukturální chromozómové aberace, je také důležité zaznamenat případnou polyploidii a endoreduplikaci.

2 ÚDAJE
1. 2.1 Zpracování výsledků
  Jelikož experimentální jednotkou je buňka, je třeba vyhodnotit procento buněk se strukturálními chromozómovými aberacemi. Je třeba registrovat jednotlivé typy strukturálních aberací včetně jejich počtu a četnosti u experimentálních i kontrolních kultur. Gapy se zaznamenávají zvlášť, ale obvykle se do celkové četnosti aberací nezahrnují.
  Současně je třeba v testu zaznamenávat také zjištěnou cytotoxicitu v experimentálních i kontrolních kulturách.
  Udávají se data pro jednotlivé kultury. Nakonec se všechna data uvedou v sumární tabulce.
  Verifikace zjevně pozitivních výsledků se nepožaduje. Nejednoznačné výsledky se objasňují dalším testováním, nebo modifikací experimentálních podmínek. O nutnosti potvrdit negativní výsledky bylo pojednáno v odst. 1.4.3.2. V následných experimentech je třeba zvážit modifikaci použitých parametrů tak, aby se rozšířil rozsah posuzovaných podmínek. K parametrům, které lze modifikovat, patří koncentrační intervaly a podmínky metabolické aktivace.
1. 2.2 Vyhodnocení a interpretace výsledků
  Ke zjišťování pozitivního výsledku se používá několik kritérií, například na koncentraci testované látky závislá frekvence buněk s chromozómovými aberacemi. Nejprve je třeba uvážit biologickou významnost výsledků. Při vyhodnocování výsledků testu se mohou použít statistické metody.⁵) Statistická významnost by však neměla být jediným určujícím faktorem pozitivního výsledku.
  Nárůst počtu polyploidních buněk může indikovat, že testovaná látka má schopnost inhibovat mitotické procesy a vyvolávat numerické chromozómové aberace. Nárůst počtu buněk s endoreduplikovanými chromozómy může naznačovat, že testovaná látka má schopnost inhibovat fáze buněčného cyklu.⁵)
  Testovaná látka, při jejímž použití výsledky nesplňují výše uvedená kritéria, se v tomto systému považuje za nemutagenní.
  Ačkoliv většina experimentů vykazuje jasně pozitivní, nebo negativní výsledky, ve výjimečných případech získaná data nedovolují jednoznačné posouzení účinku testované látky. Výsledky mohou být nejisté, nebo diskutabilní bez ohledu na počet opakovaných experimentů. Pozitivní výsledky testu na chromozómové aberace in vitro ukazují, že testovaná látka vyvolává v kultuře savčích somatických buněk strukturální chromozómové aberace. Negativní výsledky ukazují, že za daných experimentálních podmínek testovaná látka v kultuře savčích somatických buněk chromozómové aberace nevyvolává.

3 PROJEKT POKUSU, PROTOKOL POKUSU A ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA
V souladu se s příslušnými právními předpisy⁹) musí být zpracován projekt pokusu a o průběhu pokusu je nutno vést protokol.
1. Ve zprávě o průběhu pokusu je třeba uvést tyto informace:
  1. Rozpouštědlo/ vehikulum:
    1. - zdůvodnění volby rozpouštědla/vehikula
    2. - rozpustnost a stabilita testované látky v rozpouštědle/vehikulu, pokud je známa.
  1. Buňky:
    1. Podmínky pokusu:
      1. Výsledky:
        - známky toxicity, tj. stupeň konfluence, údaje o buněčném cyklu, o počtu buněk,
        - známky srážení,
        - údaje o pH a osmolalitě expozičního média, pokud byly stanoveny,
        - definice aberací, včetně gapů,
        - počet buněk s chromosomovými aberacemi a typy aberací zvlášť pro každou exponovanou a kontrolní kulturu,
        - změny ploidie, pokud byly pozorovány,
        - podle možnosti závislost odpovědi na dávce,
        - případné statistické analýzy,
        - data o souběžné negativní (rozpouštědlo/vehikulum) a pozitivní kontrole,
        - dosavadní data o negativní (rozpouštědlo/vehikulum) a pozitivní kontrole s rozpětími, středními hodnotami a směrodatnými odchylkami.
Diskuse výsledků.
Závěry.

B.11 MUTAGENITA - TEST CHROMOZOMOVÝCH ABERACÍ V KOSTNÍ DŘENI SAVCŮ IN VIVO

1 METODA je v souladu s právem Evropských společenství.⁵)

1.1 Úvod
Účelem analýzy chromozómových aberací u savců in vivo je zjistit strukturální chromozómové aberace vyvolané testovanou látkou v buňkách kostní dřeně zvířat, obvykle hlodavců.⁵) Strukturální aberace mohou být dvojího druhu: chromozómové a chromatidové. Nárůst polyploidie může naznačovat, že daná chemická látka je schopna vyvolávat numerické aberace. Aberace vyvolané chemickými mutageny jsou většinou chromatidové, ovšem k aberacím chromozómového typu dochází rovněž. Chromozómové mutace a příbuzné jevy jsou příčinou řady genetických chorob u člověka a existují přesvědčivé doklady toho, že chromozómové mutace a příbuzné jevy, jež způsobují změny v onkogenech a tumorsupresorových genech, hrají úlohu při rakovině u člověka a v experimentálních systémech.
K tomuto testu se běžně využívají hlodavci. Cílovou tkání v něm je kostní dřeň, protože se jedná o tkáň vysoce vaskularizovanou, obsahující populaci rychle se dělících buněk, jež se dají snadno izolovat a zpracovat. Jiné živočišné druhy a cílové tkáně se v tomto testu nepoužívají.
Tento test na chromozómové aberace je zvláště důležitý při hodnocení mutagenního rizika, protože umožňuje brát v úvahu faktory metabolismu in vivo, farmakokinetiky a procesů reparace DNA, i když zde mohou být mezi živočišnými druhy a mezi tkáněmi rozdíly. Test in vivo je také vhodný pro další analýzu mutagenního efektu, který byl předtím zjištěn testem in vitro.
Existují-li doklady o tom, že se testovaná látka nebo její reaktivní metabolit do cílové tkáně nedostane, není vhodné použití tohoto testu.

1.2 Definice
Aberace chromatidového typu: strukturální poškození chromozómu, které se projevuje jako zlom jedné, případně obou chromatid, nebo zlom a opětovné spojení mezi chromatidami.
Aberace chromozómového typu: strukturální poškození chromozómu vyjádřená jako zlom respektive jako zlom a opětovné spojení obou chromatid na stejném místě (zahrnuty jsou aberace typu dicentrický chromozóm, prsténčitý chromozóm-ring).
Zlom chromatidy: jako zlom lze hodnotit porušení kontinuity jedné nebo obou chromatid za předpokladu, že vzniklá mezera ve struktuře chromatidy je větší než je šířka poškozené chromatidy. Dále pak v případech, koncový (distální) fragment v místě zlomu je dislokovaný (nebo mimo osu chromatidy), případně jedna chromatida hodnoceného chromozómu je kratší v důsledku delece.
Endoreduplikace: proces, kde po S-fázi replikace DNA nepřechází jádro do mitózy, nýbrž začíná další S-fáze. Výsledkem jsou chromozómy s 4, 8, 16, ... chromatidami.
Gap: achromatická léze menší než šířka jedné chromatidy a s minimálním vybočením chromatid.
Mitotický index: poměr buněk v metafázi dělený celkovým počtem buněk v dané buněčné populaci; udává stupeň proliferace této populace.
Numerická aberace: změna počtu chromozómů oproti normálnímu počtu charakteristickému pro použité buňky.
Polyploidie: násobek haploidního počtu chromozomů (n) mimo diploidní počet (tedy 3n, 4n atd.).
Strukturální aberace: změna chromozómové struktury zjistitelná mikroskopickou analýzou buněčného dělení ve stádiu metafáze, pozorovaná jako delece a fragmenty a výměny.

1.3 Princip metody
Zvířata se vhodným způsobem vystaví testované látce a ve vhodnou dobu po působení se usmrtí. Před usmrcením se na ně působí látkou zastavující metafázi (například kolchicinem nebo Colcemidem®). Z buněk kostní dřeně se pak připraví preparáty a v metafázických buňkách se mikroskopicky zjišťují chromozómové aberace.

1.4 Popis metody

1.4.1 Příprava
1. 1.4.1.1 Výběr živočišného druhu
  Běžně se používají potkani, myši a čínští křečci, lze ovšem použít i jakýkoliv jiný vhodný savčí druh. Používají se běžné laboratorní kmeny mladých zdravých jedinců. Hmotnostní rozdíly by při zahájení studie měly být minimální a u každého pohlaví nemají přesahovat ± 20 % průměrné hmotnosti.
1. 1.4.1.2 Podmínky chovu
  Všeobecné podmínky chovu jsou uvedeny ve Všeobecném úvodu v části B, vlhkost by měla být 50 – 60 %.
1. 1.4.1.3 Příprava zvířat
  Pokusná zvířata jsou vybrána s ohledem na druh, pohlaví, a stáří v souladu s ustanovením § 15 zvláštního právního předpisu¹⁰) a označena tak, aby byla možná identifikace jednotlivých zvířat. Dobu navykání stanoví § 10 zvláštního právního předpisu.¹⁰)
1. 1.4.1.4 Příprava dávek
  Je-li testovaná látka v pevném stavu, před podáním zvířatům se rozpustí nebo se připraví její suspenze ve vhodném rozpouštědle nebo vehikulu a případně se zředí. Kapalné testované látky se mohou podávat přímo nebo se před podáváním ředí. Je třeba používat čerstvé preparáty, ledaže údaje o stálosti prokazují, že skladování ji neovlivní.

1.4.2 Podmínky testu

1.4.2.1 Rozpouštědlo/vehikulum
Rozpouštědlo/vehikulum v používaných dávkách nesmí vyvolávat toxické účinky a nesmí s testovanou látkou chemicky reagovat. Používá-li se ne příliš známé rozpouštědlo, musí být jeho použití podpořeno údaji o kompatibilitě s testovanou látkou. Doporučuje se, aby kde je to možné, bylo na prvním místě použito vodné rozpouštědlo/ vehikulum.

1.4.2.2 Kontroly

Do každého testu je třeba pro každé pohlaví zařadit souběžné pozitivní a negativní (rozpouštědlo/vehikulum) kontroly. Je třeba zacházet se zvířaty ve všech skupinách stejně.

Pozitivní kontroly by měly vyvolávat strukturální aberace in vivo při dávkách, kdy lze očekávat jejich detekovatelné zvýšení nad spontánní úroveň. Dávky při pozitivní kontrole se volí tak, aby byly účinky patrné, ale přitom nenapovídaly hodnotiteli totožnost zakódovaného preparátu. Pozitivní kontrolu je možné podávat odlišným způsobem než testovanou látku a vzorek odebírat v jednom časovém intervalu. Kde je to možné, je třeba používat pozitivní kontrolu ze stejné chemické skupiny, jako je testovaná látka. Příklady látek vhodných pro pozitivní kontrolu:

B.11 MUTAGENITA - TEST CHROMOZOMOVÝCH ABERACÍ V KOSTNÍ DŘENI SAVCŮ IN VIVO
Látka	CAS	EINECS
ethyl methansulfonát	62-50-0	200-536-7
ethyl nitrosomočovina	759-73-9	212-072-2
mitomycin C	50-07-7	200-008-6
cyklofosfamid cyklofosfamid monohydrát	50-18-0 6055-19-2	200-015-4
triethylenmelamin	51-18-3	200-083-5

Negativní kontroly ovlivněné rozpouštědlem nebo vehikulem a zpracované stejným způsobem jako experimentální skupiny měly by být zařazeny do všech časových intervalů zpracování, pokud nejsou k dispozici přijatelné historické údaje o frekvenci chromozómových aberací a o interindividuální variabilitě mezi zvířaty. Aplikuje-li se u negativních kontrol pouze jeden odběr vzorků, je nejvhodnější dobou první interval odběru vzorků. Mimoto je třeba použít i neovlivněných kontrol, ledaže existují historické nebo publikované údaje prokazující, že zvolené rozpouštědlo, nebo vehikulum nevyvolává žádné nepříznivé nebo mutagenní účinky.

1.5 Postup
1. 1.5.1 Počet a pohlaví zvířat
  V každé experimentální a kontrolní skupině musí být minimálně pět analyzovatelných jedinců každého pohlaví. Pokud v době, kdy se studie provádí, existují údaje o stejném živočišném druhu a použití stejných způsobů expozice prokazující, že mezi oběma pohlavími nejsou v toxicitě podstatné rozdíly, je testování pouze na jednom pohlaví postačující. Tam, kde humánní expozice chemickým látkám může být závislá na pohlaví, jak je tomu například u některých farmaceutických přípravků, provádí se test na zvířatech odpovídajícího pohlaví.
1. 1.5.2 Dávkovací schéma
  Testovanou látku je nejvhodnější podávat jednorázově. Pokud se jedná o objemnou dávku, může se k usnadnění aplikace dávka rozdělit, například na dvě dávky za den podané v rozmezí nanejvýše několika hodin. Jiné režimy dávkování musejí být vědecky odůvodněné.
  Vzorky se odebírají ve dvou různých časových intervalech po podání téhož dne. U hlodavců je první interval odběru vzorků 1,5-násobek normální délky buněčného cyklu (která činí obvykle 12 – 18 hodin) po podání látky. Jelikož doba potřebná pro absorpci a metabolismus testované látky a její vliv na kinetiku buněčného cyklu mohou ovlivnit optimální dobu pro detekci chromozómových aberací, doporučuje se další odběr vzorků po 24 hodinách od prvního odběru. Pokud se v daném dávkovacím režimu látka podává vícekrát než jednou za den, je třeba provést jeden odběr vzorků 1,5-násobkem délky normálního buněčného cyklu po posledním podání látky.
  Před usmrcením se zvířatům intraperitoneálně injikuje vhodná dávka Colcemidu® nebo kolchicinu a následně se z nich ve vhodném intervalu odeberou vzorky. U myší je tento interval zhruba 3 – 5 hodin, u čínských křečků zhruba 4 – 5 hodin. Z kostní dřeně se odeberou buňky a zjišťují se v nich chromozómové aberace.
1. 1.5.3 Dávkování
  Provádí-li se studie ke zjištění rozpětí toxicity, protože nejsou k dispozici žádné vhodné údaje, je třeba ji provádět v téže laboratoři za použití stejného živočišného druhu, kmene, pohlaví a pokusného režimu, jaké se použijí v hlavní studii. Při zjištění toxicity, se užívají pro první časový interval odběru vzorků tři dávky tak, aby pokrývaly rozmezí od maximální toxicity k toxicitě nízké nebo nulové. Pro pozdější časový interval odběru vzorků je pak třeba použít jenom nejvyšší dávku. Ta je definována jako dávka vyvolávající takové známky toxicity, že při vyšších dávkách ve stejném režimu podávání by účinky byly letální. Látky, jež v nízkých netoxických dávkách vykazují specifickou biologickou aktivitu, jako jsou hormony nebo mitogeny, mohou představovat z těchto kritérií pro stanovení dávek výjimky, jež se vyhodnocují individuálně případ od případu. Nejvyšší dávka může být také definována jako dávka, která vede k určitým známkám toxicity v kostní dřeni (např. pokles mitotického indexu o více než 50 %).
1. 1.5.4 Limitní test
  Jestliže test při dávce minimálně 2 000 mg/kg hmotnosti v jedné dávce nebo ve dvou dávkách podaných v jeden den nevyvolává žádné pozorovatelné toxické účinky a jestliže se na základě údajů o látkách s podobnou chemickou strukturou neočekává genotoxicita, nemusí být provedena celá studie za použití tří dávkových úrovní. Pro dlouhodobé studie činí limitní dávka 2 000 mg/kg hmotnosti za den při době trvání do 14 dnů, a 1 000 mg/kg hmotnosti při době trvání delší než 14 dnů. Podle očekávané humánní expozice může být zapotřebí použít v limitním testu vyšší dávkové úrovně.
1. 1.5.5 Aplikace látky
  Testovaná látka se obvykle aplikuje buď žaludeční sondou, nebo intraperitoneální injekcí. V odůvodněných případech jsou přijatelné i jiné způsoby expozice. Maximální objem kapaliny, která se dá sondou nebo injekcí najednou vpravit, závisí na velikosti pokusného zvířete a nemá překročit 2 ml/100g hmotnosti; vyšší dávky musí být zdůvodněné. S výjimkou dráždivých nebo žíravých látek, jež normálně vykazují při vyšších koncentracích horší účinky, je třeba upravit koncentrace látky tak, aby objem byl ve všech dávkových úrovních stejný a minimalizovala se tak objemová variabilita.
1. 1.5.6 Příprava chromozómů
  Okamžitě po usmrcení zvířete se odebere kostní dřeň, působí se ni hypotonickým roztokem a dřeň se fixuje. Suspenze buněk se nakape na podložní sklo a obarví se.
1. 1.5.7 Analýza
  Jakožto míra cytotoxicity se u všech zvířat včetně pozitivních i negativních kontrol stanoví mitotický index pro minimálně 1000 buněk z každého jedince.
  Z každého jedince se analyzuje minimálně 100 buněk. Tento počet je možné snížit při vysokém počtu aberací. Všechny preparáty (včetně pozitivních a negativních kontrol) se před mikroskopickou analýzou nezávisle zakódují. Jelikož při jejich přípravě dochází často k porušení určitého podílu metafází spojeného se ztrátou chromozómů, musí být počet centromer v hodnocených buňkách 2n ± 2.

2 ÚDAJE
1. 2.1 Zpracování výsledků
  Údaje od jednotlivých zvířat se zaznamenávají v tabulce. Experimentální jednotkou je jedinec. U každého zvířete se zaznamenává počet hodnocených buněk, počet aberací na jednu buňku a procento buněk se strukturálními chromozómovými aberacemi. U experimentálních i kontrolních skupin se zaznamenají jednotlivé typy strukturálních chromozómových aberací, jejich počet a četnost. Gapy se zaznamenávají zvlášť a registrují se, ale obvykle se do celkové frekvence aberací nezahrnují. Nejsou-li žádné doklady o tom, že obě pohlaví reagují rozdílně, je možné údaje za obě pohlaví pro statistickou analýzu sloučit.
1. 2.2 Vyhodnocení a interpretace výsledků
  Ke zjišťování pozitivního výsledku se používá několik kritérií, například na koncentraci testované látky závislá frekvence buněk s chromozómovými aberacemi, nebo zřetelný nárůst počtu buněk s aberacemi ve skupině s jednorázovou dávkou při jednom časovém intervalu odběru vzorků. Nejprve je třeba uvážit biologickou významnost výsledků. Při vyhodnocování výsledků testu se mohou použít statistické metody. Statistická významnost by však neměla být jediným určujícím faktorem pozitivního výsledku. Nejednoznačné výsledky je třeba vyjasnit dalším testováním, nejlépe za modifikovaných experimentálních podmínek.
  Nárůst počtu polyploidních buněk může indikovat, že testovaná látka má schopnost inhibovat mitotické procesy a vyvolávat numerické chromozómové aberace. Nárůst počtu buněk s endoreduplikovanými chromozómy může naznačovat, že testovaná látka má schopnost inhibovat fáze buněčného cyklu.⁵)
  Testovaná látka, při jejímž použití výsledky nesplňují výše uvedená kritéria, se v tomto systému považuje za nemutagenní.
  Většina experimentů sice poskytuje jednoznačně pozitivní nebo negativní výsledky, v ojedinělých případech však nelze ze získaného souboru dat vyvodit o aktivitě testované látky definitivní závěr. Výsledky mohou být stále nejednoznačné nebo problematické, i když se experiment několikrát opakuje.
  Pozitivní výsledky testu na chromozómové aberace in vivo ukazují, že testovaná látka vyvolává v kostní dřeni příslušného živočišného druhu strukturální chromozómové aberace. Negativní výsledky ukazují, že za daných experimentálních podmínek testovaná látka v kostní dřeni příslušného živočišného druhu chromozómové aberace nevyvolává.
  Je třeba vzít v úvahu, jaká je pravděpodobnost, že testovaná látka bude široce používána, nebo jakou specifickou cílovou tkáň zasáhne (např. systémová toxicita).

3 PROJEKT POKUSU, PROTOKOL POKUSU A ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA
V souladu se s příslušnými právními předpisy⁹) musí být zpracován projekt pokusu a o průběhu pokusu je nutno vést protokol.
1. Ve zprávě o průběhu pokusu je třeba uvést tyto informace:
  1. Rozpouštědlo/vehikulum:
    1. - zdůvodnění volby vehikula,
    2. - rozpustnost a stabilita testované látky v rozpouštědle/vehikulu, pokud je známa.
  1. Pokusná zvířata:
    1. - použitý živočišný druh/kmen,
    2. - počet, věk a pohlaví jedinců,
    3. - původ, chovné podmínky, strava apod.,
    4. - hmotnost jednotlivých zvířat na počátku testu, včetně hmotnostního rozpětí, průměrů a směrodatných odchylek pro jednotlivé skupiny.
  1. Podmínky pokusu:
    1. - pozitivní a negativní (vehikulum/rozpouštědlo) kontroly,
    2. - údaje ze studie pro určení rozpětí, byla-li provedena,
    3. - zdůvodnění volby velikosti dávky,
    4. - podrobnosti o přípravě testované látky,
    5. - podrobnosti o podávání testované látky,
    6. - zdůvodnění způsobu podávání,
    7. - případně metody k ověření, že se látka dostala do celkového oběhu nebo do cílové tkáně,
    8. - případně převod koncentrace látky v potravě/pitné vodě (ppm) na skutečnou dávku (mg/kg hmotnosti/den),
    9. - podrobnosti o kvalitě potravy a vody,
    10. - podrobný popis podávání testované látky a odběru vzorků,
    11. - metody hodnocení toxicity,
    12. - látka zastavující metafázi, její koncentrace a doba aplikace,
    13. - metody přípravy mikroskopických preparátů
    14. - kritéria pro hodnocení aberací,
    15. - počet analyzovaných buněk na jedno zvíře,
    16. - kritéria, jimiž se studie hodnotí jako pozitivní, negativní nebo nejednoznačná.
  1. Výsledky:
    1. - známky toxicity,
    2. - mitotický index,
    3. - typ a počet aberací pro každého jedince zvlášť,
    4. - celkový počet aberací v dané skupině, jejich průměr a směrodatná odchylka,
    5. - počet buněk s aberacemi ve skupině se středními hodnotami a směrodatnými odchylkami,
    6. - případné změny ploidie,
    7. - vztah dávka-účinek, je-li to možné,
    8. - statistické analýzy, byly-li provedeny,
    9. - údaje ze souběžných negativních kontrol,
    10. - historické údaje z negativních kontrol včetně rozpětí, průměrů a směrodatných odchylek.
    11. - údaje ze souběžných pozitivních kontrol.
Diskuse výsledků.
Závěry.

B.12 MUTAGENITA - IN VIVO MIKRONUKLEUS TEST V SAVČÍCH ERYTROCYTECH

1 METODA je v souladu s právem Evropských společenství.⁵)

1.1 Úvod
Mikronukleus test in vivo u savců slouží ke zjištění poškození, jež testovaná látka způsobuje v chromozómech nebo v mitotickém aparátu erytroblastů; test spočívá v tom, že se analyzují erytrocyty z kostní dřeně nebo z periferní krve zvířat, obvykle hlodavců.
Účelem mikronukleus testu je zjistit látky, jež způsobují cytogenetické poškození, jehož výsledkem je vznik mikrojader představujících chromozómové fragmenty nebo celých chromozómů.
Když z erytroblastu kostní dřeně vznikne polychromatický erytrocyt, jádro je z buňky vyloučeno; případně zbude v cytoplasmě vzniklé mikrojádro. Vizualizace mikrojádra je usnadněna tím, že těmto buňkám jádro chybí. Nárůst četnosti polychromních erytrocytů s mikrojádry je u experimentálních zvířat důkazem poškození chromozómů.
V tomto testu se kostní dřeň hlodavců používá běžně proto, že se polychromní erytrocyty v této tkáni tvoří. Analýza nezralých (polychromních) erytrocytů s mikrojádry v periferní krvi je použitelná u každého živočišného druhu, u kterého bylo prokázáno, že jeho slezina nedokáže erytrocyty s mikrojádry odstraňovat nebo že je tento živočišný druh dostatečně citlivý pro detekci látek způsobujících strukturální nebo numerické chromozómové aberace. Mikrojádra se dají rozlišovat podle řady kritérií, jako je přítomnost či nepřítomnost kinetochoru (centromery), nebo centromerické DNA v mikrojádru. Konečným cílem je stanovení četnosti nezralých (polychromních) erytrocytů s mikrojádry. Také počet zralých (normochromních) erytrocytů v periferní krvi obsahujících mikrojádra v rámci daného počtu zralých erytrocytů lze jako základní hodnotu použít v případě, že se zvířata testují po dobu minimálně čtyř týdnů.
Tento in vivo mikronukleus test u savců je zvláště vhodný k hodnocení rizika mutagenity protože umožňuje zohlednit faktory metabolismu in vivo, farmakokinetiky a procesů reparace DNA, i když zde mohou být mezi živočišnými druhy, mezi tkáněmi a mezi konečným efektem rozdíly. Test in vivo je také užitečný pro další výzkum mutagenního efektu, který byl předtím zjištěn v systému in vitro.
Existují-li doklady o tom, že se testovaná látka nebo její reaktivní metabolit do cílové tkáně nedostane, není použití tohoto testu vhodné.

1.2 Definice
Centromera (kinetochor): oblasti chromozómů, se kterými se během dělení pojí vlákna dělícího vřeténka umožňující organizovaný pohyb dceřiných chromozómů k pólům dceřiných buněk.
Mikrojádro (mikronukleus): malá jádra oddělená od jádra buňky (nucleus) vytvářená během telofáze mitózy, nebo meiózy reprezentovaná opožďujícími se fragmenty chromozómů nebo celými chromozómy.
Normochromní erytrocyt: zralý erytrocyt, jemuž chybějí ribozómy a jenž se dá od nezralých, polychromních erytrocytů odlišit pomocí barviva selektivního pro ribozómy.
Polychromní erytrocyt: nezralý erytrocyt, vývojové stádium, kdy jsou dosud přítomny ribozómy, takže jej lze odlišit od zralých, normochromních erytrocytů pomocí barviva selektivního pro ribozómy.

1.3 Princip metody
Zvířata jsou vhodným způsobem exponována testované látce. Pokud se používá kostní dřeň, zvířata se ve vhodnou dobu po působení látky usmrtí, kostní dřeň se isoluje a připraví se preparáty, jež se obarví (1-7). Pokud se používá periferní krev, odebere se ve vhodné době po působení látky a připraví se nátěry, jež se obarví.⁵) V experimentech, ve kterých se používá periferní krev musí být doba od poslední expozice do zpracování buněk co nejkratší. V preparátech se zjišťuje přítomnost mikrojader.

1.4 Popis metody

1.4.1 Příprava
1. 1.4.1.1 Výběr živočišného druhu
  Pokud se používá kostní dřeň, doporučují se jako pokusná zvířata myši nebo potkani; může však být použit jiný vhodný savčí druh. Používá-li se periferní krev, doporučují se myši. Lze ovšem použít jakýkoliv vhodný savčí druh za předpokladu, že se u něj slezinou neodstraňují erytrocyty s mikrojádry nebo že u něj byla prokázána dostatečná citlivost vůči látkám, jež způsobují strukturální nebo numerické chromozómové aberace. Používají se běžné laboratorní kmeny mladých zdravých jedinců. Hmotnostní rozdíly by při zahájení studie měly být minimální a u každého pohlaví nemají přesahovat ± 20 % průměrné hmotnosti.
1. 1.4.1.2 Podmínky chovu
  Všeobecné podmínky chovu jsou uvedeny ve Všeobecném úvodu.
  Vlhkost by měla být 50 – 60 %.
1. 1.4.1.3 Příprava zvířat
  Zdraví mladí dospělí jedinci se náhodně rozdělí do kontrolní a experimentální skupiny. Jedinci se jednoznačně označí a po dobu minimálně pěti dní se zvířata aklimatizují v laboratorních podmínkách. Klece je třeba uspořádat tak, aby se minimalizovaly případné vlivy toho, jak a kde jsou klece umístěny.
1. 1.4.1.4 Příprava dávek
  Je-li testovaná látka v pevném stavu a je-li to možné, látka se před podáním zvířatům rozpustí nebo se připraví její suspenze ve vhodném rozpouštědle nebo vehikulu. Kapalné testované látky se mohou podávat přímo nebo se před podáváním ředí. Je třeba používat čerstvé preparáty, ledaže údaje o stálosti (stabilitě) prokazují, že skladování ji neovlivní.

1.4.2 Podmínky testu

1.4.2.1 Rozpouštědlo / vehikulum
Rozpouštědlo / vehikulum v používaných dávkách nesmí vyvolávat toxické účinky a nesmí s testovanou látkou chemicky reagovat. Používá-li se nepříliš známé rozpouštědlo, musí být jeho použití podpořeno údaji o kompatibilitě s testovanou látkou. Doporučuje se, aby kde je to možné, bylo na prvním místě použito vodné rozpouštědlo / vehikulum.

1.4.2.2 Kontroly

Do každého testu je třeba pro každé pohlaví zařadit souběžné pozitivní a negativní (rozpouštědlo/vehikulum) kontroly. Je třeba zacházet se zvířaty ve všech skupinách stejně.

U pozitivních kontrol by měla být nalezena mikrojádra in vivo při dávkách, kdy lze očekávat jejich detekovatelné zvýšení nad spontánní úroveň. Dávky při pozitivní kontrole se volí tak, aby byly účinky patrné, ale přitom nenapovídaly hodnotiteli totožnost zakódovaného preparátu. Pozitivní kontrolu je možné podávat odlišným způsobem než testovanou látku a vzorek odebírat v jednom časovém intervalu. Kde je to možné, je třeba používat pozitivní kontrolu ze stejné chemické skupiny, jako je testovaná látka. Příklady látek vhodných pro pozitivní kontrolu:

B.11 MUTAGENITA - TEST CHROMOZOMOVÝCH ABERACÍ V KOSTNÍ DŘENI SAVCŮ IN VIVO B.12 MUTAGENITA - IN VIVO MIKRONUKLEUS TEST V SAVČÍCH ERYTROCYTECH
Látka	CAS	EINECS
ethyl methansulfonát	62-50-0	200-536-7
N-ethyl nitrosomočovina	759-73-9	212-072-2
mitomycin C	50-07-7	200-008-6
cyklofosfamid monohydrát cyklofosfamidu	50-18-0 6055-19-2	200-015-4
triethylenmelamin	51-18-3	200-083-5

Negativní kontroly ovlivněné rozpouštědlem nebo vehikulem a zpracované stejným způsobem jako experimentální skupiny měly by být zařazeny do všech časových intervalů zpracování, pokud nejsou k dispozici přijatelné historické údaje o frekvenci buněk s mikrojádry a o interindividuální variabilitě mezi zvířaty. Aplikuje-li se u negativních kontrol pouze jeden odběr vzorků, je nejvhodnější dobou první interval odběru vzorků. Mimoto je třeba použít i neovlivněných kontrol, ledaže existují historické nebo publikované údaje prokazující, že zvolené rozpouštědlo, nebo vehikulum nevyvolává žádné nepříznivé nebo mutagenní účinky.

Používá-li se periferní krev, může být jako souběžná negativní kontrola přijatelný i vzorek odebraný před působením látky, ovšem pouze v rámci krátkodobých studií v periferní krvi (např. 1 – 3 dávky ), kde výsledné údaje leží v očekávaném rozmezí historické kontroly.

1.5 Postup
1.6 Počet a pohlaví zvířat
V každé experimentální a kontrolní skupině musí být minimálně pět analyzovatelných jedinců každého pohlaví.⁵) Pokud v době, kdy se studie provádí, existují údaje o stejném živočišném druhu a použití stejných způsobů expozice prokazující, že mezi oběma pohlavími nejsou v toxicitě podstatné rozdíly, je testování pouze na jednom pohlaví postačující. Tam, kde humánní expozice chemikáliím může být závislá na pohlaví, jak je tomu například u některých farmaceutických přípravků, provádí se test na zvířatech odpovídajícího pohlaví.

1.7 Dávkovací schéma
Nelze jednoznačně doporučit žádný standardní rozvrh (např. jedna, dvě nebo více dávek v 24-hodinových intervalech). Lze použít delší dávkovací schémata, pokud se v daném experimentu neprokáže pozitivní efekt; v případě negativního výsledku tak dlouho, až se prokáže toxicita, nebo byla použita limitní dávka a podávání pokračovalo až do doby odběru vzorků. Pokud se jedná o objemnou dávku testované látky, může se k usnadnění aplikace rozdělit, například na dvě dávky za den podané v rozmezí nanejvýše několika hodin.
1. Test se může provádět dvěma způsoby:
  (a) Na zvířata se testovanou látkou působí jednorázově. Vzorky kostní dřeně se odeberou minimálně dvakrát, poprvé ne dříve než po 24 hodinách a celkově ne později než po 48 hodinách od podání látky, s vhodnými intervaly mezi odběry vzorků. Pokud se vzorky odeberou dříve než po 24 hodinách, musí to být odůvodněné. Vzorky periferní krve se odeberou minimálně dvakrát, poprvé ne dříve než po 36 hodinách od podání látky, se vhodnými intervaly po prvním odběru vzorku, celkově však nikoli déle než 72 hodiny. Pokud se v některém časovém intervalu zjistí pozitivní odpověď, není již další odběr zapotřebí.
  (b) Pokud se látka podává dvakrát nebo vícekrát za den (např. dvě nebo více dávek ve 24-hodinových intervalech), odeberou se vzorky v případě kostní dřeně jednou mezi 18 až 24 hodinami po posledním podání látky a v případě periferní krve jednou mezi 36 a 48 hodinami po posledním podání látky.⁵)
  Je-li to relevantní, mohou se mimoto použít i další odběrové intervaly.

1.8 Dávkování
Provádí-li se studie ke zjištění rozpětí toxicity, protože nejsou k dispozici žádné vhodné údaje, je třeba ji provádět v téže laboratoři za použití stejného živočišného druhu, kmene, pohlaví a pokusného režimu, jaké se použijí v hlavní studii.⁵) Při zjištění toxicity se užívají pro první časový interval odběru vzorků tři dávky tak, aby pokrývaly rozmezí od maximální toxicity k toxicitě nízké, nebo nulové. Pro pozdější časový interval odběru vzorků je pak třeba použít jenom nejvyšší dávku. Ta je definována jako dávka vyvolávající takové známky toxicity, že při vyšších dávkách ve stejném režimu podávání by účinky byly letální Látky, jež v nízkých netoxických dávkách vykazují specifickou biologickou aktivitu, jako jsou hormony nebo mitogeny, mohou představovat výjimky z těchto kritérií pro stanovení dávek a vyhodnocují se případ od případu. Nejvyšší dávka může být také definována jako dávka, která vede k určitým známkám toxicity v kostní dřeni (např. pokles podílu nezralých erytrocytů z celkového počtu erytrocytů v kostní dřeni resp. periferní krvi).

1.9 Limitní test
Jestliže test při dávce minimálně 2000 mg/kg hmotnosti v jedné dávce nebo ve dvou dávkách podaných v jeden den nevyvolává žádné pozorovatelné toxické účinky a jestliže se na základě údajů o látkách s podobnou chemickou strukturou neočekává genotoxicita, nemusí být provedena celá studie za použití tří dávkových úrovní. Pro dlouhodobé studie je limitní dávka 2000 mg/kg hmotnosti za den při době trvání do 14 dnů, a 1000 mg/kg hmotnosti při době trvání delší než 14 dnů. Podle očekávané humánní expozice může být zapotřebí použít v limitním testu dávkové úrovně vyšší.

1.10 Aplikace látky
Testovaná látka se obvykle vpravuje buď žaludeční sondou, nebo intraperitoneální injekcí. V odůvodněných případech mohou být přijatelné i jiné způsoby expozice. Maximální objem kapaliny, která se dá sondou nebo injekcí najednou vpravit, závisí na velikosti pokusného zvířete a nemá překročit 2 ml/100 g hmotnosti; vyšší dávky musí být zdůvodněné. S výjimkou dráždivých nebo žíravých látek, jež normálně vykazují při vyšších koncentracích horší účinky, je třeba upravit koncentrace látky tak, aby objem byl ve všech dávkových úrovních stejný a minimalizovala se tak objemová variabilita.

1.11 Příprava kostní dřeně/krve
Buňky kostní dřeně se obvykle získávají z femuru nebo tibie okamžitě po usmrcení zvířete. Běžným způsobem se kostní dřeň vyjme z femuru nebo tibie, buňky se izolují a obarví zavedenými metodami. Periferní krev se získává z ocasní žíly nebo jiné vhodné cévy. Krevní buňky se okamžitě za vitálního stavu obarví,⁵) nebo se zhotoví nátěry, které se posléze obarví. Použitím barviva specifického pro DNA (např. akridinové oranže⁵) nebo Hoechst 33258 s pyroninem-Y⁵)) se mohou eliminovat některé z artefaktů vznikajících při použití barviva, které není DNA specifické. Tato výhoda neznamená, že by se nedala použít běžná barviva (např. Giemsa). Lze použít i další systémy – například kolony se sloupcem celulózy k odstranění buněk s jádrem⁵) – pokud tyto metody jsou v laboratoři rutinně používány pro analýzu mikrojader.

1.12 Analýza
U každého jedince se stanoví podíl nezralých erytrocytů z celkového počtu erytrocytů (nezralé + zralé). K tomuto účelu se počítá v případě kostní dřeně minimálně 200 erytrocytů a v případě použití periferní krve minimálně 1000 erytrocytů.⁵) Všechny preparáty (včetně pozitivních i negativních kontrol) se před mikroskopickou analýzou nezávisle zakódují. U každého jedince se vyhodnocuje minimálně 2000 nezralých erytrocytů a zaznamená se počet erytrocytů s mikrojádry. Doplňující informace lze získat tak, že se mikrojádra analyzují ve zralých erytrocytech. Při analýze preparátů nemá být podíl nezralých erytrocytů z celkového počtu erytrocytů menší než 20 % hodnoty v kontrole. Pokud jsou zvířata exponována kontinuálně po dobu čtyř týdnů nebo delší, lze také počet mikrojader vyhodnotit z minimálně 2000 zralých erytrocytů na každého jedince. Možnou alternativou k manuálnímu vyhodnocování jsou systémy automatické analýzy (analýza obrazu a průtoková cytometrická analýza - flow cytometry), pokud jsou zdůvodněny a validovány.

2 ÚDAJE
1. 2.1 Zpracování výsledků
  Údaje u jednotlivých zvířat se zaznamenávají do tabulky. Experimentální jednotkou je zvíře. U každého jedince se zvlášť zaznamená počet analyzovaných nezralých erytrocytů, počet nezralých erytrocytů s mikrojádry a podíl nezralých erytrocytů ze všech erytrocytů. Pokud byl test prováděn kontinuálně po dobu čtyř týdnů nebo déle, je třeba uvést také údaje o zralých erytrocytech (pokud byly pořizovány). Podíl nezralých erytrocytů z celkového počtu erytrocytů a případně procento erytrocytů s mikrojádry se udává pro každého jedince. Nejsou-li žádné doklady o tom, že obě pohlaví reagují rozdílně, je možné údaje za obě pohlaví pro statistickou analýzu sloučit.
1. 2.2 Vyhodnocení a interpretace výsledků
  Ke zjišťování pozitivního výsledku se používá několik kritérií, například na koncentraci testované látky závislý nárůst počtu buněk s mikrojádry nebo zřetelný nárůst počtu buněk s mikrojádry ve skupině s jednorázovou dávkou při jednom časovém intervalu odběru vzorků. Nejprve je třeba uvážit biologickou významnost výsledků. Při vyhodnocování výsledků testu se mohou použít statistické metody.⁵) Statistická významnost by však neměla být jediným určujícím faktorem pozitivního výsledku. Nejednoznačné výsledky je třeba vyjasnit dalším testováním, nejlépe za modifikovaných experimentálních podmínek.
  Testovaná látka, při jejímž použití výsledky nesplňují výše uvedená kritéria, se v tomto systému považuje za nemutagenní.
  Většina experimentů sice poskytuje jednoznačně pozitivní nebo negativní výsledky, v ojedinělých případech však nelze ze získaného souboru dat vyvodit o aktivitě testované látky definitivní závěr. Výsledky mohou být stále nejednoznačné nebo problematické, i když se experiment několikrát opakuje.
  Pozitivní výsledky mikronukleus testu ukazují, že látka vyvolává tvorbu mikrojader, jako důsledek chromozómového poškození nebo poškození mitotického aparátu v erytroblastech testovaného zvířecího druhu. Negativní výsledky ukazují, že za daných experimentálních podmínek testovaná látka v kostní dřeni příslušného živočišného druhu nevyvolává vznik mikrojader v nezralých erytrocytech.
  Je třeba uvažovat, jaká je pravděpodobnost, že testovaná látka bude široce používána, nebo jakou specifickou cílovou tkáň zasáhne (např. systémová toxicita).

3 PROJEKT POKUSU, PROTOKOL POKUSU A ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA
V souladu se s příslušnými právními předpisy⁹) musí být zpracován projekt pokusu a o průběhu pokusu je nutno vést protokol.
1. Ve zprávě o průběhu pokusu je třeba uvést tyto informace:
  1. Rozpouštědlo / vehikulum:
    1. Pokusná zvířata:
      1. - použitý živočišný druh/kmen,
      2. - počet, věk a pohlaví jedinců,
      3. - původ, chovné podmínky, strava apod.,
      4. - hmotnost jednotlivých zvířat na počátku testu, včetně hmotnostního rozpětí, průměrů a směrodatných odchylek pro jednotlivé skupiny.
    1. Podmínky pokusu:
      1. - pozitivní a negativní (rozpouštědlo/vehikulum) kontroly,
      2. - údaje ze studie pro určení rozpětí, byla-li provedena,
      3. - zdůvodnění volby velikosti dávky,
      4. - podrobnosti o přípravě testované látky,
      5. - podrobnosti o podávání testované látky,
      6. - zdůvodnění cesty podávání,
      7. - případné metody k ověření, že se látka dostala do celkového oběhu nebo do cílové tkáně,
      8. - případný převod koncentrace látky v potravě/pitné vodě (ppm) na faktickou dávku (mg/kg hmotnosti ),
      9. - podrobnosti o kvalitě potravy a vody,
      10. - podrobný popis podávání testované látky a odběru vzorků,
      11. - metody přípravy mikroskopických preparátů,
      12. - metody měření toxicity,
      13. - kritéria pro hodnocení nezralých erytrocytů s mikrojádry,
      14. - počet analyzovaných buněk u každého jedince,
      15. - kritéria, jimiž se studie hodnotí jako pozitivní, negativní nebo nejednoznačná.
    1. Výsledky:
      1. - známky toxicity,
      2. - podíl počtu nezralých erytrocytů k celkovému počtu erytrocytů,
      3. - počet nezralých erytrocytů s mikrojádry pro každého jedince zvlášť,
      4. - průměrný počet ± směrodatná odchylka nezralých erytrocytů s mikrojádry pro každou skupinu,
      5. - vztah dávka- účinek, je-li to možné,
      6. - použité statistické analýzy a metody,
      7. - údaje ze souběžných a historických negativních kontrol,
      8. - údaje ze souběžných pozitivních kontrol.
Diskuse výsledků.
Závěry.

B.13/14 MUTAGENITA - TEST REVERZNÍCH MUTACÍ U BAKTERIÍ

1 METODA je v souladu s právem Evropských společenství.⁵)
1. 1.1 Úvod
  Při bakteriálním testu reverzních mutací se používají k detekci genových mutací kmeny Salmonella typh imurium (auxotrofní ve vztahu k aminokyselině histidin) a kmeny Escherichia coli (auxotrofní ve vztahu k aminokyselině tryptofan). Pomocí uvedených systémů lze detekovat genové mutace vzniklé mechanismem substituce, adice nebo delece jednoho nebo několika nukleotidů v chromozómu indikátorových bakteriálních kmenů.⁵) Princip bakteriálního testu reverzních mutací spočívá v tom, že se zjišťují mutace, které zpětně vracejí mutace přítomné v testovacím kmenu do původního stavu a obnovuje se funkční schopnost bakterie syntetizovat určitou základní aminokyselinu. Takto změněná bakteriální buňka je detekována na základě své schopnosti růst za nepřítomnosti aminokyseliny, kterou vyžaduje mateřský zkušební kmen.
  Genové mutace jsou u člověka příčinou řady genetických nemocí a existují přesvědčivé doklady toho, že genové mutace v onkogenech a tumorově supresorových genech somatických buněk hrají u člověka a pokusných zvířat roli při vzniku nádorů. Bakteriální test na reverzní mutace je rychlý, levný a relativně jednoduchý. Řada testovacích kmenů se vyznačuje charakteristikami, díky nimž jsou citlivější pro detekci mutací, včetně citlivých sekvencí DNA v místech reverze, zvýšené propustnosti buněk pro velké molekuly a eliminace systémů reparace DNA či posílení takových procesů reparace DNA, jež jsou náchylné k chybám. Specifita testovacích kmenů umožňuje získat některé užitečné informace o typech mutací, jež jsou vyvolány genotoxickými látkami. Pro bakteriální testy reverzních mutací je k dispozici velmi rozsáhlá databáze výsledků pro širokou škálu struktur a byly vypracovány osvědčené metody pro testování chemikálií o různých fyzikálně-chemických vlastnostech, včetně chemikálií těkavých.
1. 1.2 Definice
  Test reverzních mutací s použitím kmenů Salmonella typhi murium nebo Escherichia coli slouží ke zjištění mutací v kmeni závislém na určité aminokyselině (histidinu resp. tryptofanu), jež vedou ke vzniku kmene, který je na dodávce aminokyseliny zvenku nezávislý.
  Mutageny vyvolávající substituci páru bází jsou látky způsobující změnu bází v DNA. Při reverzním testu může k takové změně dojít na místě původní mutace nebo na jiném místě bakteriálního genomu.
  Frameshift mutageny (mutageny vyvolávající posunové mutace) jsou látky, jež způsobují přidání nebo odebrání jednoho nebo více párů bází v DNA, čímž se mění čtecí rámec v RNA.
1. 1.3 Výchozí úvahy
  V bakteriálním testu se využívají prokaryotické buňky, které se od savčích buněk liší v příjmu látek metabolismu, chromozomální struktuře a procesech opravy DNA.
  Testy in vitro obecně vyžadují exogenní zdroj metabolické aktivace. Systémy metabolické aktivace in vitro ovšem nedokáží dokonale imitovat savčí podmínky in vivo, takže test neposkytuje přímé informace o mutagenní a karcinogenní potenci dané látky v organismech savců.
  Bakteriální test reverzních mutací se běžně používá jako prvotní screening genotoxické aktivity a zvláště aktivity vyvolávající genové mutace. Pomocí rozsáhlé databáze se prokázalo, že mnohé chemikálie, které jsou v tomto testu pozitivní, vykazují také v jiných testech mutagenní aktivitu. Existují ovšem i příklady mutagenních látek, jež se tímto testem neodhalí; důvodem tohoto nedostatku může být specifická povaha vyhodnocovaných veličin, rozdíly v metabolické aktivaci nebo rozdíly v biologické dostupnosti. Na druhé straně faktory, jež citlivost bakteriálního testu reverzní mutace zvyšují, mohou vést k tomu, že se mutagenní aktivita testované látky přecení.
  Bakteriální test reverzních mutací může být nevhodný pro určité třídy chemických látek, jakými jsou například některé silně baktericidní sloučeniny (kupříkladu určitá antibiotika) a látky, o nichž se předpokládá nebo ví, že specificky narušují replikační systém savčích buněk (například některé inhibitory topoizomerázy nebo některá analoga nukleozidů); v takovém případě mohou být vhodnější testy na mutace u savců.
  Mnohé sloučeniny, jež jsou při tomto testu pozitivní, jsou skutečně karcinogenní pro savce, ovšem korelace není absolutní; závisí na chemické třídě, a existují karcinogeny, které tímto testem odhaleny nejsou, protože působí jiným, negenotoxickým mechanismem nebo mechanismem, který v bakteriálních buňkách neprobíhá.
1. 1.4 Princip metody
  Suspenze bakteriálních buněk se vystaví působení testované látky za přítomnosti a za nepřítomnosti exogenního systému metabolické aktivace. Při klasické miskové metodě “plate incorporation“ se suspenze smísí s vrchním agarem a vylije na misky s minimální živnou půdou. Při preinkubační metodě se pokusná směs inkubuje a smísí s vrchním agarem a až potom se očkuje na minimální živnou půdu. Při obou metodách se dva až tři dny po inkubaci revertantní kolonie spočítají a výsledek se porovná s počtem spontánně revertujících kolonií na kontrolních miskách s rozpouštědlem.

Následující stránka