Vyhláška, kterou se stanoví základní metody pro zkoušení toxicity chemických látek a chemických přípravků

Příloha č. 1

Seznam základních metod pro zkoušení toxicity chemických látek nebo přípravků

Příloha č. 2

Základní pojmy a metody pro zkoušení toxicity chemických látek nebo chemických přípravků

VŠEOBECNÝ ÚVOD

1. 1 ZÁKLADNÍ POJMY
   1. 1.1 Akutní toxicita
      1. zahrnuje nepříznivé účinky, které se objeví během určité doby (většinou 14 dní) po podání jedné dávky nějaké látky.
   1. 1.2 Zřejmá toxicita
      1. je všeobecný termín popisující jasné příznaky toxicity po aplikaci testované látky. Jsou to příznaky dostačující pro posouzení rizika a měly by být takové, že po zvýšení podávané dávky může být očekáván vznik těžkých toxických příznaků a pravděpodobně i úmrtí.
   1. 1.3 Dávka
      1. je množství podané testované látky. Dávka je vyjádřena jako hmotnost látky (gramy nebo miligramy) nebo jako hmotnost testované látky na jednotku hmotnosti pokusného zvířete (např. miligramy na kilogram tělesné hmotnosti), nebo jako konstantní dietní koncentrace (díly na milión dílů - ppm, nebo miligramy na kilogram potravy).
   1. 1.4 Diskriminační dávka
      1. je nejvyšší ze čtyř pevných dávkových hladin, kterou je možno podat, aniž by způsobila uhynutí (včetně humánního utracení) související s podanou látkou.
   1. 1.5 Dávkování
      1. je všeobecný termín zahrnující dávku, frekvenci a celkovou dobu podávání.
   1. 1.6 LD₅₀ (střední smrtná dávka)
      1. je statisticky vypočtená jednotlivá dávka látky, která pravděpodobně způsobí za definovanou dobu smrt 50 % zvířat, kterým byla podána. Hodnota LD₅₀ se udává jako hmotnost testované látky na jednotku hmotnosti pokusného zvířete (mg.kg^-1 tělesné hmotnosti).
   1. 1.7 LC₅₀ (střední smrtná koncentrace)
      1. je statisticky vypočtená koncentrace látky, která pravděpodobně způsobí smrt do určité doby po expozici u 50 % pokusných zvířat, exponovaných po definovanou dobu. Hodnota LC₅₀ se udává jako hmotnost testované látky ve standardním objemu vzduchu (mg.l^-1).
   1. 1.8 NOAEL
      1. je zkratka pro „No Observed Adverse Effect Level“ a je to nejvyšší dávka nebo expoziční koncentrace látky, při které není pozorován žádný statisticky významný nepříznivý účinek na organismus v porovnání s kontrolní skupinou.
   1. 1.9 LOAEL
      1. je zkratka pro „Lowest Observed Adverse Effect Level“ a je to nejnižší dávka nebo expoziční koncentrace látky, při které je ještě pozorován statisticky významný nepříznivý účinek na organismus v porovnání s kontrolní skupinou.
   1. 1.10 Toxicita po opakované dávce/subchronická toxicita
      1. zahrnuje nepříznivé účinky, které se objeví u pokusných zvířat v důsledku opakovaného denního podávání nebo expozice chemické látce, po dobu představující krátký úsek (desítky dnů) očekávané délky života příslušného živočišného druhu.
   1. 1.11 Nejvyšší tolerovaná dávka (MTD - maximum tolerated dose)
      1. je nejvyšší dávka, která u zvířat vyvolává zřetelné projevy toxicity, avšak bez podstatného vlivu na přežití s ohledem na účinek, který je testován.
   1. 1.12 Kožní dráždivost
      1. je vyvolání zánětlivých změn na kůži po aplikaci testované látky.
   1. 1.13 Oční dráždivost
      1. je vyvolání změn na oku po aplikaci testované látky na povrch oka.
   1. 1.14 Senzibilizace kůže (alergická kontaktní dermatitida)
      1. je imunologicky vyvolaná reakce kůže na testovanou látku.
   1. 1.15 Poleptání kůže
      1. je vyvolání nevratného tkáňového poškození kůže při působení testované látky po dobu od 3 minut do 4 hodin.
   1. 1.16 Toxikokinetika
      1. je studium absorpce, distribuce, metabolismu a exkrece testovaných látek.
   1. 1.17 Absorpce
      1. označuje proces(y), kterým(i) aplikovaná látka vstupuje do těla.
   1. 1.18 Exkrece
      1. označuje proces(y), kterým(i) je aplikovaná látka případně její metabolity odstraňovány z těla.
   1. 1.19 Distribuce
      1. označuje proces(y), kterým(i) je absorbovaná látka případně její metabolity rozdělovány v těle.
   1. 1.20 Metabolismus
      1. označuje proces(y), kterým(i) je chemická struktura aplikované látky měněna v těle enzymatickými nebo neenzymatickými reakcemi.
   1. 1.21 GHS
      1. Globálně harmonizovaný systém klasifikace chemických látek a směsí. Společný projekt Organizace pro hospodářkou spolupráci a rozvoj (lidské zdraví a životní prostředí), Odborného výboru OSN pro přepravu nebezpečného zboží (fyzikálně-chemické vlastnosti) a Mezinárodní organizace práce (informace o nebezpečnosti) koordinovaný Meziorganizačním programem pro řádné nakládání s chemikáliemi (IOMC).
   1. 1.22 Blížící se uhynutí
      1. když je očekáván stav agónie nebo uhynutí před další plánovanou dobou pozorování. Příznaky svědčící o tomto stavu u hlodavců mohou zahrnovat křeče, polohu na boku, polohu vleže a třes.^7a)
   1. 1.23 Limitní dávka
      1. označuje nejvyšší přípustnou dávku (2 000 nebo 5 000 mg/kg).
   1. 1.24 Stav agónie
      1. označuje stav před úhynem nebo neschopnost přežít, ani když je pokusné zvíře léčeno.^7a)
   1. 1.25 Předvídatelný úhyn
      1. přítomnost klinických příznaků svědčících o blížící se smrti, přičemž čas, kdy k úhynu dojde lze předvídat a bude kratší než je doba předpokládaného ukončení pokusu.^7a)
   1. 1.26 Opožděný úhyn
      1. znamená, že pokusné zvíře během 48 h neuhyne ani nejeví známky umírání, ale uhyne později během čtrnáctidenní doby pozorování.

1. 2 AKUTNÍ - OPAKOVANÁ APLIKACE/ SUBCHRONICKÁ A CHRONICKÁ TOXICITA

   Akutní toxické účinky a orgánová nebo systémová toxicita mohou být vyhodnoceny za použití velkého počtu různých testů toxicity (metody B.1 - B.5²)^,3)^,4)), ze kterých může být po jediné aplikaci získán předběžný odhad toxicity.

   V závislosti na toxicitě látky lze zvolit různé postupy od limitního testu až po kompletní stanovení LD₅₀. Pro inhalační studie není limitní test navržen, protože nebylo možné definovat limitní hodnotu jednorázové inhalační expozice.

   Pozornost se věnuje metodám, které využívají co nejmenší počet zvířat a minimalizují utrpení zvířete, například metoda fixní dávky (metoda B.1 bis)²) a metoda stanovení třídy akutní toxicity (metoda B.1 tris)⁴). Při testování na jednom druhu může studie na druhém druhu doplnit závěry vyvozené z první studie. V tomto případě se použije standardní testovací metoda nebo může být použito menšího počtu zvířat.

   Testem toxicity s opakovanou aplikací (metody B.7,⁴) B.8²) a B.9²)) se posuzují toxické účinky vznikající v důsledku opakované expozice. Důležité je klinické pozorování zvířat tak, aby se získalo co nejvíce informací. Tyto testy pomohou zjistit cílové orgány toxicity a toxické a netoxické dávky. Od dlouhodobých studií se vyžaduje zkoumání těchto aspektů do větší hloubky (metody B.26,⁷) B.27,⁷) B.28,¹) B.29,¹) B.30¹) a B.33¹)).

1. 3 MUTAGENITA - GENOTOXICITA

   Mutagenita se vztahuje k indukci trvalých přenosných změn v množství nebo struktuře genetického materiálu buněk nebo organismů. Tyto změny („mutace“) mohou postihnout jediný gen nebo segmenty genů, blok genů nebo celé chromozómy. Účinky na celé chromozómy se mohou projevovat změnou jejich struktury a/nebo počtu.

   Mutagenní aktivita látky se stanoví testy in vitro na genové (bodové) mutace v baktériích (metoda B.13/14)⁵) anebo na strukturální chromozómové aberace v savčích buňkách (metoda B.10)⁵).

   Přijatelné jsou také postupy in vivo, např. micronucleus test (metoda B.12)⁵) nebo analýza metafáze chromozomů kostní dřeně (metoda B.11)⁵). Je však třeba dávat jednoznačně přednost in vitro metodám, pokud nejsou kontraindikovány.

   Pro látky vyráběné ve velkém množství nebo pro stanovení a kontrolu rizika mohou být vyžadovány ještě další studie ke zjištění mutagenity nebo k předběžnému vyšetření na karcinogenitu. Tyto studie lze využít k několika účelům: potvrzení výsledků získaných základním souborem testů; zkoumání účinků nezachycených základním souborem metod; zahájení nebo rozšíření studií in vivo.

   Pro tyto účely zahrnují metody B.15,¹) B.16,¹) B.17,⁵) B.18,¹) B.19,¹) B.20,¹) B.21,¹) B.22,¹) B.23,⁵) B.24¹) a B.25¹) jak eukaryontní systémy in vivo a in vitro, tak rozšiřují rozsah biologických účinků. Tyto testy poskytují informace o bodových mutacích a jiných účincích v organismech složitějších než baktérie používané v základním souboru testů.

   Obecně platí, že další uvažované studie mutagenity je třeba naplánovat tak, aby poskytly relevantní doplňující informace o mutagenním, případně karcinogenním potenciálu testované látky.

   Konkrétní studie, vhodná pro daný případ, bude záviset na četných faktorech, včetně chemické a fyzikální charakteristiky látky, výsledků základních bakteriálních a cytogenetických testů, metabolického profilu látky, výsledků dalších testů toxicity a známých způsobů použití látky.

   Některé všeobecné zásady pro strategii testování jsou stanoveny směrnicí 93/67/EHS.

   Metody pro další výzkum jsou seřazeny níže podle jimi sledovaného hlavního genetického účinku:

   Studie detekující genové (bodové) mutace

   1. a) Studie forward nebo reversních mutací s využitím eukaryotických mikroorganismů (Saccharomyces cerevisiae) (metoda B.15).¹)
   2. b) In vitro test forward mutací v savčích buňkách (metoda B.17).⁵)
   3. c) Test na pohlaví vázané recesivní letální mutace u Drosophila melanogaster (metoda B.20).¹)
   4. d) In vivo test mutací na somatických buňkách, spot test na myších (metoda B.24).¹)

   Studie detekující chromozómové aberace

   1. a) Cytogenetický test na savcích in vivo. Provedení in vivo analýzy metafáze chromózomů buněk kostní dřeně by mělo být zváženo, pokud nebylo zahrnuto do základního vyšetření (metoda B.11).⁵) Další možnost je cytogenetická analýza zárodečných buněk in vivo (metoda B.23).⁵)
   2. b) Cytogenetický test na savčích buňkách in vitro, pokud nebyl zařazen do základního vyšetření (B.10).⁵)