Český lékopis 1997

1. - spektrofotometrického detektoru, 280 nm.

Nastříknou se odděleně oba roztoky a zajistí se, aby stříkačka, kterou se nastřikuje zkoušený roztok, nebyla kontaminována peroxidem. Na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) je pík tetrakosaktidu odpovídající hlavnímu píku na chromatogramu zkoušeného roztoku a pík s menším retenčním časem odpovídající sulfoxidu tetrakosaktidu. Jeho plocha je významně větší než plocha příslušného píku na chromatogramu zkoušeného roztoku, ale není větší než 4 % součtu ploch všech píků, vyjímaje píky rozpouštědla a zkoumadel.

1. b) Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití vrstvy celulosy pro chromatografii R.

   Zkoušený roztok. 3,0 mg zkoušené látky se rozpustí v 1,5 ml směsi stejných objemových dílů kyseliny octové zředěné RS a vody R.

   Porovnávací roztok (a). 0,5 ml zkoušeného roztoku se zředí směsí stejných objemových dílů kyseliny octové zředěné RS a vody R na 10 ml.

   Porovnávací roztok (b). 5 ml porovnávacího roztoku (a) se zředí směsí stejných objemových dílů kyseliny octové zředěné RS a vody R na 10 ml.

   Porovnávací roztok (c). K 0,5 ml zkoušeného roztoku se přidá 50 μl směsi objemových dílů peroxidu vodíku koncentrovaného R a vody R (1 + 999) a nechá se 2 h stát.

   Na vrstvu se nanese odděleně po 10 μl každého roztoku do asi 1 cm pruhů a vyvíjí se směsí objemových dílů kyseliny octové ledové R, pyridinu R, vody R a 1-butanolu R (4 + 24 + 30 + 42) po dráze 15 cm. Vrstva se usuší v proudu vzduchu a postříká se ninhydrinem RS1. Na chromatogramu porovnávacího roztoku (c) je zóna odpovídající polohou základní zóně na chromatogramu zkoušeného roztoku, ale má menší intenzitu a navíc je přítomna výrazná zóna sulfoxidu tetrakosaktidu s nižším R_F. Na chromatogramu zkoušeného roztoku není, kromě základní zóny, žádná zóna ani zóna sulfoxidu tetrakosidu intenzivnější než zóna na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) (5,0 %) a nejvýš jedna zóna může být intenzivnější než zóna na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) (2,5 %).

   Peptidy. Nejméně 85,0 %, vztaženo na C₁₃₆H₂₁₀N₄₀O₃₁S, počítáno na bezvodou látku prostou kyseliny octové. Vyhodnotí se chromatogramy získané ve zkoušce (a) na příbuzné peptidy. Obsah C₁₃₆H₂₁₀N₄₀O₃₁S se vypočítá z výšek píků nebo jejich ploch na chromatogramu zkoušeného roztoku a porovnávacího roztoku (b) a známého množství C₁₃₆H₂₁₀N₄₀O₃₁S v tetrakosaktidu CRL. Zkoušku lze hodnotit, jestliže na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) není rozlišení mezi píky tetrakosaktidu a sulfoxidu tetrakosaktidu menší než 7.

   Kyselina octová. 8 % až 13 %. Stanoví se plynovou chromatografií (2.2.28) za použití dioxanu R jako vnitřního standardu.

   Roztok vnitřního standardu. 1 ml dioxanu R se zředí vodou R na 1000 ml.

   Zkoušený roztok (a). 10,0 mg zkoušené látky se rozpustí v 1 ml vody R.

   Zkoušený roztok (b). 10,0 mg zkoušené látky se rozpustí v 1 ml roztoku vnitřního standardu. Porovnávací roztok. 0,100 g kyseliny octové ledové R se rozpustí v roztoku vnitřního standardu a zředí jím na 100 ml.

   Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

   1. - skleněné kolony délky 2 m a vnitřního průměru 2 mm naplněné ethylvinylbenzendivinylbenzen kopolymerem R (125 μm až 180 μm),
   2. - dusíku pro chromatografii R jako nosného plynu,
   3. - plamenoionizačního detektoru.

   Teplota kolony se udržuje na 150 °C.

   Voda, semimikrostanovení (2.5.12). 5 % až 16 %; provede se s 80,0 mg zkoušené látky.

Stanovení účinnosti

Účinnost zkoušené látky se stanoví za daných podmínek porovnáním její schopnosti zvyšovat množství kortikosteronu produkovaného izolovanými buňkami z nadledvin potkanů s účinností mezinárodního referenčního přípravku tetrakosaktidu nebo porovnávací látky kalibrované v mezinárodních jednotkách.

Mezinárodní jednotka je účinnost obsažená v deklarovaném množství mezinárodního referenčního přípravku, který se skládá ze syntetického tetrakosaktidu a manitolu. Hodnotu účinnosti mezinárodního referenčního přípravku v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Světová zdravotnická organizace.

Nalezená hodnota účinnosti je v rozmezí 80 % až 125 % deklarované účinnosti. Interval spolehlivosti (P = 0,95) stanovené účinnosti je v rozmezí 64 % až 156 % deklarované účinnosti.

Použije se silikonované sklo dobře vymyté vodou. Čtyři potkani, samci vážící 200 g až 400 g, se usmrtí vykrvácením. Vyjmou se nadledviny, opatrně se očistí od okolní tukové tkáně a vloží se do roztoku B uchovávaného při 4 °C. Každá žláza se rozkrojí na čtyři stejné díly a přenese do vhodného míchacího zařízení z plastické hmoty (viz obrázek 1), ve kterém je 5 ml roztoku C udržovaného při 37 °C. Buňky nadledvin se dispergují mícháním směsi při 500 ot/min. Po 20 min se odstraní supernatantní tekutina, ochladí se na 4 °C, přidá se 5 ml roztoku C a znovu se míchá. Tento postup se opakuje ještě třikrát. Všech pět supernatantů se spojí a odstřeďuje 30 min v polyetylenových zkumavkách při 4 °C 30 min při postupném zvyšování rychlosti do 100 g_n. Sediment se suspenduje v 8 ml roztoku D a odstřeďuje se 30 min při 100 g_n. Získaný sediment se znovu suspenduje v 8 ml roztoku D, směs se filtruje přes nylonovou síťku s otvory 100 μm do polyetylenové kádinky a k filtrátu se přidá vhodný objem roztoku D (bylo zjištěno, že vhodný celkový objem filtrátu je mezi 65 ml až 105 ml). Výsledná buněčná suspenze se uchovává při 4 °C.

Obr. 1. Míchací zařízení

Rozměry v milimetrech

A - kladka a míchací lopatka,

B - ložisko,

C - inkubační roztok.

Ze zkoušeného roztoku o vhodné koncentraci a z porovnávacího roztoku se připraví s ředicím roztokem E čtyři koncentrace v geometrické řadě s dvojnásobným ředěním. 0,1 ml z každého zředění se pipetuje do čtyř polystyrenových zkumavek a do každé zkumavky se přidá 1,0 ml výše připravené buněčné suspenze. Zkumavky se inkubují 2 h při 37 °C a pak se ochladí na 4 °C. 1 ml obsahu každé zkumavky se přenese do skleněných zkumavek obsahujících 1,4 ml dichlormethanu, R, směs se promíchá 10 s na vířivé míchačce a odstřeďuje se 5 min při 3000 gn 1 ml dichlormethanové vrstvy z každé zkumavky se přenese, bez porušení vodné vrstvy, do skleněných zkumavek obsahujících 0,6 ml směsi objemových dílů lihu 96% R a kyseliny sírové R (15 + 35). Směs se 10 s míchá na vířivé míchačce, odstřeďuje se 5 min při 1500 gn a nechá se 30 min stát. Fluorimetricky (2.2.21) se stanoví iradiace spodní vrstvy při excitační vlnové délce 436 nm nebo 470 nm a fluorescence se měří v maximu mezi 530 nm a 545 nm. Jestliže roztoky nejsou při měření přeneseny do kyvet, je nutné vybrat zkumavky, v nichž fluorescenční hodnoty pro standard kortikosteronu se neliší mezi sebou více než o 5 %. Výsledky stanovení se počítají obvyklými statistickými metodami. Použije se lineární část logaritmické křivky odpovědi na dávce.

Roztok B. K roztoku A se přidá glukosa R (2 g/l).

Roztok C. K roztoku B se přidá kolagenasa získaná z Clostridium histolyticum a dostatečně čistá pro přípravu dispergovaných buněk (1 g/l).

Roztok D. K roztoku B se přidá albumin hovězí R (5 g/l).

Roztok E. Ke sterilnímu roztoku chloridu sodného R (9 g/l) se přidá albumin hovězí R (1 g/l) a pH roztoku se upraví kyselinou chlorovodíkovou 1 mol/l RS na 2,0.

Uchovávání

Pod dusíkem, chráněn před světlem, při teplotě 2 C až 8 C.

Separandum.

Označování

V označení na obalu se uvede:

1. - účinnost v mezinárodních jednotkách na miligram,
2. - obsah peptidu v balení,
3. - podmínky uchovávání.

† Tetracyclini hydrochloridum

Tetracykliniumchlorid

Synonymum. Tetracyclinium chloratum

Vlastnosti

Žlutý krystalický prášek. Je dobře rozpustný ve vodě, těžce rozpustný v lihu 96%, prakticky nerozpustný v acetonu a v etheru. Rozpouští se v roztocích alkalických hydroxidů a uhličitanů. Vodné roztoky se stáním kalí vlivem vysrážení tetracyklinu.

Zkoušky totožnosti

1. A. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití vrstvy silikagelu H R. Vrstva se stejnoměrně postříká roztokem edetanu disodného R (100 g/l), jehož pH bylo upraveno hydroxidem sodným koncentrovaným RS na hodnotu 8,0, (asi 10 ml na desku rozměrů 100 mm x 200 mm). Vrstva se suší nejméně 1 h ve vodorovné poloze. Před použitím se vrstva 1 h zahřívá v sušárně při 110 °C.

   Zkoušený roztok. 5 mg se rozpustí v methanolu R a zředí se jím na 10 ml.

   Porovnávací roztok (a). 5 mg tetracykliniumchloridu CRL se rozpustí v methanolu R a zředí se jím na 10 ml.

   Porovnávací roztok (b). 5 mg tetracykliniumchloridu CRL, 5 mg chlortetracykliniumchloridu- CRL a 5 mg doxycykliniumhyklatu CRL se rozpustí v methanolu R a zředí se jím na 10 ml.

   Na vrstvu se nanese odděleně po 1 μl každého roztoku a vyvíjí se směsí objemových dílů vody R, methanolu R a dichlormethanu R (6 + 35 + 59) po dráze 15 cm. Vrstva se usuší v proudu vzduchu a pozoruje se v ultrafialovém světle při 365 nm. Hlavní skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku odpovídá polohou, barvou a velikostí hlavní skvrně na chromatogramu porovnávacího roztoku (a). Zkoušku lze hodnotit, jestliže na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) jsou tři zřetelně od sebe oddělené skvrny.

1. B. K asi 2 mg látky se přidá 5 ml kyseliny sírové R; vzniká fialově červené zbarvení. Roztok se přidá k 2,5 ml vody R; zbarvení se změní ve žluté.
2. C. Vyhovuje zkoušce (a) na chloridy (2.3.1).

Zkoušky na čistotu

Hodnota pH (2.2.3). 1,8 až 2,8. Měří se následující roztok: 0,1 g se rozpustí v 10 ml vody prosté oxidu uhličitého R.

Specifická optická otáčivost (2.2.7). -240° až -255°, počítáno na vysušenou látku. Měří se roztok připravený rozpuštěním 0,250 g v kyselině chlorovodíkové 0,1 mol/l RS a zředěním stejnou kyselinou na 25,0 ml.

Příbuzné látky. Stanoví se kapalinovou chromatografií (2.2.29) způsobem popsaným ve Stanovení obsahu. Nastříkne se porovnávací roztok (g). Zkoušku lze hodnotit, jestliže pík odpovídající anhydrotetracyklinu má poměr signálu k šumu nejméně 3. Nastříkne se zkoušený roztok a porovnávací roztok (f). Na chromatogramu zkoušeného roztoku plocha žádného píku odpovídajícího 4-epitetracyklinu, anhydrotetracyklinu nebo 4-epianhydrotetracyklinu není větší než plocha odpovídajícího píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (f) (3,0 %, 0,5 %, 0,5 %); plocha žádného píku v sestupné části hlavního píku není větší než 50,0 % plochy píku 4-epitetracyklinu na chromatogramu porovnávacího roztoku (f) (1,5 %).

Těžké kovy (2.4.8). 0,5 g vyhovuje limitní zkoušce C na těžké kovy (50 μg/g). K přípravě porovnávacího roztoku se použije 2,5 ml základního roztoku olova (10 μg Pb/ml).

Ztráta sušením (2.2.32). Nejvýše 2,0 %; 1,000 g se suší 3 h při 60 °C nad oxidem fosforečným R při tlaku nepřekračujícím 670 Pa.

Síranový popel (2.4.14). Nejvýše 0,5 %; stanoví se s 1,00 g zkoušené látky.

Sterilita (2.6.1). Pokud je látka určena k výrobě parenterálních přípravků bez dalšího vhodného sterilizaěního postupu, vyhovuje zkoušce na sterilitu.

Bakteriální endotoxiny (2.6.14). Pokud je látka určena k výrobě parenterálních přípravků bez dalšího vhodného postupu odstraňujícího bakteriální endotoxiny, vyhovuje zkoušce na bakteriální endotoxiny, obsahuje-li nejvýše 0,5 m.j. endotoxinu v miligramu.

Stanovení obsahu

Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29).

Zkoušený roztok. 25,0 mg se rozpustí v kyselině chlorovodíkové 0,01 mol/l RS a zředí se jí na 25,0 ml.

Porovnávací roztok (a). 25,0 mg tetracykliniumchloridu CRL se rozpustí v kyselině chlorovodíkové 0,01 mol/l RS a zředí se jí na 25,0 ml.

Porovnávací roztok (b). 15,0 mg 4-epitetracykliniumchloridu CRL se rozpustí v kyselině chlorovodíkové 0,01 mol/l RS a zředí se jí na 50,0 ml.

Porovnávací roztok (c). 10,0 mg anhydrotetracykliniumchloridu CRL se rozpustí v kyselině chlorovodíkové 0,01 mol/l RS a zředí se jí na 100,0 ml.

Porovnávací roztok (d). 10,0 mg 4-epianhydrotetracykliniumchloridu CRL se rozpustí v kyselině chlorovodíkové 0,01 mol/l RS a zředí se jí na 50,0 ml.

Porovnávací roztok (e). Smíchá se 1,0 ml porovnávacího roztoku (a), 2,0 ml porovnávacího roztoku (b) a 5,0 ml porovnávacího roztoku (d) a směs se zředí kyselinou chlorovodíkovou 0,01 mol/l RS na 25,0 ml.

Porovnávací roztok (f). Smíchá se 20,0 ml porovnávacího roztoku (b), 10,0 ml porovnávacího roztoku (c) a 5,0 ml porovnávacího roztoku (d) a směs se zředí kyselinou chlorovodíkovou 0,01 mol/l RS na 200,0 ml.

Porovnávací roztok (g). 1,0 ml porovnávacího roztoku (c) se zředí kyselinou chlorovodíkovou 0,01 mol/l RS na 50,0 ml.

Chromatografícký postup se obvykle provádí za použití:

1. - kolony délky 0,25 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné styrendivinylbenzen-kopolymerem R (8 pra až 10 μm),
2. - mobilní fáze, která je směsí připravenou následujícím způsobem: naváží se 80,0 g terc.butanolu R a přenese se do odměrné baňky na 1000 ml za pomoci 200 ml vody R. Přidá se 100 ml roztoku hydrogenfosforečnanu draselného R (35 g/l), jehož pH bylo upraveno kyselinou fosforečnou RS na hodnotu 9,0, 200 ml roztoku tetrabutylamoniumhydrogensulfatu R (10 g/l), jehož pH bylo upraveno hydroxidem sodným RS na 9,0, a 10 ml roztoku edetanu disodného R (40 g/l), jehož pH bylo upraveno hydroxidem sodným RS na hodnotu 9,0, a zředí se vodou R na 1000,0 ml. Průtoková rychlost je 1,0 ml/min,
3. - spektrofotometrického detektoru, 254 nm,
4. - pevné injektorové smyčky, 20 μl.

Teplota kolony se udržuje na 60 °C. Nastříkne se porovnávací roztok (e). Nastaví se citlivost detektoru tak, aby výška píků nebyla menší než 50 % celé stupnice zapisovače. Zkoušku lze hodnotit, jestliže na chromatogramu není rozlišení mezi prvním píkem (4-epitetracyklin) a druhým píkem (tetracyklin) menší než 2,5 a rozlišení mezi druhým píkem a třetím píkem (4-epianhydrotetracyklin) není menší než 8,0. Podle potřeby se přizpůsobí koncentrace terc.butanolu R v mobilní fázi. Zkoušku lze hodnotit, je-li faktor symetrie druhého píku nejvýše 1,25. Nastříkne se šestkrát porovnávací roztok (a). Zkoušku lze hodnotit, je-li relativní směrodatná odchylka plochy píku tetracyklinu nejvýše 1 %. Podle potřeby se nastaví integrátor. Zkoušený roztok a porovnávací roztok (a) se vstřikuje střídavě.

Obsah tetracykliniumchloridu se vypočítá v procentech.

Uchovávání

Ve vduchotěsných obalech, chráněn před světlem. Je-li látka sterilní, uchovává se ve sterilních vzduchotěsných zabezpečených obalech.

Separandum.

Označování

V označení na obalu se uvede, zda je látka:

1. - sterilní,
2. - prostá bakteriálních endotoxinů.

Nečistoty

1. A. R¹ = N(CH₃)₂; R² = H; R³ = NH₂: 4-epitetracyklin,
2. B. R¹ = H; R² = N(CH₃)₂; R³ = CH₃: 2-acetyl-2-dikarboxamidotetracyklin,

1. C. R¹ = H; R² = N(CH₃)₂: anhydrotetracyklin,
2. D. R¹ = N(CH₃)₂; R² = H: 4-epianhydrotetracyklin.

† Tetracyclinum

Tetracyklin

Vlastnosti

Žlutý krystalický prášek. Je velmi těžce rozpustný ve vodě, dobře rozpustný v lihu 96% a methanolu, mírně rozpustný v acetonu, prakticky nerozpustný v etheru. Rozpouští se ve zředěných kyselých a alkalických roztocích.

Zkoušky totožnosti

1. A. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití vrstvy silikagelu H R. Vrstva se stejnoměrně postříká roztokem edetanu disodného R (100 g/l), jehož pH bylo upraveno hydroxidem sodným koncentrovaným RS na hodnotu 8,0, (asi 10 ml na desku rozměrů 100 mm x 200 mm). Vrstva se suší nejméně 1 h ve vodorovné poloze. Před použitím se vrstva 1 h zahřívá v sušárně při 110 °C.

   Zkoušený roztok. 5 mg se rozpustí v methanolu R a zředí se jím na 10 ml.

   Porovnávací roztok (a). 5 mg tetracykliniumchloridu CRL se rozpustí v methanolu R a zředí se jím na 10 ml.

   Porovnávací roztok (b). 5 mg tetracykliniumchloridu CRL, 5 mg chlortetracykliniumchloridu CRL a 5 mg doxycykliniumhyklatu CRL se rozpustí v methanolu R a zředí se jím na 10 ml.

   Na vrstvu se nanese odděleně po 1 μl každého roztoku a vyvíjí se směsí objemových dílů vody R, methanolu R a dichlormethanu R (6 + 35 + 59) po dráze 15 cm. Vrstva se usuší v proudu vzduchu a pozoruje se v ultrafialovém světle při 365 nm. Hlavní skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku odpovídá polohou, barvou a velikostí hlavní skvrně na chromatogramu porovnávacího roztoku (a). Zkoušku lze hodnotit, jestliže na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) jsou tři zřetelně oddělené skvrny.

1. B. K asi 2 mg látky se přidá 5 ml kyseliny sírové R; vzniká fialově červené zbarvení. Roztok se přidá k 2,5 ml vody R; zbarvení se změní ve žluté.
2. C. Asi 10 mg látky se rozpustí ve směsi 1 ml kyseliny dusičné zředěné RS a 5 ml vody R. Protřepe se a přidá se 1 ml dusičnanu stříbrného RS2. Opalescence roztoku není intenzivnější než opalescence směsi 1 ml kyseliny dusičné zředěné RS, 5 ml vody R a 1 ml dusičnanu stříbrného RS2.

Zkoušky na čistotu

Hodnota pH (2.2.3). 3,5 až 6,0; měří se suspenze 0,1 g zkoušené látky v 10 ml vody prosté oxidu uhličitého R.

Specifická optická otáčivost (2.2.7). -260° až 280°, počítáno na vysušenou látku. Měří se roztok připravený rozpuštěním 0,250 g v kyselině chlorovodíkové 0,1 mol/l RS a zředěním stejnou kyselinou na 50,0 ml.

Příbuzné látky. Stanoví se kapalinovou chromatografií (2.2.29) způsobem popsaným ve Stanovení obsahu. Nastříkne se porovnávací roztok (g). Zkoušku lze hodnotit, jestliže pík odpovídající anhydrotetracyklinu má poměr signálu k šumu nejméně 3. Nastříkne se zkoušený roztok a porovnávací roztok (f). Na chromatogramu zkoušeného roztoku plocha žádného píku odpovídajícího 4-epitetracyklinu nebo anhydrotetracyklinu nebo 4-epianhydrotetracyklinu není větší než plocha odpovídajícího píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (f) (5,0 %, 0,5 % a 1,0 %); plocha žádného píku v sestupné části hlavního píku není větší než 40,0 % plochy píku 4-epitetracyklinu na chromatogramu porovnávacího roztoku (f) (2,0 %).

Těžké kovy (2.4.8). 0,5 g vyhovuje limitní zkoušce C na těžké kovy (50 μg/g). K přípravě porovnávacího roztoku se použije 2,5 ml základního roztoku olova (10 μg Pb/ml).

Ztráta sušením (2.2.32). Nejvýše 13 %; 1,000 g se suší v sušárně při 100 °C až 105 °C.

Síranový popel (2.4.14). Nejvýše 0,5 %; stanoví se s 1,00 g zkoušené látky.

Stanovení obsahu

Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29).

Zkoušený roztok. 25,0 mg se rozpustí v kyselině chlorovodíkové 0,01 mol/l RS a zředí se jí na 25,0 ml.

Porovnávací roztok (a). 25,0 mg tetracykliniumchloridu CRL se rozpustí v kyselině chlorovodíkové 0,01 mol/l RS a zředí se jí na 25,0 ml.

Porovnávací roztok (b). 12,5 mg 4-epitetracykliniumchloridu CRL se rozpustí v kyselině chlorovodíkové 0,01 mol/l RS a zředí se jí na 50,0 ml.

Porovnávací roztok (c). 10,0 mg anhydrotetracykliniumchloridu CRL se rozpustí v kyselině chlorovodíkové 0,01 mol/l RS a zředí se jí na 100,0 ml.

Porovnávací roztok (d). 10,0 mg 4-epianhydrotetracykliniumchloridu CRL se rozpustí v kyselině chlorovodíkové 0,01 mol/l RS a zředí se jí na 50,0 ml.

Porovnávací roztok (e). Smíchá se 1,0 ml porovnávacího roztoku (a), 2,0 ml porovnávacího roztoku (b) a 5,0 ml porovnávacího roztoku (d) a směs se zředí kyselinou chlorovodíkovou 0,01 mol/l RS na 25,0 ml.

Porovnávací roztok (f). Smíchá se 40 ml porovnávacího roztoku (b), 20,0 ml porovnávacího roztoku (c) a 5,0 ml porovnávacího roztoku (d) a směs se zředí kyselinou chlorovodíkovou 0,01 mol/l RS na 200,0 ml.

Porovnávací roztok (g). 1,0 ml porovnávacího roztoku (c) se zředí kyselinou chlorovodíkovou 0,01 mol/l RS na 50,0 ml.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

1. - kolony délky 0,25 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné styrendivinylbenzen-kopolymerem R (8 μm až 10 μm),
2. - mobilní fáze, která je směsí připravenou následujícím způsobem: naváží se 80,0 g terc.butanolu R a převede se do odměmé baňky na 1000 ml za pomoci 200 ml vody R. Přidá se 100 ml roztoku hydrogenfosforečnanu draselného R (35 g/l), jehož pH bylo upraveno kyselinou fosforečnou RS na hodnotu 9,0, 200 ml roztoku tetrabutylamoniumhydrogensulfatu R (10 g/l), jehož pH bylo upraveno hydroxidem sodným RS na hodnotu 9,0, a 10 ml roztoku edetanu disodného R (40 g/l), jehož pH bylo upraveno hydroxidem sodným RS na 9,0, a zředí se vodou R na 1000,0 ml. Průtoková rychlost je 1,0 ml/min,
3. - spektrofotometrického detektoru, 254 nm,
4. - pevné injektorové smyčky, 20 μl.

Teplota kolony se udržuje na 60 °C. Nastříkne se porovnávací roztok (e). Nastaví se citlivost detektoru tak, aby výška píků nebyla menší než 50 % celé stupnice zapisovače. Zkoušku lze hodnotit, jestliže na chromatogramu není rozlišení mezi prvním píkem (4-epitetracyklin) a druhým píkem (tetracyklin) menší než 2,5 a rozlišení mezi druhým píkem a třetím píkem (4-epianhydrotetracyklin) není menší než 8,0. Podle potřeby se přizpůsobí koncentrace terc.butanolu R v mobilní fázi. Zkoušku lze hodnotit, je-li faktor symetrie druhého píku nejvýše 1,25. Nastříkne se šestkrát porovnávací roztok (a). Zkoušku lze hodnotit, je-li relativní směrodatná odchylka plochy píku tetracyklinu nejvýše 1 %. Podle potřeby se nastaví integrátor. Zkoušený roztok a porovnávací roztok (a) se vstřikují střídavě.

Obsah tetracyklinu se vypočítá v procentech.

Uchovávání

V dobře uzavřených obalech, chráněn před světlem.

Separandum.

Nečistoty

1. A. R¹ = N(CH₃)₂; R² = H; R³ = NH₂: 4-epitetracyklin,
2. B. R¹ = H; R² = N(CH₃)₂; R³ = CH₃: 2-acetyl-2-dikarboxamidotetracyklin,

1. C. R¹ = H; R² = N(CH₃)₂: anhydrotetracyklin,
2. D. R¹ = N(CH₃)₂; R² = H: 4-epianhydrotetracyklin.

† Theobrominum

Theobromin

Vlastnosti

Bílý prášek. Je velmi těžce rozpustný ve vodě a v ethanolu, těžce rozpustný v amoniaku, prakticky nerozpustný v etheru. Rozpouští se ve zředěných roztocích alkalických hydroxidů a v minerálních kyselinách.

Zkoušky totožnosti

Základní sestava zkoušek: A a C.

Alternativní sestava zkoušek: B a C, viz Obecné zásady (1.2).

1. A. Infračervené absorpční spektrum (2.2.24) zkoušené látky se shoduje se spektrem theobrominu CRL.
2. B. Asi 20 mg se rozpustí mírným zahřátím ve 2 ml amoniaku zředěného RS1 a po ochlazení se přidají 2 ml dusičnanu stříbrného RS2; roztok zůstane čirý. Pak se několik minut povaří; vylučuje se bílá krystalická sraženina.
3. C. Vyhovuje zkoušce na xanthiny (2.3.1).

Zkoušky na čistotu

Kysele reagující látky. K 0,4 g se přidá 20 ml vody R, 1 min se vaří, ochladí se a zfiltruje. Přidá se 0,05 ml modře bromthymolové RS1; roztok je žlutý nebo žlutozelený. Na změnu indikátoru do modrého zbarvení se spotřebuje nejvýše 0,2 ml hydroxidu sodného 0,01 mol/l VS.

Příbuzné látky. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití vrstvy silikagelu GF₂₅₄R.

Zkoušený roztok. K 0,2 g jemně upráškované zkoušené látky se přidá 10 ml směsi objemových dílů methanolu R a chloroformu R (4 + 6) a 15 min se zahřívá na vodní lázni pod zpětným chladičem za občasného protřepání. Ochladí se a zfiltruje.

Porovnávací roztok. 5 mg theobrominu CRL se rozpustí ve směsi objemových dílů methanolu R a chloroformu R (4 + 6) a zředí se jí na 50 ml.

Na vrstvu se nanese odděleně po 10 μl obou roztoků a vyvíjí se směsí objemových dílů amoniaku 26% R, acetonu R, chloroformu R a 1-butanolu R (10 + 30 + 30 + 40) po dráze 15 cm. Vrstva se usuší na vzduchu a pozoruje se v ultrafialovém světle při 254 nm. Žádná ze skvrn na chromatogramu zkoušeného roztoku, kromě hlavní skvrny, není intenzivnější než skvrna na chromatogramu porovnávacího roztoku (0,5 %).

Těžké kovy (2.4.8). 1,0 g vyhovuje limitní zkoušce C na těžké kovy (20 μg/g). K přípravě porovnávacího roztoku se použijí 2 ml základního roztoku olova (10 μg Pb/ml).

Ztráta sušením (2.2.32). Nejvýše 0,5 %; 1,00 g se suší v sušárně při 100 °C až 105 °C.

Síranový popel (2.4.14). Nejvýše 0,1 %; stanoví se s 1,00 g zkoušené látky.

Stanovení obsahu

0,150 g se rozpustí ve 125 ml vroucí vody R, ochladí se na 50 °C až 60 °C a přidá se 25,0 ml dusičnanu stříbrného 0,1 mol/l VS. Titruje se hydroxidem sodným 0,1 mol/l VS do růžového zbarvení za použití 1 ml fenolftaleinu RS jako indikátoru.

1 ml hydroxidu sodného 0,1 mol/l VS odpovídá 18,02 mg C₇H₈N₄O₂.

Uchovávání

Separandum.

† Theophyllinum

Theofylin

Vlastnosti

Bílý krystalický prášek. Je těžce rozpustný ve vodě a mírně rozpustný v ethanolu. Rozpouští se v roztocích alkalických hydroxidů, v amoniaku a v minerálních kyselinách.

Zkoušky totožnosti

Základní sestava zkoušek: A, B a D.

Alternativní sestava zkoušek: A, C, D a E, viz Obecné zásady (1.2).

1. A. Teplota tání (2.2.14). 270 °C až 274 °C; stanoví se po vysušení při 100 °C až 105 °C.
2. B. Infračervené absorpční spektrum (2.2.24) zkoušené látky se shoduje se spektrem theofylinu CRL.
3. C. K 10 mg se přidá 1,0 ml roztoku hydroxidu draselného R (360 g/l), zahřívá se 3 min ve vodní lázni 90 °C teplé a potom se přidá 1,0 ml kyseliny diazobenzensulfonové RS1; vzniká červené zbarvení. Provede se slepá zkouška.
4. D. Zkouška Ztráta sušením, viz Zkoušky na čistotu, je zároveň zkouškou totožnosti.
5. E. Vyhovuje zkoušce na xanthiny (2.3.1).

Zkoušky na čistotu

Roztok S. 0,5 g se rozpustí zahřátím ve vodě prosté oxidu uhličitého R a po ochlazení se jí zředí na 75 ml.

Vzhled roztoku. Roztok S je čirý (2.2.1) a bezbarvý (2.2.2, Metoda II).

Kysele reagující látky. K 50 ml roztoku S se přidá 0,1 ml červeně methylové RS. Ke změně červeného zbarvení roztoku na žluté se spotřebuje nejvýše 1,0 ml hydroxidu sodného 0,01 mol/l VS.

Příbuzné látky. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití vrstvy vhodného silikagelu s fluorescenčním indikátorem pro detekci při 254 nm.

Zkoušený roztok. 0,2 g se rozpustí ve směsi objemových dílů methanolu R a chloroformu R (4 + 6) a zředí sejí na 10 ml.

Porovnávací roztok. 0,5 ml zkoušeného roztoku se zředí směsí objemových dílů methanolu R a chloroformu R (4 + 6) na 100 ml.

Na vrstvu se nanese odděleně po 10 μl obou roztoků a vyvíjí se směsí objemových dílů amoniaku 26% R, acetonu R, chloroformu R a 1-butanolu R (10 + 30 + 30 + 40) po dráze 15 cm. Vrstva se usuší na vzduchu a pozoruje se v ultrafialovém světle při 254 nm.

Na chromatogramu zkoušeného roztoku není žádná skvrna, kromě hlavní skvrny, intenzivnější než skvrna na chromatogramu porovnávacího roztoku (0,5 %).

Těžké kovy (2.4.8). 1,0 g vyhovuje limitní zkoušce C na těžké kovy (20 μg/g). K přípravě porovnávacího roztoku se použijí 2 ml základního roztoku olova (10 μg Pb/ml).

Ztráta sušením (2.2.32). Nejvýše 0,5 %; 1,000 g se suší v sušárně při 100 °C až 105 °C.

Síranový popel (2.4.14). Nejvýše 0,1 %; stanoví se s 1,00 g zkoušené látky.

Stanovení obsahu

0,150 g se rozpustí ve 100 ml vody R, přidá se 20 ml dusičnanu stříbrného 0,1 mol/l VS a protřepe se. Potom se přidá 1 ml modři bromthymolové RS1 jako indikátoru a titruje se hydroxidem sodným 0,1 mol/l VS do modrého zbarvení.

1 ml hydroxidu sodného 0,1 mol/l VS odpovídá 18,02 mg C₇H₈N₄O₂.

Uchovávání

Separandum.

† Theophyllinum monohydricum

Monohydrát theofylinu

Vlastnosti

Bílý krystalický prášek. Je těžce rozpustný ve vodě, mírně rozpustný v ethanolu. Rozpouští se v roztocích alkalických hydroxidů, v amoniaku a v minerálních kyselinách.

Zkoušky totožnosti

Základní sestava zkoušek: A, B a D.

Alternativní sestava zkoušek: A, C, D a E, viz Obecné zásady (1.2).

1. A. Teplota tání (2.2.14). 270 °C až 274 °C; stanoví se po vysušení při 100 °C až 105 °C.
2. B. Infračervené absorpční spektrum (2.2.24) zkoušené látky se shoduje se spektrem theofylinu CRL. Zkouška se provede s látkou vysušenou při 100 °C až 105 °C.
3. C. K 10 mg se přidá 1,0 ml roztoku hydroxidu draselného R (360 g/l), zahřívá se 3 min ve vodní lázni 90 °C teplé a potom se přidá 1,0 ml kyseliny diazobenzensulfonové RS1; vzniká červené zbarvení. Provede se slepá zkouška.
4. D. Zkouška na čistotu Voda, semimikrostanovení (2.5.12), je zároveň zkouškou totožnosti.
5. E. Vyhovuje zkoušce na xanthiny (2.3.1).

Zkoušky na čistotu

Roztok S. 0,5 g se rozpustí zahřátím ve vodě prosté oxidu uhličitého R a po ochlazení se jí zředí na 75 ml.

Vzhled roztoku. Roztok S je čirý (2.2.1) a bezbarvý (2.2.2, Metoda II).

Kysele reagující látky. K 50 ml roztoku S se přidá 0,1 ml červeně methylové RS. Ke změně červeného zbarvení roztoku na žluté se spotřebuje nejvýše 1,0 ml hydroxidu sodného 0,01 mol/l VS.

Příbuzné látky. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití vrstvy vhodného silikagelu s fluorescenčním indikátorem pro detekci při 254 nm.

Zkoušený roztok. 0,2 g se rozpustí ve směsi objemových dílů methanolu R a chloroformu R (4 + 6) a zředí sejí na 10 ml.

Porovnávací roztok. 0,5 ml zkoušeného roztoku se zředí směsí objemových dílů methanolu R a chloroformu R (4 + 6) na 100 ml.

Na vrstvu se nanese odděleně po 10 μl obou roztoků a vyvíjí se směsí objemových dílů amoniaku 26% R, acetonu R, chloroformu R a 1-butanolu R (10 + 30 + 30 + 40) po dráze 15 cm. Vrstva se usuší na vzduchu a pozoruje se v ultrafialovém světle při 254 nm.

Na chromatogramu zkoušeného roztoku není žádná skvrna, kromě hlavní skvrny, intenzivnější než skvrna na chromatogramu porovnávacího roztoku (0,5 %).

Těžké kovy (2.4.8). 1,0 g vyhovuje limitní zkoušce C na těžké kovy (20 μg/g). K přípravě porovnávacího roztoku se použijí 2 ml základního roztoku olova (10 μg Pb/ml).

Voda, semimikrostanovení (2.5.12). 8 % až 9,5 %; provede se s 1,00 g zkoušené látky.

Síranový popel (2.4.14). Nejvýše 0,1 %; stanoví se s 1,00 g zkoušené látky.

Stanovení obsahu

0,160 g se rozpustí ve 100 ml vody R, přidá se 20 ml dusičnanu stříbrného 0,1 mol/l VS a protřepe se. Potom se přidá 1 ml modři bromthymolové RS1 jako indikátoru a titruje se hydroxidem sodným 0,1 mol/l VS do modrého zbarvení.

1 ml hydroxidu sodného 0,1 mol/l VS odpovídá 18,02 mg C₇H₈N₄O₂.

Uchovávání

Separandum.

† Thiamini hydrochloridum

Thiammiumchlorid

Synonyma. Thiaminium díchloratum, vitamin B1

Vlastnosti

Bílý nebo téměř bílý krystalický prášek nebo bezbarvé krystalky. Je snadno rozpustný ve vodě, dobře rozpustný v glycerolu, těžce rozpustný v lihu 96%, prakticky nerozpustný v etheru.

Zkoušky totožnosti

Základní sestava zkoušek: A a C.

Alternativní sestava zkoušek: B a C, viz Obecné zásady (1.2).

1. A. Infračervené absorpční spektrum (2.2.24) zkoušené látky se shoduje se spektrem thiaminiumchloridu CRL. Jestliže spektra vykazují rozdíly, rozpustí se jednotlivě zkoušená látka a referenční látka ve vodě R, roztoky se odpaří do sucha a zaznamenají se spektra odparků.
2. B. Asi 20 mg se rozpustí v 10 ml vody R, přidá se 1 ml kyseliny octové zředěné RS, 1,6 ml hydroxidu sodného 1 mol/l RS a zahřívá se 30 min na vodní lázni. Po ochlazení se přidá 5 ml hydroxidu sodného zředěného RS, 10 ml hexakyanoželezitanu draselného RS, 10 ml 1-butanolu R a 2 min se intenzivně protřepává; horní lihová vrstva intenzivně světle modře fluoreskuje, zejména v ultrafialovém světle při 365 nm. Zkouška se opakuje, přičemž se místo 1,6 ml hydroxidu sodného 1 mol/l RS použije 0,9 ml hydroxidu sodného 1 mol/l RS a 0,2 g siřičitanu sodného R; nevznikne prakticky žádná fluorescence.
3. C. Vyhovuje zkoušce (a) na chloridy (2.3.1).

Zkoušky na čistotu

Roztok S. 2,5 g se rozpustí ve vodě prosté oxidu uhličitého R (připravené z vody destilované R) a zředí sejí na 25 ml.

Vzhled roztoku. 2,5 ml roztoku S se zředí vodou R na 5 ml. Vzniklý roztok je čirý (2.2.1) a není zbarven intenzivněji než porovnávací roztok Ž₇ nebo ZŽ₇ (2.2.2, Metoda II).

Hodnota pH (2.2.3). 2,7 až 3,3; měří se 2,5 ml roztoku S zředěného na 10 ml vodou prostou oxidu uhličitého R.

Dusičnany. K 0,4 ml roztoku S se přidá 1,6 ml vody R, 2 ml kyseliny sírové R a ochladí se. Na tento roztok se navrství 2 ml roztoku síranu železnatého R (80 g/l) připraveného v čas potřeby za použití vody prosté oxidu uhličitého R; na styku obou vrstev nevznikne hnědý prstenec.

Sírany (2.4.13). 5 ml roztoku S zředěného na 15 ml vodou destilovanou R vyhovuje limitní zkoušce na sírany (300 μg/g).

Těžké kovy (2.4.8). 12 ml roztoku S vyhovuje limitní zkoušce A na těžké kovy (20 μg/g). K přípravě porovnávacího roztoku se použije základní roztok olova (2 μg Pb/ml).