Český lékopis 1997

Účelem tohoto textu je pomoci analytikům při plánování a analýze biologických zkoušek předepsaných lékopisem.

Metody popsané v této příloze nejsou závazné pro analýzu výsledků biologických zkoušek obsažených v závazné části lékopisu.

Mohou se použít i jiné pokusné plány a metody vyhodnocení, pokud nejsou méně spolehlivé než zde popsané metody.

1. 1.1 Obecný plán experimentu a přesnost

   Biologické metody jsou určeny pro zkoušení těch látek a přípravků, jejichž účinnost se nedá spolehlivě zjistit chemickými nebo fyzikálními metodami. Všude, kde je to možné, se ve zkouškách užívá princip porovnání se standardním přípravkem. Určuje se množství zkoušeného přípravku, které vyvolá stejný biologický efekt jako dané množství, jednotka standardního přípravku. Pro tyto metody biologických zkoušek je nezbytné, aby test standardního a testovaného přípravku byl proveden ve stejném čase a za podmínek, které jsou pro oba přípravky stejné nebo maximálně podobné.

   Každý odhad účinnosti určený biologickou zkouškou má náhodnou chybu tkvící v biologické variabilitě odpovědí. Tato chyba by se měla, je-li to možné, stanovit z výsledků zkoušky vždy při užití oficiální metody. Metody plánování zkoušek a výpočet jejich chyb je popsán dále. Vždy před zavedením statistické metody je nutné pomocí předběžného testu stanovit dostatečný rozsah zkoušky (tj. dostatečné množství vzorků). Dále by měly být průběžně otestovány i další parametry (normalita, homogenita rozptylů).

   Směrodatná odchylka (s) se může použít k stanovení mezí spolehlivosti¹) neznámé účinnosti v závislosti na plánu experimentu a rozsahu vzorku. Pro biologické zkoušky se běžně používají 95% meze spolehlivosti. K výpočtu těchto mezí se používají statistické metody, které zajišťují s 95% pravděpodobností, že tyto meze obsahují skutečnou hodnotu účinnosti.

   Samotné odhady přesnosti jsou zatíženy nezanedbatelnou chybou, jestliže nejsou založeny na velmi velkém počtu pozorování. Výpočty účinnosti mohou vést k chybným závěrům, pokud se při stanovení jejich mezí spolehlivosti nebere na tuto skutečnost ohled. Meze spolehlivosti pro účinnost poskytují míru přesnosti, s níž byla zkouška provedena. Určují, zda přesnost vyhovuje lékopisu v závislosti na požadavcích předepsaných pro tento přípravek.

   Výraz "směrodatná odchylka" přesně znamená "standardní chyba průměru". Výrazy "průměr" a "směrodatná odchylka" jsou zde použity tak, jak jsou definovány v běžných biometrických učebnicích.

   Výrazy "udaná účinnost" nebo "deklarovaná účinnost", "předpokládaná účinnost", "relativní účinnost" a "odhadnutá účinnost" jsou použity v tomto smyslu:

   1. - "udaná účinnost" nebo "deklarovaná účinnost" označují u předepsaného přípravku nominální hodnotu určenou ze znalosti účinnosti materiálu, u hromadně vyrobeného materiálu z účinnosti odhadnuté výrobcem;
   2. – "předpokládaná účinnost" zkoušeného přípravku je východiskem ke stanovení jeho dávek odpovídající ekvipotentní dávce standardního přípravku ve srovnávací zkoušce;
   3. – "relativní účinnost" neznámého přípravku je podíl stejně účinných dávek standardního a testovaného přípravku;
   4. – "odhadovaná účinnost" je účinnost vypočítaná z výsledků zkoušky.

   V kapitole 7.1 (Slovník symbolů) je seznam symbolů použitých v této příloze. Tam, kde jsou v textu použity symboly, které nejsou popsány v této kapitole nebo jsou použity v jiném smyslu, je to uvedeno v dané části textu.

1. 1.2 Výpočty

   Rozvoj elektronických kalkulaček a počítačů zbavil biometra obtíží se zdlouhavými výpočty spojenými s hodnocením výsledků biologických zkoušek. Protože požadavky klasických statistických metod díky rozvoji výpočetní techniky nevyžadují téměř žádný čas a práci, mizí potřeba jejich náhrady rychlými přibližnými metodami.

   Pomoc elektroniky při výpočtech je různá, od kapesních kalkulaček se čtyřmi aritmetickými operacemi až po rozsáhlé sálové počítače. Je zřejmé, že žádný popis analýzy biologických zkoušek nemůže odpovídat všem druhům této techniky.

   Ačkoliv každá kalkulačka poskytuje určité služby, vyhodnocení biologických zkoušek usnadní zejména následující funkce:

   1. - alespoň šest pamětí, které umožní manipulaci s n dvojicemi proměnných x a y, tj. umožní uložení n, ∑x, ∑x², ∑y, ∑y² ∑xy;
   2. - klávesy ln x, e^x, √x a π;
   3. - alespoň třicet programovacích kroků.

   Při psaní vzorců v následujících paragrafech předpokládáme, že kalkulačka tyto požadavky splňuje. Nevýhodou použití kalkulaček je ztráta možnosti provádět i kontrolu. To může být napraveno třemi způsoby kontroly:

   1. - kontrolou přesnosti kalkulačky. Pro kontrolu přesnosti kalkulaček a počítačů byly vytvořeny datové soubory²). Skupina sedmi takových testů je v tabulce 1.2-I;
   2. - kontrolou výpočetního algoritmu pomocí dat, u kterých je znám správný výsledek;
   3. - provedením celého výpočtu zkoušky druhou osobou.

   Pro vyhledávání zdrojů chyb je velmi užitečný tisk a zobrazení vstupních dat, mezivýsledků a grafické zobrazení biologické odpovědi jako funkce dávky.

   Některé kalkulačky obsahují rezidentní program, který mimo jiné umožňuje i výpočet směrodatné odchylky. Experimentátor by měl pomocí tabulky 1.2-I zkontrolovat, zda se tak získá druhá odmocnina populačního rozptylu (součet čtverců dělený počtem pozorování) nebo druhá odmocnina výběrového rozptylu [součet čtverců odchylek dělený (počtem pozorování - 1)].

   Tab. 1.2-I Data pro kontrolu přesnosti kalkulátoru

   Tab. 1.2-I Data pro kontrolu přesnosti kalkulátoru

   Data					Průměr	Výběrový rozptyl	Výběrová směrodatná odchylka
   8	9	10	11	12	10	2,50	1,581 138 = s
   0,8	0,9	1,0	1,1	1,2	1,0	2,50 . 10-2	s. 10-1
   0,08	0,09	0,10	0,11	0,12	0,10	2,50 . 10-4	s. 10-2
   0,008	0,009	0,010	0,011	0,012	0,010	2,50 . 10-6	s. 10-3
   78	79	80	81	82	80	2,50	s
   708	709	710	711	712	710	2,50	s
   7008	7009	7010	7011	7012	7010	2,50	s

   Každý výpočet rozptylu odpovědí y ve výběru o rozsahu n je součet n čtverců odchylek všech odpovědí od výběrového průměru .

   Tento součet čtverců se dá počítat alespoň dvěma způsoby:

   1. 1. nejprve se vypočte průměr y; pak odchylky každé odpovědi y od , ty se umocní a čtverce sečtou. Tato metoda je méně citlivá na chybu vzniklou zaokrouhlováním, ale je početně náročnější. Při použití počítače se musí uložit do paměti všechny hodnoty y;
   2. 2. přepsáním vzorce do tvaru:

      Před zavedením elektronických kalkulaček s větší pamětí se tento vzorec používal často, neboť umožnil provést výpočet na jednoduché stolní kalkulačce nebo užití tabulek čtverců. Pokud počet platných číslic ∑y² překročí kapacitu kalkulaček, může tato metoda poskytovat méně přesné výsledky.

      Tato nepříjemnost se dá potlačit odečtením první zjištěné hodnoty y od dalších hodnot y. Tato změna neovlivní hodnotu směrodatné odchylky, ale získaný průměr se musí nakonec zvětšit právě o tuto první zjištěnou hodnotu veličiny y.

Výběr pokusných jednotek (zvířat, zkumavek atd.) pro jednotlivá ošetření by se měl provést čistě náhodně. Náhodně by se měl provést i každý jiný výběr pokusných podmínek, nebyl-li pokusným plánem úmyslně jinak stanoven. Příkladem je výběr polohy klecí v laboratoři a pořadí, u něhož se provede ošetření. Konkrétně: skupina zvířat, která obdrží stejnou dávku, by neměla být ošetřena společně (ve stejném čase a místě), pokud nemáme spolehlivý důkaz, že tyto zdroje nehomogenity (např. rozdíly v čase nebo místě) jsou zanedbatelné.

Náhodný výběr se dá provést pomocí standardních tabulek náhodných čísel. U těchto tabulek obvykle bývá i návod k jejich použití (viz např. Fisher R.A. a Yates F. ³)). Náhodná čísla se dají získat i pomocí kalkulaček nebo počítačů, které využívají zabudovaných generátorů náhodných čísel, nebo výpočtem, například pomocí vzorce:

kde a, l a z jsou konstanty. Vhodné hodnoty a, l a z pro tento vzorec uvádějí například Hull a Dobell⁴). Možnost testovat, zda generovaná čísla jsou skutečně náhodná, popsali např. McLaren a Marsaglia⁵). Pokud používáme generátor náhodných čísel, není provádění testu náhodnosti nadbytečné. Navíc musíme ještě zkontrolovat, zda generátor při opakovaném použití tvoří různé posloupnosti náhodných čísel.

Pro naše účely jsou vhodnější tabulky náhodných permutací. Pokud nemáme tyto tabulky k dispozici, dají se náhodné permutace čísel 1 až N vytvořit za pomoci náhodných čísel a jednoduchého algoritmu, který popsal Coan⁶), viz tabulka 2-I.

Je nutno dbát na to, aby pokaždé byla použita jiná posloupnost náhodných čísel, případně jiná náhodná permutace.

Tab. 2-I Algoritmus generování náhodných permutací čísel 1 až N

1. 3.1 Statistické modely

   Biologické zkoušky obsažené v lékopise jsou založeny na principu "ředění". O neznámém testovaném přípravku se předpokládá, že obsahuje stejnou aktivní složku jako standardní přípravek, ale s jiným poměrem aktivní a neúčinné složky. Teoreticky je v tomto případě neznámý přípravek pouze ředěním standardního přípravku pomocí nějaké neúčinné látky. Má-li se ověřit, zda se konkrétní právě prováděná zkouška řídí tímto modelem, je nutné vyzkoušet závislost odpovědi na ředění standardu. Pokud se v prováděné zkoušce výrazně liší průběh závislosti na dávce standardního a neznámého přípravku, není model pro tuto konkrétní zkoušku použitelný.

   Aby bylo možno lépe analyzovat vliv ředění na biologickou odpověď, je vhodné transformovat tuto závislost na lineární. Pro statistickou analýzu biologických zkoušek jsou určeny dva modely: model rovnoběžnosti a model poměru sklonů.

   Jejich použití je závislé na následujících podmínkách:

   1. 1. pokusným jednotkám jsou náhodně přidělena jednotlivá ošetření,
   2. 2. odpověď každého ošetření má normální rozdělení,
   3. 3. směrodatná odchylka odpovědi uvnitř každé skupiny stejně ošetřené není závislá na střední hodnotě odpovědi v této skupině.

   Podmínku 1 lze splnit správným použitím návodu z kapitoly 2. Pokud je podezření na odchylku od normality, může se použít Shapiro-Wilk test. Tento test je krátce popsán v kapitole 3.1.1. Pokud je podezření na porušení podmínek 2 a/nebo 3, může pomoci ke splnění těchto podmínek některá z transformací odpovědi y: ln (y), √y nebo 1/y. V učebnicích statistiky se najdou ještě další transformace.

   Experimentátor by se měl při zavedení metody v laboratoři rozhodnout pro typ transformace přiměřený biologické zkoušce. Pokud nejsou později při rutinním provádění biologické zkoušky splněny podmínky 2 a/nebo 3, neměla by být použita jiná transformace. Ke změně transformace může experimentátor přistoupit až po ověření, že nesplnění požadavků není náhodné, ale je způsobeno systematickou změnou experimentálních podmínek. V tomto případě by se měl znovu provést předběžný test transformace, která se bude dále pro tuto biologickou zkoušku rutinně používat.

   Zvláštní kategorii tvoří zkoušky, v nichž odpověď nelze měřit na jednotlivých experimentálních jednotkách, ale ve kterých se zjišťuje pouze podíl jednotek reagujících na ošetření. Tyto zkoušky se nazývají kvantální a metodě jejich hodnocení je věnována kapitola 4. Při použití této metody se předpokládá splnění podmínek 2 a 3.

   Dvě další podmínky závisí na zvoleném statistickém modelu:

   1. A. Model rovnoběžnosti (viz obr. 3.2.5-I) předpokládá lineární vztah mezi odpovědí Y a logaritmem X dávky D: