Český lékopis 1997, 1/1998 Sb., účinné od 1. 2. 1998

Předchozí stránka

Zkoumadla potřebná pro mnoho imunochemických metod jsou dostupná jako komerční zkušební soupravy, to jsou sady obsahující zkoumadla (zvláště antigen nebo protilátku) a látky určené ke stanovení specifikované substance in vitro, včetně návodu na jejich správné použití. Soupravy se používají podle návodu výrobce. Je důležité ověřit, zda soupravy jsou vhodné pro analýzu zkoušené látky, se zvláštním zřetelem na jejich selektivitu a citlivost. Přehled o soupravách pro imunochemická stanovení připravila Světová zdravotnická organizace (Technical Report Series 658; 1981).

Metody používající značený antigen nebo značenou protilátku

Metody používající značené látky mohou využívat vhodná značení, jako jsou enzymy, fluorofory, luminofory a radioizotopy. Je-li ke značení použit radioizotop, metoda se nazývá "radioimunoanalýza". Doporučení pro měření radioaktivity uvedená v článku Radiofarmaca lze použít při imunologických stanoveních spojených s radioizotopy. Veškerá práce s radioaktivním materiálem se provádí ve shodě s národním zákonodárstvím a mezinárodně přijatými pravidly o ochraně před radioaktivním zářením.

Metody používající neznačený antigen nebo neznačenou protilátku

Imunoprecipitační metody

Imunoprecipitační metody zahrnují flokulaci a precipitační reakce. Je-li roztok antigenů smíchán za vhodných podmínek s odpovídající protilátkou, reagující složky vytvoří flokulační nebo precipitační agregáty. Poměr reagujících složek, při němž je doba flokulace nejkratší nebo precipitace nejvýraznější, se nazývá optimální poměr a je obvykle tvořen ekvivalentními množstvími antigenu a protilátky. Imunoprecipitace může být stanovena vizuálně nebo metodami rozptylu světla (nefelometrické nebo turbidimetrické stanovení). Použitím částic (např. latex) pokrytých antigenem nebo protilátkou se může dosáhnout zvýšení citlivosti.

Ve flokulačních metodách se obvykle používá postupné ředění jedné z reagujících složek, zatímco v imunodifuzních metodách (ID) se ředění dosahuje difuzí do prostředí gelu: získají se koncentrační gradienty jedné nebo obou reagujících složek a v prostředí gelu se tak vytvoří zóny, kde poměr složek podporuje precipitaci. Zatímco flokulační metody se provádějí ve zkumavkách, v metodách imunodifuze se používají různé pomůcky, jako jsou zkumavky, destičky, sklíčka nebo komůrky.

Je-li imunoprecipitační systém složen z jednoho antigenů, který se váže na odpovídající protilátku, označuje se jako systém jednoduchý. Zahmuje-li příbuzné, ale sérologicky neidentické reagující složky, je to systém komplexní, a obsahuje-li několik sérologicky nepříbuzných složek, je to systém složený.

V jednoduchých difuzních metodách se koncentrační gradient ustaví pouze pro jednu z reagujících složek, která difunduje z vnějšího zdroje do prostředí gelu obsahujícího odpovídající druhou složku v relativně nízké koncentraci.

Jednoduchá radiální imunodifuze (SRID) je jednoduchá kvantitativní imunodifuzní technika. Když je dosaženo rovnováhy mezi vnější a vnitřní reagující složkou, vytvářejí se kruhové precipitační plochy kolem bodu s vnější složkou. Plochy jsou přímo úměrné koncentraci antigenu v gelu a nepřímo úměrné koncentraci protilátky v gelu.

V metodách dvojité difuze se koncentrační gradienty ustavují pro obě reagující složky. Antigen i protilátka difundují z oddělených míst do původně imunologicky neutrálního gelu.

Komparativní metody dvojité imunodifuze se používají pro kvalitativní porovnávání různých antigenů reakcí s vhodnou protilátkou a naopak. Srovnávání je založeno na přítomnosti nebo nepřítomnosti vzájemného působení mezi precipitačními liniemi. Mohou být rozlišeny reakce totožnosti, rozdílnosti nebo částečné totožnosti mezi antigeny nebo protilátkami.

Imunoelektroforetické metody

Imunoelektroforéza (IE) je kvalitativní technika spojující dvě metody: gelovou elektroforézu s následnou imunodifuzí.

Dvojrozměrná imunoelektroforéza je modifikace imunoelektroforetické metody. Je vhodná pro kvalitativní i kvantitativní analýzy. První část postupu je normální gelová elektroforéza, po které jsou z gelu vyříznuty podélné pásky obsahující rozdělené určované frakce a jsou přeneseny na jinou desku. Elektroforéza ve druhém směru se provádí v úhlu 90 ° k předcházející elektroforéze v gelu, který obsahuje poměrně nízkou koncentraci protilátek odpovídajících antigenům. Pro danou koncentraci protilátky a tloušťku gelu je lineární vztah mezi plochou příslušných precipitačních píků a množstvím odpovídajícího antigenu.

Elektroimunoanalýza, často označovaná jako raketková imunoelektroforéza, je rychlá kvantitativní metoda pro stanovení antigenů s nábojem odlišným od náboje protilátek nebo naopak. Elektroforéza stanovovaného antigenu se provádí v gelu, který obsahuje poměrně nízkou koncentraci odpovídající protilátky. Zkoušený materiál a roztoky standardního antigenu použité pro kalibraci jsou naneseny do odlišných jamek v gelu. V průběhu elektroforézy se vytvářejí pohyblivé precipitační zóny ve tvaru píků (raketek), které začínají u jamek. Čelo precipitátu se zastaví, není-li již antigen v přebytku. Pro danou koncentraci protilátky platí lineární vztah mezi výškou píku (raketky) precipitátu a množstvím použitého antigenu.

Protisměrná imunoelektroforéza je rychlá kvantitativní metoda, která umožňuje, aby se v elektrickém poli ustavil koncentrační gradient vnějšího antigenu a vnější protilátky v závislosti na odlišných nábojích. Naředěné roztoky standardů pro kalibraci a ředění zkoušené látky se nanesou do řady jamek v gelu a stálé množství odpovídající reagující složky je naneseno do protilehlé řady jamek. Titr zkoušené látky může být určen jako nejvyšší ředění, při kterém se tvoří precipitační linie.

Existuje mnoho modifikací dvourozměrné a raketkové imunoelektroforézy.

Jiné techniky spojují dělení antigenů podle velikosti molekuly a sérologických vlastností.

Zviditelnění a charakterizace imunoprecipitačních linií

Může se provádět selektivním nebo neselektivním barvením, fluorescencí, značením enzymy nebo izotopy nebo jinou vhodnou technikou. Metody selektivního barvení se obvykle používají pro charakterizaci nebílkovinných látek v precipitátech.

V průsvitných gelech, jako jsou gely agaru nebo agarosy, jsou precipitační linie v gelu jasně viditelné, pokud je vhodná koncentrace reagujících složek.

Validace metod

Validační požadavky

Kvantitativní imunochemická metoda je platná, jestliže:
1. 1. protilátka nebo antigen nerozlišuje signifikantně mezi zkouškou a standardem. V případě značených reagujících složek odpovídající složka nerozlišuje signifikantně mezi značenou a neznačenou látkou;
2. 2. metoda není ovlivněna zkoušenou matricí, to je žádnou složkou zkoušeného vzorku nebo jeho pomocnými látkami, které se mohou u vzorků lišit. V tom mohou být zahrnuty vysoké koncentrace jiných bílkovin, solí a konzervačních látek nebo kontaminující proteolytické aktivity,
3. 3. limit kvantitativního vyjádření je nižší než přijatá kritéria uvedená v jednotlivém článku;
4. 4. přesnost metody je taková, že odchylky výsledků vyhovují požadavkům uvedeným v jednotlivých článcích;
5. 5. při postupu v provedení zkoušky nevznikají systematické chyby.

Validační metody

Ke splnění těchto požadavků validační plán obsahuje následující prvky:

1. stanovení se provede nejméně třikrát,
2. stanovení se provede nejméně se třemi různými ředěními standardu a třemi ředěními vzorku, které mají předpokládanou podobnou účinnost jako ředění standardu,
3. plán stanovení má náhodné uspořádání,
4. je-li zkoušená látka předložena ve formě séra nebo smíchána s dalšími látkami, je standard rovněž připraven stejným způsobem,
5. zkouška zahrnuje měření nespecifické vazby značené reagující složky,
6. pro vytěsňovací imunologické stanovení:
1. a) je určena maximální vazba (nulové vytěsnění),
2. b) ředění zasahují úplnou reakční řadu od hodnot blízkých nespecifické vazbě až po maximální vazbu, přednostně jak pro standard, tak pro zkoušené přípravky.

Statistické výpočty

K vyhodnocení výsledků mohou být analyzovány reakční křivky pro vzorek a standard metodami popsanými ve stati Statistické hodnocení výsledků biologických zkoušek (5.3).

Signifikantní nerovnoběžnost ukazuje, že protilátka nebo antigen rozlišují mezi vzorkem a standardem a výsledky nejsou platné.

Ve vytěsňovacích imunologických stanoveních nesmí být hodnoty nespecifické vazby a maximálního vytěsnění při vysokých koncentracích vzorku nebo standardu signifikantně rozdílné. Rozdíly mohou ukazovat na vliv matrice, která způsobí buď inhibici vazby nebo degradaci značení.

2.7.2 Mikrobiologické stanovení účinnosti antibiotik

Účinnost antibiotika se stanoví porovnáním inhibice růstu citlivých mikroorganismů vyvolané známými koncentracemi zkoušeného antibiotika a referenční látky.

Referenční látky použité ke stanovení jsou ty, jejichž účinnost byla přesně stanovena v poměru k odpovídajícímu mezinárodnímu standardu nebo mezinárodnímu referenčnímu přípravku.

Plán stanovení je takový, aby dovolil ověřit validitu matematického modelu, na němž je založeno porovnání účinnosti. Je-li vybrán model rovnoběžných přímek, dvě logaritmické přímky dávky a odpovědi (nebo transformované odpovědi) zkoušeného přípravku a referenčního přípravku jsou rovnoběžné a jsou lineární v intervalu dávek použitých k výpočtu. Tyto podmínky se validují pro danou hladinu pravděpodobnosti, obvykle P = 0,05. Jiné matematické modely, jako model např. regresního poměru, mohou být též použity, je-li prokázána validita zkoušky.

Pokud není v článku uvedeno jinak, je interval spolehlivosti (P = 0,95) stanovení nejméně 95 % a nejvýše 105 % stanovené účinnosti. Stanovení se provádí metodou A nebo metodou B.

A. Difuzní metoda

Živná půda vhodná pro stanovení (viz níže) se rozehřeje a při vhodné teplotě, např. 48 °C až 50 °C pro vegetativní formy, se naočkuje suspenzí mikroorganismů citlivých na zkoušené antibiotikum v takovém množství, které vytváří zřetelně ohraničené inhibiční zóny o průměru přiměřeném koncentraci zkoušeného antibiotika. Naočkovaná půda se ihned vylije do Petriho misek nebo velkých pravoúhlých misek (ploten) v takovém množství, aby se vytvořila jednolitá vrstva silná 2 mm až 5 mm. Živná půda může být též vylita ve dvou vrstvách, z nichž jenom vrchní j e naočkována. Takto připravené misky se uchovávají tak, aby před použitím nedošlo k viditelnému růstu mikroorganismů nebo k jejich usmrcení a aby povrch půd byl v čase použití suchý.

Pro přípravu roztoků stejných koncentrací zkoušeného přípravku a referenční látky se použijí rozpouštědla a tlumivé roztoky uvedené v tabulce 2.7.2-1. Roztoky se nanesou buď na povrch půdy, např. do sterilních cylindříků z porcelánu, z nerezavějící oceli, případně z jiných vhodných materiálů, nebo do otvorů vyříznutých v živné půdě. Objem roztoků v každém cylindříků nebo otvoru musí být stejný. Lze též použít sterilní disky z absorbujícího papíru vhodné kvality, které se před položením na půdu napustí roztoky referenční látky nebo zkoušeného antibiotika.

K ověření platnosti stanovení se použijí nejméně tři rozdílné dávky referenční látky a tři odpovídající dávky zkoušeného antibiotika. Doporučuje se používat geometrickou řadu dávek. Při běžných zkouškách účinnosti, u nichž je prokázán lineární průběh systému na přiměřeném počtu třídávkových stanovení a u nichž s tím souhlasí oprávněná autorita, nebo může postačovat i dvoudávkové stanovení; ve všech sporných případech se však použije metoda třídávková referenční látky a rovněž tři dávky zkoušeného antibiotika o předpokládané stejné účinnosti jako dávky referenční látky.

Do každé Petriho misky nebo pravoúhlé misky se nanesou roztoky podle statisticky vhodného plánu. V případě malých misek, které nepojmou více než šest roztoků, se doporučuje měnit umístění roztoku zkoušeného antibiotika a referenční látky, aby se zabránilo interakcím koncentrovanějších roztoků.

Inkubuje se při vhodné teplotě asi 18 h. Doba předinkubační difuze, obvykle 1 h až 4 h, při pokojové teplotě nebo 4 °C, může být vhodná k potlačení účinku časových rozdílů mezi aplikací roztoků a tak zlepšit regresi.

Změří se průměry kruhových inhibičních zón s přesností nejméně 0,1 mm nebo jejich plochy s odpovídající přesností. Pomocí vhodných statistických metod se vypočítá účinnost zkoušeného antibiotika.

V každé zkoušce se použije pro každou dávku tolik inhibičních zón, aby byla zajištěna požadovaná přesnost. Stanovení účinnosti může být opakováno a výsledky mohou být statisticky sloučeny, aby se dosáhlo požadované přesnosti stanovení a ověřilo se, že účinnost antibiotika není menší než požadované minimum.

Tab. 2.7.2-1 Difuzní metoda

Metody používající značený antigen nebo značenou protilátku Metody používající neznačený antigen nebo neznačenou protilátku Imunoprecipitační metody Imunoelektroforetické metody Zviditelnění a charakterizace imunoprecipitačních linií Validace metod Validační požadavky Validační metody Statistické výpočty Tab. 2.7.2-1 Difuzní metoda
Antibiotikum	Referenční látka	Rozpouštědlo k přípravě základního roztoku	Tlumivý roztok (pH)	Mikroorganismus	Půda a konečné pH (± 0,1)	Inkubační teplota ve °C
Bacitracinum zincicum	Bacitracinum zincicum CRL	kyselina chlorovodíková 0,01 mol/l VS	pH 7,0 (0,05 mol/l)	Micrococcus flavus NCTC 7743 CIP 53.160 ATCC 10240 CCM 732 CNCTC M 8/58	A - pH 7,0	35 až 39
Bleomycini sulfas	Bleomycini sulfas CRL	voda R	pH 6,8 (0,1 mol/l)	Mycobacterium smegmatis ATCC 607 CCM 4622 CNCTC My 23/64	G - pH 7,0	35 až 37
Colistini sulfas	Colistini sulfas CRL			Bordetella bronchiseptica NCTC 8344 CIP 53.157 ATCC 4617 CCM 4416 CNCTC Brb 5/63 Escherichia coli NCIB 8879 CIP 54.127 ATCC 10536 CCM 3988 CNCTC Ec 326/71	B - pH 7,3	35 až 39
Colistimethatum natricum	Colistimethatum natricum CRL	voda R	pH 6,0 (0,05 mol/l)		B - pH 7,3	35 až 39
Dihydrostreptomycini sulfas	Dihydrostreptomycini sulfas CRL	voda R	pH 8,0 (0,05 mol/l)	Bacillus subtilis NCTC 8236 CIP 1.83 CCM 2217 CNCTC Bs 17/65 Bacillus subtilis NCTC 10400 CIP 52.62 ATCC 6633 CCM 1999 CNCTC Bs 8/58	A - pH 7,9	30 až 37
Dihydrostreptomycini sulfas	Dihydrostreptomycini sulfas CRL	voda R	pH 8,0 (0,05 mol/l)		A - pH 7,9	30 až 37
Erythromycini estolas Erythromycini ethylsuccinas Erythromycini stearas	Erythromycinum CRL	methanol R viz články	pH 8,0 (0,05 mol/l)	Bacillus pumilus NCTC 8241 CIP 76.18 CCM 2218 CNCTC Bac 2/65 Bacillus subtilis NCTC 10400 CIP 52.62 ATCC 6633 CCM 1999 CNCTC Bs 8/58	A - pH 7,9	30 až 37
	Erythromycinum CRL	methanol R			A - pH 7,9	30 až 37
Framycetini sulfas	Framycetini sulfas CRL	voda R	pH 8,0 (0,05 mol/l)	Bacillus subtilis NCTC 10400 CIP 52.62 ATCC 6633 CCM 1999 CNCTC Bs 8/58 Bacillus pumilus NCTC 8241 CIP 76.18 CCM 2218 CNCTC Bac 2/65	E - pH 7,9	30 až 37
Framycetini sulfas	Framycetini sulfas CRL	voda R	pH 8,0 (0,05 mol/l)		E - pH 7,9	30 až 37
Gentamicini sulfas	Gentamicini sulfas CRL	voda R	pH 8,0 (0,05 mol/l)	Bacillus pumilus NCTC 8241 CIP 76.18 CCM 2218 CNCTC Bac 2/65 Staphylococcus epidermidis NCIB 8853 CIP 68.21 ATCC 12228 CCM 4418 CNCTC M 12/63	A - pH 7,9	35 až 39
Gentamicini sulfas	Gentamicini sulfas CRL	voda R	pH 8,0 (0,05 mol/l)		A - pH 7,9	35 až 39
Kanamycini monosulfas Kanamycini sulfas acidus	Kanamycini monosulfas CRL	voda R	pH 8,0 (0,05 mol/l)	Bacillus subtilis NCTC 10400 CIP 52.62 ATCC 6633 CCM 1999 CNCTC Bs 8/58 Staphylococcus aureus NCTC 7447 CIP 53.156 ATCC 6538P CCM 2022 CNCTC Mau 28/58	A - pH 7,9	30 až 37
Kanamycini monosulfas Kanamycini sulfas acidus	Kanamycini monosulfas CRL	voda R	pH 8,0 (0,05 mol/l)		A - pH 7,9	35 až 39
Neomycini sulfas	Neomycini sulfas CRL	voda R	pH 8,0 (0,05 mol/l)	Bacillus pumilus NCTC 8241 CIP 76.18 CCM 2218 CNCTC Bac 2/65 Bacillus subtilis NCTC 10400 CIP 52.62 ATCC 6633 CCM 1999 CNCTC Bs 8/58	E - pH 7,9	30 až 37
Neomycini sulfas	Neomycini sulfas CRL	voda R	pH 8,0 (0,05 mol/l)		E - pH 7,9	30 až 37
Nystatinum	Nystatinum CRL	dimethylformamid R	pH 6,0 (0,05 ml/l) obsahující 5 % (V/V) dimethylformamidu R	Saccharomyces cerevisiae NCYC 87 CIP 1432.83 ATCC 9763 CCM 8191 CNCTC 51/65	F - pH 6,0	30 až 32
Polymyxini B sulfas	Polymyxini B sulfas CRL	voda R	pH 6,0 (0,05 mol/l)	Bordetella bronchiseptica NCTC 8344 CIP 53.157 ATCC 4617 CCM 4416 CNCTC Brb 5/63	B - pH 7,3	35 až 39
Rifamycinum natricum	Rifamycinum natricum CRL	methanol R	pH 7,0 (0,05 mol/l)	Micrococcus flavus NCTC 8340 CIP 53.45 ATCC 9341 CCM 552 CNCTC Sar 5/58	A - pH 6,6	35 až 39
Spiramycinum	Spiramycinum CRL	methanol R	pH 8,0 (0,05 mol/l)	Bacillus subtilis NCTC 10400 CIP 52.62 ATCC 6633 CCM 1999 CNCTC Bs 8/58	A - pH 7,9	30 až 32
Streptomycini sulfas	Streptomycini sulfas CRL	voda R	pH 8,0 (0,05 mol/l)	Bacillus subtilis NCTC 8236 CIP 1.83 CCM 2217 CNCTC Bs 17/65 Bacillus subtilis NCTC 10400 CIP 52.62 ATCC 6633 CCM 1999 CNCTC Bs 8/58	A - pH 7,9	30 až 37
Streptomycini sulfas	Streptomycini sulfas CRL	voda R	pH 8,0 (0,05 mol/l)		A - pH 7,9	30 až 37
Tobramycinum	Tobramycinum CRL	voda R	pH 8,0 (0,05 mol/l)	Bacillus subtilis NCTC 10400 CIP 52.62 ATCC 6633 CCM 1999 CNCTC Bs 8/58	A - pH 7,9	30 až 37
Vancomycini hydrochloridum	Vancomycini hydrochloridum CRL	voda R	pH 8,0	Bacillus subtilis NCTC 10400 CIP 52.62 ATCC 6633 CCM 1999 CNCTC Bs 8/58	A - pH 8,0	37 až 39

B. Turbidimetrická metoda

Vhodná živná půda se inokuluje suspenzí vybraného mikroorganismu, který je citlivý na zkoušené antibiotikum tak, aby v podmínkách zkoušky bylo dosaženo vhodného potlačení růstu mikrobiální kultury. Použije se známé množství suspenze vybrané tak, aby byl asi po čtyřhodinové inkubaci dobře měřitelný zákal.

Inokulovaná půda se musí použít ihned po naočkování.

Použije se rozpouštědlo a tlumivý roztok uvedený v tabulce 2.7.2-2 pro přípravu roztoků referenční látky a roztoků zkoušeného antibiotika ve známých koncentracích, u nichž se předpokládá stejná účinnost. K ověření platnosti stanovení se použijí nejméně tři dávky referenční látky a tři odpovídající dávky zkoušené látky. Doporučuje se použít geometrickou řadu dávek. K dosažení linearity je někdy nutné vybrat z většího počtu tří dávek za použití odpovídajících dávek referenční látky a zkoušené látky.

Použijí se stejné zkumavky. Do každé z nich se převede stejný objem roztoků a stejný objem naočkované živné půdy (např. 1 ml roztoku a 9 ml živné půdy).

Zároveň se připraví dvě kontrolní zkumavky bez antibiotika a s naočkovanou živnou půdou a do jedné se ihned přidá 0,5 ml formaldehydu R. Tyto zkumavky slouží ke standardizaci optického přístroje použitého k měření růstu.

Zkumavky se umístí buď náhodně, nebo podle latinského čtverce, nebo náhodného bloku do vodní lázně nebo jiného vhodného přístroje dovolujícího uvést rychle všechny zkumavky na uvedenou inkubační teplotu. Uchovávají se při této teplotě 3 h až 4 h a zabezpečí se stejná teplota a stejná doba inkubace.

Po inkubaci se zastaví ve všech zkumavkách růst mikroorganismů přidáním 0,5 ml formaldehydu R nebo zahřátím a změří se zákal s přesností na tři místa za použití vhodného optického přístroje. Alternativně lze použít jiný postup, který dovoluje měřit zákal každé zkumavky po stejné době inkubace.

Vypočítá se účinnost za pomoci vhodných statistických metod.

Linearita vztahu dávka-odpověď, transformovaná nebo netransformovaná, je často získána pouze ve velmi omezeném intervalu; je to ten interval, který se má použít pro výpočet účinnosti a obsahuje nejméně tři následné dávky dovolující ověřit linearitu. Při běžných zkouškách, pokud byla linearita systému prokázána na přiměřeném počtu třídávkových stanovení, postačí, pokud oprávněná autorita s tím souhlasí, použít k titraci jen dvě dávky. Ve všech sporných případech se však použije třídávková metoda.

V každé zkoušce se použije pro každou dávku tolik zkumavek, aby byla zajištěna požadovaná přesnost. Stanovení účinnosti může být opakováno a výsledky mohou být statisticky sloučeny, aby se dosáhlo požadované přesnosti stanovení a ověřilo se, že účinnost zkoušeného antibiotika není menší než požadované minimum.

Tab. 2.7.2-2 Turbidimetrická metoda

Metody používající značený antigen nebo značenou protilátku Metody používající neznačený antigen nebo neznačenou protilátku Imunoprecipitační metody Imunoelektroforetické metody Zviditelnění a charakterizace imunoprecipitačních linií Validace metod Validační požadavky Validační metody Statistické výpočty Tab. 2.7.2-1 Difuzní metoda Tab. 2.7.2-2 Turbidimetrická metoda
Antibiotikum	Referenční látka	Rozpouštědlo k přípravě základního roztoku	Tlumivý roztok (pH)	Mikroorganismus	Půda a konečné pH (± 0,1)	Inkubační teplota ve °C
Colistini sulfas	Colistini sulfas CRL			Escherichia coli NCIB 8666 CIP 2.83 ATCC 9637 CCM 2024	C - pH 7,0	35 až 37
Colistimethatum natricum	Colistimethatum natricum CRL	voda R	pH 7,0	Escherichia coli NCIB 8666 CIP 2.83 ATCC 9637 CCM 2024	C - pH 7,0	35 až 37
Dihydrostreptomycini sulfas	Dihydro- streptomycini sulfas CRL	voda R	pH 8,0	Klebsiella pneumoniae NCTC 7427 CIP 53.153 ATCC 10031 CCM 4415 CNCTC Klp 85/69	C - pH 7,0	35 až 37
Erythromycini estolas	Erythromycinum CRL	methanol R viz články		Klebsiella pneumoniae NCTC 7427 CIP 53.153 ATCC 10031 CCM 4415 CNCTC Klp 85/69 Staphylococcus aureus NCTC 7447 CIP 53.156 ATCC 6538 P CCM 2022 CNCTC Mau 28/58	D - pH 7,0	35 až 37
Erythromycini ethylsuccinas			pH 8,0
Erythromycini stearas					C - pH 7,0	35 až 37
Framycetini sulfas	Framycetini sulfas CRL	voda R	pH 8,0	Staphylococcus aureus NCTC 7447 CIP 53.156 ATCC 6538 P CCM 2022 CNCTC Mau 28/58	C - pH 7,0	35 až 37
Gentamicini sulfas	Gentamicini sulfas CRL	voda R	pH 7,0	Staphylococcus aureus NCTC 7447 CIP 53.156 ATCC 6538P CCM 2022 CNCTC Mau 28/58	C - pH 7,0	35 až 37
Gramicidin	Gramicidin CRL	methanol R	pH 7,0¹)	Streptococcus faecalis ATCC 10541 CCM 4533 CNCTC Str 6/58 Staphylococcus aureus ATCC 6538P CCM 2022 CNCTC Mau 28/58	C - pH 7,0	35 až 37
Kanamycini monosulfas	Kanamycini monosulfas CRL	voda R	pH 8,0	Staphylococcus aureus NCTC 7447 CIP 53.156 ATCC 6538 P CCM 2022 CNCTC Mau 28/58	C - pH 7,0	35 až 37
Kanamycini sulfas acidus					C - pH 7,0	35 až 37
Neomycini sulfas	Neomycini sulfas CRL	voda R	pH 8,0	Staphylococcus aureus NCTC 7447 CIP 53.156 ATCC 6538P CCM 2022 CNCTC Mau 28/58	C - pH 7,0	35 až 37
Rifamycinum natricum	Rifamycinum natricum CRL	methanol R	pH 7,0	Escherichia coli NICB 8879 CIP 54.127 ATCC 10536 CCM 3988 CNCTC Ec 32- 6/71	C - pH 7,0	35 až 37
Spiramycinum	Spiramycinum CRL	methanol R	pH 7,0	Staphylococcus aureus NCTC 7447 CIP 53.156 ATCC 6538P CCM 2022 CNCTC Mau 28/58	C - pH 7,0	35 až 37
Streptomycini sulfas	Streptomycini sulfas CRL	voda R	pH 8,0	Klebsiella pneumoniae NCTC 7427 CIP 53.153 ATCC 10031 CCM 4415 CNCTC Klp 85/69	C - pH 7,0	35 až 37
Tobramycinum	Tobramycinum CRL	voda R	pH 7,0	Staphylococcus aureus NCTC 7447 CIP 53.156 ATCC 6538 P CCM 2022 CNCTC Mau 28/58 NCTC 6571 CIP 53.154 ATCC 9144 CCM 2107 CNCTC Mau 76/69	C - pH 7,0	35 až 37
Vancomycini hydrochloridum	Vancomycini hydrochloridum CRL	voda R	pH 8,0	Staphylococcus aureus CIP 53.156 ATCC 6538P CCM 2022 CNCTC Mau 28/58	C - pH 7,0	37 až 39

Následující část se uvádí jako informace a rady; netvoří část, jež by byla v rozporu s obecnou metodou.

Doporučení pro mikrobiologické stanovení účinnosti antibiotik

Následující text uvádí doporučené mikroorganismy a podmínky zkoušky. Jiné mikroorganismy se mohou použít, pokud mají stejnou citlivost na zkoušené antibiotikum a jsou použity ve vhodné živné půdě a vhodných podmínkách teploty a pH. Výběr koncentrací roztoků musí zaručit, že v podmínkách zkoušky existuje lineární vztah mezi logaritmem dávky a odpovědí.

Příprava inokula

Bacillus cereus vac. mycoides, Bacillus subtilis, Bacillus pumilus. Suspenze spor použitého mikroorganismu se připraví takto:

Mikroorganismy se kultivují 7 dní při 35 °C až 37 °C na vhodné pevné půdě, do které byl přidán síran manganatý R (1 mg/l). Nárůst, který obsahuje zejména spory, se spláchne sterilní vodou R. Suspenze se 30 min zahřívá na 70 °C a potom se zředí na přiměřenou koncentraci spor, obvykle 10 . 10⁶ až 100 . 10⁶ v ml. Suspenze spor se mohou uchovávat po dlouhou dobu při teplotě nepřevyšující 4 °C.

Alternativně se mohou suspenze spor připravit kultivací mikroorganismů v půdě C při 26 °C po dobu 4 až 6 dní. Potom se asepticky přidá dostatek síranu manganatého R do koncentrace 1 mg/l a inkubuje se dalších 48 h. V suspenzi se mikroskopicky zjistí, zda proběhla přiměřená tvorba spor (asi 80 %) a suspenze se odstředí. Sediment se resuspenduje ve sterilní vodě R tak, aby se dosáhla koncentrace spor v ml 10 . 10⁶ až 100 . 10⁶ a potom se zahřívá 30 min na 70 °C. Suspenze se uchovává při teplotě nepřevyšující 4 °C.

Bordetella bronchiseptica. Testovací mikroorganismus se kultivuje na půdě B 16 h až 18 h při 35 °C až 37 °C. Nárůst se smyje sterilní vodou R a zředí na vhodný zákal.

Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Micrococcus flavus, Staphylococcus epidermidis. Připraví se stejně, jak je popsáno v odstavci Bordetella bronchiseptica, ale použije se půda A a naředí se na takový zákal, který při turbidimetrickém stanovení poskytuje uspokojující vztah dávky k odpovědi nebo při difuzním stanovení vytváří zřetelně ohraničené inhibiční zóny postačujícího průměru.

Saccharomyces cerevisiae, Candida tropicalis. Testovací mikroorganismus se kultivuje 24 h na půdě F při 30 °C až 37 °C. Nárůst se smyje sterilním roztokem chloridu sodného R (9 g/l) a zředí se jím na vhodný zákal.

Tlumivé roztoky

Tlumivé roztoky o pH v rozmezí 5,8 až 8,0 se připraví smícháním 50,0 ml dihydrogenfosforečnanu draselného 0,2 mol/l RS s množstvím hydroxidu sodného 0,2 mol/l VS uvedeným v následující tabulce a doplněním čerstvě připravenou vodou destilovanou R na 200,0 ml.

Tab. 2.7.2-3

Metody používající značený antigen nebo značenou protilátku Metody používající neznačený antigen nebo neznačenou protilátku Imunoprecipitační metody Imunoelektroforetické metody Zviditelnění a charakterizace imunoprecipitačních linií Validace metod Validační požadavky Validační metody Statistické výpočty Tab. 2.7.2-1 Difuzní metoda Tab. 2.7.2-2 Turbidimetrická metoda Doporučení pro mikrobiologické stanovení účinnosti antibiotik Příprava inokula Tlumivé roztoky Tab. 2.7.2-3
pH	Množství hydroxidu sodného 0,2 mol/l VS v ml
5,8	3,72
6,0	5,70
6,2	8,60
6,4	12,60
6,6	17,80
6,8	23,65
7,0	29,63
7,2	35,00
7,4	39,50
7,6	42,80
7,8	45,20
8,0	46,80

Tyto tlumivé roztoky se použijí pro všechny mikrobiologické zkoušky uvedené v tabulce 2.7.2-1 s výjimkou bleomyciniumsulfatu, pro který se tlumivý roztok o pH 6,8 připraví takto: rozpustí se 6,4 g dihydrogenfosforečnanu draselného R a 18,9 g hydrogenfosforečnanu sodného R ve vodě R a zředí se na 1000,0 ml.

Živné půdy

Mohou se použít následující půdy nebo půdy jim rovnocenné.

Metody používající značený antigen nebo značenou protilátku Metody používající neznačený antigen nebo neznačenou protilátku Imunoprecipitační metody Imunoelektroforetické metody Zviditelnění a charakterizace imunoprecipitačních linií Validace metod Validační požadavky Validační metody Statistické výpočty Tab. 2.7.2-1 Difuzní metoda Tab. 2.7.2-2 Turbidimetrická metoda Doporučení pro mikrobiologické stanovení účinnosti antibiotik Příprava inokula Tlumivé roztoky Tab. 2.7.2-3 Živné půdy
Půda A
pepton	6 g
pankreatický hydrolyzát kaseinu	4 g
hovězí výtažek	1,5 g
kvasničný výtažek	3 g
glukosa monohydrát	1 g
agar	15 g
voda	do 1000 ml
Půda B
pankreatický hydrolyzát kaseinu	17 g
papainový hydrolyzát sóji	3 g
chlorid sodný	5 g
hydrogenfosforečnan draselný	2,5 g
glukosa monohydrát	2,5 g
agar	15 g
polysorbát 80	10 g
voda	do 1000 ml

Polysorbát 80 se přidá k horkému roztoku ostatních složek po jejich rozvaření a bezprostředně před upravením objemu.

Metody používající značený antigen nebo značenou protilátku Metody používající neznačený antigen nebo neznačenou protilátku Imunoprecipitační metody Imunoelektroforetické metody Zviditelnění a charakterizace imunoprecipitačních linií Validace metod Validační požadavky Validační metody Statistické výpočty Tab. 2.7.2-1 Difuzní metoda Tab. 2.7.2-2 Turbidimetrická metoda Doporučení pro mikrobiologické stanovení účinnosti antibiotik Příprava inokula Tlumivé roztoky Tab. 2.7.2-3 Živné půdy
Půda C
pepton	6 g
hovězí výtažek	1,5 g
kvasničný výtažek	3 g
chlorid sodný	3,5 g
glukosa monohydrát	1 g
hydrogenfosforečnan draselný	3,68 g
dihydrogenfosforečnan draselný	1,32 g
voda	do 1000 ml
Půda D
výtažek ze srdce	1,5 g
kvasničný výtažek	1,5 g
pepton z kaseinu	5,0 g
glukosa monohydrát	1 g
chlorid sodný	3,5 g
hydrogenfosforečnan draselný	3,68 g
dihydrogenfosforečnan draselný	1,32 g
dusičnan draselný	2 g
voda	do 1000 ml
Půda E
pepton	5 g
masový výtažek	3 g
hydrogenfosforečnan sodný dodekahydrát	26,9 g
agar	10 g
voda	do 1000 ml

Hydrogenfosforečnan sodný se přidá jako sterilní roztok po sterilizaci půdy.

Metody používající značený antigen nebo značenou protilátku Metody používající neznačený antigen nebo neznačenou protilátku Imunoprecipitační metody Imunoelektroforetické metody Zviditelnění a charakterizace imunoprecipitačních linií Validace metod Validační požadavky Validační metody Statistické výpočty Tab. 2.7.2-1 Difuzní metoda Tab. 2.7.2-2 Turbidimetrická metoda Doporučení pro mikrobiologické stanovení účinnosti antibiotik Příprava inokula Tlumivé roztoky Tab. 2.7.2-3 Živné půdy
Půda F
pepton	9.4 g
kvasničný výtažek	4,7 g
hovězí výtažek	2.4 g
chlorid sodný	30,0 g
glukosa monohydrát	10,0 g
agar	23,5 g
voda	do 1000 ml
Půda G
glycerol	10 g
pepton	10 g
masový výtažek	10 g
chlorid sodný	3 g
agar	15 g
voda	do 1000 ml
pH 7 ± 1 po sterilizaci

2.7.3 Stanovení účinností kortikotropinu
Podstata zkoušky. Účinnost kortikotropinu je přímo úměrná poklesu obsahu kyseliny askorbové v nadledvinách potkana po hypofyzektomii. Stanovení se provádí v porovnání s účinkem mezinárodního standardu kortikotropinu nebo referečního přípravku, kalibrovaného v mezinárodních jednotkách.
Mezinárodní jednotka je účinnost obsažená v deklarovaném množství mezinárodního standardu, kterým je čištěný a lyofilizovaný prasečí kortikotropin smíchaný s laktosou.
Hodnotu účinnosti mezinárodního standardu v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Světová zdravotnická organizace.
Pro stanovení se použijí laboratorní potkani o hmotnosti 100 g až 200 g, při čemž rozdíl mezi nejlehčím a nejtěžším zvířetem ve skupině nemá být větší než 15 g. Potkani se chovají za standardních podmínek nejméně 7 dní před pokusem. Den před vlastní zkouškou se zvířata zváží a provede se hypofyzektomie.²) Po operaci se potkani umístí do místnosti se stálou teplotou mezi 24 °C až 27 °C a kromě standardní diety a vody se jim umožní volný přístup k roztoku, obsahujícímu glukosu R (50 g/l) a chlorid sodný R (1,8 g/l). Není-li předepsáno jinak, referenční přípravek i zkoušený přípravek se rozpustí v kyselině chlorovodíkové 0,01 mol/l RS na koncentraci odpovídající 5 m.j. kortikotropinu v 1 ml. K dalšímu ředění pro odstupňované dávky se použije roztok želatiny R (150 g/l). Roztoky se použijí nejpozději do 4 h po přípravě. Za 18 h až 36 h po hypofyzektomii se potkani znovu zváží a rozdělí do šesti skupin po osmi až deseti zvířatech. Třem skupinám se podává referenční přípravek a třem skupinám zkoušený přípravek ve třech odstupňovaných dávkách. Dávky se volí tak, aby po nejnižší dávce nastalo již hodnotitelné snížení obsahu kyseliny askorbové v nadledvinách a po nejvyšší nebylo ještě dosaženo největší snížení. Dávky se přepočtou na tělesnou hmotnost jednotlivého potkana a vstříknou se podkožně v objemu 0,5 ml/kg. Obvykle jsou vhodné dávky v pořadí: 1,0 m.j., 0,5 m.j. a 0,25 m.j. kortikotropinu na 100 g tělesné hmotnosti.
Přesně za tři hodiny po podání kortikotropinu se každému potkanovi v celkové anestezii vyjmou obě nadledviny, rychle se očistí od cizí tkáně a co nejrychleji se zváží, aby se předešlo ztrátě hmotnosti.
Vloží se do homogenizační zkumavky obsahující 2 ml čerstvě připraveného roztoku kyseliny metafosforečné R (25 g/l). Potkani se usmrtí a provede se kontrola úplnosti hypofyzektomie.
Nadledviny se zhomogenizují a obsah zkumavky se zředí stejným roztokem kyseliny metafosforečné R (25 g/l) na 10 ml. Za 30 min stání při pokojové teplotě se homogenát odstřeďuje a 7 ml čiré supematantní tekutiny se přidá k čerstvě připravené směsi tohoto složení: 7 ml roztoku octanu sodného R (45,3 g/l) upraveného přidáním kyseliny octové R na pH 7,3 ml vody R, 2 ml dichlotfenolin dofenolatu sodného RS.
Za 30 s po smíchání se měří kolorimetricky absorpce. Použije se filtr s největší transmisí při 470 nm a transmise s rozsahem od 450 nm do 520 nm. Obsah kyseliny askorbové se odečte ze standardní kalibrační křivky, která se sestrojí z výsledků měření vhodných objemů čerstvě připraveného roztoku kyseliny askorbové R přidaných do roztoku kyseliny metafosforečné R (25 g/l). Obsah kyseliny askorbové se vyjádří v miligramech na 100 g tkáně nadledvin každého potkana. Vypočtou se průměrné hodnoty pro potkany ve všech třech dávkových skupinách referenčního přípravku a zkoušeného přípravku a výsledky se vyhodnotí vhodnou statistickou metodou (5.3).

2.7.4 Stanovení účinnosti krevního koagulačního faktoru VIII
Podstata zkoušky. Při stanovení účinnosti krevního koagulačního faktoru VIII se využívá jeho biologického účinku jako kofaktoru aktivace faktoru X aktivovaným faktorem IX (faktor IXa) v přítomnosti iontů vápníku a fosfolipidů. Účinnost přípravku faktoru VIII se stanoví porovnáním množství potřebného k dosažení určité rychlosti tvorby faktoru Xa ve zkoušené směsi obsahující látky, jež se účastní aktivace faktoru X, s množstvím mezinárodního standardu nebo referenčního přípravku kalibrovaného v m.j., jež je zapotřebí k dosažení stejné rychlosti tvorby faktoru Xa.
Mezinárodní jednotka faktoru VIII je účinnost obsažená v deklarovaném množství mezinárodního standardu, kterým je lyofilizovaný koncetrát krevního koagulačního faktoru VIII. Hodnotu účinnosti mezinárodního standardu v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Světová zdravotnická organizace.
Lidský koagulační faktor VIII BRP se kalibruje porovnáním s mezinárodním standardem a jeho účinnost se vyjadřuje v mezinárodních jednotkách.
Chromogenní způsob stanovení se skládá ze dvou následných kroků: z aktivace faktoru X, která probíhá v reakční směsi složené z purifikovaných koagulačních faktorů a závisí na obsahu přítomného faktoru VIII, a z enzymatického štěpení chromogenního substrátu faktoru Xa, které je provázeno vznikem chromoforu, jehož množství se dá stanovit kvantitativně spektrofotometricky. Za vhodných podmínek stanovení je závislost rychlosti tvorby faktoru Xa na koncentraci faktoru VIII lineární. Stanovení se dá shrnout do následujícího schématu:
Oba kroky zahrnují zkoumadla, která se dají zajistit z různých komerčních zdrojů. Ačkoliv složení jednotlivých zkoumadel může mít některé odlišnosti, jejich základní rysy jsou popsány v následující specifikaci. Odchylky od tohoto popisu jsou přípustné, pokud se prokáže, že výsledky získané za použití mezinárodního standardu lidského koagulačního faktoru VIII se významně neliší.
Při použití komerčních testovacích souprav se zachovává návod výrobce; je důležité prokázat, že použitá testovací souprava je pro stanovení vhodná.
Zkoumadla
Názvem koagulační zkoumadla (dále zkoumadla) se označuje skupina přečištěných bílkovin lidského nebo hovězího původu. Zahrnuje faktor X, faktor IXa a aktivátor faktoru VIII, obvykle trombin. Tyto bílkoviny jsou částečně přečištěné, nejlépe alespoň na 50 % a neobsahují nečistoty, které by mohly zasahovat do aktivace faktoru VIII nebo faktoru X. Faktor X je přítomen v množstvích, jejichž konečná koncentrace během prvého kroku stanovení je 10 nmol/l až 350 nmol/l, obvykle 15 nmol/l až 30 nmol/l. Faktor IXa vzniká aktivací přečištěného faktoru IX na faktor IXaβ pomocí faktoru XIa a následným přečištěním faktoru IXaβ z reakční směsi. Jeho konečná koncentrace během tvorby faktoru Xa je méně než 30 % koncentrace faktoru X, obvykle 1 nmol/l až 100 nmol/l, nejlépe 1 nmol/l až 10 nmol/l. Trombin může být přítomen ve formě svého prekurzoru protrombinu za předpokladu, že jeho aktivace ve zkoumadle je dostatečně rychlá, aby se při stanovení zajistila téměř okamžitá a úplná aktivace faktoru VIII. Fosfolipidy mohou být přírodního původu, např. extrakt z hovězího mozku nebo míchy nebo extrakt ze sójových bohů, nebo se mohou připravit synteticky a musí obsahovat v dostatečné míře, obvykle 15 % až 35 %, fosfatidylserin. Konečná koncentrace fosfolipidu během tvorby faktoru Xa je 1 nmol/l až 50 nmol/l, nejlépe 10 nmol/l až 35 nmol/l. Zkoumadlo obsahuje ionty vápníku v konečné koncentraci 5 nmol/l až 15 mmol/l. Ke konečné tvorbě faktoru Xa dochází v roztoku, který obsahuje nejméně 1 mg/ml lidského nebo hovězího albuminu, jehož pH je vhodně upraveno na hodnotu 7,3 až 8,0. Složky konečného zkoumadla se obvykle rozdělují alespoň do dvou oddělených zkoumadel, z nichž žádné nemá vlastní schopnost tvorby faktoru Xa. Po rekonstituci mohou být spojeny za předpokladu, že v nepřítomnosti faktoru VIII nemůže vzniknout významné množství faktoru Xa. V konečné inkubační směsi musí být faktor VIII jedinou složkou, která určuje rychlost.
V druhém kroku se vytvořený faktor Xa stanoví pomocí chromogenního substrátu specifického pro faktor Xa. Tím je obvykle derivát krátkého peptidu ze tří až pěti aminokyselin s připojenou skupinou chromoforu. Při odštěpení této skupiny z peptidického substrátu se její chromoformní vlastnosti posunou do vlnové délky, která umožňuje její spektrofotometrické stanovení. Substrát je obvykle rozpuštěný ve vodě a používá se v konečné koncentraci 0,2 mmol/l až 2 mmol/l. Substrát může dále zahrnovat vhodné inhibitory pro zastavení další tvorby faktoru Xa a pro potlačení aktivity trombinu a tím se zlepšuje selektivita stanovení faktoru Xa.
Postup stanovení
Pomocí odpovídajícího množstvím vody R se rekonstituuje celý obsah ampule s referenčním přípravkem i obsah ampule se zkoušeným přípravkem; přípravky se použijí ihned po rozpuštění. Rekonstituované přípravky se ještě dostatečně předředí na roztoky s obsahem mezi 0,5 m.j./ml až 2,0 m.j./ml.
Předředění se provádí plazmou pacienta s těžkou formou hemofilie A nebo uměle připraveným zkoumadlem poskytujícím výsledky, které se významně neliší od výsledků stanovení s hemofilickou plazmou a se stejným referenčním a zkoušeným přípravkem. Předředěné roztoky musí být stabilní po dobu potřebnou na stanovení, nejméně 30 min při 20 °C a použijí se do 15 min.
Připraví se další ředění referenčního a zkoušeného přípravku. K tomu se použije izotonický tlumivý roztok bez chelatotvorných složek, který obsahuje 1 % lidského nebo hovězího albuminu a např. trometamol nebo imidazol a jehož pH se upraví na 7,3 až 8,0. Připraví se alespoň tři samostatná, nezávislá ředění obou přípravků, nejlépe každé samostatné ředění dvojmo. Připravují se ředění tak, aby konečná koncentrace faktoru VIII byla během kroku, kdy dochází k tvorbě faktoru Xa, nižší než 0,03 m.j./ml, přednostně nižší než 0,01 m.j./ml.
Připraví se kontrolní roztok, který obsahuje všechny složky kromě faktoru VIII.
Všechna ředění se připravují ve zkumavkách z plastu a ihned se použijí.
Krok 1. Předehřátá ředění referenčního přípravku faktoru VIII i zkoušeného přípravku se smíchají s odpovídajícím objemem předehřátého koagulačního zkoumadla nebo se směsí jeho oddělených složek. Takto připravené směsi se inkubují ve zkumavkách z plastů nebo v jamkách mikrotitračních destiček při 37 °C. Koncentrace jednotlivých komponent během tvorby faktoru Xa se musí řídit specifikací uvedenou výše v odstavci Zkoumadla. Ponechá se dostatečně dlouhá doba na aktivaci faktoru X, nejlépe taková, aby došlo k ukončení reakce před dosažením maximální hodnoty koncentrace faktoru Xa, aby se dosáhlo dostatečné lineární závislosti odpovědi na dávce. Aktivační čas se také vybírá tak, aby se dosáhlo lineárního průběhu křivky tvorby faktoru Xa v závislosti na čase. Vyhovující aktivační čas je obvykle mezi 2 min až 5 min, ale jsou možné odchylky, pokud se dosáhne lepší linearity závislosti odpovědi na dávce.
Krok 2. Aktivace se ukončí přidáním předehřátého zkoumadla, které obsahuje chromogenní substrát. Kvantitativně se stanoví rychlost štěpení substrátu, která musí lineárně záviset na koncentraci vzniklého faktoru Xa. Stanovení se provádí měřením změny absorbance spektrofotometrem při vhodné vlnové délce. Buď se sleduje absorbance kontinuálně, což umožňuje výpočet počáteční rychlosti štěpení substrátu, nebo se ukončí hydrolytická reakce po odpovídajícím časovém intervalu tím, že se sníží pH přidáním vhodného zkoumadla, jako je kyselina octová (50 % V/V C₂H₄O₂) nebo citronanový roztok (1 mol/l) o pH 3. Doba hydrolýzy se nastaví tak, aby se dosáhlo lineární tvorby chromoforu v závislosti na čase. Vhodná doba hydrolýzy je obvykle mezi 3 min a 15 min. Jsou ale možné odchylky, pokud se tím dosáhne lepší lineární závislosti odpovědi na dávce.
Ověří se validita stanovení a účinnost zkoušeného přípravku se vypočte obvyklými statistickými metodami pro stanovení poměru sklonů (např. Statistická analýza výsledků biologických zkoušek (5.3)).

2.7.5 Stanovení účinností heparinu
Antikoagulační účinnost heparinu se stanoví in vitro porovnáním jeho schopnosti zpomalovat za daných podmínek srážení rekalcifikované citronanové ovčí plazmy se stejnou schopností referenčního přípravku heparinu, kalibrovaného v mezinárodních jednotkách.
Mezinárodní jednotka je účinnost obsažená v deklarovaném množství mezinárodního standardu, kterým je lyofilizovaná sodná sůl heparinu, připravená z vepřové střevní mukózy. Hodnotu účinnosti mezinárodního standardu v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Světová zdravotnická organizace.
Účinnost sodné soli heparinu BRP se kalibruje v mezinárodních jednotkách v porovnání s mezinárodním standardem za pomoci některého dále uvedeného postupu stanovení.
Provede se stanovení jednou z následujících metod pro určení počátku srážení s použitím zkumavek a dalšího, pro zvolenou metodu vhodného zařízení:
1. a) přímá vizuální detekce, nejlépe při nepřímém osvětlení proti matnému černému pozadí,
2. b) spektrofotometrický záznam změny optické hustoty při vlnové délce asi 600 nm,
3. c) vizuální detekce změny tekutosti při ručním překlápění zkumavek,
4. d) automatický záznam změny tekutosti při míchání; dbá se, aby se při začáteční fázi srážení co nejvíce předešlo narušení roztoku.
Postup stanovení. Objemy uvedené v dalším textu slouží jako příklady a mohou být přizpůsobeny zvolenému zařízení za předpokladu, že jejich poměry zůstanou zachovány.
Sodná sůl heparinu BRP se rozpustí v roztoku chloridu sodného R (9 g/l) tak, aby výsledný roztok obsahoval v mililitru přesně známý počet mezinárodních jednotek. Obdobně se připraví roztok zkoušeného přípravku o stejné předpokládané účinnosti. Pomocí roztoku chloridu sodného R (9 g/l) se z obou roztoků připraví geometrické řady ředění tak, aby čas srážení zaznamenaný pro nejnižší koncentraci byl nejméně 1,5násobek času potřebného ke srážení při slepé zkoušce a aby při nejvyšší koncentraci bylo dosaženo vyhovujícího průběhu závislosti log dávka-odezva, podle stanovení v předběžné zkoušce.
Do ledové vodní lázně se vloží dvanáct zkumavek po dvojicích označených T₁, T₂ a T₃ pro dvojí měření tří ředění zkoušeného přípravku a S₁, S₂ a S₃ pro dvojí měření tří ředění referenčního přípravku. Do každé zkumavky se odměří 1,0 ml rozmražené plazmy substrátu R1 a 1,0 ml vhodně zředěného zkoušeného přípravku nebo 1,0 ml vhodně zředěného referenčního přípravku. Po každém přídavku se obsah zkumavek opatrně promíchá tak, aby se netvořily bubliny. Zkumavky v pořadí S₁, S₂, S₃, T₁, T₂ a T₃ se přenesou do vodní lázně o teplotě 37 °C na dobu 15 min. Poté se do každé zkumavky odměří 1 ml zkoumadla cefalinového R ke kterému byl přidán vhodný aktivátor jako je kaolin, v takovém množství, aby srážení ve slepé zkoušce nastalo v čase kratším než 60 s. Při aktivaci kaolinem se bezprostředně před použitím připraví směs stejných objemů zkoumadla cefalinového R a suspenze kaolinu lehkého R (4 g/l) v roztoku chloridu sodného R (9 g/l). Přesně za 2 min se do každé zkumavky přidá 1 ml roztoku chloridu vápenatého R (3,7 g/l) a zvolenou metodou (a, b, c nebo d) se stanoví čas srážení v sekundách mezi tímto posledním přídavkem a začátkem srážení. Čas srážení ve slepé zkoušce se obdobně stanoví tak, že namísto roztoku heparinu se do zkumavky odměří 1 ml roztoku chloridu sodného R (9 g/l). Slepé zkoušky se zařadí na začátek a na konec postupu měření. Hodnoty stanovené pro dvojici slepých zkoušek se nemají významně lišit. Střední hodnoty časů srážení zaznamenaných pro jednotlivé dvojice se převedou do logaritmického tvaru. Postup se zopakuje za použití čerstvých roztoků, při dodržení pořadí pro inkubaci T₁, T₂, T₃, S₁, S₂ a S₃. Výsledky se vypočítají za použití obvyklých statistických metod.
Provedou se vždy nejméně tři nezávislá stanovení. Pro každé stanovení se připraví čerstvé roztoky referenčního přípravku, zkoušeného přípravku a jiné, čerstvě rozmražené plazmy.
Účinnost zkoušeného přípravku se stanoví z výsledků všech měření za použití obvyklých statistických metod. Jestliže rozptyl mezi jednotlivými stanoveními je významný na P = 0,01, může se stanovit výsledná účinnost výpočtem prostého průměru z jednotlivých stanovení.

2.7.6 Stanovení účinností adsorbované vakcíny proti záškrtu
Podstata zkoušky. Účinnost adsorbované vakcíny proti záškrtu se stanoví porovnáním dávky potřebné k ochraně morčat před účinkem difterického toxinu s dávkou referenčního přípravku, vyjádřenou v mezinárodních jednotkách, která poskytuje stejnou ochranu. Toxin se vstřikuje buď intradermálně a sleduje se vznik specifického erytému, nebo subkutánně a sleduje se úhyn zvířat.
Mezinárodní jednotka je účinnost obsažená v deklarovaném množství mezinárodního standardu. Tento standard pozůstává z určitého množství difterického toxoidu adsorbovaného na hydroxid hlinitý. Hodnotu účinnosti mezinárodního standardu v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Světová zdravotnická organizace.
Metoda sledování erytému po intradermálním podání
Výběr a rozdělení pokusných zvířat. Ke zkoušce se použijí zdravá bílá morčata z jednoho chovu a takové velikosti, která umožní předepsaný počet injekčních podání. Rozdíl v hmotnosti mezi nejtěžším a nejlehčím zvířetem nepřesahuje 100 g. Zvířata se rozdělí do nejméně šesti stejně velkých skupin. Počet zvířat ve skupině postačuje k tomu, aby byly splněny dále předepsané požadavky na platnost zkoušky. Pokud není prokázána stabilita toxinu nebo tento toxin není dostatečně standardizován, přibere se pět morčat jako neimunizovaná kontrola. Morčata jsou stejného pohlaví nebo se samci a samice rovnoměrně rozdělí do skupin.
Výběr toxinu. Difterický toxin, který se použije ke zkoušce, obsahuje 67 až 133 Lr/100 v 1 Lf a 25 000 až 50 000 nejmenších dávek reagujících v kůži morčat v 1 Lf. Pokud je prokázána stabilita tohoto toxinu, není třeba ověřovat jeho účinnost při každém stanovení.
Příprava roztoku toxinu. Toxin se bezprostředně před použitím zředí vhodným rozpouštědlem tak, aby 0,2 ml obsahovalo asi 0,0512 Lf. Z něho se připraví řada pěti čtyřnásobných ředění obsahujících asi 0,0128, 0,0032, 0,0008, 0,0002 a 0,00005 Lf v 0,2 ml.
Stanovení účinnosti zkoušené vakcíny. Zkoušený přípravek a referenční přípravek se zředí roztokem chloridu sodného R (9 g/l) tak, aby jednotlivá ředění byla odstupňována nejvýše 2,5násobně a aby střední ředění při subkutánním podání (v dávce 1,0 ml na morče) dovolila po podání toxinu vznik intradermální reakce asi u tří ředění toxinu. Pro každé ředění se vybere jedna skupina morčat a všem morčatům ve skupině se subkutánně vstříkne po 1,0 ml příslušného ředění. Po 28 dnech se všem morčatům oholí oba boky a každému zvířeti se intradermálně vstříkne 0,2 ml každého z šesti ředění toxinu na šest různých míst tak, aby vzájemné působení sousedících míst bylo co nejmenší.
Stanovení účinnosti toxinu. Je-li třeba, vstříknou se neimunizovaným kontrolním zvířatům roztoky obsahující 80, 40, 20, 10 a 5 milióntin Lf toxinu.
Odečítání a hodnocení výsledků. 48 h po podání toxinu se vyšetří všechna místa podání a u každého zvířete se formou poměru zaznamená počet míst se specifickým difterickým erytémem a počet míst bez této reakce. Hodnoty těchto poměrů pro všechna zvířata, jimž bylo podáno stejné ředění očkovací látky, se spojí a zaznamenají do tabulky. Tyto údaje se vhodnou transformací, jako např. (hodnota poměru)² nebo arcsin ((hodnota poměru/6)²), použijí na získání odhadu relativní účinnosti každé zkoušené vakcíny pomocí kvantitativního hodnocení rovnoběžných přímek.
Požadavky na platnost zkoušky. Zkouška je platná, jsou-li splněny tyto požadavky:
1. - zkoušená vakcína a referenční přípravek vykazují průměrný počet reakcí při nejnižší dávce nižší než tři a při nejvyšší dávce vyšší než tři,
2. - je-li třeba, ředění toxinu obsahující 40 milióntin Lf dávky vyvolá pozitivní erytémovou reakci nejméně u 80 % kontrolních morčat a ředění obsahující 20 milióntin Lf dávky nevyvolá u nejméně 80 % kontrolních zvířat žádnou reakci (nejsou-li splněna tato kritéria, vybere se jiný toxin),
3. - interval spolehlivosti stanovení (P = 0,95) je v rozmezí 50 % až 200 % stanovené účinnosti,
4. - statistické hodnocení neukazuje odchylku od linearity a rovnoběžnosti.
Zkouška se může opakovat, ale jestliže se provede více stanovení, výsledky všech platných stanovení se sloučí.
Metoda sledování úhynu
Výběr a rozdělení pokusných zvířat. Ke zkoušce se použijí zdravá morčata o hmotnosti 250 g až 350 g pocházející z jednoho chovu. Morčata se rozdělí do nejméně šesti stejně velkých skupin. Počet zvířat ve skupině postačuje k tomu, aby byly splněny dále předepsané požadavky na platnost zkoušky. Pokud není prokázána stabilita toxinu nebo není-li tento toxin dostatečně standardizován, přiberou se další čtyři skupiny po pěti morčatech jako neimunizovaná kontrola. Morčata jsou stejného pohlaví nebo se samci a samice rovnoměrně rozdělí do skupin.
Výběr toxinu. Vybere se takový difterický toxin, který v 1 ml obsahuje nejméně 100 LD₅₀. Pokud je prokázána stabilita tohoto toxinu, není třeba ověřovat jeho střední smrtnou dávku při každém stanovení.
Příprava roztoku toxinu. Bezprostředně před použitím se toxin zředí vhodným rozpouštědlem tak, aby se získal roztok toxinu obsahující v 1 ml asi 100 LD₅₀. Je-li třeba, zředí se dále část roztoku toxinu stejným rozpouštědlem v poměrech 1 : 32, 1 : 100 a 1 : 320.
Stanovení účinnosti vakcíny. Zkoušený přípravek a referenční přípravek se zředí roztokem chloridu sodného R (9 g/l) tak, aby jednotlivá ředění byla odstupňována nejvýše 2,5násobně a aby střední ředění po subkutánním podání (v dávce 1,0 ml na morče) ochránila přibližně 50 % zvířat před letálním účinkem předepsané dávky difterického toxinu podaného subkutánně. Pro každé ředění se vybere jedna skupina morčat a všem morčatům ve skupině se subkutánně vstříkne po 1,0 ml příslušného ředění. Po 28 dnech se všem zvířatům subkutánně vstříkne 1,0 ml roztoku toxinu (100 LD₅₀).
Stanovení účinnosti toxinu. Je-li třeba, připraví se na podání roztoku toxinu a jeho tří ředění čtyři skupiny po pěti morčatech. Každému zvířeti ve skupině se subkutánně vstříkne 1,0 ml příslušného ředění toxinu.
Odečítání a hodnocení výsledků. Za 4 dny od podání toxinu se odečte počet přežívajících morčat. Účinnost zkoušené vakcíny se vyhodnotí porovnáním s účinností referenčního přípravku na základě poměru počtu přežívajících zvířat v každé skupině imunizovaných morčat, za použití obvyklých statistických metod.
Požadavky na platnost zkoušky. Zkouška je platná, jsou-li splněny tyto požadavky:
1. - 50% ochranná dávka zkoušeného a referenčního přípravku je mezi nejvyšší a nejnižší dávkou podanou morčatům,
2. - v případě, že čtyřem skupinám po pěti morčatech byl vstříknut roztok toxinu a jeho tři ředění, má počet uhynulých zvířat ukázat, že použitá dávka toxinu byla přibližně 100 LD ₅₀,
3. - interval spolehlivosti stanovení (P = 0,95) je v rozmezí 50 % až 200 % stanovené účinnosti,
4. - statistické hodnocení neukazuje odchylku od linearity a rovnoběžnosti.
Zkouška se může opakovat, ale jestliže se provede více stanovení, výsledky všech platných stanovení se sloučí.

2.7.7 Stanovení účinnosti vakcíny proti dávivému kašli
Podstata zkoušky. Účinnost vakcíny proti dávivému kašli se stanoví porovnáním dávky potřebné na ochranu myší před účinkem intracerebrálně podané letální dávky bakterie Bordetella pertussis s dávkou referenčního přípravku vyjádřenou v mezinárodních jednotkách, která poskytuje stejnou ochranu.
Mezinárodní jednotka je účinnost obsažená v deklarovaném množství mezinárodního standardu, který pozůstává z určitého množství sušené očkovací látky proti dávivému kašli. Hodnotu účinnosti mezinárodního standardu v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Světová zdravotnická organizace.
Výběr a rozdělení pokusných zvířat. Ke zkoušce se použijí zdravé myši, nejvýše 5 týdnů staré, vhodného kmene a pocházející z jednoho chovu. Rozdíl hmotnosti mezi nejtěžší a nejlehčí myší nepřesahuje 5 g. Vytvoří se šest skupin po nejméně šestnácti myších a čtyři skupiny po deseti myších. Myši jsou stejného pohlaví nebo se samci a samice rovnoměrně rozdělí do skupin.
Výběr infekčního kmene a příprava jeho suspenze k infekci. Vybere se vhodný kmen B. pertussis, který je schopen způsobit úhyn myší v průběhu 14 dní po intracerebrální infekci. Kmen není vhodný, jestliže za 48 h po aplikaci uhyne víc než 20 % myší. Připraví se subkultura kmene a získané bakterie B. pertussis se suspendují v roztoku obsahujícím kaseinový hydrolyzát (10 g/l) a chlorid sodný R (6 g/l) s hodnotou pH v rozmezí 7,0 až 7,2 nebo v jiném vhodném roztoku. Změří se zákal suspenze a ve stejném roztoku se připraví řada ředění. Na každé ředění se použije skupina deseti myší, kterým se intracerebrálně vstříkne po 0,02 ml nebo 0,03 ml příslušného ředění. Po 14 dnech se v každé skupině spočítají přežívající myši a z výsledků se vypočítá očekávaný zákal suspenze, která bude obsahovat 100 LD₅₀ v každé infekční dávce.
Pro zkoušení očkovací látky se připraví čerstvá subkultura téhož kmene B. pertussis a z ní suspenze bakterií se zákalem odpovídajícím přibližně 100 LD ₅₀ v každé infekční dávce. Z této suspenze se připraví tři ředění.
Stanovení účinnosti. Připraví se tři odstupňovaná ředění zkoušené vakcíny a tři podobná ředění referenčního přípravku tak, aby se mohlo očekávat, že střední ředění uchrání asi 50 % myší před letálním účinkem infekční dávky B. pertussis. Doporučené dávky jsou 1/8, 1/40 a 1/200 lidské dávky zkoušené vakcíny a 0,5, 0,1 a 0,02 mezinárodní jednotky referenčního přípravku, přičemž jsou tato množství obsažena v objemu nepřesahujícím 0,5 ml. Každým z těchto šesti ředění se imunizuje jedna skupina myší obsahující šestnáct zvířat; každé myši se vstříkne intraperitoneálně jedna dávka příslušného ředění. Za 14 až 17 dní se všechny myši infikují intracerebrálně jednou dávkou infekční suspenze. Stejnou dávkou infekční suspenze a z ní připravenými třemi ředěními se též intracerebrálně infikují čtyři skupiny po deseti myších. Z hodnocení se vyloučí všechny myši uhynulé v průběhu 48 h po infikování. Po 14 dnech se v každé skupině spočítají přežívající myši. Na základě počtů přežívajících zvířat v jednotlivých skupinách (po nejméně šestnácti zvířatech) se vyhodnotí účinnost zkoušené vakcíny v porovnání s účinností referenčního přípravku.
Požadavky na platnost zkoušky. Zkouška je platná, jsou-li splněny tyto požadavky:
1. - 50% ochranná dávka zkoušeného a referenčního přípravku je mezi nejvyšší a nejnižší dávkou podanou myším,
2. - počet myší uhynulých ve čtyřech skupinách po deseti zvířatech po podání infekční suspenze a jejích ředění udává, že infekční dávka byla přibližně 100 LD₅₀,
3. - statistické hodnocení neukazuje odchylku od linearity nebo rovnoběžnosti.
Zkouška se může opakovat, ale jestliže se provede více stanovení, výsledky všech platných stanovení se sloučí.

2.7.8 Stanovení účinnosti adsorbované vakcíny proti tetanu
Podstata zkoušky. Účinnost adsorbované vakcíny proti tetanu se stanoví porovnáním dávky potřebné k ochraně morčat nebo myší před účinkem subkutánní injekce paralyzující dávky tetanického toxinu s dávkou referenčního přípravku vyjádřenou v mezinárodních jednotkách, která poskytuje stejnou ochranu. V zemích, kde není povinná metoda s paralýzou, je možno použít metodu střední smrtné dávky (LD₅₀). Pro ni je počet zvířat a postup totožný s popsanou metodou paralýzy, avšak zkouška se místo podle příznaků tetanické paralýzy hodnotí podle úhynu zvířat.
Mezinárodní jednotka je účinnost obsažená v deklarovaném množství mezinárodního standardu, který pozůstává z určitého množství tetanického toxoidu adsorbovaného na hydroxid hlinitý. Hodnotu účinnosti mezinárodního standardu v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Světová zdravotnická organizace.
Zkouška na morčatech
Výběr a rozdělení pokusných zvířat. Ke zkoušce se použijí zdravá morčata z jednoho chovu, jejichž hmotnost je v rozmezí 250 g až 350 g. Zvířata se rozdělí do nejméně šesti stejně velkých skupin. Počet zvířat ve skupině postačuje k tomu, aby byly splněny dále předepsané požadavky na platnost zkoušky. Pokud není prokázána stabilita toxinu nebo tento toxin není dostatečně standardizován, přiberou se další čtyři skupiny po pěti morčatech jako neimunizovaná kontrola. Morčata jsou stejného pohlaví nebo se samci a samice rovnoměrně rozdělí do skupin.
Výběr toxinu. Zvolí se tetanický toxin obsahující v 1 ml nejméně padesátinásobek 50% paralyzující dávky. Pokud je prokázána stabilita tohoto toxinu, není třeba ověřovat paralyzující dávku při každém stanovení.
Příprava roztoku toxinu. Toxin se bezprostředně před použitím zředí vhodným rozpouštědlem tak, aby 1 ml obsahoval asi padesátinásobek 50% paralyzující dávky. Je-li třeba, zředí se dále část roztoku toxinu stejným rozpouštědlem v poměrech 1 : 16, 1 : 50 a 1 : 160.
Stanovení účinnosti zkoušené vakcíny. Zkoušená vakcína a referenční přípravek se zředí roztokem chloridu sodného R (9 g/l) tak, aby jednotlivá ředění byla odstupňována nejvýše 2,5násobně a aby střední ředění při subkutánním podání (v dávce 1,0 ml na morče) ochránila přibližně 50 % zvířat před paralyzujícím účinkem předepsané dávky tetanického toxinu podaného subkutánně. Pro každé ředění se vybere jedna skupina morčat a všem morčatům ve skupině se subkutánně vstříkne po 1,0 ml příslušného ředění. Po 28 dnech se každému zvířeti subkutánně vstříkne 1,0 ml roztoku toxinu (padesátinásobek 50% paralyzující dávky).
Stanovení účinnosti toxinu. Je-li třeba, vstříkne se neimunizovaným kontrolním zvířatům (čtyři skupiny po pěti morčatech) subkutánně po 1,0 ml roztoku toxinu nebo jeho příslušného ředění tak, že každé skupině se podá jedna koncentrace.
Odečítání a hodnocení výsledků. Zvířata se kontrolují dvakrát denně, přičemž se vyřadí všechna zvířata se zřetelnými příznaky tetanické paralýzy a šetrně se utratí. Pět dní po podání roztoku toxinu se spočítají zvířata bez příznaků paralýzy. Účinnost zkoušené vakcíny se vyhodnotí za použití obvyklých statistických metod porovnáním s účinností referenčního přípravku na základě poměru počtu imunizovaných morčat bez příznaků paralýzy v každé skupině po podání roztoku toxinu.
Požadavky na platnost zkoušky. Zkouška je platná, jsou-li splněny tyto požadavky:
1. - 50% ochranná dávka zkoušeného a referenčnho přípravku je mezi nejvyšší a nejnižší dávkou podanou zvířatům,
2. - v případě, že byl čtyřem skupinám po pěti morčatech vstříknut roztok toxinu a jeho tři ředění, má počet paralyzovaných zvířat ukázat, že použitá dávka toxinu byla přibližně padesátinásobkem 50% paralyzující dávky,
3. - interval spolehlivosti stanovení (P = 0,95) je mezi 50 % až 200 % stanovené účinnosti,
4. - statistické hodnocení neukazuje odchylku od linearity a rovnoběžnosti.
Zkouška se může opakovat, ale jestliže se provede více stanovení, výsledky všech platných stanovení se sloučí.
Zkouška na myších
Výběr a rozdělení pokusných zvířat. Ke zkoušce se použijí zdravé myši z jednoho chovu, hmotnosti 14 g až 20 g. Myši se rozdělí do nejméně šesti stejně velkých skupin. Počet zvířat ve skupině postačuje k tomu, aby byly splněny dále předepsané požadavky na platnost zkoušky. Pokud není prokázána stabilita toxinu nebo tento toxin není dostatečně standardizován, přiberou se další čtyři skupiny po šesti myších jako neimunizovaná kontrola. Myši jsou stejného pohlaví nebo se samci a samice rovnoměrně rozdělí do skupin.
Výběr toxinu. Zvolí se tetanický toxin obsahující v 1 ml nejméně stonásobek 50% paralyzující dávky. Pokud je prokázána stabilita tohoto toxinu, není třeba ověřovat paralytickou dávku při každém stanovení.
Příprava roztoku toxinu. Toxin se bezprostředně před použitím zředí vhodným rozpouštědlem tak, aby v 0,5 ml byl obsažen asi padesátinásobek 50% paralyzující dávky. Je-li to třeba, zředí se dále část roztoku toxinu stejným rozpouštědlem v poměrech 1 : 16, 1 : 50 a 1 : 160.
Stanovení účinnosti zkoušené vakcíny. Zkoušená vakcína a referenční přípravek se naředí roztokem chloridu sodného R (9 g/l) tak, aby jednotlivá ředění byla odstupňována nejvýše 2,5násobně a aby střední ředění po subkutánním podání (v dávce 0,5 ml na myš) ochránila přibližně 50 % zvířat před paralyzujícím účinkem předepsané dávky tetanického toxinu podaného subkutánně. Pro každé ředění se vybere jedna skupina myší a všem myším ve skupině se subkutánně vstříkne po 0,5 ml příslušného ředění. Po 28 dnech se každému zvířeti subkutánně vstříkne 0,5 ml roztoku toxinu (padesátinásobek 50% paralyzující dávky).
Stanovení účinosti toxinu. Je-li třeba, vstříkne se neimunizovaným kontrolním zvířatům (čtyři skupiny po šesti myších) subkutánně po 0,5 ml roztoku toxinu nebo jeho příslušného ředění tak, že každé skupině se podá jedna koncentrace.
Odečítání a hodnocení výsledků. Zvířata se kontrolují dvakrát denně, přičemž se vyřadí všechna zvířata se zřetelnými příznaky tetanické paralýzy a šetrně se utratí. Čtyři dny po podání roztoku toxinu se spočítají zvířata bez příznaků paralýzy. Účinnost zkoušené vakcíny se vyhodnotí za použití obvyklých statistických metod porovnáním s účinností referenčního přípravku na základě poměru počtu imunizovaných zvířat bez příznaků paralýzy v každé skupině.
Požadavky na platnost zkoušky. Zkouška je platná, jsou-li splněny tyto požadavky:
1. - 50% ochranná dávka zkoušeného a referenčního přípravku je mezi nejvyšší a nejnižší dávkou přípravků podaných zvířatům,
2. - v případě, že byl čtyřem skupinám po šesti myších vstříknut roztok toxinu a jeho tři ředění, má počet paralyzovaných zvířat ukázat, že použitá dávka toxinu byla přibližně padesátinásobkem 50% paralyzující dávky,
3. - interval spolehlivosti stanovení (P = 0,95) je v rozmezí 50 % až 200 % stanovené účinnosti,
4. - statistické hodnocení neukazuje odchylku od linearity a rovnoběžnosti.
Zkouška se může opakovat, ale jestliže se provede více stanovení, výsledky všech platných stanovení se sloučí.

2.7.9 Zkouška na Fc funkci imunoglobulinu
Podstata zkoušky. Srovnání průběhu hemolýzy senzibilizovaných lidských červených krvinek v přítomnosti zkoušeného přípravku s průběhem hemolýzy v přítomnosti porovnávacího lidského imunoglobulinu.
Příprava zkoumadel
Stabilizovaná lidská krev. Lidská krev skupiny 0 se odebere do antikoagulačního roztoku ACD. Stabilizovaná krev se uchovává při 4 °C nejdéle 3 týdny.
Tlumivý roztok fosforečnanový s chloridem sodným o pH 7,2. 1,022 g hydrofosforečnanu sodného bezvodého R, 0,336 g dihydrofosforečnanu sodného bezvodého R a 8,766 g chloridu sodného R se rozpustí v 800 ml vody R a zředí se jí na 1000 ml.
Zásobní roztok hořčíku a vápníku. 1,103 g chloridu vápenatého R a 5,083 g chloridu horečnatého R se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 25 ml.
Zásobní tlumivý roztok barbitalový. 207,5 g chloridu sodného R a 25,48 g barbitalu sodné soli R se rozpustí v 4000 ml vody R a pH se upraví kyselinou chlorovodíkovou 1 mol/l RS na 7,3. Přidá se 12,5 ml zásobního roztoku hořčíku a vápníku a zředí se vodou R na 5000 ml. Roztok se filtruje membránovým filtrem (0,22 μm) a uchovává při 4 °C ve skleněných obalech.
Tlumivý roztok barbitalu s albuminem. 0,150 g albuminu hovězího R se rozpustí v 20 ml zásobního tlumivého roztoku barbitalového a zředí se vodou R na 100 ml.
Roztok taninu. 10 mg taninu R se rozpustí ve 100 ml tlumivého roztoku fosforečnanového s chloridem sodným o pH 7,2. Připravuje se bezprostředně před použitím.
Morčecí komplement. Z krve nejméně deseti morčat se připraví směsné sérum. Oddělí se od sražené krve odstředěním při asi 4 °C. Sérum se uchovává v malých množstvích při teplotě nižší než -70 °C. Sérum se naředí tlumivým roztokem barbitalovým s albuminem na 125 až 200 CH₅₀v 1 ml bezprostředně před započetím hemolýzy účinkem komplementu a po dobu zkoušky se uchovává v lázni s ledem.
Antigen zarděnek. Volí se antigen zarděnek, který je vhodný na stanovení titru v hemaglutinačně inhibičním testu (titru HIT). Titr je větší než 256 HA jednotek.
Příprava taninovaných lidských červených krvinek. Z dostatečného objemu stabilizované lidské krve se odstředěním oddělí lidské červené krvinky. Nejméně třikrát se promyjí tlumivým roztokem fosforečnanovým s chloridem sodným o pH 7,2. Připraví se 2% (V/V) suspenze v témže roztoku, jímž se naředí i 0,1 ml roztoku taninu na 7,5 ml (konečná koncentrace 1,3 mg/l). Smíchá se 1 objemový díl čerstvě naředěného roztoku taninu s 1 objemovým dílem suspenze červených krvinek a směs se inkubuje 10 min při 37 °C. Krvinky se oddělí odstředěním (10 min při 400 g až 800 g), supernatant se odstraní a červené krvinky se jednou promyjí tlumivým roztokem fosforečnanovým s chloridem sodným o pH 7,2. V tomtéž roztoku se taninované krvinky resuspendují na koncentraci 1 % (V/V).
Taninované lidské červené krvinky s antigenem. Potřebný objem (V_s) taninovaných krvinek se smíchá s antigenem zarděnek v poměru 0,2 ml antigenu na 1 ml suspenze krvinek. Po inkubaci 30 min při 37 °C se krvinky oddělí odstředěním (10 min při 400 g až 800 g). Supernatant se oddělí a ponechá se jen objem 200 μl. Supenatant se nahradí stejným objemem tlumivého roztoku barbitalového s albuminem. Krvinky se resuspendují, oddělí se popsaným způsobem a promývací postup se opakuje. Zbylý objem 200 μl se doplní na tři čtvrtiny objemu V_s. Pro tento objem se zavede označení počáteční objem (V_i). Z něho se odebere 100 μl a zbylý objem se označí (V_r). K odebranému vzorku 100 μl se přidá 900 μl tlumivého roztoku barbitalového s albuminem a stanoví se počáteční absorbance (A) při 541 nm. Při naředění objemu (V_r) tlumivým roztokem barbitalovým s albuminem na A-násobnou hodnotu podle vzorce V_f = V_r x A se získá konečný nastavený objem senzibilizovaných červených krvinek (V_f) a nastaví se na hodnotu 1,0 ± 0,1 při desetinásobném ředění.
Vlastní zkouška
Vazba protilátky na taninované lidské červené krvinky s antigenem. Následující roztoky se připravují postupně a dvojmo. Pro každý roztok se používá samostatná semimikrokyveta (např. na jedno použití) nebo zkumavka:
1. 1. Zkoušené roztoky. Zkoušený přípravek se, pokud je to třeba, upraví hydroxidem sodným 1 mol/l RS na pH 7 a naředí se tlumivým roztokem barbitalovým s albuminem tak, aby obsahoval 30 mg až 40 mg imunoglobulinu a objem se upraví na 900 μl.
2. 2. Porovnávací roztoky. Připraví se stejným způsobem jako zkoušené roztoky za použití lidského imunoglobulinu BRP.
3. 3. Kontrola komplementu. Používá se 900 μl tlumivého roztoku barbitalového s albuminem.
Do každé kyvety nebo zkumavky se přidá 100 μl suspenze senzibilizovaných lidských červených krvinek. Obsah se dobře promíchá.
Provede se inkubace 15 min při obyčejné teplotě, přidá se 1000 μl tlumivého roztoku barbitalového s albuminem a buňky se oddělí odstředěním kyvet nebo zkumavek 10 min při 1000 g. Odstraní se 1900 μl supernatantu a nahradí se 1900 μl tlumivého roztoku barbitalového s albuminem. Celý promývací proces se opakuje. Supernatant se opět odstraní a nakonec se ponechá objem 200 μl. Zkoušené vzorky se mohou skladovat 24 h v dobře uzavřených kyvetách nebo zkumavkách při 4 °C.
Hemolýza vyvolaná komplementem. Před zahájením hemolýzy se přidá ke zkoušenému vzorku 600 μl tlumivého roztoku barbitalového s albuminem, který se nejprve předehřeje na 37 °C. Buňky se pečlivě resuspendují opakovaným pipetováním (nejméně pětkrát) a kyveta se umístí do nosiče spektrofotometru vybaveného termostatem. Po 2 min se přidá 200 μl morčecího komplementu nastaveného na 125 až 200 CH₅₀/ml. Obsah se důkladně promíchá dvojnásobným pipetováním. Po druhém pipetování se okamžitě začne zaznamenávat absorbance při 541 nm v závislosti na čase. Tlumivý roztok barbitalový s albuminem se používá jako srovnávací tekutina. Měření se zastaví, když časová závislost absorbance jasně překročí inflexní bod.
Hodnocení
Stanoví se strmost (S) křivky hemolýzy v inflexním bodě takto: Rozdělí se nejstrmější část na vhodné časové intervaly Δt (například Δt = 1 min) a vypočte se S jako změna absorbance ΔA jednoho časového intervalu (na příklad ΔA za 1 min). Největší strmost je hledaná strmost v inflexním bodě (S_exp). Stanoví se ještě absorbance na počátku měření (A_s) extrapolací křivky, která je v prvních několika minutách téměř lineární a rovnoběžná s časovou osou. Strmost (S_exp) se koriguje pomocí vzorce:
Vypočítá se aritmetický průměr korigovaných hodnot strmosti (S) pro každý přípravek. Pro funkci Fc se vypočítá index (I_FC) podle vzorce:
v němž značí:
1. - aritmetický průměr korigované strmosti zkoušeného přípravku,
2. - aritmetický průměr korigované strmosti referenčního přípravku,
3. - aritmetický průměr korigované strmosti zjištěný v pokusech s kontrolou komplementu.
Vypočtený index Fc funkce zkoušeného přípravku nemá být menší než hodnota uvedená v příbalovém letáku referenčního přípravku.

2.8 Farmakognostické metody

Vzorkování drog

Před odběrem vzorků se provede senzorická kontrola obsahu jednotlivých balení, zaměřená zejména na:
1. - nesprávné označení,
2. - nestejnorodost,
3. - trvale zatuchlý pach, případně cizí pach, nebo naopak absence pachu charakteristického pro danou drogu,
4. - napadení plísněmi, prozrazující se změnami pachu, barvy,
5. - napadení škůdci,
6. - zvlášť hrubé mechanické znečištění.

Při zjištění uvedených závad se odběr vzorků neprovádí.

Odběr vzorků

Postup. Z balení do 1 kg se odebere z celkového, dobře promíchaného množství jeden vzorek dostatečný pro zkoušení. Z balení od 1 kg do 5 kg se odeberou tři vzorky stejného objemu z horní, střední a spodní části balení, každý v dostatečném množství pro provedení zkoušek. Z balení větších než 5 kg se odeberou tři vzorky, každý o hmotnosti nejméně 250 g, z horní, střední a spodní části balení. Vzorky se pečlivě promíchají a ze směsi se odebere množství dostatečné k provedení zkoušek.

Četnost vzorků. Je-li počet balení (n) tři nebo méně, odeberou se vzorky z každého balení, jak je uvedeno výše (viz Postup). Je-li počet balení větší než tři, odeberou se vzorky, jak je uvedeno výše (viz Postup) z balení, je-li třeba, se zaokrouhlením na nejbližší celé číslo.

Úprava vzorku

Hrubý vzorek získaný po promíchání vzorků z jednotlivých balení se rozprostře ve stejnoměrné vrstvě do tvaru čtverce. Ten se úhlopříčně rozdělí na čtyři stejné části, z nichž dvě protilehlé se včetně všech příměsí promíchají a znovu se rozprostřou do čtverce. Postup se opakuje až do získání konečného vzorku v množství dostačujícím k provedení všech předepsaných zkoušek.

Vzorky se zkoušejí bezprostředně po odběru. Není-li to možné, uchovávají se tak, aby zůstaly zachovány všechny znaky a vlastnosti drogy, ve vzduchotěsných obalech, za ochrany před světlem.

Stupeň rozdrobnění

Ke stanovení stupně rozdrobnění se používají, není-li uvedeno jinak, síta (2.1.4) 8000, 2800, 2000 a 250. Požadovaný stupeň rozdrobnění závisí na charakteru drogy a účelu jejího použití a udává se číslem síta (v závorkách za názvem drogy v textu jednotlivých článků), kterým má projít, není-li uvedeno jinak, nejméně 50 % drogy. U řezaných drog prachový podíl procházející sítem 250 má být nejvýše 5 %.

U práškovaných drog má předepsaným sítem projít nejméně 80 % drogy, zbylý podíl může procházet sítem nejvýše o jeden stupeň hrubším.

Není-li uvedeno jinak, jsou drogy určené k použití buď samostatně, nebo k přípravě čajových směsí upravovány takto:

Tab. N-1

Metody používající značený antigen nebo značenou protilátku Metody používající neznačený antigen nebo neznačenou protilátku Imunoprecipitační metody Imunoelektroforetické metody Zviditelnění a charakterizace imunoprecipitačních linií Validace metod Validační požadavky Validační metody Statistické výpočty Tab. 2.7.2-1 Difuzní metoda Tab. 2.7.2-2 Turbidimetrická metoda Doporučení pro mikrobiologické stanovení účinnosti antibiotik Příprava inokula Tlumivé roztoky Tab. 2.7.2-3 Živné půdy Zkoumadla Postup stanovení Metoda sledování erytému po intradermálním podání Metoda sledování úhynu Zkouška na morčatech Zkouška na myších Příprava zkoumadel Vlastní zkouška Hodnocení Vzorkování drog Odběr vzorků Úprava vzorku Stupeň rozdrobnění Tab. N-1
Stupeň rozdrobnění, síto	Droga
řezané, 8000	kůry, květy, listy, oplodí
drobně řezané, 2800	natě
velmi drobně řezané, 2000	kořeny, plody, semena

Výjimkou jsou níže uvedené drogy, které se upravují takto:

Tab. N-2

Metody používající značený antigen nebo značenou protilátku Metody používající neznačený antigen nebo neznačenou protilátku Imunoprecipitační metody Imunoelektroforetické metody Zviditelnění a charakterizace imunoprecipitačních linií Validace metod Validační požadavky Validační metody Statistické výpočty Tab. 2.7.2-1 Difuzní metoda Tab. 2.7.2-2 Turbidimetrická metoda Doporučení pro mikrobiologické stanovení účinnosti antibiotik Příprava inokula Tlumivé roztoky Tab. 2.7.2-3 Živné půdy Zkoumadla Postup stanovení Metoda sledování erytému po intradermálním podání Metoda sledování úhynu Zkouška na morčatech Zkouška na myších Příprava zkoumadel Vlastní zkouška Hodnocení Vzorkování drog Odběr vzorků Úprava vzorku Stupeň rozdrobnění Tab. N-1 Tab. N-2
Droga	Síto	Podíl procházející sítem je nejméně
Althaeae radix, Aurantii pericarpium dulce, Belladonnae radix, Levistici radix, Lichenislandicus, Liquiritiae radix, Marrubii herba, Ononidis radix, Petroselini radix, Salviae herba	8000	50 %
Strychni semen	2800	50 %
Centaurii herba, Cinchonae cortex, Hyperici herba, Thymi herba, Uvae ursi folium	2000	50 %
Absinthii herba, Millefolii herba	2800	40 %
Rhei radix	2000	40 %

Drogy určené k výrobě nálevových sáčků se upravují na velikost částic procházejících síty 250 až 2000.

Pokud jsou řezané drogy určeny pro lékové formy připravované extrakcí, jejich jemnější podíly, pokud není uvedeno jinak, se neodstraňují. K tomuto účelu je možno použít i jemnější podíly získané při úpravě drog určených pro přípravu čajových směsí.

Následující stránka