Český lékopis 1997

Dvě selata slouží jako kontroly. Ředění se připraví pomocí tlumivého roztoku fyziologického o pH 7,2. Za 14 dní se každému imunizovanému i kontrolnímu zvířeti intramuskulárně vstříkne dávka čelenžního viru dostačující k tomu, aby nevakcinované sele uhynulo v průběhu 7 dnů po čelenži. Čelenžní virový materiál pozůstává z krve prasat, která byla infikována experimentálně virem, jenž nebyl pasážován na buněčných kulturách. Kontrolní zvířata uhynou v průběhu 7 dnů po čelenži. Imunizovaná zvířata se pozorují 14 dnů. Z počtu zvířat, která přežijí bez příznaků moru prasat, se vhodnou statistickou metodou vypočítá počet PD₅₀ obsažených ve vakcíně.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

V označení na obalu se uvede, zda byla vakcína připravena v buněčných kulturách nebo na králících.

Vaccinum pneumococcale polysaccharidicum

Polysacharidová vakcína proti pneumokokům

Je to směs stejných podílů purifikovaných antigenů pouzderného polysacharidu připravených z vhodných patogenních kmenů bakterie Streptococcus pneumoniae, jejichž pouzdra prokazatelně obsahují polysacharidy, které jsou schopné u člověka vyvolat tvorbu dostatečných hladin specifických protilátek. Vakcína obsahuje dvacet tři imunochemicky odlišných pouzderných polysacharidů, které jsou uvedeny v tabulce 1.

Vakcína je čirá, bezbarvá tekutina.

Výroba

Výroba je založena na systému jednotné inokulace, odděleně pro každý typ polysacharidu. Výrobní postup prokazatelně poskytuje stále stejnou vakcínu přiměřené bezpečnosti a imunogenity pro člověka.

Výrobní postup se validuje, aby se prokázalo, že přípravek, bude-li zkoušen, vyhoví zkoušce na neškodnost imunních sér a humánních vakcín (2.6.9) takto přizpůsobené pro morčata: každému z deseti morčat se vstříkne po deseti lidských dávkách a pozorují se 12 dní.

Monovalentní nerozplněné množství polysacharidu

Bakterie se pěstují ve vhodné tekuté živné půdě, která neobsahuje antigenní substance krevních skupin nebo vysokomolekulární polysacharidy. Ověří se bakteriální čistota kultury a kultura se inaktivuje fenolem. Nečistoty se odstraní takovými technikami, jako frakční precipitací, enzymatickým štěpením nebo ultrafiltrací. Polysacharid se získá frakční precipitací, promyje se a vysuší ve vakuu na takový obsah zbytkové vlhkosti, který je prokazatelně vhodný pro stabilitu polysacharidu. Obsah zbytkové vlhkosti se stanoví sušením za sníženého tlaku nad oxidem fosforečným nebo termogravimetrickou analýzou a získaná hodnota se použije pro výpočet výsledků dále uvedených zkoušek, které odkazují na vysušenou látku. Nerozplněné monovalentní polysacharidy se uchovávají při vhodné teplotě a za podmínek, které brání zvlhnutí.

Pouze monovalentní nerozplněné polysacharidy, které vyhovují následujícím požadavkům, se mohou použít k přípravě konečné várky vakcíny. Obsahy jednotlivých složek v procentech, stanovené níže popsanými metodami, jsou uvedeny v tabulce 1.

Bílkovina (2.5.16).

Nukleové kyseliny (2.5.17).

Celkový dusík (2.5.9).

Fosfor (2.5.18).

Velikost molekul. Stanoví se chromatografií na molekulárním sítu (2.2.30) za použití agarosy síťované pro chromatografii R nebo agarosy síťované pro chromatografii R1.

Uronové kyseliny (2.5.22).

Hexosaminy (2.5.20).

Methylpentosy (2.5.21).

O-Acetyl skupiny (2.5.19).

Zkouška totožnosti (2.7.1). Totožnost monovalentního nerozplněného polysacharidu se potvrdí dvojitou imunodifuzí nebo elektroimunodifuzí (kromě polysacharidů 7F, 14 a 33F) za použití specifických antisér.

Tab. 1. Obsah složek monovalentních nerozplněných polysacharidů v procentech

Specifita. Antigeny při zkoušení nereagují s žádným antisérem specifickým pro ostatní polysacharidy vakcíny, včetně faktorových sér pro rozlišení jednotlivých typů v rámci skupin. Polysacharidy se zkoušejí v koncentraci 50 μg/ml metodou schopnou rozlišit koncentraci 0,5 μg/ml.

Konečná várka vakcíny

Konečná várka vakcíny vznikne smícháním vysušených různých polysacharidů za aseptických podmínek. Homogenní směs se asepticky rozpustí ve vhodném izotonickém roztoku tak, aby jedna lidská dávka 0,5 ml obsahovala 25 μg každého polysacharidu. Může se přidat protimikrobní konzervační látka. Roztok se sterilizuje filtrací přes filtr zachycující bakterie.

Pouze konečná várka vakcíny, která vyhovuje následujícím požadavkům se může použít k přípravě šarže.

Protimikrobní konzervační látka. Pokud je třeba, stanoví se obsah protimikrobní konzervační látky vhodnou chemickou metodou. Obsah je 85 % až 115 % zamýšleného množství.

Sterilita (2.6.1). Konečná várka vakcíny vyhovuje zkoušce na sterilitu; na každou živnou půdu se použije 10 ml.

Šarže

Konečná várka vakcíny se asepticky rozplní do sterilních zabezpečených obalů.

Pouze šarže, která vyhovuje všem dále uvedeným požadavkům v odstavcích Zkouška totožnosti, Zkoušky na čistotu, Stanovení obsahu se může uvolnit k použití. Pokud byla stanovení obsahu fenolu a protimikrobní konzervační látky provedena s vyhovujícím výsledkem u konečné várky vakcíny, mohou se u šarže vypustit. Jestliže byla na vhodném počtu po sobě následujících šarží prokázána konzistentnost výroby, může se stanovení obsahu nahradit kvalitativní zkouškou, která prokáže totožnost každého polysacharidů, a to pokud bylo stanovení obsahu provedeno u každého monovalentního nerozplněného polysacharidů použitého k přípravě šarže vakcíny.

Zkouška totožnosti

Stanovení obsahu slouží rovněž jako průkaz totožnosti vakcíny.

Zkoušky na čistotu

Hodnota pH (2.2.3). 4,5 až 7,4.

Protimikrobní konzervační látka. Pokud je třeba, stanoví se množství protimikrobní konzervační látky vhodnou chemickou metodou. Obsah není nižší než nejnižší prokazatelně účinné množství a vyšší než 115 % hodnoty uvedené v označení.

Fenol (2.5.15). Nejvýše 2,5 g/l.

Sterilita (2.6.1). Vyhovuje zkoušce na sterilitu.

Pyrogenní látky (2.6.8). Vyhovuje ve zkoušce na pyrogenní látky, při níž se na 1 kg hmotnosti králíka vstříkne 1 ml zředěné vakcíny obsahující od každého polysacharidu 2,5 μg/ml.

Stanovení obsahu

Obsah jednotlivých polysacharidů se stanoví vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1), při níž se použijí specifická antiséra proti všem polysacharidům obsaženým ve vakcíně, včetně faktorových sér pro typizaci uvnitř jednotlivých skupin, a jednotlivé purifikované polysachridy jako standardy.

Vakcína obsahuje 70 % až 130 % množství uvedeného pro každý polysacharid v označení. Interval spolehlivosti (P = 0,95) stanovení je v rozmezí 80 % až 120 %.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

1. V označení se uvede:

   - množství každého jednotlivého polysacharidu v jedné lidské dávce udané v mikrogramech,

   - celkové množství polysacharidů v obale.

Vaccinum poliomyelitidis inactivatum

Inaktivovaná vakcína proti poliomyelitidě

Je to vodná suspenze vhodných kmenů poliomyelitického viru typu 1, typu 2 a typu 3 pomnožených ve vhodných buněčných kulturách a inaktivovaných vhodnou metodou. Je to čirá tekutina.

Výroba

Výroba je založena na systému jednotné inokulace a virus v konečné vakcíně představuje ve výrobě vakcíny nejvýše desátou subkulturu od matečného inokula, s nímž se provedly laboratorní a klinické zkoušky prokazující vhodnost kmene.

Výrobní postup se validuje, aby se prokázalo, že bude-li výrobek zkoušen, vyhoví zkoušce na neškodnost imunních sér a vakcín pro humánní použití (2.6.9).

Do média pro počáteční buněčný růst se může přidat zvířecí sérum, ale udržovací médium při pomnožování viru neobsahuje žádné bílkoviny. Koncentrace séra v konečné vakcíně nepřesahuje jednu miliontinu. Médium může obsahovat vhodný indikátor pH, jako je červeň fenolová, a vhodná antibiotika v nejmenších účinných koncentracích.

Každá virová suspenze se zkouší na totožnost, bakteriální sterilitu a po neutralizaci specifickým antisérem také na nepřítomnost cizích virů. Virová suspenze se filtruje vhodným filtrem a může se koncentrovat a purifikovat. Suspenze má v mililitru obsahovat nejméně 1 . 10⁷ CCID₅₀ každého typu viru.

Ve vhodnou dobu po poslední filtraci, nejlépe za 24 h, se přidají vhodné chemické látky, které inaktivují filtrovaný virus, aniž by poškodily jeho antigenitu. Při inaktivaci se provede vhodná filtrace, a je-li třeba, inaktivační látka se později neutralizuje.

Vhodnými zkouškami na buněčných kulturách se prokáže, že každá z monovalentních suspenzí je prostá infekčního poliomyelitického viru a jiných lidských a opičích virů. Trivalentní vakcína se připraví smícháním jednotlivých monovalentních suspenzí. Před přidáním jakékoliv protimikrobní konzervační látky se prokáže, že trivalentní suspenze je prosta infekčního poliomyelitického viru a jiných lidských a opičích virů.

Zkouška totožnosti

Podána vnímavým zvířatům podporuje vakcína tvorbu neutralizačních protilátek proti poliomyelitickému viru typu 1, typu 2 a typu 3.

Zkouška na čistotu

Sterilita (2.6.1). Vyhovuje zkoušce na sterilitu.

Stanovení účinnosti

Vakcína se zředí vhodným tlumivým roztokem dvacetkrát, stokrát a pětsetkrát. Ve skupinách po deseti třítýdenních kuřatech nebo deseti morčatech o hmotnosti 250 g až 350 g se nitrosvalově vstříkne každému zvířeti po 0,5 ml ředění vakcíny. Na každé ředění se použije jedna skupina zvířat. Pátý až šestý den po podání se zvířata vykrvácí a připraví se jednotlivá séra, která se ve zředění 1 : 4 vyšetří na přítomnost neutralizačních protilátek proti poliomyelitickým virům typu 1, typu 2 a typu 3.

Smíchá se 100 CCID₅₀ viru se zředěným sérem a inkubuje se 4 h 30 min až 6 h při 37 °C. Potom se nechá 12 h až 18 h stát při (5 ± 3) °C. Směsi se naočkují do buněčných kultur ke zjištění viru, který nebyl zneutralizován, a výsledky se odečtou za 7 dní po naočkování. Pro každou skupinu se zaznamenají počty sér s neutralizačními protilátkami a vypočítá se ředění vakcíny, které u 50 % zvířat poskytne protilátkovou odpověď.

Vakcína vyhovuje zkoušce, jestliže stonásobné nebo vyšší ředění vyvolá protilátkovou odpověď proti všem třem typům viru u 50 % zvířat.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

Vaccinum poliomyelitidis perorale

Živá vakcína proti poliomyelitidě perorální

Synonymum. Živá očkovací látka proti dětské obrně

Je to přípravek obsahující schválené kmeny živého oslabeného polyomyelitického viru typu 1, 2 nebo 3 pomnožené in vitro v kulturách schválených buněk. Obsahuje buď jeden typ, nebo kombinaci tří typů kmenů podle Sabina, upravených do formy vhodné pro perorální podání.

Je to čirá tekutina, která může být zbarvena vzhledem k přítomnosti indikátoru pH.

Výroba

Vakcinační kmeny a výrobní postup prokazatelně poskytují stále stejné vakcíny, které jsou imunogenní a bezpečné pro člověka.

Výroba vakcíny je založena na systému jednotné inokulace. Buněčné linie se používají podle systému buněčné banky. Při použití primárních buněk opičích ledvin vyhovuje výroba požadavkům dále uvedeným. Pokud není určeno a schváleno jinak, neprojde virus v konečném přípravku více než dvěma pasážemi od matečného inokula.

Výrobní postup se validuje, aby se prokázalo, že pokud bude přípravek zkoušen, vyhoví ve zkoušce na neškodnost imunních sér a vakcín pro humánní použití (2.6.9).

Substrát pro pomnožení viru

Virus se pomnožuje v lidských diploidních buňkách (5.2.3), v kontinuálních buněčných liniích nebo v buňkách opičích ledvin. Kontinuální buněčné linie schvaluje oprávněná autorita.

Primární opičí buňky. Následující speciální požadavky pro substrát pro pomnožení viru se vztahují na primární opičí buňky.

Opice použité pro přípravu kultur ledvinových buněk a pro zkoušení viru. Připravuje-li se vakcína v kulturách buněk opičích ledvin, jsou zvířata druhu schváleného oprávněnou autoritou zcela zdravá a nebyla dříve použita k žádným pokusům.

Opice se chovají v dobře postaveném zvěřinci s odpovídající ventilací v prostorných a oddělených klecích, umístěných co nejdále od sebe. Přijmou se odpovídající opatření k zabránění přenosu infekce mezi klecemi. Do jedné klece se umístí nejvýše dvě opice a obsazení klecí se nemění. V zemi výroby vakcíny se opice drží v karanténě nejméně 6 týdnů před použitím. Karanténní skupina je skupina vybraných zdravých opic chovaných v jedné místnosti se zvláštním režimem krmení a úklidu, která v karanténním období nemá styk s jinými opicemi. Když během karanténního období dojde k úhynu převyšujícímu 5 % v zásilce obsahující jednu nebo více skupin, opice z celé zásilky setrvávají v karanténě nejméně 6 dalších týdnů. Výjimkou je úhyn po nehodě, nebo tam, kde byla příčina specifikována, že není infekčním onemocněním. Jednotlivé skupiny se drží nepřetržitě v izolaci jako v karanténě, a to i po dokončení karanténního období, až do použití opic. Po odebrání poslední opice ze skupiny se místnost před použitím pro další skupinu vyčistí a dekontaminuje. Jestliže se použijí ledviny plodů, chovají se matky v karanténě po dobu březosti.

Opice, jejichž ledviny se mají vyjmout, se anestezují a pečlivě vyšetří na příznaky tuberkulózy a infekce cerkopitecidním herpesvirem 1 (B virus).

Jestliže opice vykazují nějaké patologické léze, závažné z hlediska použití jejich ledvin v přípravě inokula nebo vakcíny, nemohou se použít. Ani ostatní opice z karanténní skupiny se nemohou použít, pokud není zřejmé, že jejich použití neohrozí bezpečnost přípravku.

Všechny postupy uvedené v tomto oddíle se provádějí mimo objekt, v němž se vybírá vakcína.

Použité opice jsou prokazatelně bez protilátek proti viru SV 40 a viru opičí imunodeficience. Jestliže se pro výrobu použije druh Macaca, opice nemají prokazatelně ani protilátky proti cerkopitecidnímu herpesviru 1 (B virus). Jako indikátor nepřítomnosti protilátek proti viru B se používá lidský herpesvirus pro nebezpečí při zacházení s cerkopitecidním 1 virem (B virus).

Kultury buněk opičích ledvin pro výrobu vakcíny. Pro přípravu buněčných kultur se použijí pouze ledviny bez patologických známek. Jestliže jsou opice ze skupiny určené pro výrobu vakcíny, mohou se použít pro pomnožení viru sériově pasážované kultury buněk opičích ledvin z primárních buněk opičích ledvin, jinak se buňky opičích ledvin sériově nepasážují. Virus pro přípravu vakcíny se v takových kulturách pomnožuje asepticky. Pro růst buněk se může použít zvířecí sérum, po inokulaci viru se používá udržovací médium bez séra.

Každá skupina buněčných kultur připravených z jednotlivé opice nebo ze skupiny nejvýše deseti plodů se připravuje a zkouší samostatně.

Virové inokulum

Použité kmeny poliovirů jsou určeny podle průvodních záznamů, které obsahují informace o jejich původu a následné manipulaci s nimi.

Pracovní inokula se připraví jedinou pasáží z matečného inokula a ve schválené úrovni pasáží od originálního Sabinova viru. Inokula se připraví ve velkých množstvích a uchovávají se při teplotě nižší než -60 °C.

Pouze virové inokulum, které vyhovuje následujícím požadavkům, se může použít pro pomnožování viru.

Zkouška totožnosti. Každé pracovní inokulum se identifikuje jako poliovirus daného typu za použití specifických protilátek.

Koncentrace viru. Stanoví se dále popsanou metodou. Virová koncentrace je základ pro množství viru použitého ve zkoušce Neurovirulence.

Cizí agens (2.6.16). Jestliže je pracovní inokulum produkováno v lidských diploidních buňkách (5.2.3) nebo v kontinuální buněčné linii, vyhovuje požadavkům na inokulum pro virové vakcíny. Jestliže je pracovní inokulum produkováno v buňkách primárních opičích buněk, vyhovuje požadavkům dále uvedeným v odstavcích Pomnožování a sklizeň viru a Monovalentní spojená sklizeň a zkouškám na dospělých myších, sajících myších a na morčatech uvedeným ve stati Důkaz cizích agens v humánních virových vakcínách (2.6.16).

Neurovirulence (2.6.19). Každé matečné a pracovní inokulum vyhovuje zkoušce neurovirulence pro vakcínu proti poliomyelitidě (perorální). Nad to se zastaví používání pracovního inokula ve výrobě vakcíny, jestliže výskyt nedostatků z něho vyrobených monovalentních spojených sklizní je větší, než je předpovězeno statisticky. Referenční přípravky tří typů polioviru ze Sabinova originálu a dvou pasáží jsou k dosažení pro použití ve Světové zdravotnické organizaci, Ženeva, Švýcarsko.

Tato statistická předpověď se vypočítá po každé zkoušce na základě všech zkoušených monovalentních spojených sklizní; je stejná pravděpodobnost falešného odmítnutí v případě první zkoušky (tj. 1 %), pravděpodobnost falešného odmítnutí v případě nové zkoušky bývá zanedbatelná. Je-li tato zkouška prováděna pouze výrobcem, zkušební skla se poskytnou kontrolní autoritě k ohodnocení.

Genetické markery. Každé pracovní virové inokulum se zkouší na replikační vlastnosti při 36 °C až 40 °C, jak je popsáno v odstavci Monovalentní spojené sklizně.

Pomnožování a sklizeň viru

Všechny práce s buněčnou bankou a následnými buněčnými kulturami se provádějí v aseptických podmínkách a v prostředí, kde se nepracuje s jinými buňkami. Do růstových médií se může použít schválené zvířecí sérum (ale ne lidské), avšak konečné udržovací médium pro buňky v době pomnožování viru neobsahuje zvířecí sérum. Sérum a trypsin použité k přípravě buněčných suspenzí a médií prokazatelně neobsahují živá cizí agens. Médium pro buněčné kultury může obsahovat indikátor pH, jako je červeň fenolová, a schválená antibiotika v nejnižší účinné koncentraci. Přednostně se používá při výrobě substrát bez antibiotik. Nejméně 5 % a nejvýše 1000 ml buněčných kultur použitých při výrobě vakcíny se ponechává jako neinfikované buněčné kultury (kontrolní buňky); speciální požadavky, uvedené dále, se vztahují k výrobě vakcíny na primárních opičích buňkách. Virová suspenze se sklidí nejpozději 4 dny po inokulaci viru. Po inokulaci výrobní buněčné kultury pracovním inokulem se inokulované buňky udržují při stanovené teplotě, jež byla prokázána jako vhodná v rozmezí 33 °C až 35 °C. Teplota se udržuje neměnná, s odchylkou ±0,5 °C. Kontrolní buňky se inkubují při 33 °C až 35 °C po přiměřenou dobu inkubace.

Pouze sklizeň, která vyhovuje následujícím požadavkům, se může použít k přípravě monovalentní spojené sklizně.

Koncentrace viru. Koncentrace viru ve virových sklizních se stanoví, jak je předepsáno v odstavci Stanovení účinnosti, ke sledování pravidelnosti výroby a k výpočtu ředění, které se použije do konečné várky vakcíny.

Cizí agens (2.6.16).

Kontrolní buňky. Kontrolní buňky produkční buněčné kultury, ze které se sklízí virus, vyhovují ve zkoušce totožnosti a požadavkům na cizí agens (2.6.16) nebo, při použití primárních opičích buněk, dále uvedenému.

Primární opičí buňky. Následující speciální požadavky se vztahují k pomnožování viru v primárních opičích buňkách a k jeho sklizni.

Buněčné kultury. V den inokulace virovým inokulem se buněčné kultury vyšetří na degeneraci způsobenou infekčním agens. Jestliže se při prohlížení zjistí přítomnost cizího agens v některé buněčné kultuře, vyřadí se celá skupina kultur.

V den inokulace virovým pracovním inokulem se odebere vzorek nejméně 30 ml směsné tekutiny z buněčných kultur z ledvin z každé jednotlivé opice nebo ze skupiny nejvýše deseti opičích plodů. Vzorek se rozdělí na dvě části. Jedna část směsných tekutin se zkouší na kulturách buněk opičích ledvin připravených z téhož druhu, jaký se použil pro přípravu vakcíny, ale z jiného zvířete. Druhá část vzorku směsných tekutin se v případě nutnosti zkouší na kulturách buněk opičích ledvin z jiného druhu tak, aby alespoň jeden ze zkoušených vzorků byl zkoušen na kulturách buněk z opi c citlivých k viru SV40. Směsný vzorek se inokuluje do lahví s těmito buněčnými kulturami tak, aby ředění směsné tekutiny živným médiem nebylo vyšší než 1 : 4. Plocha vrstvy buněk je nejméně 3 cm² na mililitr směsné tekutiny. Nejméně jedna láhev každého druhu buněčné kultury zůstává bez inokulace a slouží jako kontrola. Jestliže je pro výrobu vakcíny použit druh opice, která je citlivá na SV40, zkouška na jiném druhu opice se nepožaduje. Pro pomnožování buněk se může použít zvířecí sérum za předpokladu, že neobsahuje protilátky proti SV40. Udržovací médium používané po inokulaci zkoušeného materiálu neobsáhuje sérum, s výjimkou dále uvedenou.

Buněčné kultury se inkubují při teplotě mezi 35 °C a 37 °C a pozorují se po celou dobu nejméně 4 týdnů. Během doby sledování a po nejméně 2 týdnech inkubace se z roztoku založí další subkultura na témže buněčném systému. Tyto subkultury se také pozorují nejméně 2 týdny.

Při pasážování subkultur se na původní kultury může přidat sérum, pokud toto sérum neobsahuj e protilátky proti SV40.

Pro detekci viru SV40 a ostatních virů v buňkách mohou být užitečné techniky využívající fluorescenční protilátky.

Další vzorek nejméně 10 ml směsné tekutiny se zkouší na přítomnost cerkopitecidního herpesviru 1 (B virus) a na přítomnost ostatních virů v kulturách buněk králičích ledvin. Sérum používané v růstovém médiu pro tyto kultury má být prokazatelně prosté inhibitorů viru B. Jako indikátor nepřítomnosti inhibitorů viru B se používá lidský herpesvirus pro nebezpečí při zacházení s cerkopitecidním herpesvirem 1 (B virem). Vzorek se inokuluje do láhví s těmito buněčnými kulturami tak, aby ředění směsné tekutiny růstovým médiem nebylo vyšší než 1 : 4. Plocha vrstvy buněk je nejméně 3 cm² na mililitr směsné tekutiny. Nejméně jedna láhev buněčné kultury zůstává bez inokulace a slouží jako kontrola.

Kultury se inkubují při 35 °C až 37 °C a pozorují se nejméně 2 týdny.

Další vzorek 10 ml směsné tekutiny se z buněčné kultury přemístí v den inokulace virovým inokulem a zkouší se na přítomnost cizích agens inokulaci na lidské buněčné kultury citlivé na virus spalniček.

Tyto zkoušky lze hodnotit pouze v případě, jestliže nejvýše 20 % lahví s kulturami bylo vyřazeno pro náhodné nespecifické důvody do konce vlastní zkušební doby.

Jestliže se při těchto zkouškách najde důkaz přítomnosti nějakého cizího agens, je jednotlivá sklizeň ze skupiny buněčných kultur vyřazena.

Jestliže se prokáže přítomnost cerkopitecidního herpesviru 1 (B virus), výroba perorální vakcíny proti poliomyelitidě se přeruší a informuje se oprávněná autorita. Výroba se neobnoví, dokud se neuzavře vyšetřování a nepřijmou se opatření proti jakémukoliv znovuobjevení infekce. Obnovení výroby schválí oprávněná autorita.

Jestliže tyto zkoušky nejsou prováděny bezprostředně, vzorky směsné tekutiny z kultur se uchovávají při teplotách 60 °C nebo nižších teplotách, s výjimkou vzorku pro zkoušku na B virus, který se uchovává při 4 °C po dobu nejvýše 7 dní po odběru.

Kontrolní buněčné kultury. V den inokulace virovým pracovním inokulem se 25 % (ale nejvýše 2,5 l) buněčné suspenze pocházející z ledvin jednotlivých opic nebo z nejvýše deseti plodů opic ponechá jako neinokulované kontrolní buněčné kultury. Tyto kontrolní buněčné kultury se kultivují nejméně 2 týdny za stejných podmínek jako kultury inokulované a během této doby se vyšetřuj í na výskyt cytopatických změn. Zkoušky lze hodnotit, jestliže nejvýše 20 % kontrolních buněčných kultur bylo vyřazeno pro náhodné nespecifické důvody.

Na konci doby sledování se kontrolní buňky vyšetří na degeneraci způsobenou nějakým infekčním agens. Jestliže toto vyšetření nebo některá ze zkoušek požadovaných v tomto odstavci prokáže v kontrolní kultuře známky přítomnosti nějakého cizího agens, vyřadí se poliovirus rostoucí na inokulovaných kulturách z této skupiny.

Zkoušky na hemadsorbující viry. V době sklizně viru nebo 4 dny po inokulaci výrobních kultur virovým pracovním inokulem se odebere vzorek o velikosti 4 % kontrolních buněčných kultur a zkouší se na hemadsorbující viry. Na konci sledovaného období se podobně zkoušejí zbývající buněčné kultury. Tyto zkoušky se provádějí, jak je popsáno ve stati Důkaz cizích agens v lidských virových vakcínách (2.6.16).

Zkoušky na ostatní cizí agens. V době sklizně nebo 7 dní po inokulaci výrobních kultur virovým pracovním inokulem se odebere vzorek nejméně 20 ml směsné tekutiny z každé skupiny kontrolních kultur a zkouší se na dvou druzích buněčných kultur opičích ledvin, jak je popsáno výše.

Na konci doby pozorování původních kontrolních buněčných kultur se odeberou obdobné vzorky směsných tekutin a opakují se zkoušky vztahující se k této skupině na dvou druzích buněk opičích ledvin a na kulturách králičích buněk, jak je výše popsáno v odstavci Buněčné kultury.

Jestliže se prokáže přítomnost cerkopitecidního herpesviru 1 (virus B), výrobní buněčná kultura se nepoužije a provedou se výše popsaná opatření týkající se výroby vakcíny.

Tekutiny odebrané z kontrolních buněčných kultur v době sklizně viru a na konci doby pozorování se před zkouškou na cizí agens mohou smísit. Vzorek 2 % směsné tekutiny se zkouší v každém specifikovaném systému buněčných kultur.

Jednotlivé sklizně.

Zkoušky neutralizovaných jednotlivých sklizní na buněčných kulturách opičích ledvin. Vzorek nejméně o velikosti 10 ml z každé jednotlivé sklizně se neutralizuje typově specifickým antisérem proti poliomyelitidě připraveným z jiných zvířat, než jsou opice. Při přípravě antiséra pro tento účel se imunizační antigeny připraví v jiných buňkách než opičích.

Polovina neutralizované suspenze (odpovídající nejméně 5 ml jednotlivé sklizně) se zkouší na kulturách buněk opičích ledvin připravených z téhož druhu, ale ne ze stejného zvířete, jaký se použil pro výrobu vakcíny. Druhá polovina neutralizované suspenze se zkouší, je-li třeba na buněčných kulturách opičích ledvin jiného druhu tak, že se provedou zkoušky neutralizované suspenze na buněčných kulturách z nejméně jednoho druhu, o němž je známo, že je citlivý na SV40.

Neutralizované suspenze se inokulují do lahví s těmito buněčnými kulturami takovým způsobem, aby ředění suspenze v růstovém médiu nepřesáhlo poměr 1 : 4. Plocha vrstvy buněk je nejméně 3 cm² na mililitr neutralizované suspenze. Nejméně jedna láhev každého typu buněčné kultury zůstane neinokulovaná a slouží jako kontrola a je udržována růstovým médiem obsahujícím stejnou koncentraci specifického antiséra použitého k neutralizaci.

Pro růst buněk se může použít zvířecí sérum, pokud toto sérum neobsahuje protilátky proti SV40. Udržovací médium, používané po inokulaci zkoušeného materiálu, neobsahuje žádné sérum kromě antiséra neutralizujícího poliovirus, s výjimkou dále popsanou.

Kultury se inkubují při teplotě 35 °C až 37 °C a pozorují se po celou dobu nejméně 4 týdnů. Během doby pozorování a po nejméně 2 týdnech inkubace se založí nejméně jedna subkultura z tekutiny z každé kultury na témže systému buněčné kultury. Subkultury se také pozorují nejméně 2 týdny. Sérum se může přidat k původním kulturám v době založení subkultury, pokud neobsahuj e protilátky proti SV40.

Na dalším vzorku z neutralizovaných jednotlivých sklizní se provedou další zkoušky na cizí viry inokulací 10 ml na kultury lidských buněk citlivých na virus spalniček.

Pro detekci viru SV40 a ostatních virů v buňkách mohou být užitečné techniky využívající fluorescenčních protilátek.

Tyto zkoušky lze hodnotit, jestliže nejvýše 20 % nádob s kulturami bylo vyřazeno pro náhodné nespecifické důvody do konce vlastní zkušební doby.

Když se objeví cytopatické změny v některé z kultur, příčiny těchto změn se vyšetří. Jestliže se prokáže, že cytopatické změny způsobil nezneutralizovaný poliovirus, zkouška se opakuje.

Projeví-li se známky přítomnosti SV40 nebo jiného cizího agens v jednotlivé sklizni, tato sklizeň se vyřadí.

Monovalentní spojená sklizeň

Monovalentní spojená sklizeň se připraví smícháním počtu vyhovujících jednotlivých sklizní téhož typu viru. Monovalentní spojené sklizně z kontinuálních buněčných linií se mohou purifíkovat. Každá monovalentní spojená sklizeň se filtruje filtrem zadržujícím bakterie.

Pouze monovalentní spojená sklizeň, která vyhovuje následujícím požadavkům, se může použít pro přípravu konečné várky vakcíny.

Zkouška totožnosti. Každá monovalentní spojená sklizeň se za použití specifických protilátek prokáže jako poliovirus daného typu.

Koncentrace viru. Koncentrace viru se stanoví dále popsanou metodou a slouží jako základ pro výpočet ředění přípravku v konečné várce, pro množství viru použitého ve zkoušce neurovirulence a ke sledování pravidelnosti výroby.

Neurovirulence (2.6.19). Každá monovalentní spojená sklizeň vyhovuje zkoušce neurovirulence pro vakcínu proti poliomyelitidě (perorální). Je-li tato zkouška prováděna pouze výrobcem, poskytnou se zkušební skla také oprávněné autoritě k hodnocení.

Genetické markery. Poměr replikačních kapacit viru v monovalentní spojené sklizni se získá při teplotě v rozmezí mezi 36 °C a 40 °C ve srovnání s inokulem nebo referenčním přípravkem pro markerové zkoušky a s vhodnými rct/40- a rct/40+ kmeny polioviru téhož typu. Inkubační teploty užívané v této zkoušce se řídí v rozmezí ±0,1 °C. Monovalentní spojená sklizeň vyhovuje této zkoušce, jestliže titr viru ze sklizně a vhodného referenčního materiálu je při 36 °C nejméně o 5,0 log vyšší než titr stanovený při 40 °C. Je-li růst při 40 °C tak nízký, že validní srovnání nelze provést, použije se teplota v rozmezí 39,0 °C až 39,5 °C. Při této teplotě je snížení titru referenčního materiálu v rozmezí od 3,0 log do 5,0 log proti hodnotě při 36 °C. Přijatelná minimální redukce se pro každý kmen viru stanoví při dané teplotě. Jestliže titry získané pro jeden nebo více referenčních virů nejsou ve shodě s očekávanými hodnotami, zkouška se opakuje.

Primární opičí buňky. Následující speciální požadavky platí pro monovalentní spojené sklizně odvozené z primárních opičích buněk.

Zkoušky na králících. Vzorek monovalentní spojené sklizně se zkouší na přítomnost cerkopitecidního herpesviru 1 (B virus) a ostatní viry vstříknutím nejméně 100 ml nejméně deseti zdravým králíkům hmotnosti 1,5 kg až 2,5 kg. Každý králík dostane nejméně 10 ml a nejvýše 20 ml, přičemž 1 ml je podán intradermálně na několik míst a zbytek subkutánně. Králíci se pozorují nejméně 3 týdny, sleduje se úhyn a známky onemocnění.

Všichni králíci, kteří uhynuli po prvních 24 h zkoušky a vykazují známky onemocnění, se pitvají a vyjme se jim mozek a orgány k podrobnému vyšetření pro zjištění příčiny úhynu.

Zkoušku lze hodnotit pouze v případě, jestliže nejvýše 20 % inokulovaných králíků vykazuje známky interkurentní infekce během doby pozorování. Monovalentní spojená sklizeň vyhovuje zkoušce, jestliže žádný z králíků nemá známky infekce virem B nebo ostatními cizími agens nebo léze jakéhokoliv druhu, jež lze přisoudit suspenzi várky.

Při průkazu přítomnosti viru B se provedou opatření týkající se výroby vakcíny uvedená výše v odstavci Buněčné kultury.

Zkouška na morčatech. Nejméně pěti morčatům, každému o hmotnosti 350 g až 450 g, se podá 0,1 ml monovalentní spojené sklizně intracerebrálně a 0,5 ml intraperitoneálně. Po 6 týdnů se každý pracovní den měří rektálně teplota každému zvířeti. Na konci doby pozorování se provede pitva každého zvířete.

Kromě toho se nejméně pěti morčatům intraperitoneálně podá 0,5 ml a 2 až 3 týdny se pozorují, jak je popsáno výše. Na konci doby pozorování se provede pasáž krve a suspenze jaterní nebo slezinné tkáně nejméně dalším pěti morčatům. Těmto morčatům se po dobu 2 až 3 týdnů měří rektálně teplota. Jestliže dojde po prvním dni k úhynu nebo jsou zvířata utracena pro příznaky onemocnění, provede se pitva. Pitva se provede také v případě, že vykazují po tři za sebou následující dny teplotu vyšší než 39 °C; provede se histologické vyšetření k detekci viru Marburg; navíc se intraperitoneálně podá suspenze jaterní nebo slezinné tkáně nebo krve nejméně třem dalším morčatům. Jestliže se zjistí jakékoliv příznaky infekce virem Marburg, provede se konfirmační sérologický test z krve postižených zvířat. Monovalentní spojená sklizeň vyhovuje zkoušce, jestliže nejméně 80 % morčat přežívá do konce doby pozorování v dobrém zdravotním stavu a žádné zvíře nemá příznaky infekce virem Marburg.

Konečná várka vakcíny

Konečná várka vakcíny se připraví z jedné nebo více vyhovujících monovalentních spojených sklizní a může obsahovat více než jeden typ viru. Mohou se přidat vhodné ochucující látky a stabilizátory.

Pouze konečná várka vakcíny, která vyhovuje následujícím požadavkům, se může použít pro přípravu šarže.

Bakterie a houby. Provede se zkouška na sterilitu (2.6.1); na každou živnou půdu se použije 10 ml.

Šarže

Pouze šarže, která vyhovuje následujícímu požadavku na teplotní stabilitu a vyhovuje všem požadavkům uvedeným v odstavcích Zkouška totožnosti, Zkouška na čistotu a Stanovení účinnosti, se může uvolnit k použití.

Teplotní stabilita. Vzorky z šarže se 48 h uchovávají při 37 °C. Stanoví se celková koncentrace viru, jak je popsáno v odstavci Stanovení účinnosti, současně ve vzorkách vystavených vyšší teplotě a ve vzorkách nezahřáté vakcíny. Stanovený rozdíl mezi celkovou virovou koncentrací zahřáté a nezahřáté vakcíny není vyšší než 0,5 log₁₀ infekční virové jednotky (CCID₅₀) na jednu lidskou dávku.

Zkouška totožnosti

Použitím specifických protilátek se prokáže, že vakcína obsahuje poliovirus každého typu uvedeného v označení na obalu.

Zkouška na čistotu