Český lékopis 1997

Bakterie a houby. Vakcína vyhovuje zkoušce na sterilitu (2.6.1).

Stanovení účinnosti

Titrace infekčního viru se provádí nejméně trojmo za použití metody dále popsané. K validaci každého stanovení se používá vhodný referenční virus. Jestliže vakcína obsahuje více než jeden typ polioviru, titruje se každý typ odděleně za neutralizace ostatních přítomných typů vhodnými specifickými antiséry (nebo přednostně monoklonálními protilátkami).

Pro trivalentní vakcínu jsou stanoveny tyto dolní titry virů: nejméně 1 . 10^6,0 infekčních virových jednotek (CCID₅₀) v jednotlivé lidské dávce pro typ 1; nejméně 1 . 105,0 infekčních virových jednotek (CCID₅₀) pro typ 2; nejméně 1 . 10^5,5 infekčních virových jednotek (CCID₅₀) pro typ 3.

Pro monovalentní a divalentní vakcínu rozhodne o výši minimálního titru oprávněná autorita.

Metoda. Skupiny osmi až dvanácti jamek s plochým dnem na mikrotitrační destičce se inokulují 0,1 ml každého vybraného ředění viru a následně se přidá vhodná suspenze buněk linie Hep-2 (Cincinnati). Destičky se inkubují ve vhodné teplotě. Kultury se vyšetřují v 7. až 9. dnu. Zkoušku lze hodnotit pouze v případě, jestliže interval spolehlivosti (P = 0,95 ) logaritmu virové koncentrace je nejvýše ±0,3.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

V označení na obalu se uvede:

1. - typy polioviru obsažené ve vakcíně,
2. - minimální množství viru každého typu obsažené v jedné lidské dávce,
3. - buněčný substrát použitý pro výrobu vakcíny,
4. - že se vakcína nevstřikuje.

Vaccinum pseudopestis aviariae inactivatum

Inaktivovaná vakcína proti pseudomoru ptáků

Synonymum. Inaktivovaná vakcína proti Newcastleské chorobě

Je to emulze nebo suspenze vhodného kmene viru pseudomoru ptáků inaktivovaného takovým způsobem, který zachová jeho imunogenní účinnost. Vakcína může obsahovat olejové nebo jiné vhodné adjuvans.

Výroba

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Virus se pomnoží v kuřecích embryích pocházejících ze zdravých chovů nebo ve vhodných buněčných kulturách (5.2.4).

Zkouška na pomnožení reziduálních živých virů se provádí při sklizni meziproduktu těsně před přidáním adjuvans, aby potvrdila inaktivaci viru. Zkouška se provádí na kuřecích embryích nebo ve vhodné buněčné kultuře a použité množství inaktivovaného viru odpovídá nejméně deseti dávkám vakcíny. Nezjistí se žádný živý virus.

Výběr složení vakcíny

Vakcína je prokazatelně uspokojivá z hlediska bezpečnosti a imunogenity pro všechny druhy a kategorie ptáků, pro které je určena. K průkazu účinnosti (5.2.7) se může použít následující zkouška.

Imunogenita. Pro domácí drůbež je k prokázání imunogenity vhodná zkouška s virulentní čelenží (zkouška B) popsaná v odstavci Stanovení účinnosti.

Zkouška totožnosti

Podána vnímavým zvířatům podporuje vakcína tvorbu protilátek proti viru pseudomoru ptáků (ptačí paramyxovirus typ I).

Zkoušky na čistotu

Bezpečnost. Pokud je vakcína určena pro domácí drůbež, podá se deseti kuřatům z chovu prostého specifikovaných patogenů (5.2.2). Pokud vakcína není určena pro domácí drůbež, podává se deseti zdravým ptákům toho druhu, pro který je určena. Podají se dvě dávky vakcíny jedním z doporučených způsobů podání každému z deseti ptáků starých 14 dní až 28 dní. Doba pozorování je 21 dnů. Neobjeví se žádné abnormální místní ani systémové reakce.

Inaktivace. Deseti kuřecím embryím z chovu prostého specifikovaných patogenů (SPF vejce) (5.2.2) a starých 9 dní až 11 dní se do alantoidní dutiny vstříkne po dvou pětinách dávky a nechají se inkubovat. Pozorují se 6 dnů, pak se odděleně shromáždí alantoidní tekutina z vajec obsahujících živá embrya a z vajec obsahujících mrtvá embrya, z nichž se vyřadí ta, která uhynula do 24 h po injekci. Embrya, která uhynula do 24 h po injekci, se zkouší na přítomnost viru pseudomoru ptáků. Vakcína nevyhovuje, pokud je tento virus zjištěn.

Do alantoidní dutiny každého z deseti 9 dnů až 11 dnů starých SPF vajec se vstříkne po 0,2 ml spojené alantoidní tekutiny z vajec se živými embryi a do každého z dalších deseti SPF vajec 0,2 ml spojené tekutiny z vajec s uhynulými embryi, inkubuje se 5 až 6 dnů. Alantoidní tekutina z každého vejce se zkouší na přítomnost hemaglutininů za použití kuřecích erytrocytů.

Vakcína vyhovuje zkoušce, jestliže nejsou přítomny známky hemaglutinační aktivity a jestliže neuhyne více než 20 % embryí v jedné ze skupin. Pokud v jedné ze skupin uhyne více než 20 % embryí, opakuje se zkouška v této skupině. Nezjistí se hemaglutinační aktivita a nejvýše 20 % embryí ve skupině smí uhynout.

K vyloučení bakteriální infekce se mohou v této zkoušce použít antibiotika.

Cizí agens. Každému z deseti kuřat z chovu prostého specifikovaných patogenů a 14 až 28 dnů starých se jedním z doporučených způsobů podají dvě dávky. Po třech týdnech se každému kuřeti doporučeným způsobem podá jedna dávka. Po dvou týdnech se získají vzorky sér od každého kuřete a provedou se zkoušky na přítomnost protilátek proti sledovaným agens metodami předepsanými pro chovy prosté specifikovaných patogenů, které se používají pro výrobu a kontrolu kvality vakcín (5.2.2): virus ptačí encefalomyelitidy, virus ptačí infekční bronchitidy, virus ptačí leukózy, hemaglutinační ptačí adenovirus, virus infekční burzitidy, virus infekční laryngotracheitidy, virus chřipky A, virus Markovy choroby. Vakcína nevyvolá tvorbu protilátek proti těmto virům.

Sterilita. Vakcína vyhovuje zkoušce na sterilitu předepsané v článku Vaccina ad usum veterinarium.

Stanovení účinnosti

1. A. Každému z nejméně deseti kuřat z chovu prostého specifikovaných patogenů a 21 až 28 dnů starých se vstříkne intramuskulárně objem vakcíny odpovídající 1/50 dávky. Za 17 až 21 dnů se odeberou vzorky séra od každého vakcinovaného kuřete a od každého z deseti kontrolních kuřat stejného věku a stejného původu. Hladina protilátek v jednotlivých sérech se měří dále popsanou hemaglutinačně-inhibiční zkouškou (HI) nebo rovnocennou metodou se stejným počtem hemaglutinačních jednotek a množstvím erytrocytů a s pozitivním kontrolním sérem kalibrovaným podle mezinárodního referenčního přípravku séra proti pseudomoru ptáků. Hodnotu účinnosti mezinárodního standardu v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Světová zdravotnická organizace. Vakcína vyhovuje zkoušce, jestliže průměrný HI titr vakcinované skupiny je stejný nebo větší než 4 log₂ a titr u nevakcinované skupiny je 2 log nebo méně. Jestliže HI titry nejsou uspokojivé, provede se zkouška B.

   Hemaglutinačně-inhibični zkouška. Zkoušená séra se 30 min inaktivují zahřátím na 56 °C. Do první řady jamek mikrotitrační destičky se odpipetuje po 0,05 ml inaktivovaných sér a do ostatních jamek se odpipetuje 0,50 ml roztoku chloridu sodného R (9 g/l) o pH 7,2 až 7,4. Připraví se dvojnásobné ředění séra po celé destičce. Do každé jamky se přidá 0,05 ml suspenze obsahující 4 hemaglutinační jednotky inaktivovaného viru pseudomoru ptáků. Destičky se 1 h inkubují při 4 °C, přidá se 0,05 ml 1% suspenze červených krvinek získaných ze 3- až 4týdenních kuřat vnímavých k pseudomoru ptáků. Destičky se 1 h inkubují při 4 °C. Ve zkoušce se použijí jak pozitivní, tak negativní séra. Pozitivní kontrolní sérum má titr 300 m.j. až 400 m.j. stanovených kalibrací na mezinárodní referenční přípravek a HI titr 5 log₂ až 6 log₂ stanovený v použitém zkušebním systému.

1. B. Použijí se kuřata z chovu prostého specifikovaných patogenů (5.2.2) a stará 21 až 28 dnů. Pro vakcinaci se použijí nejméně tři skupiny, v každé nejméně dvacet kuřat; deset kuřat se ponechá jako kontrolní skupina. Vybere se takový počet různých objemů vakcíny, jaký je počet skupin: například objemy odpovídající 1/25, 1/50,1/100 dávky. Každé skupině se podá odlišný objem. Každému kuřeti se intramuskulárně podá objem zvolený pro danou skupinu. Za 17 až 21 dnů se všem kuřatům podá intramuskulární injekce o obsahu 6 log₁₀ embryonální LD₅₀ viru pseudomoru ptáků kmene - Herts (Weybridge 33/56). (Embryonální LD₅₀ aplikovaného kmene se stanoví sledováním embryí po dobu 6 dnů.) Kuřata se sledují 21 dnů. Z počtu kuřat, které přežijí 21 dní v každé vakcinační skupině bez klinických známek onemocnění Newcastleskou chorobou, se vypočítá PD₅₀ standardními statistickými metodami. Vakcína vyhovuje zkoušce, jestliže nejmenší dávka uvedená na označení vakcíny odpovídá nejméně 50 PD₅₀ a spodní hranice spolehlivosti je nejméně 35 PD₅₀ na dávku. Je-li tento limit méně než 35 PD₅₀na dávku, zkouška se opakuje. Vakcína v opakované zkoušce obsahuje nejméně 50 PD₅₀. Zkoušku lze hodnotit pouze v případě, pokud všechna kuřata v kontrolní skupině uhynou během 6 dnů po čelenži.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

V označení na obalu se uvede:

1. - druh a třída ptáků, pro které je vakcína určena,
2. - kmen viru, který byl použit pro výrobu.

Vaccinum pseudopestis aviariae vivum cryodesiccatum

Živá vakcína proti pseudomoru ptáků lyofilizovaná

Synonymum. Živá vakcína proti Newcastleské chorobě

Je to přípravek lentogenního kmene viru pseudomoru.

Výroba

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Virus se pomnoží v alantoidní dutině kuřecích embryí z chovů prostých specifikovaných patogenů (5.2.2) nebo ve vhodných buněčných kulturách (5.2.4). Jsou-li buněčné kultury ptačího původu, jsou získány z chovů prostých specifikovaných patogenů (5.2.2). Virové suspenze se shromáždí, smíchají s vhodnou stabilizující tekutinou a lyofilizují.

Výběr vakcinačního kmene

Pro přípravu vakcíny se může použít pouze kmen, který je prokazatelně imunogenní a jehož index neurovirulence není vyšší než 0,5. Při průkazu bezpečnosti (5.2.6) a účinnosti (5.2.7) se mohou použít následující zkoušky.

Index neurovirulence. Vzorek inokula, je-li třeba rekonstituovaný, se vstříkne do alantoidní dutiny kuřecích embryí 9 až 11 dní starých pocházejících z chovu prostého specifikovaných patogenů (5.2.2). Vejce se inkubuje 2 dny, potom se sklidí alantoidní tekutiny. Každému z nejméně deseti jednodenních (to je více než 24 h, ale méně než 40 h po vylíhnutí) vnímavých kuřat z chovu prostého specifikovaných patogenů se intracerebrálně vstříkne 0,05 ml alantoidní tekutiny obsahující množství viru odpovídající nejméně 10⁸EID₅₀. Kuřata se pozorují 8 dnů a každý den se zaznamenává počet zdravých, počet vykazujících příznaky onemocnění a počet uhynulých. Všechny tři soubory se sečtou. Celkový součet zdravých se násobí nulou, celkový počet vykazujících příznaky onemocnění se násobí 1 a celkový počet úhynů se násobí 2. Index neurovirulence se získá, když se součet tří předchozích součinů dělí součtem počtu zdravých, nemocných a uhynulých zvířat.

Imunogenita. K prokázání imunogenity je vhodná zkouška, která je popsána v odstavci Stanovení účinnosti.

Zkoušení šarže

Pokud byly zkouška na viry ptačí leukózy a zkoušky na cizí viry na buněčných kulturách a kuřecích embryích provedeny na reprezentativní šarži vakcíny s vyhovujícími výsledky, mohou být tyto zkoušky při rutinních kontrolách jiných šarží vakcíny připravených z téhož inokula vypuštěny, pokud k tomu dá souhlas oprávněná autorita.

Pokud bylo stanovení účinnosti provedeno s vyhovujícími výsledky na reprezentativní šarži vakcíny, může být tato zkouška při rutinní kontrole jiných šarží vakcíny připravených ze stejného inokula vypuštěna, pokud k tomu dá souhlas oprávněná autorita.

Zkouška totožnosti

Rekonstituovaná vakcína smísená s monospecifickým antisérem již nevyvolá hemaglutinaci vhodné koncentrace kuřecích erytrocytů nebo již neinfikuje vnímavá kuřecí embrya, ve stáří 9 až 11 dnů, nebo vnímavé buněčné kultury, do nichž je inokulována.

Zkoušky na čistotu

Bezpečnost. Použije se nejméně deset kuřat z chovu prostého specifikovaných patogenů (5.2.2) a nejnižšího stáří, které je pro vakcinaci uvedeno v označení. Každému kuřeti se nakape do oka deset dávek vakcíny rekonstituované tak, aby se získala koncentrace vhodná pro zkoušku. Kuřata se pozorují 21 dnů. U vakcín určených k vakcinaci kuřat starých dva týdny nebo více se použijí kuřata inokulovaná ve zkoušce na cizí antigeny. Jestliže v období pozorování uhyne více než dvě kuřata z příčin, které nelze přisoudit vakcíně, zkouška se opakuje. Vakcína vyhovuje zkoušce, jestliže žádné z kuřat nemá vážné klinické příznaky, zvláště příznaky dýchací, a žádné z kuřat neuhyne z příčin, které lze přisoudit vakcíně.

Viry ptačí leukózy (2.6.4). Neutralizovaná vakcína vyhovuje zkoušce na leukózní viry.

Cizí viry při použití buněčných kultur (2.6.5). Neutralizovaná vakcína vyhovuje zkoušce na cizí viry při použití buněčných kultur.

Cizí viry při použití kuřecích embryí (2.6.3). Neutralizovaná vakcína vyhovuje zkoušce na cizí viry při použití kuřecích embryí.

Cizí antigeny (2.6.6). Vakcína vyhovuje zkoušce na cizí antigeny při použití kuřat.

Bakterie a houby. Provede se kvantitativní zkouška na bakterie a houby. Vakcína neobsahuje více než jeden saprofytický mikroorganismus v dávce a je prosta patogenních mikroorganismů. Vakcíny určené pro parenterální podání a tekutiny s nimi dodávané vyhovují zkoušce na sterilitu předepsané v článku Vaccina ad usum veterinarium.

Mykoplazmata (2.6.7). Vakcína vyhovuje zkoušce na mykoplazmata.

Titr viru. Rekonstituovaná vakcína se titruje v buněčných kulturách nebo inokulací do alantoidní dutiny kuřecích embryí starých 9 až 11 dnů. Jedna dávka vakcíny obsahuje nejméně takové množství viru, které odpovídá minimálnímu titru uvedenému v označení.

Stanovení účinnosti

Použijí se vnímavá kuřata z jednoho chovu prostého specifikovaných patogenů a nejnižšího stáří, které je pro vakcinaci uvedeno v označení. Každému z nejméně dvaceti kuřat pro každý z udávaných způsobů podání se podá takový objem rekonstituované vakcíny, který obsahuje množství viru, jež odpovídá minimálnímu titru uvedenému v označení. Pro kontrolu se použije deset kuřat. Po 14 až 21 dnech se každé kuře čelenžuje intramuskulárně 10⁵ LD₅₀ virulentního kmene viru pseudomoru ptáků. Zvířata se pozorují 10 dnů. Vakcína vyhovuje zkoušce, jestliže na konci doby pozorování nejméně 90 % vakcinovaných kuřat přežívá a nejeví příznaky onemocnění a všechna kontrolní kuřata uhynula do 6 dnů po inokulaci virulentním čelenžním kmenem.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

V označení na obalu se uvede stáří zvířat, jež se mají vakcinovat.

Vaccinum rabiei ex cellulis ad usum humanum

Humánní vakcína proti vzteklině připravená v buněčných kulturách

Je to lyofilizovaný přípravek vhodného stabilního kmene viru vztekliny pomnoženého v buněčných kulturách a inaktivovaného validovanou metodou.

Vakcína se rozpustí bezprostředně před použitím podle návodu, vznikne čirá tekutina, která může být zbarvena vzhledem k přítomnosti indikátoru pH.

Vakcína vyhovuje požadavkům článku Vaccina ad usum humanum.

Výroba

Výrobní metoda prokazatelně poskytuje stejnorodou vakcínu, která vyhovuje požadavkům na imunogenitu, neškodnost a stabilitu. Jestliže není stanoveno oprávněnou autoritou jinak, virus v konečné vakcíně neprojde více pasážemi od matečného inokula než virus vakcíny, která vyhověla v klinické zkoušce na neškodnost a účinnost: dokonce podle autorizované výjimky počet pasáží pro klinickou studii nepřesáhne pět.

Výrobní metoda se validuje, aby se dokázalo, že přípravek, bude-li zkoušen, vyhoví zkoušce na neškodnost pro imunní séra a vakcíny pro humánní použití (2.6.9).

Substrát pro pomnožení viru

Virus se pomnoží v buňkách lidské diploidní linie (5.2.3), v kontinuální linii schválené oprávněnou autoritou nebo v buňkách kuřecích embryí odvozených z chovu prostého specifikovaných patogenů (5.2.2).

Inokula

Použitý kmen viru je identifikován záznamy, včetně informace o původu kmene a následné manipulaci s ním.

Pracovní inokulum se připraví nejvýše pěti pasážemi od matečného inokula. Jen takové pracovní inokulum, které vyhovuje následujícím zkouškám, se může použít pro pomnožování viru.

Totožnost. Každé pracovní inokulum se specifickými protilátkami prokáže jako rabický virus.

Virová koncentrace. Aby se zajistila stejnorodost výroby, stanoví se virová koncentrace v každém pracovním inokulu metodou buněčné kultury za použití imunofluorescence.

Cizí agens (2.6.16). Pracovní inokulum vyhovuje požadavkům na virová inokula. Je-li virus pasážován na myších mozcích, provedou se specifické zkoušky na myší viry.

Pomnožování a sklizeň viru

Všechny činnosti s buněčnou bankou a následnými buněčnými kulturami probíhají za aseptických podmínek v prostoru, kde se nepracuje s jinými buňkami. Do médií se může použít schválené sérum živočišného, nikoli humánního původu, ale konečné udržovací médium pro buněčný růst při pomnožování viru neobsahuje živočišné sérum: média mohou obsahovat lidský albumin vyhovující článku Albumini humani solutio. Sérum a trypsin použité pro přípravu buněčné suspenze a médií prokazatelně neobsahují infekční cizí agens: trypsin vyhovuje článku Trypsinům. Média pro buněčnou kulturu mohou obsahovat indikátor pH, jako je fenolová červeň, a schválená antibiotika v nejnižší účinné koncentraci. Nejméně 500 ml buněčných kultur použitých pro výrobu vakcíny se ponechá neinfikovaných (kontrolní buňky). Virová suspenze se sklízí jednou nebo vícekrát během inkubace. Více sklizní z téže produkční buněčné kultury se může spojit a považovat za jednu sklizeň. Jen taková jednotlivá sklizeň, která vyhovuje následujícím požadavkům, se může použít pro přípravu inaktivované virové sklizně.

Totožnost. Jednotlivá sklizeň obsahuje virus, který se specifickými protilátkami prokáže jako rabický virus.

Virová koncentrace. Infekční virus se stanoví na buněčných kulturách: titrem se sleduje stejnoměrnost výroby.

Kontrolní buňky. Kontrolní buňky z produkční buněčné kultury, z níž se odvozují jednotlivé sklizně, vyhovují zkoušce totožnosti a požadavkům na cizí agens (2.6.16).

Purifikace a inaktivace

Virová sklizeň se může koncentrovat a případně též purifikovat vhodnými metodami: virová sklizeň se inaktivuje validovanou metodou v pevně definovaném stadiu výroby, které může být před, během nebo po koncentraci nebo purifikaci. Metoda je prokazatelně schopna inaktivovat rabický virus bez zničení imunogenní aktivity. Při použití betapropiolaktonu nepřesahuje jeho koncentrace v žádné chvíli 1 : 3500.

Pro přípravu konečné várky vakcíny se použije jen taková inaktivovaná virová suspenze, která vyhovuje následujícím požadavkům.

Inaktivace. Provede se pomnožovací zkouška na zbytkový infekční rabický virus buďto ihned po inaktivaci, nebo se použije vzorek zmražený bezprostředně po inaktivaci a uchovávaný při -70 °C. Naočkuje se takové množství inaktivované virové suspenze, které odpovídá nejméně dvaceti pěti dávkám vakcíny na buněčnou kulturu téhož typu, jaký byl použit pro výrobu vakcíny. Subkultury po 7 dnech a po 14 dnech se zkoušejí na přítomnost rabického viru imunofluorescenční zkouškou. Rabický virus se nezjistí.

Zbytková DNK hostitelských buněk. Jestliže se pro pomnožování viru použije kontinuální buněčná linie, stanoví se obsah zbytkové DNK hostitelských buněk vhodnou metodou, jak je uvedeno v článku Producta ab ADN recombinante, a není větší než 100 pg v jedné lidské dávce.

Konečná várka vakcíny

Konečná várka vakcíny se připraví z jedné nebo více inaktivovaných virových suspenzí. Může se přidat schválený stabilizátor k uchování účinnosti přípravku při lyofilizaci a po ní.

K přípravě šarže se může použít jen taková konečná várka vakcíny, která vyhovuje následujícím požadavkům.

Obsah glykoproteinu. Vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1) se stanoví obsah glykoproteinu, např. jednoduchou radiální imunodifuzí, metodou ELISA nebo Zkouškou vazby protilátek. Obsah je v rozmezí schváleném pro jednotlivý přípravek.

Sterilita (2.6.1). Konečná várka vakcíny vyhovuje zkoušce na sterilitu, při níž se na každou živnou půdu použije 10 ml.

Šarže

Konečná várka vakcíny se asepticky rozplní do sterilních obalů a lyofilizuje až do obsahu vlhkosti, který zaručuje optimální stabilitu přípravku. Obaly se uzavírají tak, aby se vyloučila kontaminace a pronikání vlhkosti.

K použití se může uvolnit jen taková šarže, která vyhovuje požadavkům uvedeným dále v odstavcích Zkouška totožnosti, Zkouška na čistotu a Stanovení účinnosti. Za předpokladu, že zkouška na inaktivaci byla provedena v inaktivované virové suspenzi s vyhovujícím výsledkem a zkouška na bovinní sérumalbumin v konečné várce s vyhovujícím výsledkem, mohou být tyto zkoušky vynechány u šarže.

Zkouška totožnosti

Přítomnost antigenu rabického viru se prokáže vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1) za použití protilátek, nejlépe mnonoklonálních. Vedle toho také stanovení účinnosti slouží jako zkouška totožnosti.

Zkoušky na čistotu

Inaktivace. Množství odpovídající nejméně dvaceti pěti lidským dávkám vakcíny se naočkuje na buněčnou kulturu téhož typu, který byl použit pro přípravu vakcíny. Subkultury po 7 dnech a po 14 dnech se zkoušejí na přítomnost rabického viru imunofluorescenční zkouškou. Rabický virus se nezjistí.

Bovinní sérumalbumin. Nejvýše 50 ng v jedné lidské dávce. Obsah se stanoví vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1).

Bakteriální endotoxiny (2.6.14). Nejvýše 25 m.j. v jedné lidské dávce.

Pyrogenní látky (2.6.8). Vakcína vyhovuje ve zkoušce na pyrogenní látky, při níž se, pokud není stanoveno jinak, vstříkne každému králíkovi jedna lidská dávka desetkrát zředěná.

Voda, semimikrostanovení (2.5.12). Nejvýše 3,0 %.

Stanovení účinnosti

Účinnost se stanoví porovnáním dávky potřebné k ochraně myší proti účinku letální dávky rabického viru intracerebrálně podané s množstvím referenčního přípravku nezbytným k vytvoření stejné ochrany. Pro toto porovnání je zapotřebí referenční vakcína kalibrovaná v mezinárodních jednotkách a vhodný rabický virus používaný jako čelenžní přípravek.

Mezinárodní jednotka je účinnost obsažená v deklarovaném množství mezinárodního standardu. Hodnotu účinnosti mezinárodního standardu v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Světová zdravotnická organizace.

Dále uvedená zkouška používá rovnoběžný model s nejméně třemi body pro zkoušený přípravek i pro referenční přípravek. Pouze pracovník se zkušenostmi s touto metodou podání je oprávněn provádět zjednodušenou zkoušku s jedním ředěním zkoušeného přípravku. Taková zkouška dovoluje pracovníkovi určit, že vakcína má účinnost signifikantně vyšší, než je požadované minimum, ale nedává plnou informaci o validitě každého jednotlivého stanovení účinnosti. Užití jednoho ředění dovoluje značnou redukci počtu zvířat předepsaných pro zkoušku a je zvažováno každou laboratoří ve vztahu k ustanovením Evropské konvence pro ochranu obratlovců používaných pro vědecké a jiné experimentální účely.

Výběr a rozložení zkušebních zvířat. Používají se zdravé samičky myší staré asi 4 týdny hmotnosti 11 g až 15 g a pocházející z jednoho chovu. Myši se rozdělí do šesti skupin o tolika zvířatech, aby byly splněny požadavky na validitu zkoušky. Pro titraci čelenžní suspenze se rozdělí do čtyř skupin po pěti.

Příprava čelenžní suspenze. Myším se intracerebrálně vstříkne kmen CVS rabického viru, a když myši vykazují známky onemocnění, ale před jejich úhynem, se usmrtí, vyjmou se mozky a připraví se homogenát mozkové tkáně ve vhodném ředidle. Větší částice se oddělí odstředěním a supernatant se použije jako čelenžní suspenze. Suspenze se rozplní v malých objemech do ampulí, které se zataví a uchovávají při teplotě nižší než -60 °C. Jedna ampule se suspenzí se rozmrazí, vhodným ředidlem se připraví sériová ředění. Každé ředění se intracerebrálně vstříkne skupině pěti myší po 0,03 ml příslušného ředění. Myši se pozorují po dobu 14 dnů. Hodnota LD₅₀ neředěné suspenze se vypočítá z počtu zvířat v každé skupině, která vykazují známky onemocnění nebo uhynula mezi pátým a čtrnáctým dnem.

Stanovení účinnosti zkoušené vakcíny. Připraví se tři pětinásobná sériová ředění zkoušeného přípravku a tři pětinásobná sériová ředění referenčního přípravku. Připraví se ředění tak, že u nejkoncentrovanějšího ředění lze očekávat, že ochrání více než 50 % zvířat, jimž bylo podáno, a u nejméně koncentrovaných ředění lze očekávat ochranu nižší než 50 % u zvířat, kterým bylo toto ředění podáno. Každé ze šesti ředění se podá jedné ze šesti šestnáctičlenných skupin zvířat a každé myši se intraperitoneálně vstříkne 0,5 ml toho ředění, které bylo přiděleno skupině. Po sedmi dnech se připraví tři identická ředění zkoušeného přípravku a referenčního přípravku a injekce se opakuje. Sedm dní po druhé injekci se připraví na základě předchozí titrace taková suspenze čelenžního viru, aby 0,03 ml obsahovalo 50 LD₅₀. Intracerebrálně se každé vakcinované myši vstříkne 0,03 ml této suspenze. Připraví se tři vhodná sériová ředění čelenžní suspenze a suspenze a ředění se přičlení ke čtyřem skupinám po deseti zvířatech. Čelenžní suspenze a tři ředění se intracerebrálně vstříknou čtyřem skupinám myší po 0,03 ml. Zvířata všech skupin se pozorují 14 dní a zaznamenávají se počty zvířat vykazujících známky onemocnění vzteklinou nebo uhynulých v období od pátého do čtrnáctého dne po čelenži.

Zkoušku lze hodnotit, jestliže 50% ochranná dávka referenčního přípravku i zkoušeného přípravku leží mezi nejvyšší a nejnižší dávkou podanou myši; jestliže titrace čelenžní suspenze prokáže, že 0,03 ml čelenžní suspenze obsahuje nejméně 10 LD₅₀ jestliže statistická analýza vykazuje signifikantní sklon a nesignifikantní odchylku linearity nebo rovnoběžnosti v závislosti dávka - odpověď; jestliže interval spolehlivosti (P = 0,95) je v rozmezí 25 % až 400 % stanovené účinnosti.

Vakcína vyhovuje, jestliže stanovená účinnost je nejméně 2,5 m.j. v lidské dávce.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

V označení na obalu se uvede biologický původ buněk použitých k přípravě vakcíny.

Vaccinum rabiei inactivatum ad usum veterinarium

Inaktivovaná vakcína proti vzteklině pro veterinární použití

Je to tekutý nebo lyofilizovaný přípravek z fixního viru vztekliny inaktivovaný vhodným způsobem. Virus se pomnoží ve vhodné buněčné kultuře nebo v jiných vhodných substrátech a může se purifikovat a koncentrovat. Vakcína může obsahovat adjuvans a vhodnou protimikrobní konzervační látku.

Výroba

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Vakcíny z tkáňových kultur se připravují pomnožením viru v primárních buněčných kulturách ze zdravých zvířat nebo ve vhodných buněčných liniích (5.2.4). Virová suspenze se sklízí jedenkrát nebo vícekrát během 28 dní po naočkování. Vícenásobné sklizně z jedné buněčné kultury se mohou spojit a považovat za jednotlivou sklizeň. Virus vztekliny se inaktivuje vhodnou metodou.

U vakcín z buněčných kultur se na buněčných kulturách stejného druhu, jaké byly použity při výrobě vakcíny, provede zkouška na zbytkový infekční virus vztekliny, aby se potvrdila účinná inaktivace viru vztekliny. Množství inaktivovaného viru pro tuto zkoušku odpovídá nejméně dvaceti pěti dávkám vakcíny. Nezjistí se živý virus.

Účinnost reprezentativní šarže vakcíny se prokazuje přímou čelenží a nepřímou metodou prokazující tvorbu neutralizačních protilátek na každém druhu zvířat, pro který je vakcína určena.

Následující požadavky platí pro tekuté přípravky a pro lyofilizované přípravky rekonstituované podle údajů v označení.

Zkouška totožnosti

Vakcína po podání zvířatům podporuje tvorbu specifických neutralizačních protilátek.

Zkouška na čistotu

Bezpečnost. Jestliže je vakcína určena pro více než jeden druh zvířat, včetně psa, provede se zkouška na psech. Jinak se použije jeden z druhů zvířat, pro který je vakcína určena. Dvěma vnímavým zvířatům se vstříkne způsobem uvedeným v označení dvojnásobek nejmenší dávky vakcíny. Zvířata se pozorují 21 dní. Nevzniknou významné místní nebo systémové reakce.

Inaktivace. Nejméně deseti myším hmotnosti 11 g až 15 g se intracerebrálně vstříkne po 0,03 ml ředění, které odpovídá nejméně pětinásobku udané nejmenší dávky. Pokud vakcína obsahuje protimikrobní konzervační látku nebo adjuvans, rozředí se před aplikací nejvýše desetkrát. V tomto případě, a nebo když vakcinační kmen je patogenní jen pro sající myšky, provede se zkouška na jednodenních až čtyřdenních myškách. Zvířata se pozorují 21 dní. Jestliže více než dvě zvířata uhynou v průběhu prvních 48 h, zkouška se opakuje. Zvířata nemají od 3. do 21. dne po podání žádné příznaky vztekliny nebo jiné anomálie, které by bylo možno přičítat vakcíně.

Místo této zkoušky je možno použít u tkáňových vakcín, které neobsahují žádné adjuvans, vhodnější pomnožovací zkoušky na přítomnost zbytkového infekčního viru, pro kterou se použije stejný druh tkáňových kultur, jaký byl použit pro výrobu vakcíny.

Sterilita. Vyhovuje zkoušce na sterilitu předepsané v článku Vaccina ad usum veterinarium.

Stanovení účinnosti

Účinnost se stanoví porovnáním dávky potřebné k ochraně myší před klinickými účinky dále definované dávky vzteklinového viru intracerebrálně podaného v porovnáním s množstvím referenčního přípravku inaktivované vakcíny proti vzteklině pro veterinární použití BRP kalibrované v mezinárodních jednotkách nezbytným k dosažení stejné ochrany.

Výběr a rozdělení pokusných zvířat. Ke zkoušce se používají zdravé myši ve stáří asi 4 týdnů a hmotnosti 11 g až 15 g z jednoho chovu. Myši se rozdělí do nejméně deseti skupin po nejméně deseti zvířatech. Všechny myši jsou stejného pohlaví.

Příprava suspenze k čelenži. Jedné skupině myší se intracerebrálně vstříkne kmen CVS viru vztekliny. Při vzniku příznaků vztekliny ještě před jejich uhynutím se myši usmrtí, odeberou se mozky a z mozkové tkáně se připraví ve vhodném rozpouštědle homogenní suspenze. Po oddělení hrubých částic odstředěním se supernatant použije jako čelenžní suspenze. Suspenze se rozplní v malých objemech do ampulí, které se zataví a uchovávají při teplotě nižší než -60 °C. Jedna ampule se rozmrazí a ve vhodném rozpouštědle se připraví sériové ředění. Každé ředění se použije pro jednu skupinu deseti myší. Každé myši se intracerebrálně vstříkne 0,03 ml příslušného ředění. Myši se pozorují 14 dní a v každé skupině se zaznamenává počet zvířat, u kterých se mezi 5. až 14. dnem vyvinuly příznaky vztekliny. Potom se vypočte ID50 neředěné suspenze.

Postup zkoušky. Připraví se nejméně tři sériová ředění zkoušeného přípravku a tři podobné řady ředění porovnávacího přípravku.

Ředění se vyberou tak, aby ředění s nejvyšší koncentrací vakcíny chránilo nejméně 50 % zvířat, jimž bylo podáno, a ředění s nejnižší koncentrací vakcíny chránilo méně než 50 % zvířat, jimž bylo podáno. Každé ředění se použije u jedné skupiny myší. Každé myši se intraperitoneálně vstříkne 0,5 ml příslušného ředění. Za 14 dní po podání vakcíny se připraví suspenze čelenžního viru tak, aby na podkladě předtitrace obsahovala každá čelenžní dávka 50 ID ₅₀ v 0,03 ml. Všem vakcinovaným myším se intracerebrálně vstříkne po 0,03 ml čelenžní suspenze. Mimo to se připraví tři další sériová ředění použitého čelenžního viru. Ředění použité k čelenži a připravená tři další ředění se intracerebrálně vstříknou v dávce 0,03 ml na myš dalším čtyřem skupinám po deseti nevakcinovaných myších. Zvířata všech skupin se pozorují 14 dní. V každé skupině mohou do 4 dní po čelenži uhynout nejvýše dvě myši. V každé skupině se zaznamenává počet zvířat, u kterých se v době od 5 do 14 dní po čelenži vyskytly příznaky vztekliny.

Zkoušku lze hodnotit pouze v případě, jestliže:

1. - 50% ochranná dávka zkoušeného i referenčního přípravku je mezi největší a nejmenší dávkou vakcíny podanou myším,
2. - kontrolní titrace čelenžní suspenze prokáže, že v dávce 0,03 ml bylo dosaženo nejméně 10 ID ₅₀,
3. - interval spolehlivosti (P = 0,95) je v rozmezí 25 % až 400 % stanovené účinnosti,
4. - statistická analýza ukazuje signifikantní vzestup a žádné signifikantní odchylky od linearity a rovnoběžnosti přímek závislosti odpovědi na dávce.

Vakcína vyhovuje zkoušce, když stanovená účinnost je nejméně 1 m.j. v nejmenší předepsané dávce.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

1. V označení na obalu se uvede:
   1. - druh tkáně nebo buněčné kultury, které byly použity pro přípravu vakcíny, a druh původu,
   2. - nejmenší počet mezinárodních jednotek v dávce.

Vaccinum rabiei perorale vivum ad vulpem

Živá vakcína proti vzteklině perorální pro lišky

Je to přípravek z imunogenního kmene oslabeného viru vztekliny. Vakcína se vloží do návnady tak, že se mohou asepticky provést dále popsané zkoušky.

Výroba