Oxid dusnatý a oxid dusičitý v medicinálních plynech se stanoví pomocí chemiluminiscenčního analyzátoru, viz obrázek 2.5.26-1.
Obr. 2.5.26-1 Chemiluminiscenční analyzátor
Přístroj se skládá z následujících částí:
- - zařízení pro filtraci, nastavení a kontrolu průtoku zkoušeného plynu,
- - konvertoru, který redukuje oxid dusičitý na oxid dusnatý pro stanovení součtu obsahů oxidu dusnatého a oxidu dusičitého; obsahuje nerezovou, skleněnou nebo křemennou pícku udržovanou na teplotě nepřevyšující 550 °C,
- - generátoru ozonu s kontrolovanou průtokovou rychlostí plynu; ozon se vytváří působením elektrických výbojů mezi dvěma elektrodami s přiloženým vysokým napětím. Do ozonového generátoru se přivádí buď čistý kyslík, nebo vysušený atmosférický vzduch a koncentrace takto získaného ozonu musí značně převyšovat maximální koncentraci všech stanovovaných oxidů dusíku,
- - komůrky, v níž reaguje oxid dusnatý s ozonem,
- - systému pro detekci světelného záření emitovaného při vlnové délce 1,2 µm, sestávajícího ze selektivního optického filtru a fotonásobiče.
- 2.5.27 Kyslík v medicinálních plynech
Kyslík v medicinálních plynech se stanoví pomocí paramagnetického analyzátoru.
Princip metody je založen na vysoké paramagnetické citlivosti kyslíkové molekuly. Kyslík vykazuje silnou interakci na magnetická pole, která se měří elektronicky, zesilují se a převádějí na odečty koncentrace kyslíku. Měření koncentrace kyslíku závisí na teplotě a tlaku. Jestliže analyzátor není automaticky kompenzován na změny teploty a tlaku, musí být těsně před použitím kalibrován. Protože paramagnetický vliv kyslíku je lineární, musí mít přístroj vhodný rozsah s možností odečtu koncentrace na 0,1 % nebo přesnější.
Kalibrace přístroje. Nastavení se provede následujícím způsobem:
- - nula se nastaví po dosažení konstantního odečtu při průchodu dusíku R1 přístrojem při vhodné průtokové rychlosti. Nastavení by mělo být provedeno v souladu s instrukcí výrobce,
- - příslušná limitní hodnota se nastaví při průchodu vzduchu (20,9 % O 2V/V) přístrojem při vhodné průtokové rychlosti po dosažení konstantního odečtu. Limitní hodnota by měla být nastavena na 20,9 % kyslíku V/V v souladu s instrukcí výrobce.
Stanovení obsahu. Zkoušený plyn se nechá procházet přístrojem konstantní průtokovou rychlostí tak dlouho, dokud se nedosáhne vyhovujícího odečtu.
- 2.5.28 Voda v medicinálních plynech
Voda v medicinálních plynech se stanoví pomocí elektrolytického hygrometru popsaného níže. Měřicí celu tvoří tenká vrstva oxidu fosforečného mezi dvěma stočenými platinovými dráty, které působí jako elektrody. Vodní pára ze zkoušeného plynuje absorbována oxidem fosforečným za tvorby elektricky vodivé kyseliny fosforečné. Elektrické napětí přiváděné kontinuálně na elektrody vyvolává elektrolýzu vody a tím regeneruje oxid fosforečný. Měří se vznikající elektrický proud, jehož velikost je úměrná množství vody ve zkoušeném plynu. Systém je samokalibrační vzhledem k platnosti Faradayova zákona.
Odebere se vzorek zkoušeného plynu a nechá se temperovat při pokojové teplotě. Měřicí cela se čistí, dokud se nedosáhne stabilního odečtu na stupnici přístroje. Změří se obsah vody ve zkoušeném plynu a překontroluje se stálost teploty zařízení umístěného na vstupu do přístroje.
- 2.5.29 Oxid siřičitý
150 ml vody R se převede do baňky (A), viz obr. 2.5.29-1, str. 195, a celým systémem se nechá 15 min proudit oxid uhličitý R průtokovou rychlostí 100 ml/min. Do zkumavky (D) se převede 10 ml peroxidu vodíku zředěného RS neutralizovaného po přidání roztoku modři brom fenolové R (1 g/l) v lihu R 20% (V/V). Bez přerušení proudu oxidu uhličitého se odstraní nálevka (B) a pomocí 100 ml vody R se hrdlem převede do baňky (A) 25,0 g zkoušené látky. Nálevkou se přidá 80 ml kyseliny chlorovodíkové zředěné RS a vaří se 1 h. Pak se otevře uzávěr nálevky, přeruší se proud oxidu uhličitého, zahřívání a chlazení vodou. Obsah zkumavky se převede pomocí malého množství vody R do 200ml kuželové širokohrdlé baňky, zahřívá se 15 min na vodní lázni a ochladí se. Přidá se 0,1 ml roztoku modři bromfenolové R (1 g/l) v lihu R 20% (V/V) a titruje se hydroxidem sodným 0,1 mol/l VS do změny žlutého zbarvení na fialově modré.
Obsah oxidu siřičitého (SO2) v µg/g se vypočítá podle vztahu:
- 128a,
v němž značí:
- a - spotřebu hydroxidu sodného 0,1 mol/l VS v mililitrech.
- 2.5.30 Oxidanty
4,0 g se převedou do 125ml kuželové baňky se zabroušenou zátkou, přidá se 50,0 ml vody R, baňka se uzavře a směs se 5 min míchá. Pak se obsah baňky převede do 50ml odstřeďovaní zkumavky se skleněnou zátkou a odstřeďuje se. 30,0 ml čiré supernatantní tekutiny se převede do 125ml kuželové baňky se zabroušenou zátkou, přidá se 1 ml kyseliny octové ledové R a 0,5 g až 1,0 g jodidu draselného R, baňka se uzavře a roztok se důkladně promíchá. Nechá se stát 25 min až 30 min ve tmě. Pak se přidá 1 ml škrobu RS a titruje se thiosíranem sodným 0,002 mol/l VS do odbarvení. Provede se slepá zkouška.
Spotřeba je nejvýše 1,4 ml thiosíranu sodného 0,002 mol/l VS (0,002 %, počítáno jako H2O2). 1 ml thiosíranu sodného 0,002 mol/l VS odpovídá 34 µg oxidantu, počítáno jako peroxid vodíku.
Obr. 2.5.29-1 Přístroj na stanovení oxidu siřičitého
Rozměry v milimetrech.
- 2.6 Biologické zkoušky
- 2.6.1 Zkouška na sterilitu
Tato zkouška se provádí s léčivými látkami, pomocnými látkami, léčivými přípravky a zdravotnickými materiály, u nichž je lékopisem předepsána sterilita. Vyhovující výsledek však pouze udává, že zkoušený vzorek není znečištěn žádným mikrobem zjistitelným v podmínkách zkoušky. Stupeň záruky poskytnutý nepřítomností znečišťujících jednotek ve vzorku ve vztahu ke kvalitě šarže je funkcí účinnosti přijatého plánu vzorkování. Rozšíření platnosti výsledku na celou šarži výrobku předpokládá záruku, že přípravek byl vyroben za homogenních podmínek, což závisí na opatřeních v průběhu výroby.
Pokud se přípravek sterilizuje v uzavřených konečných obalech, vyšší stupeň záruky než provedení zkoušky na sterilitu poskytuje sledování správného průběhu sterilizace celé šarže pomocí měření a automatického zaznamenávání hodnot biologicky opodstatněných fyzikálních parametrů.
Zkouška na sterilitu je jedinou analytickou metodou vhodnou pro zkoušení přípravků vyrobených za aseptických podmínek a jedinou analytickou metodou platnou pro úřední autoritu, která zkouší přípravek na sterilitu.
Podstata zkoušky. Na vybraných půdách se za stanovených podmínek kultivace zjišťuje, zda zkoušený přípravek obsahuje mikroorganismy schopné pomnožení v daných podmínkách.
Opatření proti mikrobiálnímu znečištění
Zkouška na sterilitu se provádí za podmínek zabraňujících náhodnému znečištění v průběhu zkoušky, např. použitím sterilního boxu s laminárním prouděním vzduchu. Opatření proti náhodnému znečištění nesmí inaktivovat mikroorganismy, které mají být zjištěny zkouškou.
Je nutno pravidelně ověřovat pracovní podmínky zkoušky kontrolou vzduchu a povrchů pracovního prostředí a souběžnou kontrolou přípravků, jejichž sterilita je známa.
Výběr živné půdy
Vhodné půdy pro aeroby, anaeroby a houby a způsob jejich přípravy jsou popsány níže. Mohou se použít jiné půdy, u nichž je prokázána vhodnost pro kultivaci široké oblasti mikroorganismů. Půdy odpovídají následujícím zkouškám, provedeným s každou šarží před nebo souběžně se zkouškou provedenou u zkoušených přípravků.
Sterilita. Půdy určené zejména k průkazu bakterií se inkubují při teplotě 30 °C až 35 °C a půdy určené zejména k průkazu hub se inkubují při teplotě 20 °C až 25 °C po dobu nejméně 7 dní. Není pozorován růst mikroorganismů.
Živné vlastnosti. Zkumavky s vybranými půdami se naočkují dávkou asi 100 živých mikroorganismů (aeroby, anaeroby a houby) a inkubují se při shora uvedených (odstavec Sterilita) teplotách nejdéle 7 dní.
Půdy jsou vhodné, jestliže v nich dojde k rychlému a mohutnému pomnožení mikroorganismů. Ke zkoušce se doporučují tyto testovací mikroorganismy:
Ke zkoušce se doporučují tyto testovací mikroorganismy:
Opatření proti mikrobiálnímu znečištění Výběr živné půdy Staphylococcus aureus, např. ATCC 6538 P CCM 2022 CIP 53.156 CNCTC Mau 28/58 NCTC 7447 Bacillus subtilis, např. ATCC 6633 CCM 1999 CIP 52.62 CNCTC Bs 8/58 NCIB 8054 Clostridium sporogenes, např. ATCC 19404 CCM 4409 CIP 79.03 CNCTC Cl 66/79 Candida albicans, např. ATCC 2091 CCM 8226 CIP 1180.79 CNCTC 55/79 Účinnost půd v přítomnosti a nepřítomnosti zkoušeného přípravku
- a) Do nejméně 4 zkumavek živné půdy nebo každé živné půdy použité pro zkoušku sterility se přidá množství zkoušeného přípravku, které bude použito ve zkoušce na sterilitu. (U catgutu nebo jiných chirurgických šicích materiálů se do každé zkumavky vloží 2 vlákna.) Polovina zkumavek se naočkuje 0,1 ml suspenze vhodného kmene (v případě antibiotik se použije kmen citlivý na antibiotikum) aerobního mikroorganismu, jako např. Staphylococcus aureus, zředěné tak, aby 1 ml obsahoval asi 1000 živých zárodků (naočkuje se tedy asi 100 zárodků) a druhá polovina zkumavek se naočkuje 0,1 ml suspenze spor vhodného kmene (v případě antibiotik se užije kmen citlivý na antibiotikum) anaerobního mikroorganismu, jako např. Clostridium sporogenes, zředěné tak, aby 1 ml obsahoval 1000 spor (naočkuje se asi 100 spor). Stejně se připraví skupina zkumavek bez přidání zkoušeného přípravku a naočkuje se stejným způsobem. Všechny zkumavky se inkubují při teplotě 30 °C až 35 °C po dobu nejvýše 7 dnů.
- b) Do nejméně dvou zkumavek s půdou na kultivaci hub se přidá zkoušený přípravek ve stejném množství jako ve zkoušce na sterilitu (u catgutu nebo jiných chirurgických materiálů se na každou zkumavku použijí 2 vlákna). Zkumavky se naočkují 0,1 ml suspenze vhodného kmene (u antibiotik se použije kmen citlivý na antibiotikum) houby, jako např. Candida albicans, zředěné tak, aby 1 ml obsahoval asi 1000 živých zárodků (naočkuje se asi 100 zárodků). Stejně se připraví 2 zkumavky bez přidání zkoušeného přípravku a naočkují se stejným způsobem. Všechny zkumavky se inkubují při teplotě 20 °C až 25 °C nejdéle 7 dnů.
Jestliže se živná půda původně určená pro kultivaci hub používá také ke kultivaci bakterií, zkouší se oběma druhy mikroorganismů.
Pokud je během inkubace růst mikrobů ve zkumavkách se zkoušenou látkou i bez ní podobný (rychlý a mohutný), nemá látka protimikrobní účinek a zkoušku na sterilitu je možno provést bez modifikací. Jestliže je ve zkumavkách se zkoušenou látkou slabší nebo opožděný růst ve srovnání se zkumavkami bez této látky nebo jestliže ve zkumavkách se zkoušenou látkou nenastane růst, má tato látka protimikrobní účinek, který musí být odstraněn filtrací, zředěním nebo neutralizací před nebo v průběhu zkoušky na sterilitu. Účinnost odstranění protimikrobního účinku se ověří opakováním zkoušky.
Postup zkoušky na sterilitu
Zkouška může být provedena metodou membránové filtrace nebo přímým očkováním do živných půd. Pokud to povaha přípravku dovoluje, tj. u filtrovatelných vodných, lihových nebo olejových přípravků, u přípravků mísitelných nebo rozpustných ve vodných nebo olejových rozpustidlech, které samy v podmínkách zkoušky nemají žádný protimikrobní účinek, má se dát přednost metodě membránové filtrace.
Membránová filtrace
Používají se membránové filtry s jmenovitou velikostí pórů nejvýše 0,45 (µm, jejichž účinnost zadržet mikroorganismy byla ověřena. Filtry např. z dusičnanů celulosy se používají pro vodné, olejové a slabě lihové roztoky, filtry např. z octanu celulosy se používají pro silně lihové roztoky.
Dále popsaná metoda je určena pro filtry o průměru asi 50 mm. Pokud se použijí filtry jiného průměru, měl by se jim přizpůsobit objem zřeďovacího i promývacího roztoku. Filtrační přístroj a membránové filtry se sterilizují vhodnými postupy. Přístroj je upraven tak, aby zkoušený roztok mohl být do něho naplněn a filtrován za aseptických podmínek a aby umožnil vyjmutí membránového filtru a jeho přenesení do živné půdy nebo aby po přidání živné půdy umožnil kultivaci.
Vodné roztoky. Na membránový filtr se přenese malé množství vhodné sterilní tekutiny, jako např. neutrální roztok masového nebo kaseinového peptonu (1 g/l), a zfiltruje se. Ihned poté se jedním nebo více filtry zfiltruje obsah zkoušené nádoby nebo nádob v množství podle tabulek 2.6.1-1 a 2.6.1-2. Obsah se, pokud je to nutné, zředí vybraným sterilním rozpustidlem asi na 100 ml. Má-li zkoušený roztok protimikrobní účinek, promyje se membránový filtr nejméně třikrát asi 100 ml vybraného sterilního rozpustidla, a pokud je to nutné, přidá se ke sterilnímu rozpustidlu nebo k živné půdě neutralizující látka. Membránový filtr se přenese do živné půdy nebo se asepticky rozdělí na dvě stejné části a každá z nich se přenese do vhodné půdy. Lze též nalít půdu na membránu v přístroji. Pokud není předepsáno jinak, inkubují se 7 dní při teplotě 30 °C až 35 °C půdy určené zejména k průkazu bakterií a při 20 °C až 25 °C půdy určené zejména k průkazu hub. (Pokud je podezření na možnou přítomnost mikroorganismů oslabených vlastnostmi látky nebo provedeným zpracováním, může kompetentní autorita prodloužit dobu inkubace).
Tab. 2.6.1-1 Množství zkoušeného vzorku pro zkoušku na sterilitu parenterálních přípravků
Opatření proti mikrobiálnímu znečištění Výběr živné půdy Účinnost půd v přítomnosti a nepřítomnosti zkoušeného přípravku Postup zkoušky na sterilitu Membránová filtrace Tab. 2.6.1-1 Množství zkoušeného vzorku pro zkoušku na sterilitu parenterálních přípravků Obsah jednotlivé nádoby Nejmenší množství použité pro jednotlivou půdu Tekutiny méně než 1 ml celý obsah nádoby 1 ml a více, méně než 4 ml polovina obsahu nádoby 4 ml a více, méně než 20 ml 2 ml 20 ml až 100 ml 10 %, není-li předepsáno jinak. více než 100 ml 10 %, nejméně však 50 ml, není-li předepsáno
jinak.Pevné látky méně než 50 mg celý obsah nádoby 50 mg a více, méně než 200 mg polovina obsahu nádoby 200 mg a více 100 mg Rozpustné pevné látky. Na každou živnou půdu se použije podle tabulky 2.6.1-1 a 2.6.1-2 určené množství látky, které se rozpustí ve vhodném rozpustidle, jako je např. neutrální roztok masového nebo kaseinového peptonu (1 g/l), a postupuje se stejně jako u vodných roztoků za použití membránového filtru vhodného pro zvolené rozpustidlo.
Oleje a roztoky v olejích. Na každou živnou půdu se použije podle tabulky 2.6.1-1 a 2.6.1-2 určené množství látky. Oleje a roztoky v olejích s dostatečně nízkou viskozitou se filtrují přímo suchým membránovým filtrem. Viskózní oleje se mohou zředit vhodným sterilním ředidlem, jako je isopropylmyristat, u něhož je prokázáno, že v podmínkách zkoušky nemá protimikrobní vlastnosti. Olej se nechá proniknout membránovým filtrem vlastní tíží a tlak nebo sání se nastavují zvolna. Membránový filtr se promyje nejméně třikrát asi 100 ml vhodného sterilního roztoku, jako je např. neutrální roztok masového nebo kaseinového peptonu (1 g/l), obsahující (4-terc.oktylfenoxy)polyoxyethanol (1 g/l), nebo polysorbát 80 (10 g/l). Membránový filtr nebo filtry se přenesou do živné půdy nebo živných půd, nebo naopak se k nim půda přidá, jak je uvedeno u vodných roztoků, a inkubují se při stejných teplotách po stejnou dobu.
Masti a krémy. Na každou živnou půdu se použije množství přípravku uvedené v tabulce 2.6.1-2. Masti s hydrofobním základem a emulze typu v/o se mohou ředit isopropylmyristatem až na koncentraci (10 g/l) a zahřívat, pokud je to potřeba, na nejvýše 40 °C (výjimečně až na 45 °C). Zfiltruje se tak rychle, jak je možné, a postupuje se, jak je popsáno u olejů a roztoků v oleji.
Přímé očkování do živných půd
Do živné půdy se dá takové množství zkoušeného přípravku, jaké je předepsáno tabulkami 2.6.1-1 a 2.6.1-2. Pokud není předepsáno jinak, je pro tekutiny poměr asi 1 : 10 a pro pevné látky asi 1 : 100.
Tab. 2.6.1-2 Množství zkoušeného vzorku pro zkoušku na sterilitu neparenterálních přípravků
Opatření proti mikrobiálnímu znečištění Výběr živné půdy Účinnost půd v přítomnosti a nepřítomnosti zkoušeného přípravku Postup zkoušky na sterilitu Membránová filtrace Tab. 2.6.1-1 Množství zkoušeného vzorku pro zkoušku na sterilitu parenterálních přípravků Přímé očkování do živných půd Tab. 2.6.1-2 Množství zkoušeného vzorku pro zkoušku na sterilitu neparenterálních přípravků Druh přípravku Celkové spojené množství Množství pro jednotlivou půdu Pro membránovou filtraci vodné roztoky 10 ml až 100 ml 5 ml až 10 ml jiné přípravky rozpustné ve vodě nebo isopropylmyristatu nebo jiném rozpustidle 1 g až 10 g množství odpovídající 0,5 g až 1 g Pro přímé očkování tekuté přípravky 10 ml až 100 ml 5 ml až 10 ml rozpustné přípravky 1 g až 10 g množství odpovídající 0,5 g až 1 g nerozpustné přípravky, krémy a masti, jež je nutno suspendovat nebo emulgovat 1 g až 10 g množství odpovídající 0,5 g až 1 g Olejové tekutiny. Použijí se živné půdy, k nimž byl přidán roztok polysorbátu 80 (10 g/l) nebo (4-terc.oktylfenoxy)polyoxyethanol (1 g/l) nebo jiné emulgující látky ve vhodné koncentraci, u níž bylo prokázáno, že v podmínkách zkoušky nemá protimikrobní účinek.
Masti a krémy. Zředí se v poměru 1 : 10 vhodným emulgátorem ve sterilním rozpustidle, např. neutrálním roztokem masového nebo kaseinového peptonu (1 g/l). Zředěný přípravek se očkuje do živné půdy, která neobsahuje emulgující látku.
Má-li zkoušený přípravek protimikrobní účinek, provede se zkouška po neutralizaci vhodnou neutralizační látkou nebo po zředění dostatečným množstvím živné půdy. Je-li nutné použít větší objem přípravku, lze dát přednost použití koncentrované živné půdy připravené tak, aby se dosáhlo potřebného zředění. V některých případech lze koncentrovanou živnou půdu přidat přímo k přípravku v jeho obalu.
Pokud není předepsáno jinak, inkubují se naočkované živné půdy nejméně 14 dní, půdy určené zejména k průkazu bakterií při teplotě 30 °C až 35 °C, půdy určené zejména k průkazu hub při 20 °C až 25 °C. V průběhu inkubace se půdy několikrát prohlížejí. Půdy s olejovými přípravky se každý den opatrně protřepou. Pokud se však použije k důkazu anaerobů thioglykolanová nebo jí podobná půda, je nutno omezit třepání nebo míchání na minimum, aby byly zachovány anaerobní podmínky.
Odečítání a hodnocení výsledků
V živných půdách se v průběhu a na závěr inkubace makroskopicky zjišťuje případný růst mikrobů. Jestliže není pozorován žádný růst, vyhovuje zkoušený přípravek zkoušce na sterilitu. Je-li zjištěn růst, přípravek nevyhovuje zkoušce na sterilitu, pokud nebylo opakováním zkoušky nebo jinými prostředky zjištěno, že zkouška byla neplatná z důvodů, jež se nevztahují na zkoušený přípravek. K průkazu, že růst mikrobů v živné půdě nebyl způsoben vlastním znečištěním zkoušeného přípravku, ale znečištěním v průběhu zkoušky, je povoleno provést následující opakovači zkoušky.
První opakování. Počet vybraných vzorků a zkoušené množství jsou stejné jako při původní zkoušce. Není-li zjištěn růst mikrobů, zkoušený přípravek vyhovuje zkoušce na sterilitu. Pokud se při prvním opakování zjistí v některé půdě růst mikrobů, izolují se a identifikují mikrobi a srovnají se s nálezem v původní zkoušce. Pokud se oba nálezy snadno nerozliší, zkoušený přípravek nevyhovuje zkoušce na sterilitu. Pokud se snadno rozliší, může se provést druhé opakování.
Druhé opakování. Použije se dvojnásobek vzorků oproti původní zkoušce a z každého vzorku se odebere stejné množství jako při původní zkoušce. Není-li zjištěn růst mikrobů, zkoušený přípravek vyhovuje zkoušce na sterilitu. Pokud se při druhém opakování zjistí růst, zkoušený přípravek nevyhovuje zkoušce na sterilitu.
Postup zkoušky pro parenterální přípravky
Pokud se použije metoda membránové filtrace, zkouší se, pokud možno, celý obsah nádoby, ale nejméně množství uvedené v tabulce 2.6.1-1. Je-li nutno, zředí se asi na 100 ml vhodným sterilním roztokem, např. neutrálním roztokem masového nebo kaseinového peptonu (1 g/l).
Pokud se použije metoda přímého očkování do živné půdy, očkuje se množství uvedené v tabulce 2.6.1-1. Zkoušky na bakteriální a houbovou sterilitu se provádějí se stejným vzorkem zkoušeného přípravku. Pokud objem nebo množství v jedné nádobě nestačí k provedení obou zkoušek, použije se obsah ze dvou nebo více nádob k naočkování různých půd. Je-li objem tekutiny v nádobě větší než 100 ml, měla by se použít membránová filtrace s ohledem na skutečnost, že celkový objem filtrovaný jedním filtrem nesmí překročit 1000 ml.
Postup zkoušky pro oční a jiné neparenterální přípravky s požadavkem sterility
Pro membránovou filtraci a přímé očkování do půd se použije obsah přiměřeného počtu nádob nebo postačující části obsahu odebrané z jednotlivých nádob tak, aby byl získán homogenní vzorek v rozmezí uvedeném v tabulce 2.6.1-2 jako Celkové spojené množství. Pro každou živnou půdu se ze smíšeného vzorku použije Množství pro jednotlivou půdu, uvedené v tabulce 2.6.1-2.
Postup zkoušky pro chirurgický obvazový materiál
Zkoušený vzorek. Ochranný obal se otevře za aseptických podmínek, ve sterilním boxu nebo jiném místě, např. v prostoru s laminárním prouděním sterilního vzduchu, a z různých míst balení se odeberou pro každou živnou půdu 3 vzorky. U bavlněné vaty, buničité vaty nebo podobných netkaných materiálů má být jejich hmotnost nejméně 1 g, u tkaných materiálů a náplastí má být jejich plocha asi 10 cm2. U řezaných gázových roušek, ať jsou či nejsou individuálně baleny, se z různých míst hromadného balení odeberou pro každou živnou půdu 3 celé roušky. Použije se takové množství půdy (20 ml až 150 ml), aby celý vzorek byl ponořen. Při prvním nebo druhém opakování zkoušky se odebírá stejný počet vzorků z jiného, čerstvě otevřeného balení.
Očkování do živné půdy. Pro každou živnou půdu se použijí 3 nádoby a do každé z nich se ponoří jeden vzorek.
Vyloučení protimikrobních vlastností. Jestliže při ověřování účinnosti živných půd je potlačen růst testovacího mikroorganismu přítomností zkoušeného vzorku, opakuje se zkouška na sterilitu buď za použití vhodné inaktivační látky, nebo, pokud to povaha materiálu dovoluje, níže popsanou metodou membránové filtrace.
Membránová filtrace. Každý vzorek se protřepává 10 min nejméně v 50 ml živné půdy obsahující lecithin (0,7 g/l) a polysorbát 80 (5 g/l). Ihned se zfiltruje sterilním membránovým filtrem, předem zvlhčeným stejnou živnou půdou, tolik výtřepku, kolik projde filtrem. Filtr se promyje nejméně třemi po sobě následujícími dávkami po 50 ml vhodné sterilní tekutiny, jako je např. neutrální roztok masového nebo kaseinového peptonu (1 g/l), a membrána se přenese do nádoby se živnou půdou vybranou pro zkoušku.
Postup zkoušky pro catgut a jiný chirurgický šicí materiál
Zkouška se provádí tak, jak je předepsáno u chirurgických obvazů, s následujícími změnami.
Zkoušený vzorek. Použije se celá nit z čerstvě otevřeného balení. Je-li nutné provést druhé opakování zkoušky, opakuje se se stejným počtem nití jako v původní zkoušce (tj. 5 nití). Každý vzorek se odebere z jiného, čerstvě otevřeného balení.
Očkování do živných půd. Každá nit se vloží samostatně do nádoby se živnou půdou. Pro každý druh půdy se použije 5 nádob. Použije se takové množství půdy (20 ml až 150 ml), aby zkoušený materiál byl ponořen. U balení s více nitěmi se odebírá 5 nití z pěti různých balení.
Účinnost živných půd za přítomnosti a za nepřítomnosti zkoušeného vzorku. Ověří se živné vlastnosti každé šarže půdy a zajistí se neutralizace inhibičních účinků, vyvolaných např. sterilizačními metodami nebo složkami zvláčňujících tekutin. Nejméně 2 nádoby každé živné půdy se naočkují testovacími mikroorganismy. Nádoby obsahují 2 nitě a nejméně 2 nádoby jsou bez nití. Půdy s bakteriemi se inkubují při teplotě 30 °C až 35 °C a půdy s houbami při teplotě 20 °C až 25 °C po dobu nejvýše 7 dní. Pokud je růst mikroorganismů během inkubace podobný (rychlý a mohutný) v přítomnosti i v nepřítomnosti zkoušeného přípravku, nemá přípravek protimikrobní účinek a zkouška může být provedena bez modifikace. Jestliže růst není podobný, zkouška se opakuje po vhodné neutralizaci nebo vyloučení inhibičního účinku.
Inkubace. Inkubuje se nejméně 14 dní při teplotě 30 °C až 35 °C pro aerobní a anaerobní bakterie a při teplotě 20 °C až 25 °C pro houby.
Nejmenší počet vzorků pro zkoušku na sterilitu doporučených ke zkoušení v poměru k počtu jednotek v šarži
Pokud je v článku uvedeno, aby léčivá látka, pomocná látka, léčivý přípravek nebo zdravotnický materiál vyhověl zkoušce na sterilitu, vztahuje se tento požadavek na každou jednotku zkoušené šarže. Proto se zkouší dostatečný počet vzorků, aby výsledek zkoušky měl potřebný stupeň spolehlivosti. Pro zkoušku na sterilitu se pod pojmem šarže rozumí homogenní soubor uzavřených nádob, které byly připraveny tak, že nebezpečí znečištění je pro každou její jednotku stejné. Nejmenší počet vzorků, který je doporučen ke zkoušení a je uveden v tabulce 2.6.1-3, předpokládá, že výrobek byl na všech stupních výroby zpracován za podmínek vylučujících znečištění. Při použití tohoto doporučení je třeba vzít v úvahu objem přípravku v nádobě, validaci sterilizační metody a jakékoliv další zvláštnosti vztahující se k výrobku.
Tab. 2.6.1-3
Opatření proti mikrobiálnímu znečištění Výběr živné půdy Účinnost půd v přítomnosti a nepřítomnosti zkoušeného přípravku Postup zkoušky na sterilitu Membránová filtrace Tab. 2.6.1-1 Množství zkoušeného vzorku pro zkoušku na sterilitu parenterálních přípravků Přímé očkování do živných půd Tab. 2.6.1-2 Množství zkoušeného vzorku pro zkoušku na sterilitu neparenterálních přípravků Odečítání a hodnocení výsledků Postup zkoušky pro parenterální přípravky Postup zkoušky pro oční a jiné neparenterální přípravky s požadavkem sterility Postup zkoušky pro chirurgický obvazový materiál Postup zkoušky pro catgut a jiný chirurgický šicí materiál Tab. 2.6.1-3 Počet jednotek v šarži Nejmenší počet zkoušených vzorků Parenterální přípravky ne více než 100 nádob 10 % nebo 4 nádoby, podle toho, co je více. více než 100, ale ne více než 500 nádob 10 nádob více než 500 nádob 2 % nebo 20 nádob, podle toho, co je méně. Oční a ostatní neparenterální přípravky ne více než 200 nádob 5 % nebo 2 nádoby, podle toho, co je více. více než 200 nádob 10 nádob Pokud je přípravek v jednodávkovém obalu, použije se tabulka pro parenterální přípravky. Chirurgické obvazové materiály ne více než 100 balení 10 % nebo 4 balení, podle toho, co je více. více než 100, ale ne více než 500 balení 10 balení více než 500 balení 2 % nebo 20 balení, podle toho, co je méně. Catgut a jiný chirurgický šicí materiál ne více než 1000 balení 2 % nebo 5 balení, podle toho, co je více. z každých dalších 1000 balení další 2 balení až do nejvyššího celkového počtu 40 balení. Velká balení pevných výrobků do 4 balení každé balení více než 4, ale ne více než 50 balení 20 % nebo 4 balení, podle toho, co je více. více než 50 balení 2 % nebo 10 balení, podle toho, co je více. Živné půdy doporučené pro zkoušku na sterilitu
Následující živné půdy byly shledány vhodnými pro zkoušku na sterilitu. Thioglykolanová půda je především určena pro kultivaci anaerobních bakterií, ale umožní objevit také aerobní bakterie. Půda ze sójového a kaseinového hydrolyzátu je především určena pro kultivaci aerobních bakterií, ale je vhodná i pro kultivaci hub. Mohou se používat i jiné živné půdy, pokud podporují růst široké řady mikroorganismů a pokud vyhovují zkoušce na růstové vlastnosti za přítomnosti zkoušeného přípravku.
Opatření proti mikrobiálnímu znečištění Výběr živné půdy Účinnost půd v přítomnosti a nepřítomnosti zkoušeného přípravku Postup zkoušky na sterilitu Membránová filtrace Tab. 2.6.1-1 Množství zkoušeného vzorku pro zkoušku na sterilitu parenterálních přípravků Přímé očkování do živných půd Tab. 2.6.1-2 Množství zkoušeného vzorku pro zkoušku na sterilitu neparenterálních přípravků Odečítání a hodnocení výsledků Postup zkoušky pro parenterální přípravky Postup zkoušky pro oční a jiné neparenterální přípravky s požadavkem sterility Postup zkoušky pro chirurgický obvazový materiál Postup zkoušky pro catgut a jiný chirurgický šicí materiál Tab. 2.6.1-3 Živné půdy doporučené pro zkoušku na sterilitu Thioglykolanová půda L-cystin 0,5 g agar granulovaný (obsah vlhkosti do 15 %) 0,75 g chlorid sodný 2,5 g glukosa monohydrát 5,5 g kvasničný výtažek (rozpustný ve vodě) 5,0 g pankreatický hydrolyzát kaseinu 15,0 g thioglykolan sodný nebo 0,5 g kyselina thioglykolová 0,3 g roztok sodné soli resazurinu (1 g/l) čerstvě připravený 1,0 ml voda 1000 ml pH se upraví tak, aby po sterilizaci bylo 7,1 ± 0,2.
Agar se rozpustí varem ve vodě. Pak se L-cystin rozpustí v asi 6 ml roztoku hydroxidu sodného 1 mol/l a přidá se k teplému roztoku agaru. Postupně se přidají pankreatický kaseinový hydrolyzát, kvasničný výtažek, glukosa a chlorid sodný a po jejich rozpuštění za tepla se přidá thioglykolan sodný nebo kyselina thioglykolová a případně se ještě přidá roztok hydroxidu sodného 1 mol/l na úpravu pH. Je-li zapotřebí filtrace, zahřeje se roztok téměř až k varu a za tepla se filtruje navlhčeným filtračním papírem. Potom se přidá roztok sodné soli resazurinu, promíchá se a rozplní do vhodných nádob, které zajistí, že se do konce inkubační doby nezmění pohlcováním kyslíku barevně více než horní třetina půdy. Sterilizuje se 20 min v autoklávu při 120 °C. Je-li to nutné, regeneruje se půda právě před použitím tak, že se 20 min zahřívá ve vodní lázni a potom se rychle ochladí.
Půda z hydrolyzátů sóji a kaseinu
Opatření proti mikrobiálnímu znečištění Výběr živné půdy Účinnost půd v přítomnosti a nepřítomnosti zkoušeného přípravku Postup zkoušky na sterilitu Membránová filtrace Tab. 2.6.1-1 Množství zkoušeného vzorku pro zkoušku na sterilitu parenterálních přípravků Přímé očkování do živných půd Tab. 2.6.1-2 Množství zkoušeného vzorku pro zkoušku na sterilitu neparenterálních přípravků Odečítání a hodnocení výsledků Postup zkoušky pro parenterální přípravky Postup zkoušky pro oční a jiné neparenterální přípravky s požadavkem sterility Postup zkoušky pro chirurgický obvazový materiál Postup zkoušky pro catgut a jiný chirurgický šicí materiál Tab. 2.6.1-3 Živné půdy doporučené pro zkoušku na sterilitu Půda z hydrolyzátů sóji a kaseinu pankreatický hydrolyzát kaseinu 17,0 g papainový hydrolyzát sóji 3,0 g chlorid sodný 5,0 g hydrogenfosorečnan draselný 2,5 g glukosa monohydrát 2,5 g voda 1000 ml pH se upraví tak, aby po sterilizaci bylo 7,3 ± 0,2.
Pevné látky se za mírného zahřátí rozpustí ve vodě a roztok se ochladí na pokojovou teplotu. V případě potřeby se přidá roztok hydroxidu sodného 1 mol/l na úpravu pH. Je-li to nutné, filtruje se do vyjasnění, potom se rozplní do vhodných nádob a sterilizuje se 20 min v autoklávu při 120 °C.
- 2.6.2 Mycobacterium tuberculosis
Podstata zkoušky. Nepřítomnost mikroba Mycobacterium tuberculosis se zjišťuje kultivací ve vhodných živných půdách a naočkováním přípravku vnímavým laboratorním zvířatům.
Postup zkoušky
- a) Kultivační metoda. Do nejméně deseti zkumavek obsahujících po 25 ml vhodné tekuté živné půdy a do nejméně deseti zkumavek obsahujících vhodnou pevnou živnou půdu se naočkuje po 0,5 ml zkoušeného přípravku. Inkubuje se 42 dní při teplotě 37 °C. Růstové vlastnosti živných půd v přítomnosti zkoušeného přípravku se ověří naočkováním vhodného kmene Mycobacterium tuberculosis, jako je např. H 37 RA nebo BCG, a je-li třeba, použije se vhodná neutralizační látka. Jestliže v prvních osmi dnech inkubace vyrostou kolonie kontaminujících mikroorganismů, zkouška se opakuje a současně se provede bakteriologická zkouška sterility. Přípravek nevyhovuje, jestliže se na konci inkubační doby zjistí nárůst mykobakterií v některé zkumavce.
- b) Naočkování a zkouška laboratorních zvířat. Pěti morčatům o hmotnosti 250 g až 350 g, jež byla v tuberkulinové zkoušce (ověří se intradermálním podáním 100 m.j. tuberkulinu) negativní, se intraperitoneálně vstříkne po 1 ml zkoušeného přípravku. Zvířata se pozorují 60 dní. Jestliže přežije méně než dvě zvířata, zkouška se opakuje. Zvířata, která přežila, se usmrtí a při pitvě se ani u jednoho z pěti morčat nenajdou tuberkulózní změny.
- 2.6.3 Důkaz cizích virů zkouškou na kuřecích embryích
Podstata zkoušky. Přítomnost cizích virů se zjišťuje naočkováním zkoušeného přípravku do alantoidního vaku a na chorioalantoidní membránu kuřecích embryí a sledováním, zda zkoušená očkovací látka nevyvolá jejich úhyn nebo vznik změn.
Postup zkoušky. Ke zkoušce se použije tekutá nebo lyofilizovaná očkovací látka, jež byla rozpuštěna v tekutině uvedené na štítku nebo v jiné vhodné tekutině vždy s přísadou antibiotik. Předpisuje-li to článek, neutralizuje se očkovací látka monospecifickým antisérem. V případě potřeby se očkovací látka ředí tak, aby deset očkovacích dávek bylo obsaženo v 0,2 ml. Směs se naočkuje devíti až jedenácti denním kuřecím embryím z chovu bez specifikovaných patogenů. Embrya se rozdělí do dvou skupin po deseti:
- - 0,2 ml se vstříkne do alantoidního vaku každého vejce z první skupiny,
- - 0,2 ml se vstříkne na chorioalantoidní membránu každého vejce z druhé skupiny.
Vejce se po dobu 7 dní denně prosvěcují. Embrya, která uhynula v průběhu prvních 24 h, se vyřadí jako nespecifické úhyny; jestliže v každé skupině nepřežije prvních 24 h po naočkování alespoň šest embryí, je zkouška neplatná. U všech embryí, která uhynou po více než 24 h od naočkování, nebo u těch, která přežijí 7 dní, se hledají změny. Zárověň se hledají změny v chorioalantoidních membránách. Alantoidní tekutiny se zkoušejí na přítomnost hemaglutinačních látek a v buňkách získaných odstředěním alantoidní tekutiny se pomocí fluorescenční protilátky zjišťuje přítomnost viru infekční bronchitidy. Mimoto se provede další pasáž na kuřecích embryích.
Materiál z živých a mrtvých embryí se odděleně shromáždí a každá z takto získaných směsí se vstříkne výše uvedeným postupem do deseti vajec pro oba výše popsané způsoby podání. Směsi z chorioalantoidní membrány se vstříknou na tuto membránu, alantoidní tekutiny do alantoidních vaků. Vejce se pozorují 7 dní a zkoušejí stejným způsobem, jak je uvedeno výše.
Očkovací látka nevyhovuje, jestliže dojde k jakémukoliv úhynu nebo vzniku změn, jež by mohla způsobit očkovací látka.
- 2.6.4 Zkouška na viry leukózy
Podstata zkoušky. Přítomnost virů leukózy se zjišťuje metodou komplement-fixační reakce po pomnožení v buněčné kultuře kuřecích fibroblastů.
Postup zkoušky. Je-li to předepsáno v článku, neutralizuje se očkovací látka monospecifickým antisérem. Na buněčné kultury kuřecích embryonálních fibroblastů, o kterých je známo, že podporují pomnožování virů leukózy podskupin A a B, se naočkuje očkovací látka v množství 10 dávek na jednu kulturu. Kultur má být alespoň pět a každá má mít plochu alespoň 60 cm2. Fibroblasty se pasážují v tří- až čtyřdenních intervalech a udržují se alespoň 9 dní. Na konci poslední pasáže se buňky oddělí, resuspendují se na koncentraci 107 buněk v ml a připraví se extrakt. Každý extrakt se komplement-fixační reakcí přezkouší na přítomnost skupinově specifického antigenu ptačí leukózy. Na kontrolní buněčné kultury se naočkují viry leukózy podskupin A a B a zkoušejí se souběžně. Očkovací látka nevyhovuje, jestliže se zjistí jakákoliv známka přítomnosti viru leukózy. Nejsou-li výsledky jednoznačné, provedou se další pasáže fibroblastů a zkouší se až do dosažení jednoznačného výsledku.
- 2.6.5 Důkaz cizích virů zkouškou na buněčných kulturách
Podstata zkoušky. Přítomnost cizích virů se zjišťuje naočkováním zkoušeného přípravku do buněčné kultury a sledováním, zda nedojde ke vzniku cytopatického efektu nebo ke vzniku hemadsorpce.
Postup zkoušky. Ke zkoušce se použije tekutá nebo lyofilizovaná očkovací látka, jež byla rozpuštěna tekutinou uvedenou na štítku nebo jinou vhodnou tekutinou. Předepisuje-li to článek, neutralizuje se očkovací látka monospecifickým antisérem. V případě potřeby se očkovací látka zředí tak, aby 10 očkovacích dávek bylo obsaženo v 0,1 ml. Naočkuje se po 0,5 ml směsi na kultury ledvinných buněk odvozených z kuřat, která pocházejí z chovu bez specifikovaných patogenů, nebo na kultury jaterních buněk z embryí, která pocházejí z chovu bez specifikovaných patogenů, a nechá se 1 h adsorpovat při teplotě 37 °C. Kultur by mělo být alespoň pět a měly by mít celkovou plochu asi 150 cm2. V kulturách se nejméně pět dní hledají cytopatické efekty, jejichž příčinou může být očkovací látka. Jestliže se nepozorují žádné specifické efekty, provedou se další pasáže směsí buněk a tekutin odebraných ze všech kultur v intervalech nejméně pětidenních a pozorují se v průběhu dvacetidenního inkubačního období. Zkoušejí se rovněž poslední pasáže kultur na přítomnost původců hemadsorpce, k čemuž se použijí kuřecí erytrocyty. Původci hemadsorpce jsou mikroorganismy nebo viry, které způsobují adsorpci erytrocytů na povrch buněčných kultur, v nichž se pomnožili. Hemadsorpce se zjišťuje tímto způsobem: Na konci období zkoušek se z jednovrstvé buněčné kultury slije tkáňové médium a kultura se promyje. Pak se přidá 0,5% suspenze promytých erytrocytů. Nechá se adsorpovat 20 min při teplotě 4 °C. Buňky se promyjí tlumivým roztokem fosforečnanovým s chloridem sodným o pH 7,4 a pozorují se pod mikroskopem. Došlo-li k hemadsorpci, jsou vidět shluky erytrocytů přichycených na jednovrstvou buněčnou kulturu. Jestliže po každé pasáži nepřežije alespoň 80 % kultur, je zkouška neplatná. Vakcína nevyhovuje zkoušce, jestliže se zjistí jakýkoliv cytopatický efekt nebo přítomnost původců hemadsorpce.
- 2.6.6 Důkaz cizích antigenů zkouškou na kuřatech
Podstata zkoušky. V séru naočkovaných kuřat se sérologickými metodami zjišťuje přítomnost protilátek proti cizím antigenům.
Postup zkoušky. Pokud není v článku předepsáno jinak, provede se zkouška nejméně na deseti dvoutýdenních kuřatech pocházejících z chovu bez specifikovaných patogenů. Každému kuřeti se intramuskulárně vstříkne 100 dávek a do oka se nakape 10 dávek. Za dva týdny se očkování opakuje. Kuřata se pozorují pět týdnů od prvního očkování. V období sledování se kuřatům nepodávají žádné protimikrobní látky.
Od všech kuřat se před prvním očkováním a na konci zkušebního období odebere sérum. Každý vzorek séra se vhodnou metodou vyzkouší na protilátky proti původcům níže uvedených infekcí s výjimkou protilátek proti původci, z něhož byla vakcína připravena. Vakcína nevyhovuje zkoušce, jestliže se dokáže přítomnost cizího antigenů. Zkouška je neplatná a opakuje se, když byla v sérech před očkováním prokázána nějaká protilátka. Jestliže do konce zkoušky přežije méně než 80 % zvířat, je zkouška rovněž neplatná. Se souhlasem národní autority se mohou použít jiné druhy zkoušek, pokud jsou alespoň tak citlivé, jako uvedené zkoušky a přiměřeně specifické.
Opatření proti mikrobiálnímu znečištění Výběr živné půdy Účinnost půd v přítomnosti a nepřítomnosti zkoušeného přípravku Postup zkoušky na sterilitu Membránová filtrace Tab. 2.6.1-1 Množství zkoušeného vzorku pro zkoušku na sterilitu parenterálních přípravků Přímé očkování do živných půd Tab. 2.6.1-2 Množství zkoušeného vzorku pro zkoušku na sterilitu neparenterálních přípravků Odečítání a hodnocení výsledků Postup zkoušky pro parenterální přípravky Postup zkoušky pro oční a jiné neparenterální přípravky s požadavkem sterility Postup zkoušky pro chirurgický obvazový materiál Postup zkoušky pro catgut a jiný chirurgický šicí materiál Tab. 2.6.1-3 Živné půdy doporučené pro zkoušku na sterilitu Půda z hydrolyzátů sóji a kaseinu Postup zkoušky Infekce Druh zkoušky infekční bronchitida1) precipitace v agarovém gelu nebo inhibice hemaglutinace infekce burzy (choroba Gumboro) precipitace v agarovém gelu Markova choroba precipitace v agarovém gelu Newcastleská choroba inhibice hemaglutinace infekce Salmonella pullorum aglutinace infekce adenoviry2) precipitace v agarovém gelu infekce virem ptačí encefalomyelitidy precipitace v agarovém gelu nebo enzymově imunosorbentové stanovení (ELISA) infekce reoviry2) precipitace v agarovém gelu infekce viry leukózy2) sérová neutralizace influenza A2) precipitace v agarovém gelu infekční laryngotracheitida2) sérová neutralizace
- 2.6.7 Zkouška na mykoplazmata
Podstata zkoušky. Kultivací na pevných a v tekutých půdách se zjišťuje přítomnost mykoplazmat.
Zkouška používaná pro aviární vakcíny
Živné půdy. Ke kultivaci většiny známých druhů mykoplazmat se používají pevné a tekuté živné půdy popsané níže. Vybrané půdy se vyzkouší alespoň, zda umožňují růst Mycoplasma gallisepticum (půda I) a Mycoplasma synoviae (půda II). Ke zkoušení půd se doporučuje použít kmeny, které prošly omezeným počtem pasáží.
Inhibující látky. Zkouška se provede s přidáním i bez přidání zkoušeného přípravku. Je-li třeba, neutralizují se inhibující látky obsažené ve zkoušené vakcíně a opakováním zkoušky se ověří účinnost neutralizačního postupu.
Postup zkoušky
Tekuté půdy. Použijí se alespoň dvě tekuté živné půdy, které jsou vhodné pro kultivaci mykoplazmat (viz níže). Pro každou půdu se rozpustí obsah pěti nádobek lyofilizované očkovací látky (nebo nejvýše 5000 očkovacích dávek) v 12 ml tekutiny uvedené na štítku nebo jiné vhodné tekutiny. U tekutých očkovacích látek se použije odpovídající množství. Do 100 ml půdy se naočkuje 10 ml rozpuštěné očkovací látky. Dojde-li po přidání očkovací látky k nějakým významným změnám pH půdy, upraví se pH na původní hodnotu přidáním roztoku hydroxidu sodného nebo kyseliny chlorovodíkové. Inkubuje se tři týdny při teplotě (37 ± 1) °C a denně se prohlíží. Třetí, sedmý a čtrnáctý den od začátku inkubace se vyočkuje po 0,2 ml na agarovou půdu (miska o průměru 90 mm obsahující 18 ml půdy). Pokud se v tekuté půdě zjistí nějaká barevná změna, vyočkuje se bezprostředně. Jestliže se v tekuté půdě projeví kontaminace bakteriemi nebo houbami, zkouška se opakuje.
Pro každé očkování se použijí čtyři misky, z nichž dvě se inkubují při teplotě (37 ± 1) °C za aerobních podmínek v atmosféře vzduchu s vysokou relativní vlhkostí a obsahem 5 % až 10 % oxidu uhličitého a další dvě se inkubují za anaerobních podmínek v dusíkové atmosféře s vysokou relativní vlhkostí a obsahem 5 % až 10 % oxidu uhličitého. Misky se 3 týdny pravidelně prohlížejí stereomikroskopem a v případě potřeby se barví vhodným barvivem. Když na agarové půdě vyroste kolonie, provede se identifikace.
Pevné půdy. Použijí se alespoň dvě pevné živné půdy, které jsou vhodné na kultivaci mykoplazmat (viz níže). Na šest misek od každé půdy se naočkuje po 0,2 ml směsi očkovací látky popsané ve zkoušce v tekutých živných půdách. Misky se inkubují a prohlížejí tak, jak je uvedeno výše.
Hodnocení. Vakcína vyhovuje, jestliže nebyla prokázána kontaminace mykoplazmaty.
Zkouška na neaviární mykoplazmata a ureaplazmata
Živné půdy. Použijí se živné půdy vybrané pro podporu pomnožování širokého rozsahu mykoplazmat. U každé šarže se prokáže, že podporuje pomnožování Mycoplasma hyopneumoniae a Ureaplasma urealyticum. Ke zkoušení půd se doporučuje použít kmeny, které prošly omezeným počtem pasáží. Zkouška se provede s tekutými a pevnými živnými půdami, jež byly vybrány tak, aby společně poskytovaly nejlepší podmínky k pomnožení všech možných kontaminant. Tekuté půdy obsahují fenolovou červeň.
Inhibující látky. Zkouška se provede s přidáním i bez přidání zkoušeného přípravku. Je-li třeba, neutralizují se inhibující látky obsažené ve zkoušeném přípravku a opakováním zkoušky se ověří účinnost neutralizačního postupu.
Vzorkování. Doporučený počet zkoušených nádobek (viz též 2.6.1) 1 % z množství v šarži, nejméně však 4 a nejvýše 10. Obsah nádobek se po případné rekonstituci smíchá.
Postup zkoušky
Tekuté půdy. 50 ml každé půdy se zvlášť naočkuje 5 ml zkoušeného přípravku. Dojde-li po přidání přípravku k nějakým významným změnám pH půdy, upraví se pH na původní hodnotu přidáním roztoku hydroxidu sodného nebo kyseliny chlorovodíkové. Inkubuje se tři týdny při teplotě (36 ± 1) °C a třikrát týdně se prohlíží. Třetí, sedmý a čtrnáctý den se vyočkuje po 0,2 ml na agarovou půdu v misce o průměru 60 mm. Pokud se v tekuté půdě zjistí nějaká barevná změna, vyočkuje se bezprostředně. Jestliže se v tekuté půdě projeví kontaminace bakteriemi nebo houbami, zkouška se opakuje. Pro každé vyočkování se použijí čtyři misky, z nichž dvě se inkubují při teplotě (36 ± 1) °C za aerobních podmínek v atmosféře vzduchu s vysokou relativní vlhkostí a obsahem 5 % až 10 % oxidu uhličitého a další dvě se inkubují za anaerobních podmínek v dusíkové atmosféře s vysokou relativní vlhkostí a obsahem 5 % až 10 % oxidu uhličitého. Misky se tři týdny pravidelně prohlížejí stereomikroskopem a v případě potřeby se barví vhodným barvivem.
Pevné půdy. Na čtyři misky (o průměru 60 mm) od každé půdy se naočkuje po 0,2 ml zkoušeného přípravku. Misky se inkubují a prohlížejí tak, jak je uvedeno výše. Kdyby po sedmi dnech od naočkování byla nejvýše jedna miska v každé části zkoušky náhodně kontaminována bakteriemi nebo houbami či poškozena, může se tato miska vyloučit z odčítání za předpokladu, že nevykazuje růst mykoplazmat. Jestliže by v jakékoliv části zkoušky bylo náhodně kontaminováno bakteriemi nebo houbami či poškozeno více než jedna miska, je zkouška neplatná a opakuje se.
Hodnocení. Přípravek vyhovuje, jestliže nebyla prokázána kontaminace mykoplazmaty nebo ureaplazmaty.
Následující oddíl se uvádí jako informace a rada; netvoří část, jež by byla v rozporu s obecnou metodou.
Doporučené živné půdy
Následující půdy se doporučují. Jiné půdy mohou být použity za předpokladu, že se u každé šarže prokáže schopnost podporovat růst mykoplazmat v přítomnosti i nepřítomnosti zkoušené vakcíny.
- I. Půdy doporučené pro důkaz Mycoplasma gallisepticum
- a) Tekutá půda
Opatření proti mikrobiálnímu znečištění Výběr živné půdy Účinnost půd v přítomnosti a nepřítomnosti zkoušeného přípravku Postup zkoušky na sterilitu Membránová filtrace Tab. 2.6.1-1 Množství zkoušeného vzorku pro zkoušku na sterilitu parenterálních přípravků Přímé očkování do živných půd Tab. 2.6.1-2 Množství zkoušeného vzorku pro zkoušku na sterilitu neparenterálních přípravků Odečítání a hodnocení výsledků Postup zkoušky pro parenterální přípravky Postup zkoušky pro oční a jiné neparenterální přípravky s požadavkem sterility Postup zkoušky pro chirurgický obvazový materiál Postup zkoušky pro catgut a jiný chirurgický šicí materiál Tab. 2.6.1-3 Živné půdy doporučené pro zkoušku na sterilitu Půda z hydrolyzátů sóji a kaseinu Postup zkoušky Zkouška používaná pro aviární vakcíny Postup zkoušky Zkouška na neaviární mykoplazmata a ureaplazmata Postup zkoušky Doporučené živné půdy infuze z hovězího srdce (1) 90,0 ml koňské sérum (nezahřáté) 20,0 ml roztok kvasničného výtažku (250 g/l) 10,0 ml roztok octanu thallného (10 g/l) 1,0 ml roztok červeně fenolové (0,6 g/l) 5,0 ml roztok penicilinu (20 000 m.j./ml) 0,25 ml roztok kyseliny deoxyribonukleové (2 g/l) 1,20 ml pH se upraví na 7,8.
- b) Pevná půda
Připraví se stejně jako tekutá půda s tím rozdílem, že infuze z hovězího srdce obsahuje v litru 15 g agaru.
- II. Půdy doporučené pro důkaz Mycoplasma synoviae
- a) Tekutá půda
Opatření proti mikrobiálnímu znečištění Výběr živné půdy Účinnost půd v přítomnosti a nepřítomnosti zkoušeného přípravku Postup zkoušky na sterilitu Membránová filtrace Tab. 2.6.1-1 Množství zkoušeného vzorku pro zkoušku na sterilitu parenterálních přípravků Přímé očkování do živných půd Tab. 2.6.1-2 Množství zkoušeného vzorku pro zkoušku na sterilitu neparenterálních přípravků Odečítání a hodnocení výsledků Postup zkoušky pro parenterální přípravky Postup zkoušky pro oční a jiné neparenterální přípravky s požadavkem sterility Postup zkoušky pro chirurgický obvazový materiál Postup zkoušky pro catgut a jiný chirurgický šicí materiál Tab. 2.6.1-3 Živné půdy doporučené pro zkoušku na sterilitu Půda z hydrolyzátů sóji a kaseinu Postup zkoušky Zkouška používaná pro aviární vakcíny Postup zkoušky Zkouška na neaviární mykoplazmata a ureaplazmata Postup zkoušky Doporučené živné půdy infuze z hovězího srdce (1) 90,0 ml esenciální vitaminy (2) 0,025 ml roztok glukosy monohydrátu (500 g/l) 2,0 ml prasečí sérum (inaktivované při 56 °C, 30 min) 12,0 ml roztok ß-nikotinamid-adeninu dinukleotidu (10 g/l) 1,0 ml roztok cysteiniumchloridu (10 g/l) 1,0 ml roztok červeně fenolové (0,6 g/l) 5,0 ml roztok penicilinu (20 000 m.j./ml) 0,25 ml Smíchají se roztoky ß-nikotinamid-adeninu dinukleotidu a cysteiniumchloridu a za 10 min se přidají k ostatním složkám. Hodnota pH se upraví na 7,8.
- b) Pevná půda
Opatření proti mikrobiálnímu znečištění Výběr živné půdy Účinnost půd v přítomnosti a nepřítomnosti zkoušeného přípravku Postup zkoušky na sterilitu Membránová filtrace Tab. 2.6.1-1 Množství zkoušeného vzorku pro zkoušku na sterilitu parenterálních přípravků Přímé očkování do živných půd Tab. 2.6.1-2 Množství zkoušeného vzorku pro zkoušku na sterilitu neparenterálních přípravků Odečítání a hodnocení výsledků Postup zkoušky pro parenterální přípravky Postup zkoušky pro oční a jiné neparenterální přípravky s požadavkem sterility Postup zkoušky pro chirurgický obvazový materiál Postup zkoušky pro catgut a jiný chirurgický šicí materiál Tab. 2.6.1-3 Živné půdy doporučené pro zkoušku na sterilitu Půda z hydrolyzátů sóji a kaseinu Postup zkoušky Zkouška používaná pro aviární vakcíny Postup zkoušky Zkouška na neaviární mykoplazmata a ureaplazmata Postup zkoušky Doporučené živné půdy infuze z hovězího srdce (1) 90,0 ml ionagar (3) 1,4 g Hodnota pH se upraví tak, aby bylo 7,8; sterilizuje se v autoklávu a pak se přidají:
Opatření proti mikrobiálnímu znečištění Výběr živné půdy Účinnost půd v přítomnosti a nepřítomnosti zkoušeného přípravku Postup zkoušky na sterilitu Membránová filtrace Tab. 2.6.1-1 Množství zkoušeného vzorku pro zkoušku na sterilitu parenterálních přípravků Přímé očkování do živných půd Tab. 2.6.1-2 Množství zkoušeného vzorku pro zkoušku na sterilitu neparenterálních přípravků Odečítání a hodnocení výsledků Postup zkoušky pro parenterální přípravky Postup zkoušky pro oční a jiné neparenterální přípravky s požadavkem sterility Postup zkoušky pro chirurgický obvazový materiál Postup zkoušky pro catgut a jiný chirurgický šicí materiál Tab. 2.6.1-3 Živné půdy doporučené pro zkoušku na sterilitu Půda z hydrolyzátů sóji a kaseinu Postup zkoušky Zkouška používaná pro aviární vakcíny Postup zkoušky Zkouška na neaviární mykoplazmata a ureaplazmata Postup zkoušky Doporučené živné půdy esenciální vitaminy (2) 0,025 ml roztok glukosy monohydrátu (500 g/l) 2,0 ml prasečí sérum (nezahřáté) 12,0 ml roztok β-nicotinamid-adeninu dinukleotidu (10 g/l) 1,0 ml roztok cysteiniumchloridu (10 g/l) 1,0 ml roztok červeně fenolové (0,6 g/l) 5,0 ml roztok penicilinu (20 000 m.j./ml) 0,25 ml
(1) Infuze z hovězího srdce
Opatření proti mikrobiálnímu znečištění Výběr živné půdy Účinnost půd v přítomnosti a nepřítomnosti zkoušeného přípravku Postup zkoušky na sterilitu Membránová filtrace Tab. 2.6.1-1 Množství zkoušeného vzorku pro zkoušku na sterilitu parenterálních přípravků Přímé očkování do živných půd Tab. 2.6.1-2 Množství zkoušeného vzorku pro zkoušku na sterilitu neparenterálních přípravků Odečítání a hodnocení výsledků Postup zkoušky pro parenterální přípravky Postup zkoušky pro oční a jiné neparenterální přípravky s požadavkem sterility Postup zkoušky pro chirurgický obvazový materiál Postup zkoušky pro catgut a jiný chirurgický šicí materiál Tab. 2.6.1-3 Živné půdy doporučené pro zkoušku na sterilitu Půda z hydrolyzátů sóji a kaseinu Postup zkoušky Zkouška používaná pro aviární vakcíny Postup zkoušky Zkouška na neaviární mykoplazmata a ureaplazmata Postup zkoušky Doporučené živné půdy hovězí srdce (pro přípravu infuze) 500,0 g pepton 10,0 g chlorid sodný 5,0 g destilovaná voda do 1000,0 ml Sterilizuje se v autoklávu.
(2) Esenciální vitaminy
Opatření proti mikrobiálnímu znečištění Výběr živné půdy Účinnost půd v přítomnosti a nepřítomnosti zkoušeného přípravku Postup zkoušky na sterilitu Membránová filtrace Tab. 2.6.1-1 Množství zkoušeného vzorku pro zkoušku na sterilitu parenterálních přípravků Přímé očkování do živných půd Tab. 2.6.1-2 Množství zkoušeného vzorku pro zkoušku na sterilitu neparenterálních přípravků Odečítání a hodnocení výsledků Postup zkoušky pro parenterální přípravky Postup zkoušky pro oční a jiné neparenterální přípravky s požadavkem sterility Postup zkoušky pro chirurgický obvazový materiál Postup zkoušky pro catgut a jiný chirurgický šicí materiál Tab. 2.6.1-3 Živné půdy doporučené pro zkoušku na sterilitu Půda z hydrolyzátů sóji a kaseinu Postup zkoušky Zkouška používaná pro aviární vakcíny Postup zkoušky Zkouška na neaviární mykoplazmata a ureaplazmata Postup zkoušky Doporučené živné půdy Biotin 100,0 mg pantotenan vápenatý 100,0 mg choliniumchlorid 100,0 mg kyselina listová 100,0 mg inositol 200,0 mg nikotinamid 100,0 mg pyridoxoliumchlorid 100,0 mg riboflavin 10,0 mg thiaminiumchlorid 100,0 mg destilovaná voda do 1000,0 ml (3) Ionagar
Velmi čistý agar používaný pro mikrobiologii a imunologii, připravený výměnou iontů, čímž vzniká produkt mající vyšší čistotu, čirost a pevnost gelu. Obsahuje přibližně:
Opatření proti mikrobiálnímu znečištění Výběr živné půdy Účinnost půd v přítomnosti a nepřítomnosti zkoušeného přípravku Postup zkoušky na sterilitu Membránová filtrace Tab. 2.6.1-1 Množství zkoušeného vzorku pro zkoušku na sterilitu parenterálních přípravků Přímé očkování do živných půd Tab. 2.6.1-2 Množství zkoušeného vzorku pro zkoušku na sterilitu neparenterálních přípravků Odečítání a hodnocení výsledků Postup zkoušky pro parenterální přípravky Postup zkoušky pro oční a jiné neparenterální přípravky s požadavkem sterility Postup zkoušky pro chirurgický obvazový materiál Postup zkoušky pro catgut a jiný chirurgický šicí materiál Tab. 2.6.1-3 Živné půdy doporučené pro zkoušku na sterilitu Půda z hydrolyzátů sóji a kaseinu Postup zkoušky Zkouška používaná pro aviární vakcíny Postup zkoušky Zkouška na neaviární mykoplazmata a ureaplazmata Postup zkoušky Doporučené živné půdy voda 12,2 % popel 1,5 % popel nerozpustný v kyselině 0,2 % chloridy 0 fosforečnany (jako P2O5) 0,3 % celkový dusík 0,3 % měď 8 μg/g železo 170 μg/g vápník 0,28 % hořčík 0,32 % - I. Půdy doporučené pro důkaz Mycoplasma gallisepticum
- 2.6.8 Zkouška na pyrogenní látky
Podstata zkoušky. Pyrogenní látky obsažené ve sterilním injekčním roztoku vyvolají u králíka po nitrožilním podání vzestup jeho rektální teploty.
Výběr zvířat. Ke zkoušce se použijí zdraví dospělí králíci3) o hmotnosti nejméně 1,5 kg. Zvířata jsou chována v klidném prostředí v individuálních klecích, krmena standardní vyváženou dietou bez obsahu antibiotik a jejich hmotnost nevykazuje během týdne před zkouškou žádný úbytek. Teplota chovné místnosti je stálá a neliší se o více než 3 °C od teploty zkušební místnosti. U všech králíků, používaných k těmto zkouškám, se vedou záznamy o jejich hmotnosti, podaných přípravcích a teplotních křivkách. Po zkoušce s nepyrogenním výsledkem se může králík vzít do nové zkoušky nejdříve za 3 dny, po zkoušce s pyrogenním přípravkem se tento interval prodlužuje na 3 týdny.
Přístrojové vybavení. Pohyblivost králíka při zkoušce se omezuje vhodným zařízením, které fixuje netraumatizujícím způsobem pouze šíji zvířete a dovolí mu zaujmout normální uvolněnou pozici v sedě. K měření tělesné teploty se použijí rektální teploměry nebo elektrické termometry, které udávají teplotu s přesností 0,1 °C. Po lehkém potření nedráždivou vazelínou jsou zavedeny do konečníku za vnitřní sfinkter, tj. přibližně do hloubky 5 cm. Tato hloubka zavedení teploměru musí být u každého králíka během celé zkoušky konstantní.
Nádoby, injekční stříkačky a jehly, které přicházejí do styku se zkoušeným roztokem, se pečlivě vymyjí vodou pro injekci a sterilizují v horkovzdušném sterilizátoru 30 min při 250 °C nebo 1 h při 200 °C.
Předběžné otestování králíků. U každého králíka, vybraného pro zkoušku na pyrogen, je třeba otestovat jeho citlivost na nepyrogenní roztok chloridu sodného (9 g/l), zahřátý na 38,5 °C a podaný nitrožilně v dávce 10 ml/kg tělesné hmotnosti. Rektální teplota měřená průběžně od 90 min před injekcí do 3 h po injekci nevykazuje změnu vyšší než 0,6 °C, jinak se zvíře nepoužije k vlastní zkoušce. Tento test citlivosti se též provede u všech králíků, kteří mají být po zkoušce s pyrogenním výsledkem znovu vzati do pokusů.
Provedení zkoušky. Zkouška se provádí v oddělené nerušené místnosti se stálou teplotou kolem 20 °C. Ke zkoušce se použijí tři králíci, kterým je večer předtím odebrána potrava. Po upoutání do fixačního zařízení a zavedení rektálních termometrů se u každého zvířete 90 min sleduje tělesná teplota v 30min intervalech. Za "výchozí teplotu" králíka je považován průměr ze dvou odečtů, naměřených v posledních 40 min před podáním zkoušeného roztoku. "Maximální teplotou" se rozumí nejvyšší teplota naměřená v 30min intervalech v průběhu 3 h po podání zkoušeného roztoku. Reakce králíka je vyjádřena rozdílem mezi jeho výchozí a maximální naměřenou teplotou. Jestliže je tento rozdíl negativní, je výsledek počítán jako nulová odpověď. Ze zkoušky se vyřadí králík, u kterého se při stanovení "výchozí teploty" liší naměřené dvě hodnoty o více než 0,2 °C nebo"výchozí teplota" je vyšší než 39,8 °C nebo nižší než 38,0 °C. U jednotlivých zvířat ve skupině se jejich "výchozí teploty" mezi sebou neliší o více než 1 °C.
Zkoušený roztok, zahřátý na teplotu asi 38,5 °C, se pomalu vstříkne do marginální ušní žíly králíka s dobou podání nejvýše 4 min, není-li v příslušném článku uvedeno jinak. Zkoušená látka se může rozpustit nebo zředit nepyrogenním roztokem chloridu sodného (9 g/l) nebo jiným předepsaným ředidlem. Množství látky pro provedení zkoušky se liší podle zkoušeného přípravku a je předepsáno v příslušném článku. Objem vstřikovaného roztoku má být nejméně 0,5 ml/kg a nejvýše 10 ml/kg tělesné hmotnosti.
Zhodnocení výsledků. Výsledek zkoušky se posoudí na základě naměřených vzestupů rektální teploty u použité skupiny králíků podle tabulky 2.6.8-1.
Jestliže součet reakcí (tj. vzestupů rektální teploty u jednotlivých králíků ve skupině) je vyšší než hodnoty uvedené v druhé kolonce, ale menší než limity uvedené ve třetí kolonce, zkouška se opakuje na další trojici králíků až do celkového a konečného počtu dvanácti zvířat.
Králíci, u nichž vzestup rektální teploty ve zkoušce na pyrogen přestoupí 1,2 °C,se trvale vyřadí.
Tab. 2.6.8-1
Opatření proti mikrobiálnímu znečištění Výběr živné půdy Účinnost půd v přítomnosti a nepřítomnosti zkoušeného přípravku Postup zkoušky na sterilitu Membránová filtrace Tab. 2.6.1-1 Množství zkoušeného vzorku pro zkoušku na sterilitu parenterálních přípravků Přímé očkování do živných půd Tab. 2.6.1-2 Množství zkoušeného vzorku pro zkoušku na sterilitu neparenterálních přípravků Odečítání a hodnocení výsledků Postup zkoušky pro parenterální přípravky Postup zkoušky pro oční a jiné neparenterální přípravky s požadavkem sterility Postup zkoušky pro chirurgický obvazový materiál Postup zkoušky pro catgut a jiný chirurgický šicí materiál Tab. 2.6.1-3 Živné půdy doporučené pro zkoušku na sterilitu Půda z hydrolyzátů sóji a kaseinu Postup zkoušky Zkouška používaná pro aviární vakcíny Postup zkoušky Zkouška na neaviární mykoplazmata a ureaplazmata Postup zkoušky Doporučené živné půdy Tab. 2.6.8-1 Počet králíků Přípravek vyhovuje, není-li součet reakcí vyšší než Přípravek nevyhovuje, je-li součet reakcí vyšší než 3 1,15 °C 2,65 °C 6 2,80 °C 4,30 °C 9 4,45 °C 5,95 °C 12 6,60 °C 6,60 °C
- 2.6.9 Zkouška na neškodnost
Všeobecná zkouška
Zkouška se provede na skupině pěti zdravých myší, vážících 17 g až 22 g. Množství zkoušené látky, předepsané v příslušném článku, se rozpustí v 0,5 ml vody na injekci R nebo sterilního roztoku chloridu sodného (9 g/l) a vstříkne se myším do ocasní žíly během 15 s až 30 s, není-li předepsáno jinak.
Přípravek vyhovuje zkoušce, jestliže žádná myš neuhyne během 24 h nebo během doby, která je předepsána v příslušném článku. Uhyne-li více než jedno zvíře, přípravek nevyhovuje. Při úhynu jednoho zvířete ze skupiny se zkouška opakuje. Přípravek vyhovuje zkoušce, jestliže z druhé skupiny neuhyne během určené doby pozorování žádná myš.
Imunní séra a vakcíny pro humánní použití
Pokud není předepsáno jinak, vstříkne se intraperitoneálně pěti zdravým myším, vážícím 17 g až 22 g, po jedné lidské dávce, nejvýše však po 1,0 ml zkoušeného přípravku. Lidskou dávkou se rozumí dávka uvedená v označení zkoušeného přípravku nebo v jeho příbalovém letáku. Zvířata se pozorují 7 dní. Přípravek vyhovuje zkoušce, jestliže žádné zvíře nemá příznaky onemocnění. Uhyne-li více než jedno zvíře, přípravek nevyhovuje. Při úhynu nebo příznacích onemocnění jednoho zvířete se zkouška opakuje. Přípravek vyhovuje zkoušce, jestliže během určené doby pozorování z druhé skupiny žádné zvíře neuhyne ani nemá žádné příznaky onemocnění.
Zkouška se také provede na dvou zdravých morčatech vážících 250 g až 350 g. Každému zvířeti se intraperitoneálně vstříkne jedna lidská dávka, nejvýše však 5,0 ml zkoušeného přípravku. Lidskou dávkou se rozumí dávka uvedená v označení zkoušeného přípravku nebo v jeho příbalovém letáku. Zvířata se pozorují 7 dní. Přípravek vyhovuje zkoušce, jestliže žádné zvíře nemá příznaky onemocnění. Uhyne-li více než jedno zvíře, přípravek nevyhovuje. Při úhynu nebo příznacích onemocnění jednoho zvířete se zkouška opakuje. Přípravek vyhovuje zkoušce, jestliže během určené doby pozorování z druhé skupiny žádné zvíře neuhyne ani nemá žádné příznaky onemocnění.
Imunní séra a vakcíny pro veterinární použití
Pokud není předepsáno jinak, vstříkne se podkožně pěti zdravým myším, vážícím 17 g až 22 g, po 0,5 ml zkoušeného přípravku. Zvířata se pozorují 7 dní. Přípravek vyhovuje, jestliže žádné zvíře nemá významné místní nebo systémové reakce. Uhyne-li více než jedno zvíře, přípravek nevyhovuje. Uhyne-li jedno zvíře nebo má významné místní nebo systémové reakce, zkouška se opakuje. Přípravek vyhovuje zkoušce, jestliže během určené doby pozorování žádné zvíře z druhé skupiny neuhyne ani nemá významné místní ani systémové reakce.
Zkouška se také provede na dvou zdravých morčatech vážících 250 g až 350 g. Každému zvířeti se intraperitoneálně vstříknou nejméně 2 ml zkoušeného přípravku. Zvířata se pozorují 7 dní.
Přípravek vyhovuje, jestliže žádné zvíře nemá významné místní nebo systémové reakce. Uhyne-li více než jedno zvíře, přípravek nevyhovuje. Uhyne-li jedno zvíře nebo má významné místní nebo systémové reakce, zkouška se opakuje. Přípravek vyhovuje zkoušce, jestliže během určené doby pozorování žádné zvíře z druhé skupiny neuhyne ani nemá významné místní ani systémové reakce.
- 2.6.10 Zkouška na přítomnost histaminu
Podstata zkoušky. Přítomnost znečištěnin typu histaminu ve zkoušeném přípravku vyvolá na izolovaném tenkém střevě morčete kontrakce, které se porovnávají s účinkem standardu (histaminiumdichloridu).
Příprava zvířete. Ke zkoušce se použije zdravé morče o hmotnosti 250 g až 350 g, které bylo předchozích 24 h ponecháno bez krmiva. Po usmrcení vykrvácením se odejme distální část tenkého střeva v délce 2 cm a vymyje se šetrně pomocí stříkačky roztokem B, zahřátým na teplotu 34 °C až 36 °C. Na oba konce střevního segmentu se připevní tenká nit, kterou se prošije střevní stěna tak, aby střevo zůstalo průchodné. Jeden konec střeva se touto nití připevní ke skleněnému nosiči a vloží se na dno orgánové lázně o objemu 10 ml až 20 ml naplněné roztokem B, který je udržován na stálé teplotě 34 °C až 36 °C a probublává se směsí 95 % (V/V) kyslíku a 5 % (V/V) oxidu uhličitého. Druhý konec střeva se napojí na izotonický snímač kontrakcí, které se registrují pomocí kymografu nebo jiným vhodným kontinuálním zapisovačem při zvětšení přibližně dvacetinásobném. Napnutí střeva má být asi 9,8 mN (1 g) a mělo by být upraveno podle citlivosti orgánu.
Příprava roztoků.
Opatření proti mikrobiálnímu znečištění Výběr živné půdy Účinnost půd v přítomnosti a nepřítomnosti zkoušeného přípravku Postup zkoušky na sterilitu Membránová filtrace Tab. 2.6.1-1 Množství zkoušeného vzorku pro zkoušku na sterilitu parenterálních přípravků Přímé očkování do živných půd Tab. 2.6.1-2 Množství zkoušeného vzorku pro zkoušku na sterilitu neparenterálních přípravků Odečítání a hodnocení výsledků Postup zkoušky pro parenterální přípravky Postup zkoušky pro oční a jiné neparenterální přípravky s požadavkem sterility Postup zkoušky pro chirurgický obvazový materiál Postup zkoušky pro catgut a jiný chirurgický šicí materiál Tab. 2.6.1-3 Živné půdy doporučené pro zkoušku na sterilitu Půda z hydrolyzátů sóji a kaseinu Postup zkoušky Zkouška používaná pro aviární vakcíny Postup zkoušky Zkouška na neaviární mykoplazmata a ureaplazmata Postup zkoušky Doporučené živné půdy Tab. 2.6.8-1 Všeobecná zkouška Imunní séra a vakcíny pro humánní použití Imunní séra a vakcíny pro veterinární použití Roztok A: chlorid sodný 160,0 g chlorid draselný 4,0 g chlorid vápenatý bezvodý 2,0 g chlorid hořečnatý bezvodý 1,0 g hydrogenfosforečnan sodný dodekahydrát 0,10 g voda na injekci do 1000,0 ml Roztok B: roztok A 50,0 ml atropiniumsulfat 0,0005 g hydrogenuhličitan sodný 1,0 g glukosa monohydrát 0,5 g voda na injekci do 1000,0 ml Roztok B se má připravovat vždy čerstvý pro spotřebu do 24 h.
Porovnávací roztok. Jako porovnávací roztok se používá roztok histaminiumdichloridu R o doporučené koncentraci 0,1 mg/ml. Připraví se vždy čerstvý.
Provedení zkoušky. Orgánová lázeň se vypláchne roztokem B a nechá se 10 min stabilizovat. Po následném dvoj- až trojnásobném propláchnutí roztokem B se vyvolají stahy střeva přidáváním roztoku histaminiumdichloridu R v objemech mezi 0,2 ml až 0,5 ml, aby se zjistila dávka, která způsobí reprodukovatelnou submaximální kontrakci. Tato dávka se nazývá "dávka vysoká". Před každým přidáním histaminu se lázeň třikrát propláchne roztokem B (kontinuálním průtokem bez vyprázdnění lázně). Dávky se aplikují v pravidelných intervalech umožňujících úplnou relaxaci střevního segmentu (asi 2 min).
Po zjištění "vysoké dávky" se určuje dávka zvaná "nízká" tím, že se do lázně přidává roztok histaminiumdichloridu R ve větším zředění (ale ve stejných objemech) tak, aby se dosáhla reprodukovatelná kontrakce střevního segmentu přibližně poloviční ve srovnání s dávkou "vysokou".
V dalším postupu se pravidelně střídá podávání "vysoké" a "nízké" dávky roztoku histaminu s podáním zkoušené látky, jejíž koncentrace se upravuje tak, aby vyvolaná kontrakce střeva (pokud je vůbec pozorovatelná) byla menší než stah po “vysoké dávce“ histaminu. Kontrakce střeva po zkoušené látce mají být reprodukovatelné a velikost stahů po "vysoké" i "nízké" dávce histaminu má v průběhu sledování zůstat nezměněna.
Zhodnocení výsledků. Ze srovnání velikosti kontrakce střeva po podání zkoušené látky s kontrakcemi dosaženými po "vysoké" a "nízké" dávce histaminu se provede odhad obsahu histaminové účinnosti ve zkoušené látce, vyjádřený v mikrogramech báze histaminu. Tato hodnota nemá přesáhnout limit uvedený v lékopisném článku.
Jestliže zkoušený roztok nevyvolá žádný stah střeva, připraví se čerstvý roztok zkoušené látky s přidaným histaminem v množství, které představuje povolené maximum pro zkoušenou látku podle lékopisného článku, a pozoruje se, zda po přidání do lázně odpovídá kontrakce střeva přidanému histaminu. Jestliže tomu tak není nebo není-li kontrakce, vyvolaná zkoušeným roztokem reprodukovatelná nebo jsou-li následné odpovědi na "vysokou" a "nízkou" dávku histaminu sníženy, výsledky zkoušky nejsou hodnotitelné a provede se Zkouška na hypotenzivní látky (2.6.11).
- 2.6.11 Zkouška na hypotenzivní látky
- 2.6.1 Zkouška na sterilitu