Platné znění

Vyhláška, kterou se u chemických látek a chemických přípravků stanoví základní metody pro zkoušení fyzikálně-chemických vlastností, výbušných vlastností a vlastností nebezpečných pro životní prostředí

účinné od 1. 5. 2004Obrázek

účinné od 1. 5. 2004Obrázek 2

účinné od 1. 5. 2004Příklad adaptace kalu

účinné od 1. 5. 2004Obrázek
  1. účinné od 1. 5. 2004X. METODA PRO STANOVENÍ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI – SIMULAČNÍ ZKOUŠKA S AKTIVOVANÝM KALEM – metoda C.10 podle přílohy směrnice 92/69/EHS
    1. účinné od 1. 5. 2004X.1 METODA
      1. účinné od 1. 5. 2004X.1.1 ÚVOD
        1. účinné od 1. 5. 2004X.1.1.1 Obecné poznámky
          1. účinné od 1. 5. 2004Metoda je vhodná pouze pro ty organické látky, které v používaných koncentracích:
            1. účinné od 1. 5. 2004— jsou natolik rozpustné ve vodě, aby bylo možné připravit zásobní roztok,
            2. účinné od 1. 5. 2004— mají za podmínek zkoušky zanedbatelnou tenzi par,
            3. účinné od 1. 5. 2004— neinhibují bakterie.

          účinné od 1. 5. 2004Je užitečné mít informace o relativním podílu nejdůležitějších komponent obsažených ve zkoušeném materiálu, zvláště tehdy, když biologická rozložitelnost dosahuje nízkých nebo marginálních hodnot. Při interpretaci nízkých hodnot biologické rozložitelnosti a volbě vhodné zkušební koncentrace je potřebné znát údaje o toxicitě látky vůči mikroorganismům.

        1. účinné od 1. 5. 2004X.1.1.2 Stanovení úplné biologické rozložitelnosti (analýza DOC/CHSK)

          účinné od 1. 5. 2004Cílem metody je stanovení úplné biologické rozložitelnosti organické látky na základě měření úbytku zkoušené látky a vzniklých metabolitů v koncentracích DOC více než 12 mg.l-1 (nebo CHSK cca 40 mg.l-1) ve zkušebním zařízení s náplní aktivovaného kalu. Prokázalo se, že optimální je koncentrace DOC 20 mg/l.

          účinné od 1. 5. 2004Je nutné znát obsah organického uhlíku nebo CHSK zkoušené látky.

        1. účinné od 1. 5. 2004X.1.1.3 Stanovení primární biologické rozložitelnosti (specifická analýza)

          účinné od 1. 5. 2004Cílem metody je stanovení primární biologické rozložitelnosti zkoušené látky při koncentraci cca 20 mg/l v modelovém zařízení s aktivovaným kalem (pokud to umožňuje analytická metoda nebo toxicita zkoušené látky, může být použita koncentrace zkoušené látky vyšší nebo nižší). To dovolí odhadnout primární biologickou rozložitelnost zkoušené látky. (vymizení původní „rodičovské“ chemické struktury).

          účinné od 1. 5. 2004Cílem metody není stanovení stupně mineralizace zkoušené látky.

          účinné od 1. 5. 2004Ke kvantitativní analýze musí být k dispozici vhodná metoda.

      1. účinné od 1. 5. 2004X.1.2 DEFINICE A JEDNOTKY
        1. účinné od 1. 5. 2004X.1.2.1 Analýza DOC/CHSK
          1. účinné od 1. 5. 2004Úbytek látky je vyjádřen vztahem:
            účinné od 1. 5. 2004
            Obrázek 2 Příklad adaptace kalu
            (1a)
            1. účinné od 1. 5. 2004DR = DOC nebo CHSK úbytek v % vztažený na zkoušenou látku při dané střední době prodlení,
            2. účinné od 1. 5. 2004T = koncentrace zkoušené látky na přítoku do zkušební jednotky v mg.l-1 DOC nebo CHSK,
            3. účinné od 1. 5. 2004E = koncentrace DOC nebo CHSK na odtoku ze zkušební jednotky v mg.l-1,
            4. účinné od 1. 5. 2004Eo = koncentrace DOC nebo CHSK na odtoku z kontrolní jednotky v mg.l-1.

          účinné od 1. 5. 2004Rozklad je definován jako procentuální úbytek DOC nebo CHSK při udané době zdržení, vztažený na zkoušenou látku.

        1. účinné od 1. 5. 2004X.1.2.2 Specifická analýza
          1. účinné od 1. 5. 2004Procentuální odstranění zkoušené látky z vodné fáze (Rw) během udaného času prodlení:
            účinné od 1. 5. 2004
            Obrázek 2 Příklad adaptace kalu
            (1b)
            1. účinné od 1. 5. 2004C1 = koncentrace zkoušené látky v přítoku do zkušebního zařízení (v mg.l-1) stanovená specifickou analýzou,
            2. účinné od 1. 5. 2004C0 = koncentrace zkoušené látky na odtoku ze zkušebního zařízení (v mg.l-1) stanovená specifickou analýzou.
      1. účinné od 1. 5. 2004X.1.3 REFERENČNÍ LÁTKY

        účinné od 1. 5. 2004Při zkoušení nových látek je někdy vhodné použít referenční látku. Specifické referenční látky doposud nejsou doporučeny.

      1. účinné od 1. 5. 2004X.1.4 PRINCIP ZKUŠEBNÍCH METOD

        účinné od 1. 5. 2004Ke stanovení úplné biologické rozložitelnosti se používají dvě paralelně pracující modelová zařízení s aktivovaným kalem (potvrzující zkouška OECD nebo zařízení s porézní nádobkou). Zkoušená látka se přidává na přítoku do jedné z jednotek (se syntetickou nebo s komunální odpadní vodou), zatímco ve druhé je obsažena pouze odpadní voda. Ke stanovení primární biologické rozložitelnosti pomocí specifické analýzy zkoušené látky na přítoku a odtoku je zapotřebí jedna jednotka.

        účinné od 1. 5. 2004Na odtoku se měří koncentrace DOC nebo CHSK nebo se stanoví koncentrace zkoušené látky specifickou analýzou.

        účinné od 1. 5. 2004DOC zkoušené látky se nestanovuje, pouze se konstatuje.

        účinné od 1. 5. 2004Při měření DOC nebo CHSK se vychází z toho, že rozdíl mezi průměrnými koncentracemi na odtoku ze zkušební a z kontrolní jednotky je způsoben nerozloženou částí zkoušených látek.

        účinné od 1. 5. 2004Jestliže jsou prováděny specifické analýzy, lze stanovovat změny koncentrace původní chemické látky (primární biologická rozložitelnost).

        účinné od 1. 5. 2004Obě zařízení mohou být provozována jako „spřažená“ pomocí postupu vzájemné inokulace.

      1. účinné od 1. 5. 2004X.1.5 KRITÉRIA KVALITY

        účinné od 1. 5. 2004Koncentrace zkoušené látky se volí s ohledem na druh analytické metody a její mez stanovitelnosti.

      1. účinné od 1. 5. 2004X.1.6 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY
        1. účinné od 1. 5. 2004X.1.6.1 Příprava
          1. účinné od 1. 5. 2004X.1.6.1.1 Přístroje
            1. účinné od 1. 5. 2004Pokud se neprovádí specifická analýza, používají se dvě modelové zkušební jednotky stejného typu. Mohou být používány dva typy zařízení:

              účinné od 1. 5. 2004Potvrzující zkouška OECD

              účinné od 1. 5. 2004Zařízení se skládá ze zásobní nádoby (A) na syntetickou odpadní vodu, dávkovacího čerpadla (B), aerační nádoby (C), sedimentační nádoby (D), mamutky (E) k recirkulaci aktivovaného kalu a sběrné nádoby vyčištěné vody (F).

              účinné od 1. 5. 2004Nádoby (A a F) musí být ze skla nebo z vhodné umělé hmoty objemu nejméně 24 l. Čerpadlo (B) musí zajišťovat konstantní přítok syntetických splašků do aerační nádoby. Použit může být jakýkoliv vhodný systém zajišťující stanovený přítok a koncentraci. Za normálních podmínek je výška separátoru (D) nastavena tak, aby objem kultivační suspenze v aerační nádobě byl 3 l. V dolní části konické části aerační nádoby je ponořena porézní aerační krychlička. Množství dodávaného vzduchu může být kontrolováno průtokoměrem. Mamutka (E) je osazena tak, aby byl aktivovaný kal ze separátoru do aktivační nádoby dopravován rovnoměrně.

              účinné od 1. 5. 2004Zařízení s porézní nádobkou

              účinné od 1. 5. 2004Porézní nádobka je vyrobena z porézní polyethylenové fólie (tloušťka 2 mm, maximální velikost pórů 95 mikronů) stočené do válce o průměru 14 cm s konickým dnem 45 °, obrázky 1 a 2 v příloze 2. Porézní nádobka je umístěna v nepropustné nádobě o průměru 15 cm zhotovené z vhodné umělé hmoty, která má nad konickou částí odtok ve výšce 17,2 cm, čímž je v zařízení vymezen objem 3 l. Na horním konci vnitřní nádoby je upevněn kruhový držák tak, že mezi vnější a vnitřní nádobou je 0,5 cm odtoková mezera.

              účinné od 1. 5. 2004Celé zařízení je umístěno do vodní lázně regulované termostatem. Vzduch je přiváděn na dno vnitřní nádoby pomocí vhodného rozvaděče.

              účinné od 1. 5. 2004Nádoby (A) a (E) musí být vyrobeny ze skla nebo vhodné umělé hmoty a mají mít objem nejméně 24 l. Čerpadlo (B) umožňuje konstantní přítok odpadních vod do aerační nádoby. Může být použit jakýkoliv vhodný systém za předpokladu, že zaručuje stanovený přítok a koncentraci.

              účinné od 1. 5. 2004K dispozici musí být zásoba dalších porézních nádobek jako náhrada za zanesené; zanesené nádobky se čistí namočením na 24 hodin do roztoku chlornanu sodného a promytím pitnou vodou.

          1. účinné od 1. 5. 2004X.1.6.1.2 Filtrace

            účinné od 1. 5. 2004Používají se membránové filtrační přístroje a membránové filtry (velikost pórů 0,45 μm). Membránový filtr nesmí uvolňovat uhlík ani nesmí adsorbovat zkoušenou látku při filtraci.

          1. účinné od 1. 5. 2004X.1.6.1.3 Odpadní voda

            účinné od 1. 5. 2004Může být použito buď vhodné syntetické médium nebo komunální odpadní voda.

            1. účinné od 1. 5. 2004Příklad syntetického média:
              1. účinné od 1. 5. 2004V 1 l pitné vody se rozpustí:
                účinné od 1. 5. 2004
                Obrázek 2 Příklad adaptace kalu Potvrzující zkouška OECD Zařízení s porézní nádobkou
                pepton160 mg,
                masový extrakt110 mg,
                močovina30 mg,
                NaCl7 mg,
                CaCl2 . 2 H2O4 mg,
                MgSO4 . 7 H2O2 mg,
                K2HPO428 mg.
            1. účinné od 1. 5. 2004Komunální odpadní vody:
              1. účinné od 1. 5. 2004Odebírají se čerstvé každý den z přepadu mechanického stupně čistírny, která čistí převážně městské odpadní vody.
          1. účinné od 1. 5. 2004X.1.6.1.4 Zásobní roztok zkoušené látky

            účinné od 1. 5. 2004Připraví se např. 1% roztok zkoušené látky, který se bude přidávat do zkušební jednotky. Stanoví se koncentrace zkoušené látky a určí se příslušný objem zásobního roztoku, který je potřebné přidat k odpadní vodě nebo dalším čerpadlem přímo do zkušební jednotky, aby byla dosažena požadovaná zkušební koncentrace.

          1. účinné od 1. 5. 2004X.1.6.1.5 Inokulum
          2. účinné od 1. 5. 2004Poznámka: Je-li používána komunální odpadní voda není vhodné používání inokula s malou koncentrací bakterií, ale má se používat aktivovaný kal.

            3. účinné od 1. 5. 2004Mohou se používat inokula z různých zdrojů.

            1. účinné od 1. 5. 2004Příklady vhodného inokula:
              1. účinné od 1. 5. 2004a) Inokulum z odtoku biologické čistírny odpadních vod

                účinné od 1. 5. 2004Inokulum může být získáno z odtoku dobře fungující čistírny zpracovávající převážně komunální odpadní vody. Vzorek odtoku musí být v době mezi odběrem a použitím uchován v aerobních podmínkách. Inokulum se připraví filtrací vzorku vody přes hrubý filtr, prvních 200 ml filtrátu se vylije. Až do okamžiku použití se filtrát uchovává v aerobních podmínkách. Inokulum musí být použito ve stejný den kdy bylo připraveno. K inokulaci se užívá nejméně 3 ml.

              1. účinné od 1. 5. 2004b) Směsné inokulum
                1. účinné od 1. 5. 2004Inokulum odebrané z odtoku čistírny:
                  1. účinné od 1. 5. 2004Viz předchozí popis.
                1. účinné od 1. 5. 2004Inokulum z půdy:
                  1. účinné od 1. 5. 2004100 g zahradní zeminy (úrodná, nesterilní zemina) se suspenduje v 1 l nechlórované pitné vody (nevhodné jsou zeminy s vysokým obsahem jílu, písku a humusu). Po zamíchání se nechá suspenze 30 minu dekantovat. Kapalná fáze se přefiltruje, prvních 200 ml se vylije. Filtrát se ihned provzdušňuje až do okamžiku použití. Inokulum je možné použít pouze ten den, kdy bylo připraveno.
                1. účinné od 1. 5. 2004Inokulum z povrchové vody:
                  1. účinné od 1. 5. 2004Další díl směsného inokula se získává z mesosaprobních povrchovým vod. Odebraný vzorek se filtruje, prvních 200 ml se vylije. Až do okamžiku použití se filtrát udržuje v aerobních podmínkách. Inokulum musí být použito pouze ten den, kdy bylo připraveno.
                  2. účinné od 1. 5. 2004Směsné inokulum se získá smísením a dobrým promícháním stejných objemových dílů všech tří dílčích inokulí. K očkování se používají nejméně 3 ml směsného roztoku.
            1. účinné od 1. 5. 2004c) Inokulum z aktivovaného kalu

              účinné od 1. 5. 2004Používá se aktivovaný kal (s obsahem suspendovaných pevných částic do 2,5 g/l) odebraný z aerační nádrže čistírny komunálních odpadních vod.

        1. účinné od 1. 5. 2004X.1.6.2 Postup

          účinné od 1. 5. 2004Zkouška se provádí při laboratorní teplotě, která se má udržovat mezi 18 - 25 °C.

          účinné od 1. 5. 2004Zkouška může být event. prováděna při nižších teplotách (do 10 ° C). Pokud se zkoušená látka za těchto podmínek rozkládá, nejsou zapotřebí žádná další měření. Jestliže však při nižší teplotě rozkládána není, musí být zkouška opakována při teplotě 18 - 25 °C.

          1. účinné od 1. 5. 2004X.1.6.2.1 Fáze zapracování: tvorba kalu/stabilizace kalu

            účinné od 1. 5. 2004Fází růstu/stabilizace kalu je období, během kterého dochází za provozních podmínek k ustálení koncentrace aktivovaného kalu a funkce zkušební jednotky

            účinné od 1. 5. 2004Rozběhová fáze začíná první vsádkou zkoušené látky a končí dobou, kdy naměřený úbytek zkoušené látky dosáhne relativně konstantní hodnoty. Tato fáze by neměl trvat déle než 6 týdnů.

            účinné od 1. 5. 2004Hodnotící fáze je doba trvající 3 týdny od okamžiku kdy úbytek zkoušené látky dosáhl relativně konstantní, zpravidla vysoké, hodnoty. Pro látky, které se během šest týdnů trvající rozběhové fáze nerozkládají nebo jejich úbytek dosahuje nízkých hodnot se za vyhodnocovací fázi považuje období dalších tří následujících týdnů.

            účinné od 1. 5. 2004Na začátku zkoušky se zkušební jednotka(y) naplní zkušební kapalinou s inokulem.

            účinné od 1. 5. 2004Zapne se provzdušňování a mamutka (při použití zkušebního zařízení podle OECD) a zapne se dávkovací zařízení.

            účinné od 1. 5. 2004Přítok odpadních vod bez zkoušené látky do aerační nádoby se udržuje na rychlosti 1 l.h-1 nebo 1/2 l.h-1; doba zdržení tak dosáhne 3 h nebo 6 h.

            účinné od 1. 5. 2004Intenzita provzdušňování musí být regulována tak, aby se udržoval obsah aerační nádoby ve vznosu a obsah rozpuštěného kyslíku neklesl pod hodnotu 2 mg.l-1.

            účinné od 1. 5. 2004Pěnění směsi se zabraňuje vhodnými prostředky, které neinhibují kal.

            účinné od 1. 5. 2004Kal, který se shromažďuje v horní části aerační nádoby a u průkazné zkoušky OECD na dně sedimentační nádoby a v cirkulačním okruhu musí být alespoň jednou za den vracen do matečné suspenze setřením nebo jiným vhodným způsobem.

            účinné od 1. 5. 2004Jestliže kal špatně sedimentuje lze zvýšit jeho hustotu přídavkem 2 ml 5% roztoku chloridu železitého. Přídavek je možné opakovat podle potřeby.

            1. účinné od 1. 5. 2004Spřažená zařízení
              1. účinné od 1. 5. 2004Zařízení jsou spřažena tak, že je mezi nimi 1x denně vyměňováno 1,5 l suspenze (včetně kalu) z aeračních nádob. Dochází-li k silné adsorbci zkoušené látky, odebere se 1,5 l kapalné fáze ze sedimentační nádoby a přidává se do aerační nádoby druhého zařízení.
          1. účinné od 1. 5. 2004X.1.6.2.3 Analytika
            1. účinné od 1. 5. 2004Ke sledování chování zkoušené látky se používají dvě metody stanovení:
              1. účinné od 1. 5. 2004DOC a CHSK.
                1. účinné od 1. 5. 2004Hodnoty DOC se stanoví dvakrát pomocí analyzátoru uhlíku a CHSK se stanoví podle literatury (2).
              1. účinné od 1. 5. 2004Specifická analýza
                1. účinné od 1. 5. 2004Koncentrace zkoušené látky se stanoví vhodnou analytickou metodou. Je-li to možné, stanoví se zvlášť množství látky adsorbované na aktivovaný kal.
    1. účinné od 1. 5. 2004X.2 DATA A VYHODNOCENÍ
      1. účinné od 1. 5. 2004X.2.1 SPŘAŽENÁ ZAŘÍZENÍ

        účinné od 1. 5. 2004Pokud je používáno spřažené zařízení, počítá se denně stupeň odstranění, DR, postupem podle 1. 2. 1.

        účinné od 1. 5. 2004Tyto denní hodnoty se opraví na hodnotu Drc, zohledněním přenosu materiálu při očkování. Tento výpočet se provádí dle rovnice (2) pro střední dobu prodlení 3 hodiny a podle rovnice (3) pro střední dobu prodlení 6 hodin.

        účinné od 1. 5. 2004
        Obrázek 2 Příklad adaptace kalu Potvrzující zkouška OECD Zařízení s porézní nádobkou
        (2)
        účinné od 1. 5. 2004
        Obrázek 2 Příklad adaptace kalu Potvrzující zkouška OECD Zařízení s porézní nádobkou
        (3)

        účinné od 1. 5. 2004Ze získaných hodnot se vypočítá jejich průměr a dále standardní odchylka podle rovnice (4)

        účinné od 1. 5. 2004
        Obrázek 2 Příklad adaptace kalu Potvrzující zkouška OECD Zařízení s porézní nádobkou
        (4)
        1. účinné od 1. 5. 2004kde:
          1. účinné od 1. 5. 2004sDRc = standardní odchylka,
          2. účinné od 1. 5. 2004= průměr hodnot DRc,
          3. účinné od 1. 5. 2004n = počet stanovení.
        1. účinné od 1. 5. 2004Odlehlé hodnoty DRc se eliminují vhodnou statistickou metodou, např. Nalimovou metodou (6) pro 95% hladinu významnosti, průměr a standardní odchylka se potom vypočtou s vyloučením odlehlých hodnot Drc:
          1. účinné od 1. 5. 2004Výsledek se vyjádří dle (5):
            účinné od 1. 5. 2004
            Obrázek 2 Příklad adaptace kalu Potvrzující zkouška OECD Zařízení s porézní nádobkou
            (5)
            1. účinné od 1. 5. 2004kde
              1. účinné od 1. 5. 2004tn-1; α = tabulková hodnota t pro n dvojic hodnot e a Eo a statistickou mez spolehlivosti P(P=1-α), kde P = 95% (1).

        účinné od 1. 5. 2004Výsledkem je průměr s udanými mezemi tolerance pro 95% hladinou významnosti případně s udanou standardní odchylkou, počtem dat hodnot DRc bez odlehlých hodnot a počtem odlehlých hodnot.

        1. účinné od 1. 5. 2004Např.
          1. účinné od 1. 5. 2004DRc = 98,6 ± 2,3% úbytku DOC,
          2. účinné od 1. 5. 2004s = 4,65% úbytku DOC,
          3. účinné od 1. 5. 2004n = 18,
          4. účinné od 1. 5. 2004x = počet odlehlých hodnot.
      1. účinné od 1. 5. 2004X.2.2 NESPŘAŽENÁ ZAŘÍZENÍ
        1. účinné od 1. 5. 2004Provozní výkon zařízení může být ověřen následovně:
          účinné od 1. 5. 2004

        účinné od 1. 5. 2004Vynášením denně naměřených úbytků do grafu se zdůrazní všechny trendy, např. adaptace.

        1. účinné od 1. 5. 2004X.2.2.1 Využití stanovení CHSK/DOC

          účinné od 1. 5. 2004Z denně naměřených hodnot se podle kap. 1.2.1 vypočítá procentuální úbytek DR.

          1. účinné od 1. 5. 2004Z řady hodnot DR se spočítá jejich průměr a podle rovnice (6) standardní odchylka:
            účinné od 1. 5. 2004
            Obrázek 2 Příklad adaptace kalu Potvrzující zkouška OECD Zařízení s porézní nádobkou
            (6)
            1. účinné od 1. 5. 2004kde
              1. účinné od 1. 5. 2004sDR = standardní odchylka hodnot Dri,
              2. účinné od 1. 5. 2004 = průměr hodnot Dri,
              3. účinné od 1. 5. 2004n = počet stanovení.

          účinné od 1. 5. 2004Odlehlé hodnoty DR se eliminují vhodnou statistickou metodou např. podle Nalimova (6) při 95% hladině významnosti, střední hodnota a standardní odchylka jsou potom znovu vypočítány s vyloučením odlehlých hodnot DR.

          účinné od 1. 5. 2004Výsledná hodnota se počítá dle rovnice (7)

          účinné od 1. 5. 2004
          Obrázek 2 Příklad adaptace kalu Potvrzující zkouška OECD Zařízení s porézní nádobkou
          (7)
          1. účinné od 1. 5. 2004kde
            1. účinné od 1. 5. 2004tn-1; α - tabulková hodnota t pro n dvojic hodnot e a Eo a statistickou n mez spolehlivosti P (P=1-α), kde P = 95 % (l).

          účinné od 1. 5. 2004Výsledkem je průměr s mezemi tolerance při 95% hladině významnosti s udanou standardní odchylkou, počtem dat hodnot DR bez odlehlých hodnot a počtem odlehlých hodnot.

          1. účinné od 1. 5. 2004Např.:
            1. účinné od 1. 5. 2004Dr = (98,6 ± 2,3%) úbytku DOC,
            2. účinné od 1. 5. 2004s = 4,65% úbytku DOC,
            3. účinné od 1. 5. 2004n = 18,
            4. účinné od 1. 5. 2004x = počet odlehlých hodnot.
        1. účinné od 1. 5. 2004X.2.2.2 Použití výsledků specifické analýzy

          účinné od 1. 5. 2004Odstranění zkoušené látky z vodné fáze (Rw) v % se počítá podle 1. 2. 2.

    1. účinné od 1. 5. 2004X.3 ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA
      1. účinné od 1. 5. 2004X.3.1 PROTOKOL O ZKOUŠCE
        1. účinné od 1. 5. 2004V protokolu o zkoušce by měly být uvedeny pokud je to možné následující údaje:
          1. účinné od 1. 5. 2004— provozní podmínky, které jsou zaznamenány do formuláře uvedeného v příloze č. 3 této metody;
          2. účinné od 1. 5. 2004— druh použitého zkušebního zařízení (zařízení pro průkaznou zkoušku OECD nebo zařízení s porézní nádobkou);
          3. účinné od 1. 5. 2004— způsob provozování zařízení: spřažená nebo nespřažená zařízení;
          4. účinné od 1. 5. 2004— druh odpadních vod: syntetické nebo komunální odpadní vody, u komunálních odpadních vod datum a místo odběru;
          5. účinné od 1. 5. 2004— druh inokula, datum a místo odběru;
          6. účinné od 1. 5. 2004— popis použitých analytických metod, pokud byly prováděny specifické analýzy;
          7. účinné od 1. 5. 2004— grafické vyjádření závislosti úbytku CHSK nebo DOC na čase ve fázi rozběhové a vyhodnocovací;
          8. účinné od 1. 5. 2004— výsledek stanovení obsahu zkoušené látky prostřednictvím CHSK nebo DOC v zásobním roztoku;
          9. účinné od 1. 5. 2004— při provádění specifické analýzy: grafické vyjádření procentuálního úbytku zkoušené látky z kapalné fáze během rozběhové a vyhodnocovací fáze v závislosti na čase;
          10. účinné od 1. 5. 2004— střední úbytek DOC nebo CHSK zkoušené látky a standardní odchylka výsledků získaných během vyhodnocovací fáze, kdy úbytek zkoušené látky je konstantní;
          11. účinné od 1. 5. 2004— grafické vyjádření koncentrace aktivovaného kalu v závislosti na čase;
          12. účinné od 1. 5. 2004— poznámky týkající se aktivovaného kalu (odstraňování přebytečného kalu ze zařízení, tvorba shluků, použití chloridu železitého atd.);
          13. účinné od 1. 5. 2004— proměřované koncentrace zkoušené látky;
          14. účinné od 1. 5. 2004— výsledky analýz kalu;
          15. účinné od 1. 5. 2004— všechny informace o zkoušené látce a o referenční látce, pokud byla použita;
          16. účinné od 1. 5. 2004— vědecké zdůvodnění všech odchylek a změn metody.
      1. účinné od 1. 5. 2004X.3.2 INTERPRETACE VÝSLEDKŮ

        účinné od 1. 5. 2004Příčinou nízké hodnoty úbytku zkoušené látky z vodné fáze může být inhibice mikroorganismů způsobená touto látkou. Projevuje se to především rozpouštěním a ztrátou kalu, zakalováním kapalné fáze a snížením účinnosti odstraňování CHSK nebo DOC v zařízení.

        účinné od 1. 5. 2004Někdy hraje roli fyzikálně-chemická adsorbce. Vztah mezi biologickým působením na látku a její fyzikálně-chemickou adsorpcí je možné rozlišit po odpovídající desorpci.

        účinné od 1. 5. 2004K rozlišení úplného nebo částečného biologického rozkladu od adsorbce je nutno provést další zkoušky.

        účinné od 1. 5. 2004Nabízí se zde více možností. Nejlepším postupem je použití kapalné fáze ze sedimentační nádoby jako inokula v některé ze zkoušek snadné biologické rozložitelnosti (nejlépe v respirometrické zkoušce).

        účinné od 1. 5. 2004Vysoké hodnoty úbytku DOC nebo CHSK jsou zpravidla způsobovány biologickým rozkladem, nízké hodnoty úbytku naproti tomu nelze odlišit od jiných mechanizmů odstranění látky. Pokud např. rozpustná sloučenina vykazuje stupeň adsorbce 98 % a denně je odstraňováno 10 % kalu, dochází až ke 40 % odstranění látky v tomto kalu. Je-li denně odstraňováno 30 % kalu, může eliminace na základě adsorbce a odstranění kalu stoupnout na 65 % (4):

        účinné od 1. 5. 2004Při používání specifických analýz je třeba brát na zřetel vliv struktury látky na specifickou analýzu. Úbytek látky stanovený specifickou analýzou nemůže být interpretován jako mineralizace látky.

    1. účinné od 1. 5. 2004X.4 LITERATURA

      účinné od 1. 5. 2004(1) OECD, Paris 1981, Test Guideline 303 A, Decision of the Council C (81) 30 final.

      účinné od 1. 5. 2004(2) Annex V C9 Degradation Test - Chemical Oxygen Demand, Commission Directive 84/449/EEC,Official Journal of the European Communities, No L 251,19. 9. 1984).

      účinné od 1. 5. 2004(3) H. A. Painter and E. F. King, WRC Porous Pot method for asessing biodegradability. Technical report TR7O. June 1978, Water Research Center, Velká Británie.

      účinné od 1. 5. 2004(4) Wierich P. and Gerike P., The Fate of Soluble, Recalcitrant, and Absorging Compounds in Activated Sludge Plants, Ecotoxicology and Enviromental Safety, Vol 5, Nr. 2 - June 1981, str. 161 - 171.

      účinné od 1. 5. 2004(5) Council Directives 82/242/EEC und 82/243/EEC, Official Journal of the European Communities, No L109, 22. 4. 1982, amending Council Directives 73/404/EEC und 73/405/EEC on biodegradability of detergents, Official Journal of the European Communities, No L347, 17. 12. 1973.

      účinné od 1. 5. 2004(6) Streuli, H., Fehlerhafte Interpretation und Anwendung von Ausreissetest, insbesondere bei Rindversuchen zur Überprüfung analytisch-chemischer Untersuchungsmethoden, Fressenius-Zeitschrift für Analytische Chemie (1980), str. 406 - 408.

    PŘÍLOHA 1

    účinné od 1. 5. 2004

    účinné od 1. 5. 2004Obrázek 1

    účinné od 1. 5. 2004Obrázek
  2. účinné od 1. 5. 2004A = zásobník
  3. účinné od 1. 5. 2004B = dávkovací zařízení
  4. účinné od 1. 5. 2004C = aerační komora (objem 3 litry)
  5. účinné od 1. 5. 2004D = sedimentační nádoba
  6. účinné od 1. 5. 2004E = mamutka
  7. účinné od 1. 5. 2004F = zásobník na výtok
  8. účinné od 1. 5. 2004G = aerátor
  9. účinné od 1. 5. 2004H = průtokoměr (nepovinně)

    10. účinné od 1. 5. 2004Obrázek 2

    účinné od 1. 5. 2004Obrázek

    PŘÍLOHA 2

    účinné od 1. 5. 2004

    účinné od 1. 5. 2004Obrázek 1

    účinné od 1. 5. 2004Zařízení používané pro stanovení biologické rozložitelnosti

    účinné od 1. 5. 2004Obrázek
  10. účinné od 1. 5. 2004A = zásobník
  11. účinné od 1. 5. 2004B = dávkovací čerpadlo
  12. účinné od 1. 5. 2004C = porézní aerační nádobka
  13. účinné od 1. 5. 2004D = vnější nepropustná nádoba
  14. účinné od 1. 5. 2004E = zásobník na výtok
  15. účinné od 1. 5. 2004F = vzduchovací kámen
  16. účinné od 1. 5. 2004G = rotametr

    17. účinné od 1. 5. 2004Obrázek 2

    účinné od 1. 5. 2004Detaily třílitrové vzduchovací porézní nádobky

    účinné od 1. 5. 2004Obrázek

    PŘÍLOHA 3

    účinné od 1. 5. 2004

    účinné od 1. 5. 2004Provozní podmínky simulační zkoušky s aktivovaným kalem

    účinné od 1. 5. 2004Obrázek
  1. účinné od 1. 5. 2004XI. METODA PRO STANOVENÍ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI – ZKOUŠKA INHIBICE DÝCHÁNÍ AKTIVOVANÉHO KALU – metoda C.11 podle přílohy směrnice 92/69/EHS
    1. účinné od 1. 5. 2004XI.1 METODA
      1. účinné od 1. 5. 2004XI.1.1 ÚVOD

        účinné od 1. 5. 2004Popsaná metoda hodnotí vliv zkoušené látky na mikroorganizmy měřením intenzity jejich dýchání za definovaných podmínek v přítomnosti různých koncentrací zkoušené látky.

        účinné od 1. 5. 2004Účelem této metody je poskytnout rychlou vyhledávací metodu, kterou je možné určit látky, které mohou nepříznivě ovlivnit aerobní mikrobiální čistírny vod, a naznačit vhodné koncentrace zkoušených látek, které nejsou inhibující a které je možno použít ve zkouškách biologické rozložitelnosti.

        účinné od 1. 5. 2004Definitivní zkoušce může předcházet zkouška pro nalezení pracovní oblasti. Může poskytnout informace o oboru koncentrací, které je možné použít v hlavní zkoušce.

        účinné od 1. 5. 2004Do schématu zkoušky jsou zařazeny dvě kontroly, jedna na začátku a druhá na konci řady pokusů. Každou dávku aktivovaného kalu je také nutno kontrolovat s použitím referenční látky.

        účinné od 1. 5. 2004Tato metoda se nejsnáze aplikuje na látky, které díky své rozpustnosti a nízké těkavosti zůstávají ve vodě.

        účinné od 1. 5. 2004U látek s nízkou rozpustností v médiích používaných ve zkoušce může být nemožné stanovit EC50.

        účinné od 1. 5. 2004Pokud má zkoušená látka sklon k rozkladu oxidační fosforylací mohou výsledky založené na absorpci kyslíku vést k nesprávným závěrům,

        1. účinné od 1. 5. 2004Pro provedení zkoušky je užitečné znát následující informace:
          1. účinné od 1. 5. 2004— rozpustnost ve vodě,
          2. účinné od 1. 5. 2004— tlak par,
          3. účinné od 1. 5. 2004— strukturní vzorec,
          4. účinné od 1. 5. 2004— čistota zkoušené látky.
        1. účinné od 1. 5. 2004Doporučení:
          1. účinné od 1. 5. 2004Aktivovaný kal může obsahovat potenciálně patogenní organizmy a je třeba s ním zacházet opatrně.
      1. účinné od 1. 5. 2004XI.1.2 DEFINICE A JEDNOTKY

        účinné od 1. 5. 2004Respirační rychlost je spotřeba kyslíku mikroorganizmy odpadních vod v aerobním kalu, obecně vyjádřená jako mg O2 na 1 mg kalu za hodinu.

        1. účinné od 1. 5. 2004Pro výpočet inhibičního účinku zkoušené látky při určité koncentraci se respirační rychlost vyjadřuje jako procento průměrné hodnoty dvou kontrolních respiračních rychlostí:

          účinné od 1. 5. 2004

          1. účinné od 1. 5. 2004kde:
            1. účinné od 1. 5. 2004Rs = rychlost spotřeby kyslíku při použité koncentraci zkoušené látky,
            2. účinné od 1. 5. 2004Rc1 = rychlost spotřeby kyslíku v kontrolní zkoušce 1,
            3. účinné od 1. 5. 2004Rc2 = rychlost spotřeby kyslíku v kontrolní zkoušce 2.
            4. účinné od 1. 5. 2004EC50 v této zkoušce je koncentrace zkoušené látky, při které respirační rychlost činí 50 % hodnoty vycházející z kontrolní zkoušky za podmínek popsaných v této metodě.
      1. účinné od 1. 5. 2004XI.1.3 REFERENČNÍ LÁTKY

        účinné od 1. 5. 2004Jako referenční látku se doporučuje používat známý inhibitor dýchání 3,5-dichlorfenol. Ověřením EC50 u každé dávky aktivovaného kalu by mělo být zkontrolováno, že kal není abnormálně citlivý.

      1. účinné od 1. 5. 2004XI.1.4 PRINCIP ZKUŠEBNÍ METODY

        účinné od 1. 5. 2004Rychlost dýchání aktivovaného kalu vyživovaného standardním množstvím syntetické odpadní vody se měří po době kontaktu 30 minut, 3 hodin nebo v obou časech. Měří se také rychlost dýchání téhož aktivovaného kalu v přítomnosti různých koncentrací zkoušené látky za jinak stejných podmínek. Inhibiční efekt zkoušené látky při určité koncentraci se vyjadřuje jako procento průměrné rychlosti dýchání ze dvou kontrolních pokusů. Hodnota EC50 se vypočítá ze stanovení při různých koncentracích.

      1. účinné od 1. 5. 2004XI.1.5 KRITÉRIA KVALITY
        1. účinné od 1. 5. 2004Výsledky zkoušky jsou platné, jestliže:
          1. účinné od 1. 5. 2004— respirační rychlosti dvou kontrolních pokusů se od sebe liší nejvýše o 15 %,
          2. účinné od 1. 5. 2004— EC50 (pro 30 minut nebo pro 3 hodiny) 3,5-dichlorfenolu leží v přijatém rozmezí 5 - 30 mg.l-1.
      1. účinné od 1. 5. 2004XI.1.6 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY
        1. účinné od 1. 5. 2004XI.1.6.1 Činidla
          1. účinné od 1. 5. 2004XI.1.6.1.1 Roztoky zkoušené látky

            účinné od 1. 5. 2004Roztoky zkoušené látky se připravují čerstvé na začátku studie s použitím zásobního roztoku. Použije-li se níže popsaný postup, je vhodná koncentrace zásobního roztoku 0,5 g.l-1.

          1. účinné od 1. 5. 2004XI.1.6.1.2 Roztok kontrolní látky

            účinné od 1. 5. 2004Roztok 3,5-dichlorfenolu lze připravit například rozpuštěním 0,5 g 3,5-dichlorfenolu v 10 ml 1 M NaOH, zředěním destilovanou vodou přibližně na 30 ml, přidáním 0,5 M H2SO4 do bodu začínajícího srážení ( je třeba asi 8 ml 0,5 M H2SO4) a konečným doplněním směsi destilovanou vodou na 1 litr. pH musí potom ležet mezi 7 a 8.

          1. účinné od 1. 5. 2004XI.1.6.1.3 Syntetická odpadní voda
            1. účinné od 1. 5. 2004Používaná syntetická odpadní voda se připraví rozpuštěním následujícího množství látek v 1 litru vody:
              1. účinné od 1. 5. 2004— 16 g peptonu,
              2. účinné od 1. 5. 2004— 11 g masového extraktu,
              3. účinné od 1. 5. 2004— 3 g močoviny,
              4. účinné od 1. 5. 2004— 0,7 g NaCl,
              5. účinné od 1. 5. 2004— 0,4 g CaCl2.2H2O,
              6. účinné od 1. 5. 2004— 0,2 g MgSO4.7H2O,
              7. účinné od 1. 5. 2004— 2,8 g K2HPO4.
          2. účinné od 1. 5. 2004Poznámka 1: Tato syntetická odpadní voda má stonásobnou koncentraci oproti vodě popsané v technické zprávě OECD “Návrh metody stanovení biologické rozložitelnosti povrchově aktivních látek používaných v syntetických detergentech“ (11.6.1976), s přídavkem monohydrogenfosforečnanu draselného.
          3. účinné od 1. 5. 2004Poznámka 2: Nepoužije-li se připravené médium ihned, je nutné je přechovávat

            4. účinné od 1. 5. 2004v temnu při 0 - 4 °C ne déle než jeden týden za podmínek, které nezpůsobují žádné změny v jeho složení. Médium je také možné před uschováním sterilizovat, nebo je možné pepton a masový extrakt přidat krátce před provedením zkoušky. Před použitím je nutné médium důkladně promíchat a upravit pH.

        1. účinné od 1. 5. 2004XI.1.6.2 Aparatura

          účinné od 1. 5. 2004Měřicí aparatura: Přesná konstrukce není podstatná. Musí však mít volný prostor nad kapalinou a sonda musí přesně zapadat do hrdla odměrné baňky.

          1. účinné od 1. 5. 2004Z běžného laboratorního vybavení je třeba zejména toto:
            1. účinné od 1. 5. 2004— měřicí přístroje,
            2. účinné od 1. 5. 2004— provzdušňovací zařízení,
            3. účinné od 1. 5. 2004— měřič pH a monitorovací zařízení,
            4. účinné od 1. 5. 2004— kyslíková elektroda.
        1. účinné od 1. 5. 2004XI.1.6.3 Příprava inokula

          účinné od 1. 5. 2004Jako mikrobiální inokulum pro zkoušku se používá aktivovaný kal z čistírny odpadních vod čistící převážně domovní odpadní vody.

          účinné od 1. 5. 2004Je-li to nutné, je možné při dodání kalu do laboratoře odstranit hrubé částice krátkodobým usazením (např. 15 minut) a dekantovat horní vrstvu jemnějších tuhých částic pro použití. Alternativně je možné kal po několik sekund.promíchat.

          účinné od 1. 5. 2004Lze-li mimoto předpokládat, že je přítomna látka mající inhibiční účinek, je nutné kal promýt vodovodní vodou nebo izotonickým roztokem. Po zcentrifugování se roztok nad usazeninou dekantuje (tento postup se opakuje třikrát).

          účinné od 1. 5. 2004Malé množství kalu se zváží a vysuší. Z výsledku je možné vypočítat množství vlhkého kalu, které je nutné suspendovat ve vodě, aby se získal aktivovaný kal

          účinné od 1. 5. 2004v oblasti koncentrací suspendovaných tuhých látek ve směsné kapalině mezi 2 a 4 g.l-1. Dodrží-li se níže doporučený postup získá se zkušební médium s koncentrací kalu 0,8 a 1,6 g.l-1.

          účinné od 1. 5. 2004Není-li možné kal použít v den kdy byl shromážděn přidá se ke každému litru aktivovaného kalu, připraveného tak, jak je popsáno výše, 50 ml syntetické odpadní vody, potom se provzdušňuje přes noc při 20 ± 2 °C. Poté se udržuje za provzdušňování pro použití během dne. Před použitím se zkontroluje pH a je-li třeba, upraví se na 6 - 8. Obsah suspendovaných tuhých látek ve směsné kapalině je třeba stanovit, jak je popsáno v předchozím odstavci.

          účinné od 1. 5. 2004Požaduje-li se použití stejné dávky kalu v následující dny (nejvýše po čtyři dny), přidává se na konci každého pracovního dne dalších 50 ml syntetické odpadní vody na litr kalu.

        1. účinné od 1. 5. 2004XI.1.6.4 Provedení zkoušky
          účinné od 1. 5. 2004
          PŘÍLOHA 3 Provozní podmínky simulační zkoušky s aktivovaným kalem
          Trvání/doba kontaktu: 30 minut a (nebo) 3 hodiny, během kterých probíhá provzdušňování
          Voda: Pitná voda (v případě potřeby zbavená chlóru)
          Přívod vzduchu: Čistý vzduch, prostý oleje. Průtok 0,1 - 1 l.min-1.
          Měřicí aparatura: Baňka s plochým dnem, jaká se používá pro stanovení BSK.
          Měřič obsahu kyslíku: Vhodná kyslíková elektroda, se zapisovačem.
          Živný roztok: Syntetická odpadní voda (viz výše).
          Zkoušená látka: Roztok zkoušené látky se připraví čerstvý na začátku zkoušky.
          Referenční látka: např. 3,5-dichlorfenol (nejméně tři koncentrace)
          Kontrolní zkouška: Naočkovaný vzorek bez zkoušené látky
          Teplota: 20 ± 2 °C
          1. účinné od 1. 5. 2004Dále je uveden navržený experimentální postup, kterého je možné použít jak pro zkoušenou, tak pro referenční látku, pro dobu kontaktu tři hodiny:

            účinné od 1. 5. 2004Používá se několika nádob (např. jednolitrových kádinek).

            účinné od 1. 5. 2004Je třeba použít alespoň pět koncentrací, odstupňovaných o konstantní faktor nepřevyšující pokud možno 3,2.

            účinné od 1. 5. 2004V okamžiku “0“ se 16 ml syntetické odpadní vody doplní vodou na 300 ml. Přidá se 200 ml mikrobiálního inokula a výsledná směs (500 ml) se převede do první nádoby (první kontrola C1).

            účinné od 1. 5. 2004Nádoby, používané v pokusu, je nutné nepřetržitě provzdušňovat, aby bylo zaručeno, že koncentrace rozpuštěného kyslíku nepoklesne pod 2,5 mg.l-1 a aby těsně před měřením rychlosti dýchání činila koncentrace kyslíku přibližně 6,5 mg.l-1.

            účinné od 1. 5. 2004V okamžiku “15 minut“ (15 minut je libovolně zvolený, avšak vhodný interval) se opakuje totéž až na to, že se k 16 ml syntetické odpadní vody před doplněním vodou na 300 ml a přidáním mikrobiálního inokula na celkový objem 500 ml přidá 100 ml zásobního roztoku zkoušené látky. Tato směs se pak převede do druhé nádoby a provzdušňuje se jako výše. Tento postup se opakuje v 15-minutových intervalech s různými objemy zásobního roztoku zkoušené látky, čímž se získá řada nádob obsahujících různé koncentrace zkoušené látky. Nakonec se připraví druhá kontrolní nádoba.

            účinné od 1. 5. 2004Po třech hodinách se zaznamená pH, dobře promíchaný vzorek obsahu první nádoby se převede do měřicí aparatury a v době do 10 minut se změří rychlost dýchání.

            účinné od 1. 5. 2004Stanovení se opakuje u obsahu každé z nádob v 15minutových intervalech tak, že doba kontaktu v každé nádobě je tři hodiny.

            účinné od 1. 5. 2004Referenční látka se zkouší na každé dávce mikrobiálního inokula týmž způsobem.

            účinné od 1. 5. 2004Mají-li se měření provádět po 30 minutách kontaktu, je třeba použít jiného režimu (např. použití více než jednoho měřiče kyslíku).

            účinné od 1. 5. 2004Vyžaduje-li se měření chemické spotřeby kyslíku, připraví se další nádoby, obsahující zkoušenou látku, syntetickou odpadní vodu a čistou vodu, ale ne aktivovaný kal. Spotřeba kyslíku se měří a zaznamená po době provzdušňování 30 minut a (nebo) tři hodiny (doba kontaktu).

    1. účinné od 1. 5. 2004XI.2 VÝSLEDKY A VYHODNOCENÍ

      účinné od 1. 5. 2004Rychlost dýchání se vypočítá ze záznamu zapisovače mezi přibližně 6,5 mg.l-1 a 2,5 mg.l-1, nebo za desetiminutovou periodu, je-li rychlost dýchání nízká. Část respirační křivky, ze které se vyhodnocuje rychlost dýchání, musí být lineární.

      účinné od 1. 5. 2004Jestliže rychlosti dýchání v obou kontrolních pokusech neleží v rozmezí 15 % od sebe navzájem, nebo EC50 (za 30 minut nebo tři hodiny) referenční látky neleží v akceptovaném rozmezí (5 - 30 mg.l-1 pro 3,5-dichlorfenol), je zkouška neplatná a musí se opakovat.

      účinné od 1. 5. 2004Pro každou zkušenou koncentraci (viz bod 1. 2) se vypočte inhibice v %. Inhibice v % se vynese proti koncentraci na logaritmicko-normálním (nebo logaritmicko-pravděpodobnostním) papíru a odečte se hodnota EC50.

      účinné od 1. 5. 2004Standardními postupy je možné stanovit pro hodnoty EC50 95% meze spolehlivosti.

    1. účinné od 1. 5. 2004XI.3 ZPRÁVA
      1. účinné od 1. 5. 2004XI.3.1 PROTOKOL O ZKOUŠCE
        1. účinné od 1. 5. 2004Je-li to možné, má protokol o zkoušce obsahovat tyto informace:
          1. účinné od 1. 5. 2004— zkoušená látka: chemické identifikační údaje,
          2. účinné od 1. 5. 2004— systém použitý při zkoušce: zdroj, koncentrace a veškerá předběžná úprava aktivovaného kalu,
          3. účinné od 1. 5. 2004— experimentální podmínky:
            1. účinné od 1. 5. 2004– pH reakční směsi před měřením respirace,
            2. účinné od 1. 5. 2004– teplota při zkoušce,
            3. účinné od 1. 5. 2004– ba trvání zkoušky,
            4. účinné od 1. 5. 2004– referenční látka a její změřená EC50,
            5. účinné od 1. 5. 2004– abiotická spotřeba kyslíku (pokud k ní dochází).
          1. účinné od 1. 5. 2004— výsledky:
            1. účinné od 1. 5. 2004– veškeré naměřené hodnoty,
            2. účinné od 1. 5. 2004– křivka inhibice a metoda výpočtu EC50,
            3. účinné od 1. 5. 2004– EC50 a je-li možné 95% meze spolehlivosti, EC20 a EC80,
            4. účinné od 1. 5. 2004– veškerá pozorování a veškeré odchylky od této zkušební metody, které mohly ovlivnit výsledek.
      1. účinné od 1. 5. 2004XI.3.2 INTERPRETACE VÝSLEDKŮ

        účinné od 1. 5. 2004Hodnotu EC50 je třeba považovat pouze za orientační hodnotu pravděpodobné toxicity zkoušené látky buď při zpracování odpadních vod aktivovaným kalem, nebo pro mikroorganizmy v odpadních vodách, protože složité interakce, ke kterým dochází v životním prostředí, nelze přesně simulovat laboratorní zkouškou. Mimoto, zkoušené látky, které mohou mít inhibiční účinky na oxidaci amoniaku, mohou také způsobovat atypické inhibiční křivky. Proto je nutné interpretovat tyto křivky opatrně.

    1. účinné od 1. 5. 2004XI.4 LITERATURA

      účinné od 1. 5. 2004(1) International Standard ISO 8192-1986.

      účinné od 1. 5. 2004(2) Broecker, B., Zahn, R., Water Research 11, 1977, str. 165

      účinné od 1. 5. 2004(3) Brown, D., Hitz, H.R., Schaefer, L., Chemosphere 10, 1981, str. 245

      účinné od 1. 5. 2004(4) ETAD (Ecological and Toxicological Association of Dyestuffs Manufacturing Industries - Ekologická a toxikologická asociace průmyslu výroby barviv), Recommended Method No 103, také popsáno v:

      účinné od 1. 5. 2004(5) Robra, B., Wasser/Abwasser 117, 1976, str. 80

      účinné od 1. 5. 2004(6) Schefer, W., Textilveredlung 6, 1977, str. 247

      účinné od 1. 5. 2004(7) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 209, Decision of the Council C(81) 30 final.

  1. účinné od 1. 5. 2004XII. METODA PRO STANOVENÍ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI -– MODIFIKOVANÁ ZKOUŠKA SCAS – metoda C.12 podle přílohy směrnice 92/69/EHS
    1. účinné od 1. 5. 2004XII.1 METODA
      1. účinné od 1. 5. 2004XII.1.1 ÚVOD

        účinné od 1. 5. 2004Cílem této metody je hodnocení potenciální úplné biologické rozložitelnosti netěkavých organických látek rozpustných ve vodě, jsou-li vystaveny poměrně vysokým koncentracím mikroorganizmů po dlouhé časové období. Životaschopnost mikroorganizmů se udržuje po tuto dobu denními přídavky živin z usazené odpadní vody. (Pro potřebu během víkendů lze odpadní vodu přechovávat při 4 °C. Alternativně je možné použít syntetickou odpadní vodu podle potvrzující zkoušky OECD.)

        účinné od 1. 5. 2004Při interpretaci výsledků (viz 3. 2) je nutné brát v úvahu, že může docházet k fyzikálně-chemické adsorpci na suspendovaných tuhých látkách.

        účinné od 1. 5. 2004V důsledku dlouhé doby zdržení kapalné fáze (36 hodin) a průběžného přidávání živin nesimuluje zkouška podmínky existující v čistírně odpadních vod. Výsledky získané při pokusech s různými látkami ukazují, že zkouška má vysoký potenciál biologického rozkladu.

        účinné od 1. 5. 2004Podmínky poskytované zkouškou jsou vysoce příznivé pro výběr a adaptaci mikroorganizmů schopných rozkládat zkoušenou látku. (Postup je možné použít také k získávání aklimatizovaných inokulí pro použití v jiných zkouškách.)

        účinné od 1. 5. 2004V této metodě se používá k hodnocení výsledné biologické rozložitelnosti zkoušené látky hodnota koncentrace rozpuštěného organického uhlíku (DOC). DOC se doporučuje raději stanovit po okyselení a přečištění než jako rozdíl Ccelk. - Canorg.

        účinné od 1. 5. 2004Současné použití specifické analytické metody může umožnit určení primárního rozkladu látky (úbytek výchozí chemické struktury).

        1. účinné od 1. 5. 2004Metoda je použitelná pouze pro ty organické látky, které v koncentracích používaných ve zkoušce:
          1. účinné od 1. 5. 2004— jsou rozpustné ve vodě (alespoň 20 mg rozpuštěného organického uhlíku na litr),
          2. účinné od 1. 5. 2004— mají zanedbatelnou tenzi par,
          3. účinné od 1. 5. 2004— nepůsobí inhibičně na bakterie,
          4. účinné od 1. 5. 2004— významně se neadsorbují ve zkušebním systému,
          5. účinné od 1. 5. 2004— neztrácejí se ze zkoušeného roztoku pěněním.

        účinné od 1. 5. 2004Je nutné stanovit obsah organického uhlíku ve zkoušené látce.

        účinné od 1. 5. 2004Při interpretaci získaných výsledků, zejména v případech, kdy výsledky jsou nízké nebo marginální, jsou cenné informace o relativních podílech hlavních složek ve zkoušeném vzorku

        účinné od 1. 5. 2004Pro interpretaci nízkých výsledků a při volbě vhodné koncentrace při zkoušce mohou být užitečné informace o toxicitě látky pro mikroorganizmy.

      1. účinné od 1. 5. 2004XII.1.2 DEFINICE A JEDNOTKY

        účinné od 1. 5. 2004CT = koncentrace zkoušené látky na začátku provzdušňovací periody, vyjádřená jako množství organického uhlíku přítomného nebo přidaného k usazené odpadní vodě (mg.l-1),

        účinné od 1. 5. 2004Ct = koncentrace rozpuštěného organického uhlíku v kapalině nad usazeninou, ve zkoušce, na konci provzdušňovací periody (mg.l-1),

        účinné od 1. 5. 2004Cc= koncentrace rozpuštěného organického uhlíku v kapalině nad sedimentem, v kontrolní zkoušce, na konci provzdušňovací periody (mg.l-1).

        účinné od 1. 5. 2004Biologický rozklad je v této metodě definován jako úbytek organického uhlíku.

        1. účinné od 1. 5. 2004Biologický rozklad je možné vyjádřit jako:
          1. účinné od 1. 5. 20041. Procentický úbytek Dda množství denně přidávané látky:
            účinné od 1. 5. 2004
            PŘÍLOHA 3 Provozní podmínky simulační zkoušky s aktivovaným kalem
            (1)
            1. účinné od 1. 5. 2004kde Dds = rozklad/denní přídavek
          1. účinné od 1. 5. 20042. Procentický úbytek Dssd množství látky přítomného na začátku každého dne:
            účinné od 1. 5. 2004
            PŘÍLOHA 3 Provozní podmínky simulační zkoušky s aktivovaným kalem
            (2a))
            účinné od 1. 5. 2004
            PŘÍLOHA 3 Provozní podmínky simulační zkoušky s aktivovaným kalem
            (2b))
            1. účinné od 1. 5. 2004kde Dred = rozklad/denní přídavek;
            2. účinné od 1. 5. 2004indexy i a (i + 1) se vztahují ke dni měření.

        účinné od 1. 5. 2004Rovnice 2(a) se doporučuje, mění-li se DOC v odcházející vodě den ode dne, zatímco rovnici 2(b) lze používat, zůstává-li DOC v odcházející vodě den ode dne relativně konstantní.

      1. účinné od 1. 5. 2004XII.1.3 REFERENČNÍ LÁTKY
      2. účinné od 1. 5. 2004XII.1.4 PRINCIP ZKUŠEBNÍ METODY

        účinné od 1. 5. 2004Aktivovaný kal z čistírny odpadních vod se vpraví do semikontinuální jednotky pro aktivovaný kal (SCAS, semi-continuous activated sludge unit). Přidají se zkoušená látka a usazená domovní odpadní voda a směs se provzdušňuje 23 hodin. Provzdušňování se pak ukončí, kal se nechá usadit a kapalina nad usazeninou se odstraní.

        účinné od 1. 5. 2004Kal zbylý v provzdušňovací komoře se pak smísí s další alikvotní částí zkoušené látky a odpadní vody a cyklus se opakuje.

        účinné od 1. 5. 2004Biologický rozklad se určí stanovením obsahu rozpuštěného organického uhlíku v kapalině nad sedimentem. Tato hodnota se porovná s hodnotou, zjištěnou pro kapalinu získanou z kontrolní nádoby, do které byla dávkována pouze usazená odpadní voda.

        účinné od 1. 5. 2004Použije-li se specifická analytická metoda, je možné měřit změny koncentrace výchozí chemické látky v důsledku biologického rozkladu (primární biologický rozklad).

      1. účinné od 1. 5. 2004XII.1.5 KRITÉRIA KVALITY

        účinné od 1. 5. 2004Reprodukovatelnost této metody, založené na úbytku rozpuštěného organického uhlíku, nebyla ještě stanovena. (Pokud se uvažuje primární biologický rozklad, dosahuje se velmi přesných hodnot pro látky, které se rozkládají ve vysokém stupni.)

        účinné od 1. 5. 2004Citlivost metody je ve velké míře určena variabilitou slepé zkoušky a v menší míře přesností stanovení rozpuštěného organického uhlíku a obsahem zkoušené látky v kapalině na začátku každého cyklu.

      1. účinné od 1. 5. 2004XII.1.6 POPIS PRACOVNÍHO POSTUPU
        1. účinné od 1. 5. 2004XII.1.6.1 Příprava

          účinné od 1. 5. 2004Sestaví se dostatečný počet čistých provzdušňovacích jednotek, alternativně je možné použít originální zkušební jednotku SCAS o obsahu 1,5 l, a trubic pro přívod vzduchu (obrázek 1) pro každou zkoušenou látku a pro kontrolní zkoušky. Stlačený vzduch přiváděný do zkušebních jednotek, přečištěný vatovým filtrem, musí být prostý organického uhlíku a musí být předem nasycen vodou, aby se snížily ztráty vypařováním.

          účinné od 1. 5. 2004Vzorek směsné kapaliny, obsahující 1 - 4 g suspendovaných tuhých látek v 1 litru, se získá z čistírny pracující s aktivovaným kalem, čistící převážně domovní odpadní vody. Pro každou provzdušňovací jednotku je třeba přibližně 150 ml směsné kapaliny.

          účinné od 1. 5. 2004Zásobní roztoky zkoušené látky se připravují s použitím destilované vody; normálně požadovaná koncentrace je 400 mg.l-1 jako organický uhlík, což představuje koncentraci zkoušené látky 20 mg.l-1 uhlíku na začátku každého cyklu provzdušňování, nedochází-li k biologickému rozkladu.

          účinné od 1. 5. 2004Dovoluje-li to toxicita pro mikroorganizmy jsou přípustné vyšší koncentrace.

          účinné od 1. 5. 2004Měří se obsah organického uhlíku zásobních roztoků.

        1. účinné od 1. 5. 2004XII.1.6.2 Experimentální podmínky

          účinné od 1. 5. 2004Zkoušku je třeba provádět při 20 - 25 °C. Používá se vysoká koncentrace aerobních mikroorganizmů (1 - 4 g.l-1 suspendovaných látek), a efektivní doba zdržení je 36 hodin. Uhlíkaté látky v přiváděné odpadní vodě se v široké míře oxidují, normálně během osmi hodin po začátku každého cyklu provzdušňování. Potom kal endogenně dýchá po zbytek provzdušňovací periody, a v této době je jediným dostupným substrátem zkoušená sloučenina, pokud se také rychle nemetabolizuje. Tyto skutečnosti spolu s denně opakovaným očkováním, používá-li se jako médium domovní odpadní voda, vytvářejí vysoce příznivé podmínky jak pro aklimatizaci, tak pro vysoký stupeň rozkladu.

        1. účinné od 1. 5. 2004XII.1.6.3 Provedení zkoušky

          účinné od 1. 5. 2004Získá se vzorek směsné kapaliny z vhodné čistírny čistící aktivovaným kalem převážně domovní odpadní vody nebo vzorek kapaliny z laboratorní jednotky a udržuje se v aerobních podmínkách až do použití v laboratoři. Do každé aerační i kontrolní jednotky se naplní 150 ml směsné kapaliny (používá-li se originální jednotka pro zkoušku SCAS, je třeba uvedené objemy násobit 10) a zahájí se provzdušňování. Po 23 hodinách se provzdušňování ukončí a kal se nechá 45 minut usadit. Postupně se otevřou kohouty všech nádob a odeberou se 100 ml podíly kapaliny nad usazeninou. Ke kalu zbylému v každé aerační jednotce se přidá 100 ml usazené domovní odpadní vody získané bezprostředně před použitím. Opět se zahájí provzdušňování. V této etapě se nepřidávají žádné zkoušené látky, a do jednotek se denně přidává domovní odpadní voda pouze do té doby, než se po usazení získá čirá kapalina nad usazeninou. To trvá obvykle až dva týdny, během kterých se obsah rozpuštěného organického uhlíku v kapalině nad usazeninou na konci každého aeračního cyklu přiblíží konstantní hodnotě.

          účinné od 1. 5. 2004Na konci této fáze se jednotlivé usazené kaly smísí a do každé jednotky se předloží 50 ml výsledného směsného kalu.

          účinné od 1. 5. 2004Do kontrolních jednotek se přidá 95 ml usazené odpadní vody a 5 ml vody, a do zkušebních jednotek se přidá 95 ml usazené odpadní vody plus 5 ml příslušného zásobního roztoku zkoušené látky (450 mg.l-1). Znovu se zahájí provzdušňování a pokračuje se v něm 23 hodin. Kal se pak nechá 45 minut usadit, kapalina nad usazeninou se odebere a analyzuje na obsah rozpuštěného organického uhlíku.

          účinné od 1. 5. 2004Výše uvedený postup plnění a odběru se opakuje v průběhu zkoušky denně.

          účinné od 1. 5. 2004Může se ukázat nutným očistit před usazováním stěny jednotek, aby se předešlo hromadění tuhých látek nad hladinou kapaliny. Pro každou jednotku se používá samostatná stěrka nebo kartáč, aby se předešlo vzájemné kontaminaci.

          účinné od 1. 5. 2004V ideálním případě se rozpuštěný organický uhlík stanoví v kapalinách nad usazeninami denně, i když jsou přípustné méně časté analýzy. Před analýzou se kapaliny zfiltrují přes promyté 0,45 µm membránové filtry nebo se zcentrifugují. Membránové filtry jsou vhodné, je-li zaručeno, že ani neuvolňují uhlík, ani ve filtračním kroku neabsorbují příslušnou látku. Teplota vzorku po dobu, kdy je v odstředivce, nesmí přesáhnout 40 °C.

          účinné od 1. 5. 2004Doba trvání zkoušky pro látky, u kterých dochází k malému nebo žádnému biologickému rozkladu není určena, ale na základě zkušenosti lze doporučit, aby trvala obecně nejméně 12 týdnů, avšak ne déle než 26 týdnů.

    1. účinné od 1. 5. 2004XII.2 VÝSLEDKY A VYHODNOCENÍ

      účinné od 1. 5. 2004Hodnoty koncentrace rozpuštěného organického uhlíku v čiré kapalině nad usazeninami ve zkušebních jednotkách a v kontrolních jednotkách se vynesou proti času.

      účinné od 1. 5. 2004Po skončení biologického rozkladu se koncentrace zjištěná ve zkoušce přiblíží hodnotě v kontrolní jednotce. Jakmile se ve třech po sobě následujících měřeních zjistí, že rozdíl mezi oběma úrovněmi je konstantní, provede se takový počet dalších měření, který je postačující pro statistické vyhodnocení výsledků, a vypočte se procentní hodnota biologického rozkladu zkoušené látky (Dda nebo Dred, viz 1. 2).

    1. účinné od 1. 5. 2004XII.3 ZPRÁVA
      1. účinné od 1. 5. 2004XII.3.1 PROTOKOL O ZKOUŠCE
        1. účinné od 1. 5. 2004Je-li to možné, má protokol o zkoušce obsahovat tyto informace:
          1. účinné od 1. 5. 2004— veškeré informace o druhu odpadní vody, typu použité jednotky a o experimentálních výsledcích týkajících se zkoušené látky, referenční látky ( pokud byla použita) a slepé zkoušky,
          2. účinné od 1. 5. 2004— teplotu,
          3. účinné od 1. 5. 2004— křivku úbytku s popisem, způsob výpočtu (viz 1. 2),
          4. účinné od 1. 5. 2004— datum a lokalitu, kde byly odebrány aktivovaný kal a odpadní voda, stav adaptace, koncentrace atd.,
          5. účinné od 1. 5. 2004— vědecké důvody pro veškeré změny v postupu zkoušky,
          6. účinné od 1. 5. 2004— podpis a datum.
      1. účinné od 1. 5. 2004XII.3.2 INTERPRETACE VÝSLEDKŮ

        účinné od 1. 5. 2004Protože látky zkoušené touto metodou nejsou snadno biologicky rozložitelné, bude normálně jakýkoli úbytek DOC, ke kterému dojde pouze v důsledku biologického rozkladu, během dnů nebo týdnů, postupný, s výjimkou případů, kdy aklimatizace je náhlá, jak je to indikováno náhlým vymizením zkoušené látky po několika týdnech.

        účinné od 1. 5. 2004Někdy může hrát významnou úlohu fyzikálně-chemická adsorpce; to je indikováno úplným nebo částečným úbytkem přidaného DOC na začátku. K čemu dojde potom, závisí na činitelích jako je míra adsorpce a koncentrace suspendovaných látek v nepoužité odcházející vodě. Obvykle rozdíl mezi koncentrací DOC v kapalinách nad usazeninou u kontroly a ve zkoušce postupně vzrůstá z počáteční nízké hodnoty a tento rozdíl pak, pokud nedojde k aklimatizaci, zůstává na nové hodnotě po zbytek experimentu,.

        účinné od 1. 5. 2004Je-li třeba rozlišit mezi biologickým rozkladem (nebo částečným biologickým rozkladem) a adsorpcí, jsou nezbytné další zkoušky. Je možné je provést řadou způsobů, ale nejpřesvědčivější je použití kapaliny nad usazeninou nebo kalu jako inokula ve zkoušce vybrané ze základního souboru (nejlépe v respirometrické zkoušce).

        účinné od 1. 5. 2004Zkoušené látky, u kterých v této zkoušce dochází k vysokému neadsorpčnímu úbytku DOC, je třeba považovat za potenciálně biologicky rozložitelné. Částečný neadsorpční úbytek ukazuje, že u látky dochází alespoň k určitému biologickému rozkladu.

        účinné od 1. 5. 2004Nízké nebo nulové úbytky DOC mohou být způsobeny inhibicí mikroorganizmů zkoušenou látkou, což se může projevit také lyzí a ztrátou kalu, takže kapalina nad usazeninou je zakalená. Zkoušku je nutné opakovat s nižší koncentrací zkoušené látky.

        účinné od 1. 5. 2004Vyšší citlivosti je možné dosáhnout použitím specifické analytické metody nebo sloučeniny značené 14C. V případě zkoušené látky značené uhlíkem 14C se zachycením 14CO2 potvrdí, že došlo k biologickému rozkladu.

        účinné od 1. 5. 2004Tam, kde jsou výsledky uvedeny také jako primární biologický rozklad, je třeba, pokud je to možné, uvést také vysvětlení změny chemické struktury, která vede ke ztrátě odezvy u mateřské zkoušené látky.

        účinné od 1. 5. 2004Je nutné uvést potvrzení platnosti metody spolu s odezvou zjištěnou u média ve slepé zkoušce.

    1. účinné od 1. 5. 2004XII.4 LITERATURA

      účinné od 1. 5. 2004(1) OECD, Paris, 1981. Test Guideline 302 A, Decision of the Council C(81) 30 final.

    PŘÍLOHA 1

    účinné od 1. 5. 2004

    účinné od 1. 5. 2004Zkouška SCAS: příklad výsledků

    účinné od 1. 5. 2004
    PŘÍLOHA 1 Zkouška SCAS: příklad výsledků
    LátkaCT
    (mg.l-1)    		C1 - Cc
    (mg.l-1)    		Procento biolog.
    rozkladu Dda    		Doba trvání
    zkoušky
    (dny)
    4 -acetylaminobenzen sulfonan17,22,08540
    tetrapropylenbenzen sulfonan17,38,451,440
    4 - nitrofenol16,90,895,340
    diethylenglykol16,50,298,840
    anilin16,91,795,940
    cyklopentantetra-karboxylát17,93,281,1120

    PŘÍLOHA 2

    účinné od 1. 5. 2004

    účinné od 1. 5. 2004Příklad zkušební aparatury

    účinné od 1. 5. 2004Obrázek
  1. účinné od 1. 5. 2004XIII. METODA PRO STANOVENÍ BIOAKUMULACE - PRŮTOKOVÁ ZKOUŠKA NA RYBÁCH – metoda C.13 podle přílohy směrnice Komise 98/73/ES ze dne 18. září 1998, kterou se po dvacáté čtvrté přizpůsobuje technickému pokroku směrnice rady 67/548/EHS o sbližování správních a právních předpisů týkajících se klasifikace, balení a označování nebezpečných látek
    1. účinné od 1. 5. 2004XIII.1 METODA

      účinné od 1. 5. 2004Tato bioakumulační metoda je replikou metody OECD TG 305 (1996).

      1. účinné od 1. 5. 2004XIII.1.1 Úvod

        účinné od 1. 5. 2004V této metodě je popsán postup pro charakterizování potenciálu látek bioakumulovat se v rybách za průtokových podmínek. Ačkoliv jsou průtokové režimy preferovány, semistatické režimy se připouštějí, jsou-li splněna kritéria validace.

        účinné od 1. 5. 2004V metodě jsou dostatečně popsány podrobnosti pro provedení zkoušky, přičemž je poskytnuta dostatečná volnost pro přizpůsobení experimentálního uspořádání podmínkám v jednotlivých laboratořích a různým vlastnostem zkušebních látek. Metoda je nejefektivnější pro stabilní organické chemikálie s hodnotou log Pov od 1,5 do 6,0 (1), ale může být také použita na superlipofilní látky (s hodnotou log Pov > 6,0). Předběžně odhadnutý bioakumulační faktor (BCF), někdy označován jako KB, bude pro takové superlipofilní látky pravděpodobně vyšší než hodnota bioakumulačního faktoru v rovnovážném stavu (BCFss), která je očekávána z laboratorních experimentů. Předběžné odhady pro organické látky s hodnotou log Pov až asi 9,0 lze získat pomocí rovnice Binteina et al (2). Mezi parametry, které charakterizují bioakumulační potenciál, patří rychlostní konstanta příjmu (k1), rychlostní konstanta vylučování (k2) a BCFss.

        účinné od 1. 5. 2004Zkušební látky značení radioizotopy mohou usnadnit analýzu vzorků vody a ryb a mohou být použity v případě, že by měla být provedena identifikace a kvantifikace produktů odbourávání. Měří-li se celkový obsah radioaktivního zůstatku (například spálením nebo solubilizací tkáně), zakládá se hodnota BCF na výchozí sloučenině, všech zadržených metabolitech a také na asimilovaném uhlíku. Hodnoty BCF založené na celkovém obsahu radioaktivního zbytku tedy nemohou být přímo srovnatelné s hodnotou BCF získanou specifickou chemickou analýzou pouze výchozí sloučeniny.

        účinné od 1. 5. 2004V metodách se značením radioaktivními izotopy mohou být pro stanovení výchozí sloučeniny zařazeny purifikační postupy, a je-li to považováno za nezbytné, mohou být charakterizovány hlavní metabolity. Je možné rovněž kombinovat studii metabolismu ryb se studií bioakumulace analýzou a identifikací reziduí v tkáních.

      1. účinné od 1. 5. 2004XIII.1.2 Definice a jednotky

        účinné od 1. 5. 2004Biokoncentrace/Bioakumulace je nárůst koncentrace zkušební látky v organismu (v jeho specifické tkáni) nebo na něm vzhledem ke koncentraci zkušební látky v okolním médiu.

        účinné od 1. 5. 2004Bioakumulační faktor (BCF nebo KB) je koncentrace zkušební látky v rybách nebo na nich nebo v jejich specifikovaných tkáních (Cf v µg/g (ppm)) dělená koncentrací chemikálie v okolním médiu (Cw v µg/ml (ppm)), a to v každém okamžiku fáze příjmu při této zkoušce.

        účinné od 1. 5. 2004Bioakumulační faktor v rovnovážném stavu (BCFSS nebo KB) se po dlouhou dobu výrazně nemění; koncentrace zkušební látky v okolním médiu je po tuto dobu konstantní.

        účinné od 1. 5. 2004Plató nebo rovnovážný stav je stav dosažený tehdy, je-li při grafickém vyjádření křivka časové závislosti koncentrace zkušební látky v rybách (Cf) rovnoběžná s časovou osou a tři po sobě jdoucí analýzy Cf vzorků odebraných v intervalech alespoň dvou dnů se neliší více než o ±20 % a není-li mezi těmito třemi dobami odběru žádný výrazný rozdíl. Analyzují-li se sdružené vzorky, požadují se čtyři po sobě jdoucí analýzy. V případě zkušebních látek, jejichž příjem probíhá pomalu, jsou vhodnější sedmidenní intervaly.

        účinné od 1. 5. 2004Bioakumulační faktory vypočtené přímo z rychlostních konstant kinetiky (k1/k2) se nazývají kinetické koncentrační faktory (BCFk).

        účinné od 1. 5. 2004Rozdělovací koeficient oktanol-voda (Pov) je rovnovážný poměr mezi rozpustností chemikálie v n-oktanolu a ve vodě (metoda A.8) a označuje se také jako Kow. Logaritmus hodnoty Pov se používá jako ukazatel potenciálu chemikálie bioakumulovat se ve vodních organismech.

        účinné od 1. 5. 2004Expozice nebo fáze příjmu je časový úsek, během něhož jsou ryby vystaveny působení zkušební chemikálii.

        účinné od 1. 5. 2004Rychlostní konstanta příjmu (k1) je číselná hodnota definující rychlost nárůstu koncentrace zkušební látky v testovacích rybách nebo na nich (nebo v jejich specifikovaných tkáních), jsou-li ryby této chemikálii vystaveny (k1 se vyjadřuje ve jednotce den-1).

        účinné od 1. 5. 2004Po-expoziční nebo vylučovací fáze je časový úsek po přemístění testovacích ryb z média obsahujícího zkušební látku do média, které tuto látku neobsahuje, během něhož se studuje vylučování látky z testovacích ryb (nebo její čistý úbytek v nich).

        účinné od 1. 5. 2004Rychlostní konstanta vylučování (k2) je číselná hodnota definující rychlost poklesu koncentrace zkušební látky v testovacích rybách (nebo v jejich specifikovaných tkáních) po jejich přemístění z média obsahujícího zkušební látku do média, které tuto látku neobsahuje (k2 se vyjadřuje ve jednotce den-1).

      1. účinné od 1. 5. 2004XIII.1.3 Princip zkušební metody

        účinné od 1. 5. 2004Zkouška má dvě fáze: fázi expozice (příjem) a po-expoziční fázi (vylučování). Během fáze příjmu jsou dvě oddělené skupiny ryb stejného druhu exponovány alespoň dvěma koncentracím zkušební látky. Poté jsou přemístěny do média, které zkušební látku neobsahuje, aby začala fáze vylučování. Fáze vylučování je vždy nezbytná, není-li příjem látky během fáze příjmu nevýznamný (např. je-li BCF menší než 10). Koncentrace zkušební látky v rybách nebo na nich (nebo v jejich specifikovaných tkáních) se sleduje v průběhu obou fází zkoušky. Vedle těchto dvou zkušebních koncentrací se za stejných podmínek, s výjimkou přítomnosti zkušební látky, udržuje kontrolní skupina ryb, aby mohly být na odpovídající kontrolní skupině porovnány možné nepříznivé účinky pozorované při bioakumulačních zkouškách a aby byly získány pozaďové koncentrace zkušební látky.

        účinné od 1. 5. 2004Fáze příjmu tvá 28 dnů, není-li prokázáno, že rovnováhy je dosaženo dříve. Délku fáze příjmu a dobu potřebnou k ustavení rovnovážného stavu lze předpovědět pomocí rovnice v příloze 3. Fáze vylučování poté začne po přemístění ryb do jiné nádrže bez zkušební látky. Je-li to možné, vypočítají se bioakumulační faktory nejlépe jako poměr (BCFss), tj. poměr koncentrace v rybách (Cf) a ve vodě (Cw) ve zřetelném rovnovážném stavu, a jako kinetický bioakumulační faktor (BCFk), tj. poměr rychlostních konstant příjmu (k1) a vylučování (k2) za předpokladu kinetiky prvního řádu. Neřídí-li se zjevně naměřené hodnoty kinetikou prvního řádu, měl by být použit složitější model (příloha 5).

        účinné od 1. 5. 2004Nedojde-li k rovnovážnému stavu do 28 dnů, měla by být fáze příjmu prodloužena do jeho dosažení nebo na 60 dnů, podle toho, co nastane dříve; poté začne fáze vylučování.

        účinné od 1. 5. 2004Rychlostní konstanta příjmu, rychlostní konstanta vylučování (úbytku) (nebo konstanty, jsou-li použity složitější modely), bioakumulační faktor a, je-li to možné, intervaly spolehlivosti každého z těchto parametrů se vypočítají z modelu, který popisuje naměřené koncentrace zkušební látky v rybách a ve vodě. Faktor BCF se vyjadřuje jako funkce celkové živé hmotnosti ryby. Pro zvláštní účely však mohou být použity specifikované tkáně nebo orgány (svalovina, játra), je-li ryba dostatečně velká nebo je-li možné ji rozdělit na jedlý (vykostěný) podíl a nejedlý podíl (vnitřnosti). Vzhledem k tomu, že u mnoha organických látek existuje zřetelný vztah mezi potenciálem bioakumulace a lipofilií, existuje také odpovídající vztah mezi obsahem tuku v testovacích rybách a pozorovanou bioakumulací takové látky. Aby se tedy snížilo kolísání výsledků pro tyto látky s vysokou lipofilií (tj. s log Pov > 3), měla by být bioakumulace vztažena vedle celkové hmotnosti těla také k obsahu tuku.

        účinné od 1. 5. 2004Obsah tuku by měl být stanoven pokud možno na stejném biologickém materiálu, jaký je použit ke stanovení koncentrace zkušební látky.

      1. účinné od 1. 5. 2004XIII.1.4 Informace o zkušební látce
        1. účinné od 1. 5. 2004Před prováděním zkoušek bioakumulace by měly být o zkušební látce známy tyto informace:
          1. účinné od 1. 5. 2004a) rozpustnost ve vodě,
          2. účinné od 1. 5. 2004b) rozdělovací koeficient oktanol-voda Pov (označovaný také jako Kow, stanovený metodou HPLC, viz A.8),
          3. účinné od 1. 5. 2004c) hydrolýza,
          4. účinné od 1. 5. 2004d) fototransformace ve vodě stanovená ozářením slunečním nebo simulovaným slunečním světlem za podmínek zkoušky bioakumulace (3),
          5. účinné od 1. 5. 2004e) povrchové napětí (tj. u látek, u nichž nelze stanovit log Pov),
          6. účinné od 1. 5. 2004f) tlak par,
          7. účinné od 1. 5. 2004g) popřípadě ochota k biologickému odbourávání.

        účinné od 1. 5. 2004Další požadovanou informací je toxicita pro druh ryby, který má být použit, nejlépe asymptotická hodnota LC50 (tj. časově nezávislá). Musí být k dispozici vhodná analytická metoda o známé správnosti, přesnosti a citlivosti pro kvantitativní stanovení zkušební látky ve zkušebních roztocích a v biologickém materiálu a dále podrobnosti o přípravě a uchovávání vzorků. Měly by být také známy meze stanovitelnosti zkušební látky jak ve vodě, tak v rybích tkáních. Je-li použita zkušební látka značená 14C, měla by být známá aktivita nečistot vyjádřená v procentech.

      1. účinné od 1. 5. 2004XIII.1.5 Platnost zkoušky
        1. účinné od 1. 5. 2004Aby zkouška platila, měly by platit následující podmínky:
          1. účinné od 1. 5. 2004— kolísání teploty je menší než ±2 °C,
          2. účinné od 1. 5. 2004— koncentrace rozpuštěného kyslíku neklesne pod 60% nasycení,
          3. účinné od 1. 5. 2004— koncentrace zkušební látky v nádrži je udržována v intervalu ±20 % kolem střední hodnoty naměřených hodnot během fáze příjmu,
          4. účinné od 1. 5. 2004— mortalita nebo jiné nepříznivé účinky/choroby jak u kontrolních, tak u exponovaných ryb je na konci zkoušky menší než 10 %; jestliže je zkouška prodloužena na několik týdnů nebo měsíců, měl by být úhyn nebo jiné nepříznivé účinky v obou skupinách ryb menší než 5 % za měsíc nebo by neměl překročit celkem 30 %.
      1. účinné od 1. 5. 2004c1.6 Referenční sloučeniny

        účinné od 1. 5. 2004Použití referenčních sloučenin o známém bioakumulačním potenciálu je popřípadě užitečné pro kontrolu experimentálního postupu. Zatím nelze ještě doporučit žádné specifické látky.

      1. účinné od 1. 5. 2004XIII.1.7 Popis zkušební metody
        1. účinné od 1. 5. 2004XIII.1.7.1 Přístroje a pomůcky