Platné znění

Vyhláška, kterou se u chemických látek a chemických přípravků stanoví základní metody pro zkoušení fyzikálně-chemických vlastností, výbušných vlastností a vlastností nebezpečných pro životní prostředí

účinné od 1. 5. 2004V případě všech částí zařízení je třeba se důsledně vyhýbat použití materiálů, které mají schopnost rozpouštět, sorbovat nebo vyluhovat a mají nepříznivý účinek na ryby. Lze použít standardní pravoúhlé nebo válcové nádrže vyrobené z inertního materiálu a mající vhodný objem s ohledem na náplň. Použití měkkých trubek z plastu by mělo být minimalizováno. Měly by být použity trubky z teflonu (R), z korozivzdorné oceli a/nebo ze skla. Zkušenosti ukázaly, že pro látky s vysokými absorpčními koeficienty, jako jsou syntetické pyrethroidy, je potřebné silanizované sklo. V těchto případech musí být zařízení po použití zlikvidováno.

  1. účinné od 1. 5. 2004XIII.1.7.2 Voda

    účinné od 1. 5. 2004Ve zkoušce se používá přírodní voda a měla by být získána z nekontaminovaného zdroje stálé kvality. Ředicí voda musí mít kvalitu, která umožní přežití zvoleného druhu ryby po dobu aklimatizace a v průběhu fází zkoušky, aniž by vykazoval abnormální klinický zjev nebo chování. V ideálním případě by mělo být prokázáno, že testovací druh může v ředicí vodě přežít, růst a rozmnožovat se (např. zkouškou s laboratorní kulturou nebo zkouškou toxicity během životního cyklu). Voda by měla být charakterizována alespoň hodnotou pH, tvrdostí, celkovým obsahem nerozpuštěných látek, celkovým obsahem organického uhlíku a podle možnosti také obsahem amoniaku a dusičnanů, alkalitou a v případě mořských druhů salinitou. Všechny parametry, které jsou důležité pro optimální prospívání ryb, jsou známy, v příloze I jsou přesto uvedeny doporučené maximální koncentrace pro řadu parametrů sladkovodní a mořské vody.

    účinné od 1. 5. 2004Voda by měla mít po celou dobu zkoušky stejnou kvalitu. Hodnota pH by měla být v rozmezí 6,0 až 8,5, avšak během zkoušky by se pH nemělo lišit o více než ±0,5. Pro ujištění, že voda nebude mít přílišný vliv na výsledky zkoušky (například tvorbou komplexů se zkušební látkou) nebo nepříznivý vliv na stav obsádky ryb, by měly být odebírány v pravidelných intervalech její vzorky pro analýzu. Stanovení těžkých kovů (např. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni), hlavních aniontů, kationtů (např. Ca, Mg, Na, K, Cl, SO4), pesticidů (např. celkový obsah organofosforových a organochlorových pesticidů), celkový obsah organického uhlíku a suspendovaných látek by měl být proveden každé tři měsíce, je-li kvalita ředicí vody relativně konstantní. Je-li prokázáno, že kvalita vody je konstantní po dobu alespoň jednoho roku, mohou být stanovení méně častá a intervaly lze prodloužit (např. každých šest měsíců).

    účinné od 1. 5. 2004Celkový přirozený obsah částic a rovněž obsah organického uhlíku (TOC) v ředicí vodě by měl být co nejnižší, aby nedošlo k absorpci zkušební látky na organických látkách, což může snížit její biologickou dostupnost (4). Maximální přijatelná hodnota je 5 mg/l pro částice (sušina zachycená filtrem 0,45 µm) a 2 mg/l pro celkový organický uhlík (viz příloha II). Je-li to nezbytné, měla by být voda před použitím filtrována. Příspěvek k obsahu organického uhlíku od testovacích ryb (exkrety) a ze zbytků potravy by měl být co nejmenší. V průběhu zkoušky by neměla koncentrace organického uhlíku ve zkušební nádrži překročit koncentraci organického uhlíku pocházejícího ze zkušební látky a z rozpouštědla, je-li použito, o více než 10 mg/l (±20 %).

  1. účinné od 1. 5. 2004XIII.1.7.3 Zkušební roztoky

    účinné od 1. 5. 2004Zásobní roztok zkušební látky se připraví ve vhodné koncentraci. Zásobní roztok by měl být připraven nejlépe jednoduchým smícháním nebo protřepáním zkušební látky s ředicí vodou. Použití rozpouštědel nebo dispersantů (solubilizačních činidel) se nedoporučuje; může však být v některých případech nezbytné pro vytvoření zásobního roztoku o vhodné koncentraci. Rozpouštědly, která mohou být použita, jsou ethanol, methanol, ethylenglykol-monomethylester, ethylenglykol-dimethylester, dimethylformamid a triethylenglykol. Dispersanty, které mohou být použity, jsou Cremophor RH40, Tween 80, 0,01% methylcelulosa a HCO-40. Snadno biologicky odbouratelná činidla je třeba používat rozvážně, neboť mohou způsobit problémy s růstem bakterií v průtokových zkouškách. Zkušební látka může být značena radioaktivními izotopy a měla by být nejvyšší čistoty (např. > 98%).

    účinné od 1. 5. 2004Pro průtokové zkoušky je pro zajištění koncentrací testované látky nezbytný systém, který plynule dávkuje a ředí zásobní roztok zkušební látky (např. dávkovací čerpadlo, proporcionální dávkovač, saturační systém). Přijatelná je výměna nejlépe pěti objemů v každé zkušební nádrži za den. Upřednostňuje se průtokový režim, není-li to však možné (např. jsou-li testovací organismy nepříznivě ovlivňovány), může být použita semi-statická technika za předpokladu, že jsou splněna kritéria validity. Rychlosti průtoku zásobního roztoku a ředicí vody by měly být kontrolovány jak 48 hodin před zkouškou, tak poté alespoň denně během zkoušky. Tato kontrola by měla zhrnovat stanovení rychlosti průtoku v každé testovací nádrži a měla by zajistit, aby se rychlost průtoku neměnila o více než 20 % v rámci jedné nádrže nebo mezi nádržemi.

  1. účinné od 1. 5. 2004XIII.1.7.4 Výběr druhů

    účinné od 1. 5. 2004Důležitými kritérii pro výběr druhu jsou jeho dostupnost, možnost získat jej ve vyhovující velikosti a jeho bezproblémové udržování v laboratoři. Dalšími kritérii pro výběr druhu ryb jsou jeho rekreační, komerční a ekologický význam a rovněž srovnatelná citlivost, úspěšné dřívější použití atd. Doporučené druhy jsou uvedeny v příloze II. Mohou být použity jiné druhy, avšak zkušební postup musí být upraven, aby byly vytvořeny vhodné zkušební podmínky. V takovém případě by měly být uvedeny důvody pro výběr druhu a experimentální podmínky.

  1. účinné od 1. 5. 2004XIII.1.7.5 Chov ryb

    účinné od 1. 5. 2004Obsádka ryb se nechá aklimatizovat alespoň dva týdny při zkušební teplotě a krmí se odpovídající potravou stejného typu jako v průběhu zkoušky.

    1. účinné od 1. 5. 2004Po 48 hodinách aklimatizace se zaznamená úhyn a použijí se následující kritéria:
      1. účinné od 1. 5. 2004— úhyn vyšší než 10 % populace za sedm dnů: vyměnit celou obsádku;
      2. účinné od 1. 5. 2004— úhyn 5 až 10 % populace za sedm dnů: nechat aklimatizovat dalších sedm dnů;
      3. účinné od 1. 5. 2004— úhyn nižší než 5 % populace za sedm dnů: násada se přijímá; dojde li během dalších sedmi dnů k úhynu vyššímu než 5 %, celá násada se vymění.

    účinné od 1. 5. 2004Zajistí se, aby ryby použité pro zkoušku nevykazovaly pozorovatelné nemoci a abnormality. Všechny nemocné ryby se vymění. Dva týdny před zkouškou nebo v průběhu zkoušky nesmí být léčeny nemoci u ryb.

  1. účinné od 1. 5. 2004XIII.1.8 Provedení zkoušky
    1. účinné od 1. 5. 2004XIII.1.8.1 Předběžná zkouška

      účinné od 1. 5. 2004Může být užitečné provést předběžný experiment s cílem optimalizovat zkušební podmínky konečné zkoušky, např. výběr koncentrace (koncentrací) zkušební látky, délka fáze příjmu a fáze vylučování.

    1. účinné od 1. 5. 2004XIII.1.8.2 Délka fáze příjmu

      účinné od 1. 5. 2004Předpověď délky fáze příjmu lze získat z praktických zkušeností (např. z dřívější studie nebo z akumulace podobné chemikálie) nebo z určitých empirických vztahů využívajících znalosti buď rozpustnosti ve vodě, nebo rozdělovacího koeficientu oktanol-voda pro zkušební látku (viz příloha 3).

      účinné od 1. 5. 2004Fáze příjmu tvá 28 dnů, není-li prokázáno, že rovnováhy je dosaženo dříve. Nedojde-li k rovnovážnému stavu do 28 dnů, měla by být fáze příjmu prodloužena do jeho dosažení, přičemž se provádějí další měření, nebo na 60 dnů, podle toho, co nastane dříve.

      1. účinné od 1. 5. 2004XIII.1.8.2.2 Délka fáze vylučování

        účinné od 1. 5. 2004Doba odpovídající polovině délky fáze příjmu je obvykle dostatečná k tomu, aby došlo k přiměřenému (např. 95%) snížení obsahu látky v organismu (vysvětlení odhadu viz příloha 3). Jestliže doba nezbytná pro dosažení 95% úbytku je neúčelně dlouhá, překračuje například dvakrát normální délku fáze příjmu (tj. více než 56 dnů), může být použita kratší doba (tj. dokud není koncentrace zkušební látky menší než 10 % koncentrace v rovnovážném stavu). V případě látek se složitějším charakterem příjmu a vylučování, než jaký je popsán modelem ryby s jedním kompartmentem řídícím se kinetikou prvního řádu, však delší fáze vylučování umožní stanovit rychlostní konstanty úbytku. Délka fáze však může být určena dobou, po kterou zůstává koncentrace zkušební látky v rybách nad mezí detekce analytické metody.

      1. účinné od 1. 5. 2004XIII.1.8.2.3 Počet testovacích ryb

        účinné od 1. 5. 2004Počet ryb na jednu zkušební koncentraci se zvolí tak, aby pro každý odběr byly k dispozici čtyři ryby na jeden vzorek. Je-li požadována větší statická síla, bude na vzorek nezbytných více ryb.

        účinné od 1. 5. 2004Použijí-li se pohlavně dospělé ryby, uvede se, zda byly v experimentu použity ryby samičího nebo samčího pohlaví (nebo – uvede se pohlaví ryb použitých v experimentu). V případě použití obou pohlaví společně by mělo být před započetím expozice prokázáno, že rozdíl v obsahu tuku mezi oběma pohlavími není významný; oddělení samců a samic může být nezbytné.

        účinné od 1. 5. 2004V každé zkoušce se vyberou ryby podobné hmotnosti, tak aby hmotnost nejmenší z nich nebyla nižší než dvě třetiny hmotnosti největší ryby. Všechny by měly být stejného stáří a měly by pocházet ze stejného zdroje. Vzhledem k tomu, že se jeví, že stáří a hmotnost ryby mají často významný vliv na hodnoty BCF (1), musí být tyto podrobnosti přesně zaznamenány. Doporučuje se zvážit před zkouškou dílčí vzorek obsádky ryb s cílem odhadnout střední hmotnost.

      1. účinné od 1. 5. 2004XIII.1.8.2.4 Násada

        účinné od 1. 5. 2004Volí se vysoký poměr množství vody k množství ryb, aby se minimalizovalo snížení koncentrace Cw způsobené přidáním ryb na začátku zkoušky a také proto, aby nedošlo k poklesu koncentrace rozpuštěného kyslíku. Je důležité, aby rychlost nasazování byla přiměřená použitému druh. V každém případě se obvykle doporučuje rychlost nasazování 0,1 až 1,0 g ryb (živá hmotnost) na litr vody za den. Vysoká rychlost nasazování může být zvolena, je-li prokázáno, že požadovaná koncentrace zkušební látky může být udržována v mezích ±20 % a že koncentrace rozpuštěného kyslíku neklesne pod 60% nasycení.

        účinné od 1. 5. 2004Při volbě režimu nasazování má být přihlédnuto k obvyklému přirozenému prostředí ryb. Například ryby žijící u dna mohou vyžadovat při stejném obejmu vody větší plochu dna než pelagické druhy ryb.

      1. účinné od 1. 5. 2004XIII.1.8.2.5 Krmení

        účinné od 1. 5. 2004Během aklimatizace a po dobu zkoušky se ryby krmí vhodnou potravou se známým obsahem tuku a celkových bílkovin podávanou v množství dostatečném pro udržení zdravého stavu a pro udržení tělesné hmotnosti. Ryby se krmí denně v průběhu aklimatizace a po dobu zkoušky množstvím přibližně 1 až 2 % tělesné hmotnosti; tím se udrží v průběhu zkoušky obsah tuku u většiny druhů ryb na relativně konstantní úrovni. Množství krmiva by mělo být například jednou týdně nově přepočítáno, aby byla udržena odpovídající tělesná hmotnost a obsah tuku. Hmotnost ryb v každé nádrži může být pro tento výpočet odhadnuta z hmotnosti ryb naposledy odebraných z dotyčné nádrže. Ryby, které zůstaly v nádrži, se neváží.

        účinné od 1. 5. 2004Nezkrmená potrava a exkrety se odstraňují z nádrží denně krátce po krmení (30 minut až jednu hodinu). Nádrže se udržují v celém průběhu zkoušky v co nejvyšší čistotě, aby byla koncentrace organických látek co nejnižší, neboť přítomnost organického uhlíku může snižovat biologickou dostupnost zkušební látky (1).

        účinné od 1. 5. 2004Poněvadž mnoho krmiv pochází z rybí moučky, mělo by být krmivo analyzováno na přítomnost zkušební látky. Je rovněž žádoucí, aby bylo krmivo analyzováno na přítomnost pesticidů a těžkých kovů.

      1. účinné od 1. 5. 2004XIII.1.8.2.6 Světlo a teplota

        účinné od 1. 5. 2004Fotoperioda je obvykle 12 až 16 hodin a teplota (±2 °C) by měla odpovídat testovacímu druhu (viz příloha 2). Druh a charakteristiky osvětlení by měly být známy. Měla by být věnována pozornost možné fototransformaci zkušební látky za světelných podmínek studie. Měly by být použito vhodné osvětlení, aby nedošlo k expozici ryb fotoproduktům nevyskytujícím se v přírodě. V některých případech může být vhodné použít filtr pro odfiltrování UV záření s vlnovou délkou kratší než 290 nm.

      1. účinné od 1. 5. 2004XIII.1.8.2.7 Zkušební koncentrace

        účinné od 1. 5. 2004Ryby jsou vystaveny za průtokových podmínek alespoň dvěma koncentracím zkušební látky ve vodě. Vyšší (nejvyšší) koncentrace zkušební látky se obvykle volí tak, aby byla na úrovni 1 % její asymptotické hodnoty akutní LC50 a aby byla desetkrát vyšší než je mez detekce této látky ve vodě při použití analytické metody. Nejvyšší zkušební koncentraci lze také stanovit dělením akutní 96hodinové LC50 příslušným poměrem akutní/chronická letální dávka (u některých chemikálií může koeficient ležet mezi 3 a 100). Je-li to možné, volí se druhá (další) koncentrace tak, aby se lišila od výše uvedené faktorem 10. Není-li to možné z důvodu kritéria 1 % z LC50 nebo z důvodu kritéria meze detekce, může být použit nižší faktor než 10 nebo by mělo být zváženo použití zkušební látky značené 14C. Žádná koncentrace by neměla překročit rozpustnost látky.

        účinné od 1. 5. 2004Je-li použito rozpouštěcí činidlo, neměla by být jeho koncentrace vyšší než 0,1 ml/l a mělo by být stejné ve všech zkušebních nádržích. Jeho příspěvek, společně s příspěvkem zkušební látky, k celkovému obsahu organického uhlíku ve zkušební vodě by měl být znám. Avšak maximální snaha by měla být vynaložena k zamezení použití takovýchto látek.

      1. účinné od 1. 5. 2004XIII.1.8.2.8 Kontroly

        účinné od 1. 5. 2004Vedle zkušební série by měla být založena kontrola sestávající z ředicí vody, která popřípadě obsahuje rozpouštěcí činidlo, pokud bylo zjištěno, že toto činidlo nemá žádné účinky na ryby. Není-li tomu tak, měly by být založeny obě kontroly.

    1. účinné od 1. 5. 2004XIII.1.8.3 Četnost měření kvality vody

      účinné od 1. 5. 2004V průběhu zkoušky by měly být v každé nádrži měřeny množství rozpuštěného kyslíku, TOC, pH a teplota. Celková tvrdost a popřípadě salinita by měly být měřeny v kontrolách a v jedné nádrži s vyšší (nejvyšší) koncentrací. Množství rozpuštěného kyslíku a popřípadě salinita by měly být měřeny alespoň třikrát – na začátku, přibližně uprostřed a na konci fáze příjmu – a jednou týdně ve fázi vylučování. Hodnota TOC by měla být měřena na začátku zkoušky (24 hodin a 48 hodin před započetím fáze příjmu) před nasazením ryb a alespoň jednou týdně jak v průběhu fáze příjmu, tak v průběhu fáze vylučování. Teplota by měla být měřena denně, pH na začátku a na konci každé fáze a tvrdost vody jednou v průběhu zkoušky. Teplota by měla být měřena nejlépe nepřetržitě alespoň v jedné nádrži.

    1. účinné od 1. 5. 2004XIII.1.8.4 Odběr vzorků a analýza ryb a vody
      1. účinné od 1. 5. 2004XIII.1.8.4.1 Časový rozvrh odebírání vzorků ryb a vody

        účinné od 1. 5. 2004Voda ze zkušebních nádrží se pro stanovení koncentrace zkušební látky odebírá před nasazením ryb a během fáze příjmu i během fáze vylučování. Voda se odebírá alespoň ve stejnou dobu jako ryby a před krmením. Během fáze příjmu se stanovují koncentrace zkušební látky, aby se ověřilo, že jsou v souladu s kritérii validity.

        účinné od 1. 5. 2004Ryby se odebírají alespoň pětkrát během fáze příjmu a alespoň čtyřikrát během fáze vylučování. Vzhledem k tomu, že v mnoha případech bude obtížné s tímto počtem vzorků vypočítat rozumně přesný odhad hodnoty BCF, zejména jde-li o jinou než jednoduchou kinetiku prvního řádu, může být účelné odebírat vzorky v obou fázích častěji (viz příloha 4). Dodatečné vzorky se uloží a analyzují až poté, co se výsledky prvního kola analýz ukáží jako nedostatečné pro výpočet hodnoty BCF o požadované přesnosti.

        účinné od 1. 5. 2004Příklad přijatelného časového rozvrhu odběru vzorků je uveden v příloze 4. Jiné plány lze snadno odvodit pomocí jiné předpokládané hodnoty Pov, jejíž pomocí se vypočítá expoziční doba pro 95% příjem.

        účinné od 1. 5. 2004V odběru vzorků se pokračuje během fáze příjmu do ustavení rovnovážného stavu nebo po dobu 28 dnů, podle toho, co nastane dříve. Není-li rovnovážného stavu dosaženo do 28 dnů, v odběru se vzorků se pokračuje do ustavení rovnovážného stavu nebo do 60 dnů, podle toho, co nastane dříve. Před zahájením fáze vylučování se ryby přemístí do čistých nádrží.

      1. účinné od 1. 5. 2004XIII.1.8.4.2 Odběr vzorků a příprava vzorků

        účinné od 1. 5. 2004Vzorky vody pro analýzy se odebírají například odsáváním potrubím z inertního materiálu ze středu zkušební nádrže. Vzhledem k tomu, že se biologicky nedostupná frakce zkušební látky nedá často oddělit od biologicky dostupné frakce ani filtrací, ani odstředěním (zejména v případě superlipofilních chemikálií, tj. chemikálií s log Pov > 5) (1), (5), nemohou být vzorky takto zpracovány. Namísto toho je třeba učinit opatření pro to, aby nádrže byly udržovány co nejčistší, a obsah organického uhlíku by měl být pravidelně monitorován jak během fáze příjmu, tak během fáze vylučování.

        účinné od 1. 5. 2004Při každém odběru se z nádrží odebere vhodný počet ryb (obvykle alespoň čtyři). Odebrané ryby se rychle omyjí pod tekoucí vodu, osuší se „do sucha“, ihned se usmrtí nejvhodnější humánní metodou a zváží se.

        účinné od 1. 5. 2004Ryby a voda se pokud možno analyzují ihned po odběru s cílem předejít degradaci nebo ztrátám a vypočítat přibližné rychlosti příjmu a vylučování ještě v průběhu zkoušky. Okamžitá analýza rovněž zabrání zpoždění ve stanovení plató při jeho dosažení.

        účinné od 1. 5. 2004Nedojde-li k okamžité analýze, vzorky se vhodným způsobem uchovají. Před zahájením studie je třeba zjistit informace o řádné metodě uchovávání vzorků s ohledem na dotyčnou zkušební látku – například hluboké zmrazení, udržování při 4 °C, délka uchovávání, vyluhování atd.

      1. účinné od 1. 5. 2004XIII.1.8.4.3 Kvalita analytické metody

        účinné od 1. 5. 2004Vzhledem k tomu, že celý postup je určen hlavně správností, přesností a citlivostí analytické metody použité pro analýzu zkušební látky, je třeba experimentálně kontrolovat, že přesnost a reprodukovatelnost chemické analýzy a rovněž výtěžek zkušební látky jak z vody, tak ze vzorů ryb jsou pro dotyčnou analytickou metodu dostatečné. Kontroluje se také, zda se zkušební látka nevyskytuje v použité ředicí vodě.

        účinné od 1. 5. 2004Hodnoty Cw a Cf se podle potřeby korigují podle výtěžku a pozaďových hodnot kontrol. Vzorky ryb a vody se zpracovávají tak, aby se minimalizovala kontaminace a ztráty (např. v důsledku absorpce odběrovým zařízením).

      1. účinné od 1. 5. 2004XIII.1.8.4.4 Analýza vzorků ryb

        účinné od 1. 5. 2004Je-li ve zkoušce použit materiál značený radioizotopy, je možné provést analýzu s celkovou aktivitou (tj. s výchozí látkou i s metabolity) nebo lze provést separaci, tak aby mohla být výchozí látka analyzována samostatně. V rovnovážném stavu nebo na konci fáze příjmu, podle toho, k čemu dojde dříve, mohou být stanoveny také hlavní metabolity. Je-li hodnota BCF vypočtená z celkové aktivity reziduí ≥ 1 000 %, může být účelné, a pro určité kategorie chemikálií, např. pesticidy, je to důrazně doporučeno, identifikovat a kvantifikovat produkty odbourávání představující ≥ 10 % celkového množství reziduí v tkáních ryb v rovnovážném stavu. Jsou-li produkty odbourávání představující ≥ 10 % celkové aktivity reziduí identifikovány a kvantifikovány, doporučuje se také identifikovat a kvantifikovat produkty odbourávání ve vodě.

        účinné od 1. 5. 2004Koncentrace zkušební látky by měla být obvykle stanovena pro každou jednotlivou zváženou rybu. Není-li to možné, mohou být vzorky při každém odběru sdružovány, avšak sdružování omezuje statistické postupy, které lze na data aplikovat. Pokud na specifickém statistickém postupu a na síle záleží, měl by být ve zkoušce nasazen dostatečný počet ryb vyhovující požadovanému sdružování a požadované síle (6), (7).

        účinné od 1. 5. 2004Hodnota BCF by měla být vyjádřena jako funkce celkové živé hmotnosti a v případě lipofilních látek také jako funkce obsahu tuku. Obsah tuku v rybách se stanoví pokud možno při každém odběru. Pro stanovení obsahu tuku by měla být použita vhodná metoda (odkazy 8 a 2 v příloze 3). Jako standardní metoda může být doporučena technika extrakce do chloroformu/methanolu (9). Různé metody nedávají stejné hodnoty (10), je proto důležité uvést podrobnosti o použité metodě. Je-li to možné, měla by být analýza tuků provedena na extraktu připravenému pro analýzu zkušební látky, neboť tuky musí být často před chromatografickou analýzou odstraněny. Obsah tuku v rybách (v mg/kg živé hmotnosti) na konci experimentu by se neměl lišit od obsahu na počátku od více než ±25 %. Měl by být uveden také podíl pevných látek v tkáních, aby bylo možné provést přepočet koncentrace tuků z živé hmotnosti na hmotnost sušiny.

  1. účinné od 1. 5. 2004XIII.2 DATA
    1. účinné od 1. 5. 2004XIII.2.1 Zpracování výsledků

      účinné od 1. 5. 2004Křivka příjmu zkušební látky se sestrojí vynesením její koncentrace v rybách nebo na nich (nebo ve specifikovaných tkáních) v průběhu fáze příjmu proti času v lineárním měřítku. Dosáhla-li křivka plató, tj. začíná být rovnoběžná s časovou osou, vypočítá se hodnota BCFss v rovnovážném stavu z poměru

      účinné od 1. 5. 2004

      účinné od 1. 5. 2004Není-li rovnovážného stavu dosaženo, je možné vypočítat hodnotu BCFss s dostatečnou přesností pro posouzení rizika z „rovnovážného stavu v 80% (1,6/k2) nebo 95% (3,0/k2) rovnováze. Také koncentrační faktor BCFk se stanoví jako poměr dvou rychlostních konstant prvního řádu k1/k2. Rychlostní konstanta vylučování se obvykle stanoví z křivky vylučování (tj. grafu poklesu koncentrace zkušební látky v rybách v čase). Rychlostní konstanta příjmu se poté vypočte pomocí hodnoty k2 a hodnoty Cf odvozené z křivky příjmu (viz také příloha 5). Upřednostňovanou metodou pro získání hodnoty BCFk a rychlostních konstant k1 a k2 je metoda nelineárního odhadu parametrů s využitím počítače (11). K výpočtu hodnot k1 a k2 lze jinak použít grafické metody. Není-li zjevně křivka vylučování křivkou prvního řádu, měly by být použity složitější modely (viz odkazy v příloze 3) a měl by být konzultován biostatistik.

    1. účinné od 1. 5. 2004XIII.2.2 Interpretace výsledků

      účinné od 1. 5. 2004Výsledky by měly být interpretovány opatrně v případě, že naměřené koncentrace zkušebních roztoků se pohybují na úrovních blízkých mezi detekce analytické metody.

      účinné od 1. 5. 2004Jasně vymezené křivky příjmu a úbytku jsou ukazatelem dobré kvality dat o bioakumulaci. Rozdíl konstant příjmu/vylučování pro dvě zkušební koncentrace by měl být nižší než 20 %. Pozorované významné rozdíly v rychlostech příjmu/vylučování mezi dvěma použitými zkušebními koncentracemi by měly být zaznamenány a mělo by být uvedeno jejich možné vysvětlení. Interval spolehlivosti hodnot BCF u dobře navržených studií se všeobecně blíží ±20 %.

  1. účinné od 1. 5. 2004XIII.3 ZPRÁVY

    účinné od 1. 5. 2004Protokol o zkoušce musí obsahovat následující informace:

    1. účinné od 1. 5. 2004XIII.3.1 Zkušební látka
      1. účinné od 1. 5. 2004— fyzikální povaha a popřípadě fyzikálně-chemické vlastnosti,
      2. účinné od 1. 5. 2004— chemické identifikační údaje (včetně obsahu organického uhlíku, je-li to třeba),
      3. účinné od 1. 5. 2004— v případě značení radioaktivními izotopy jejich přesná poloha a aktivita příměsí, vyjádřená v procentech.
    1. účinné od 1. 5. 2004XIII.3.2 Testovací druh
      1. účinné od 1. 5. 2004— vědecký název, kmen, zdroj, případné předběžné ošetření, aklimatizace, stáří, rozpětí velikostí atd.
    1. účinné od 1. 5. 2004XIII.3.3 Zkušební podmínky
      1. účinné od 1. 5. 2004— použitý zkušební postup (např. průtokový nebo semistatický),
      2. účinné od 1. 5. 2004— typ a charakteristiky použitého osvětlení a fotoperioda (fotoperiody),
      3. účinné od 1. 5. 2004— uspořádání zkoušky (např. počet a velikost zkušebních nádrží, rychlost výměny objemu vody, počet opakování, počet ryb v jednom opakování, počet zkušeních koncentrací, délka fází příjmu a vylučování, četnost odběru vzorků ryb a vzorků vody),
      4. účinné od 1. 5. 2004— metoda přípravy zásobních roztoků a častost jejich obnovování (je-li použito rozpouštěcí činidlo,musí být uvedena jeho koncentrace a jeho příspěvek k obsahu organického uhlíku ve vodě),
      5. účinné od 1. 5. 2004— nominální zkušební koncentrace, střední hodnoty naměřených koncentrací ve zkušebních nádržích, jejich směrodatné odchylky a metody jejich stanovení,
      6. účinné od 1. 5. 2004— zdroj ředicí vody, popis jakékoliv předchozí úpravy, výsledky jakéhokoliv prokazování schopnosti zkušebních ryb žít v této vodě a charakteristiky vody: hodnota pH, tvrdost, teplota, koncentrace rozpuštěného kyslíku, úroveň zbytkového chloru (je-li měřena), obsah celkového organického uhlíku, obsah suspendovaných látek, (popřípadě) salinita zkušebního média a výsledky jakýchkoliv jiných provedených měření,
      7. účinné od 1. 5. 2004— kvalita vody ve zkušebních nádržích, hodnota pH, tvrdost vody, obsah TOC, teplota a koncentrace rozpuštěného kyslíku,
      8. účinné od 1. 5. 2004— podrobné informace o krmení (například typ krmiva, zdroj, složení – alespoň pokud možno obsah tuku a bílkovin, podávané množství a četnost),
      9. účinné od 1. 5. 2004— informace o zpracování vzorků ryb a vody, včetně podrobností o přípravě, uchovávání, o extrakci a analytických postupech (a přesnosti), pokud jde o zkušební látku a obsah tuku (je-li měřen).
    1. účinné od 1. 5. 2004XIII.3.4 Výsledky
      1. účinné od 1. 5. 2004— výsledky jakýchkoliv provedených předběžných studií,
      2. účinné od 1. 5. 2004— úhyn kontrolních ryb a ryb v každé expoziční nádrži a jakékoliv pozorované neobvyklé chování,
      3. účinné od 1. 5. 2004— obsah tuku v rybách (je-li stanoven při zkoušce),
      4. účinné od 1. 5. 2004— křivky (včetně všech naměřených dat) příjmu a vylučování zkušební chemikálie rybami, doba dosažení rovnovážného stavu,
      5. účinné od 1. 5. 2004— hodnoty Cf a Cw (popřípadě se směrodatnými odchylkami a rozpětím) pro všechny odběry (hodnota Cf se vyjadřuje v µg/g živé hmotnosti (ppm) celého těla nebo specifikované tkáně, např. tuku, a Cw se vyjadřuje v µg/ml (ppm)); hodnoty Cw pro kontroly (měly by být uvedeny také hodnoty pozadí),
      6. účinné od 1. 5. 2004— bioakumulační faktor v rovnovážném stavu (BCFss) a/nebo kinetický koncentrační faktor (BCFk) a popřípadě 95% intervaly spolehlivosti pro rychlostní konstanty příjmu a vylučování (úbytku) (vše vztaženo na celý organismus a na celkový obsah tuku v rybě, je-li stanoven, nebo na její specifikovanou tkáň), intervaly spolehlivosti a směrodatné odchylky (jsou-li k dispozici) a metody výpočtu/analýzy dat pro každou použitou koncentraci zkušební látky,
      7. účinné od 1. 5. 2004— v případě použití látek značených radioaktivními izotopy a je-li to nutné, musí být uvedena akumulace jakýchkoliv detekovaných metabolitů,
      8. účinné od 1. 5. 2004— všechny zvláštnosti zkoušky, všechny odchylky od těchto postupů a ostatní relevantní informace.

      účinné od 1. 5. 2004Všem výsledkům typu „nedetekováno při uvedené mezi detekce“ by mělo být předcházeno předběžným odzkoušením metod a uspořádání experimentu, neboť takové výsledky nelze použít pro výpočet rychlostních konstant.

  1. účinné od 1. 5. 2004XIII.4 LITERATURA

    účinné od 1. 5. 2004(1) Connell D.W. (1988). Bioaccumulation behaviour of persistent chemicals with aquatic organisms. Rev. Environ. Contam. Toxicol. 102, pp. 117-156.

    účinné od 1. 5. 2004(2) Bintein S., Devillers J., Karcher W. (1993). Non-linear dependence of fish bioconcentration on n-octanol/water partition coefficient. SAR and QSAR in Environmental Research, 1, pp. 29-390.

    účinné od 1. 5. 2004(3) OECD, Paris (1996). Direct phototransformation of chemicals in water. Environmental Health and Safety Guidance Document Series on Testing and Assessment of Chemicals. No 3.

    účinné od 1. 5. 2004(4) Kristensen P. (1991). Bioconcentration in fish: comparison of bioconcentration factors derived from OECD and ASTM testing methods; influence of particulate organic matter to the bioavailability of chemicals. Water Quality Institute, Denmark.

    účinné od 1. 5. 2004(5) US EPA 822-R-94-002 (1994) Great Lake Water Quality Initiative Technical Support Document for the Procedure to Determine Bioaccumulation Factors. July 1994.

    účinné od 1. 5. 2004(6) US FDA (Food and Drug Administration) Revision. Pesticide analytical manual, 1, 5600 Fisher's Lane, Rockville, MD 20852, July 1975.

    účinné od 1. 5. 2004(7) US EPA (1974). Section 5, A(1). Analysis of Human or animal Adipose Tissue, in Analysis of Pesticide Residues in Human and Environmental Samples, Thompson J. F. (ed.) Research Triangle Park, N.C. 27711.

    účinné od 1. 5. 2004(8) Compaan H. (1980) in „The determination of the possible effects of chemicals and wastes on the aquatic environment: degradation, toxicity, bioaccumulation“, Ch. 2.3, Part II. Government Publishing Office, the Hague, Netherlands.

    účinné od 1. 5. 2004(9) Gardner et al, (1995). Limn. & Oceanogr. 30, pp. 1099-1105.

    účinné od 1. 5. 2004(10) Randall R. C., Lee H., Ozretich R. J., Lake J. L., Pruell R. J. (1991). Evaluation of selected lipid methods for normalising pollutant bioaccumulation. Envir. Toxicol. Chem. 10, pp 1431-1436.

    účinné od 1. 5. 2004(11) CEC, Bioconcentration of chemical substances in fish: the flow-through method - Ring Test Programme, 1984 to 1985. Final report March 1987. Authors: P. Kristensen, N. Nyholm.

    účinné od 1. 5. 2004(12) ASTM E-1022-84 (Reapproved 1988). Standard Practice for conducting Bioconcentration Tests with Fishes and Saltwater Bivalve Molluscs.

PŘÍLOHA 1

účinné od 1. 5. 2004

účinné od 1. 5. 2004Chemické charakteristiky přijatelné ředicí vody

účinné od 1. 5. 2004
PŘÍLOHA 1 Chemické charakteristiky přijatelné ředicí vody
LátkaKoncentrační limit
1Nerozpuštěné látky5 mg/l
2Celkový obsah organického uhlíku2 mg/l
3Neionizovaný amoniak1 µg/l
4Zbytkový chlor10 µg/l
5Celkové organofosforové pesticidy50 ng/l
6Celkové organochlorové pesticidy a polychlorované bifenyly50 ng/l
7Celkový organický chlor25 ng/l
8Hliník1 µg/l
9Arsen1 µg/l
10Chrom1 µg/l
11Kobalt1 µg/l
12Měď1 µg/l
13Železo1 µg/l
14Olovo1 µg/l
15Nikl1 µg/l
16Zinek1 µg/l
17Kadmium100 ng/l
18Rtuť100 ng/l
19Stříbro100 ng/l

PŘÍLOHA 2

účinné od 1. 5. 2004

účinné od 1. 5. 2004Doporučené druhy ryb pro zkoušení

účinné od 1. 5. 2004
PŘÍLOHA 2 Doporučené druhy ryb pro zkoušení
Doporučený druhDoporučené
rozpětí zkušební
teploty
(°C)		Doporučená celková
délka těla
testovacích jedinců
(cm)
1Danio rerio1 (Teleostei, Cyprinidae)
(Hamilton-Buchanan), danio pruhované		20 - 253,0 ± 0,5
2Pimephales promelas (Teleostei, Cyprinidae)
(Rafinesque), střevle		20 - 255,0 ± 2,0
3Cyprinus carpio (Teleostei, Cyprinidae)
(Linnaeus), kapr obecný		20 - 255,0 ± 3,0
4Oryzias latipes (Teleostei, Poeciliidae)
(Temminck and Schlegel), halančík japonský		20 - 254,0 ± 1,0
5Poecilia reticulata (Teleostei, Poeciliidae)
(Peters), živorodka duhová		20 - 253,0 ± 1,0
6Lepomis macrochirus (Teleostei, Centrarchidae)
(Rafinesque), slunečnice		20 - 255,0 ± 2,0
7Oncorhynchus mykiss (Teleostei, Salmonidae)
(Walbaum), pstruh duhový		13 - 178,0 ± 4,0
8Gasterosteus aculeatus (Teleostei Gasterosteidae)
(Linnaeus), koljuška tříostná		18-203,0 ± 1,0
  • účinné od 1. 5. 20041 Meyer A., Orti G. (1993) Proc. Royal Society of London, Series B., Vol. 252, p. 231.
    1. účinné od 1. 5. 2004V různých zemích byly použity různé druhy estuarinních a mořských druhů, například:
      účinné od 1. 5. 2004
      PŘÍLOHA 2 Doporučené druhy ryb pro zkoušení
      ryba z čeledi Scienidae (Smuhovití)Leiostomus xanthurus
      halančíkCyprinodon variegatus
      ryba z čeledi Argentinidae (Stříbronicovití)Menidia beryllina
      ryba z čeledi Enbiotocidae (Příbojkovití)Cymatogaster aggregata
      platýz z čeledi PleuronectidaeParophrys vertulus
      vranka z čeledi CottidaeLeptocottus armatus
      koljuška tříostnáGasterosteus aculeeatus
      mořčák z čeledi MoronidaeDicentracus labrax
      ouklej obecnáAlburnus alburnus

    účinné od 1. 5. 2004Dostupnost ryb

    účinné od 1. 5. 2004Sladkovodní ryby uvedené v seznamu se snadno chovají a/nebo jsou dobře dostupné po celý rok, zatímco dostupnost mořských nebo estuarijních ryb je omezena na určité země. Lze je množit a chovat buď v rybích farmách, nebo v laboratoři za kontrolovaných zdravotních a parazitologických podmínek tak, aby ryby byly zdravé a byly známého původu. Tyto ryby jsou dostupné v mnoha částech světa.

    PŘÍLOHA 3

    účinné od 1. 5. 2004

    účinné od 1. 5. 2004Předpověď délky fáze příjmu a fáze vylučování

    1. účinné od 1. 5. 20041. Předpověď délky fáze příjmu

      účinné od 1. 5. 2004Před provedením zkoušky lze získat odhad hodnoty k2 a odtud lze získat dobu nezbytnou pro dosažení určitého stupně rovnovážného stavu (v procentech) z empirických vztahů mezi k2 a rozdělovacím koeficientem n-oktanol/voda (Pov) nebo mezi k2 a rozpustností ve vodě (s).

      1. účinné od 1. 5. 2004Odhad hodnoty k2 (den-1) lze získat například z následujícího empirického vztahu (1):
        účinné od 1. 5. 2004
        PŘÍLOHA 3 Předpověď délky fáze příjmu a fáze vylučování
        (1)

      účinné od 1. 5. 2004Další vztahy viz odkaz 2.

      1. účinné od 1. 5. 2004Není-li rozdělovací koeficient (Pov) znám, lze jej odhadnout (3) ze znalosti rozpustnosti látky ve vodě (s) pomocí vztahu:
        účinné od 1. 5. 2004
        PŘÍLOHA 3 Předpověď délky fáze příjmu a fáze vylučování
        (2)
        1. účinné od 1. 5. 2004kde s = rozpustnost (v mol/l): (n = 36).

      účinné od 1. 5. 2004Tyto vztahy platí pouze pro chemikálie s hodnotou log Pov od 2 do 6,5 (4).

      1. účinné od 1. 5. 2004Dobu, za kterou dojde k dosažení určitého stupně rovnovážného stavu vyjádřeného v procentech, lze získat pomocí odhadu hodnoty k2, z obecné rovnice kinetiky popisující příjem a vylučování (kinetika prvního řádu):

        účinné od 1. 5. 2004

      1. účinné od 1. 5. 2004nebo je-li Cw konstanta:
        účinné od 1. 5. 2004
        PŘÍLOHA 3 Předpověď délky fáze příjmu a fáze vylučování
        (3)

      účinné od 1. 5. 2004Blíží-li se rovnovážný stav (t→∞), může být rovnice 3 zjednodušena (5), (6) na

      účinné od 1. 5. 2004

      účinné od 1. 5. 2004Pak k1/k2· Cw přiblížením koncentrace v rybách v „rovnovážném stavu“ (Cf,s).

      1. účinné od 1. 5. 2004Rovnice 3 může být přepsána na rovnici:
        účinné od 1. 5. 2004
        PŘÍLOHA 3 Předpověď délky fáze příjmu a fáze vylučování
        (4)

      účinné od 1. 5. 2004Použitím rovnice 4 lze předpovědět dobu potřebnou k dosažení určitého stupně rovnovážného stavu vyjádřeného v procentech, je-li hodnota k2 předem odhadnuta z rovnice 1 nebo 2.

      účinné od 1. 5. 2004Je pravidlem, že statisticky optimální délka fáze příjmu pro získání statisticky přijatelných dat (BCFk) je doba nezbytná k tomu, aby křivka sestrojená vynesením logaritmu koncentrace zkušební látky v rybách proti času v lineárním měřítku dosáhla svého středního bodu, popřípadě 1,6k2, neboli 80 % rovnovážného stavu, ale ne více než 3,0k2, neboli 95 % rovnovážného stavu (7).

      1. účinné od 1. 5. 2004Doba nezbytná pro dosažení 80 % rovnovážného stavu je při použití rovnice 4:
        účinné od 1. 5. 2004
        PŘÍLOHA 3 Předpověď délky fáze příjmu a fáze vylučování
        nebo(5).
      1. účinné od 1. 5. 2004Podobně 95 % rovnovážného stavu je dosaženo:
        účinné od 1. 5. 2004
        PŘÍLOHA 3 Předpověď délky fáze příjmu a fáze vylučování
        (6).
      1. účinné od 1. 5. 2004Například délka fáze příjmu (up) pro zkušební látku s log Pov = 4 je (při použití rovnic 1, 5 a 6):
        účinné od 1. 5. 2004
        PŘÍLOHA 3 Předpověď délky fáze příjmu a fáze vylučování
        1. účinné od 1. 5. 2004up (80 %) = 1,6/0,652, tj. 2,45 dnů (59 hodin)
      1. účinné od 1. 5. 2004nebo up (95 %) = 3,0/0,652, tj. 4,60 dnů (110 hodin).
      2. účinné od 1. 5. 2004Podobně pro zkušební látku s hodnotou s = 10-5 mol/l (log(s) = 5,0) je délka fáze (při použití rovnic 1, 2, 5 a 6):

        účinné od 1. 5. 2004

        účinné od 1. 5. 2004

        1. účinné od 1. 5. 2004k2 = 0,246 den-1
        2. účinné od 1. 5. 2004up (80 %) = 1,6/0,246, tj. 6,5 dnů (156 hodin)
        3. účinné od 1. 5. 2004nebo up (95 %) = 3,0/0,246, tj. 12,2 dnů (293 hodin).
      1. účinné od 1. 5. 2004Rovnice
        účinné od 1. 5. 2004
        PŘÍLOHA 3 Předpověď délky fáze příjmu a fáze vylučování
        (hodin)

      účinné od 1. 5. 2004může být eventuelně použita pro výpočet doby potřebné pro dosažení efektivního rovnovážného stavu (4).

    1. účinné od 1. 5. 20042. Předpověď délky fáze vylučování
      1. účinné od 1. 5. 2004Předpověď doby nezbytné pro snížení obsahu látky v organismu na určitou procentuální úroveň počáteční koncentrace může být rovněž získána z obecné rovnice kinetiky popisující příjem a vylučování (kinetika prvního řádu) (1), (8):
        1. účinné od 1. 5. 2004V případě fáze vylučování se Cw předpokládá rovna nule. Rovnice může být zjednodušena na rovnici:
          účinné od 1. 5. 2004
          PŘÍLOHA 3 Předpověď délky fáze příjmu a fáze vylučování
          nebo
        1. účinné od 1. 5. 2004kde Ct,0 je koncentrace na počátku fáze vylučování. 50% vyloučení bude dosaženo v čase (t50):
          účinné od 1. 5. 2004
          PŘÍLOHA 3 Předpověď délky fáze příjmu a fáze vylučování
          nebo
      1. účinné od 1. 5. 2004Podobně 95% vyloučení bude dosaženo v čase

        účinné od 1. 5. 2004

      účinné od 1. 5. 2004Je-li pro první fázi zvoleno dosažení 80% příjmu (1,6/k2) a pro fázi vylučování je zvoleno dosažení 95% úbytku (3,0/k2), je délka fáze vylučování přibližně dvojnásobkem délky fáze příjmu.

      účinné od 1. 5. 2004Je však důležité poznamenat, že odhady jsou založeny na předpokladu, že se příjem a vylučování řídí kinetikou prvního řádu. Neřídí-li se zjevně kinetikou prvního řádu, měl by být použit složitější model (např. odkaz (1)).

    účinné od 1. 5. 2004Literatura (k příloze 3)

    účinné od 1. 5. 2004(1) Spacie A., Hamelink J. L. (1982). Alternative models for describing the bioconcentration of organics in fish. Environ. Toxicol. and Chem. 1, pp. 309-320.

    účinné od 1. 5. 2004(2) Kristensen P. (1991). Bioconcentration in fish: comparison of BCFs derived from OECD and ASTM testing methods; influence of particulate matter to the bioavailability of chemicals. Danish Water Quality Institute.

    účinné od 1. 5. 2004(3) Chiou C. T., Schmedding D. W. (1982). Partitioning of organic compounds in octanol-water systems. Environ. Sci. Technol. 16 (1), pp. 4-10.

    účinné od 1. 5. 2004(4) Hawker D. W., Connell D. W. (1988). Influence of partition coefficient of lipophilic compounds on bioconcentration kinetics with fish. Wat. Res. 22 (6), pp. 701-707.

    účinné od 1. 5. 2004(5) Branson D. R., Blau G. E., Alexander H. C., Neely W. B. (1975). Transactions of the American Fisheries Society, 104 (4), pp. 785-792.

    účinné od 1. 5. 2004(6) Ernst W. (1985). Accumulation in Aquatic organisms. In: Appraisal of tests to predict the environmental behaviour of chemicals. Ed. by Sheehman P., Korte F., Klein W., Bourdeau P. H. Part 4.4, pp. 243-255. SCOPE, 1985, John Wiley & Sons Ltd N.Y.

    účinné od 1. 5. 2004(7) Reilly P. M., Bajramovic R., Blau G. E., Branson D. R., Sauerhoff M. W. (1977). Guidelines for the optimal design of experiments to estimate parameters in first order kisnetic models, Can. J. Chem. Eng. 55, pp. 614-622.

    účinné od 1. 5. 2004(8) Könemann H., Van Leeuwen K. (1980). Toxicokinetics in fish: Accumulation and Elimination of six Chlorobenzenes by Guppies. Chemosphere, 9, pp. 3-19.

    PŘÍLOHA 4

    účinné od 1. 5. 2004

    účinné od 1. 5. 2004Teoretický příklad plánu odběru vzorků pro bioakumulační zkoušky látek s logPov = 4

    účinné od 1. 5. 2004
    PŘÍLOHA 4 Teoretický příklad plánu odběru vzorků pro bioakumulační zkoušky látek s logPov = 4
    Odběr vzorků rybPlán dob odběru vzorkůPočet vzorků vodyPočet ryb na vzorek
    Minimální
    požadovaná
    četnost
    (dny)    		Dodatečný odběr
    vzorků
    Fáze příjmu−1
    0    		2(*)
    2    		Přídavek 45 až 80
    ryb
    1.0,30,42
    (2)    		4
    (4)
    2.0,60,92
    (2)    		4
    (4)
    3.1,21,72
    (2)    		4
    (4)
    4.2,43,32
    (2)    		4
    (4)
    5.4,726
    Fáze vylučováníPřenesení ryb do
    vody neobsahující
    zkušební
    chemikálii
    6.5,05,34
    (4)
    7.5,97,04
    (4)
    8.9,311,24
    (4)
    9.14,017,56
    (4)
  • účinné od 1. 5. 2004(*) Odběr vzorku vody po dodání alespoň tří „objemů nádrže“.

    • účinné od 1. 5. 2004Hodnoty v závorkách jsou počty vzorků (vody, ryb), které mají být odebrány, je prováděn dodatečný odběr.

  • účinné od 1. 5. 2004Poznámka: Předběžný odhad k2 pro logPov rovný 4,0 je 0,652 den-1. Celková délka experimentu je stanovena na
    1. účinné od 1. 5. 20043 × up = 3 × 4,6 dnů, tj. 14 dnů. Odhad hodnoty „up“ viz příloha 3.

    • PŘÍLOHA 5

    účinné od 1. 5. 2004

    účinné od 1. 5. 2004Omezení modelu

    účinné od 1. 5. 2004U většiny bioakumulačních dat se předpokládá, že jsou „rozumně“ dobře popsány jednoduchým modelem se dvěma kompartmenty/dvěma parametry, jak je patrné z přímky, která aproximuje body pro koncentrace v rybách během fáze vylučování, je-li vynesena na semilogaritmickém papíru. (Nelze-li tyto body popsat přímkou, měl by být použit složitější model (viz například Spacie a Hamelik, odkaz 1 v příloze 3).

    účinné od 1. 5. 2004Grafická metoda stanovení rychlostní konstanty vylučování (úbytku) k2

    účinné od 1. 5. 2004Koncentrace zkušební látky nalezená v každém vzorku ryb se vynese na semi-logaritmickém papíru proti času odběru vzorků. Směrnice této přímky je rovna k2.

    účinné od 1. 5. 2004

    účinné od 1. 5. 2004Obrázek

    účinné od 1. 5. 2004Je třeba si všimnout, že odchylky od přímky mohou znamenat složitější model vylučování, než je kinetika prvního řádu. Pro analýzu typů vylučování, které se odchylují od kinetiky prvního řádu, mohou být použity grafické metody.

    účinné od 1. 5. 2004Grafická metoda stanovení rychlostní konstanty příjmu k1

    1. účinné od 1. 5. 2004Při dané konstantě k2 se k1 vypočte následujícím způsobem:
      účinné od 1. 5. 2004
      PŘÍLOHA 5 Omezení modelu
      (1)

    účinné od 1. 5. 2004Hodnota Cf se odečte ze středního bodu hladké křivky příjmu vytvořené vynesením logaritmu koncentrace proti času (v lineárním měřítku).

    účinné od 1. 5. 2004Metoda výpočtu rychlostních konstant příjmu a vylučování (úbytku) s využitím počítače

    1. účinné od 1. 5. 2004Upřednostňovanou metodou pro získání hodnoty bioakumulačního faktoru a rychlostních konstant k1 a k2 je metoda nelineárního odhadu parametrů s využitím počítače. Těmito programy se naleznou hodnoty k1 a k2 založené na sadě po sobě jdoucích dat koncentrací a na modelu:
      účinné od 1. 5. 2004
      PŘÍLOHA 5 Omezení modelu
      (2)
      účinné od 1. 5. 2004
      PŘÍLOHA 5 Omezení modelu
      (3)
      1. účinné od 1. 5. 2004kde tc = čas konce fáze příjmu.

    účinné od 1. 5. 2004Tento přístup poskytuje odhady směrodatné odchylky k1 a k2.

    účinné od 1. 5. 2004Vzhledem k tomu, že ve většině případů lze odhadnout k2 z křivky vylučování s relativně vysokou přesností a vzhledem k tomu, že mezi těmito dvěma parametry k1 a k2 existuje silná korelace, jsou-li odhadovány současně, může být účelné nejdříve vypočítat k2 pouze z dat vylučování a následně vypočítat k1 z dat příjmu pomocí nelineární regrese.

    1. účinné od 1. 5. 2004XIV. METODA PRO STANOVENÍ RŮSTU NA NEDOSPĚLÝCH RYBÁCH – metoda C.14 podle přílohy směrnice Komise 2001/59/ES ze dne 6. srpna 2001, kterou se po dvacáté osmé přizpůsobuje technickému pokroku směrnice Rady 67/548/EHS o sbližování správních a právních púředpúsů týkajících se klasifikace, balení a označování nebezpečných látek (dále jen „směrnice 2001/59/ES“)
      1. účinné od 1. 5. 2004XIV.1 METODA

        účinné od 1. 5. 2004Metoda růstové zkoušky pro stanovení toxicity je replikou metody OECD TG 215 (2000).

        1. účinné od 1. 5. 2004XIV.1.1 ÚVOD

          účinné od 1. 5. 2004Zkouška je určena k posouzení účinků dlouhodobé expozice chemickým látkám na růst nedospělých ryb. Je založena na metodě pro posouzení účinků chemických látek na růst nedospělého pstruha duhového (Oncorynchus mykiss) při průtokových podmínkách, která byla vyvinuta v Evropské unii a testována v okružních testech (1, 3). Mohou být použity také jiné dobře popsané druhy. Byly například získány zkušenosti z růstových zkoušek s daniem pruhovaným (Danio rerio) (2, 4, 5) a halančíkem japonským (Oryzias latipes) (6, 7, 8).

          účinné od 1. 5. 2004Viz také obecný úvod, část C.

        1. účinné od 1. 5. 2004XIV.1.2 DEFINICE

          účinné od 1. 5. 2004Nejnižší koncentrace s pozorovanými účinky (Lowest observed effect concentration, LOEC): je nejnižší zkoušená koncentrace zkoušené látky, při níž jsou u látky pozorovány významné účinky ve srovnání s kontrolou (na úrovni pravděpodobnosti falešně pozitivního hodnocení p < 0,05). Všechny zkoušené koncentrace vyšší než LOEC musí mít stejné nebo vážnější škodlivé účinky, než účinky pozorované při koncentraci LOEC.

          účinné od 1. 5. 2004NOEC (no observed effect concentration, koncentrace bez pozorovaných účinků): je zkušební koncentrace bezprostředně nižší než LOEC.

          účinné od 1. 5. 2004ECx: je pro tuto metodu koncentrace zkoušené látky, která vyvolává x% změnu rychlosti růstu ryb ve srovnání s kontrolami.

          účinné od 1. 5. 2004Velikost násady: je živá hmotnost ryb v jednotce objemu vody.

          účinné od 1. 5. 2004Hustota obsádky: je počet ryb v jednotce objemu vody.

          účinné od 1. 5. 2004Individuální specifická rychlost růstu ryby: vyjadřuje rychlost růstu jedince vycházející z jeho výchozí hmotnosti.

          účinné od 1. 5. 2004Průměrná specifická rychlost růstu pro nádrž: vyjadřuje střední rychlost růstu populace v nádrži při určité koncentraci.

          účinné od 1. 5. 2004Pseudospecifická rychlost růstu: vyjadřuje rychlost růstu jednotlivce vycházející ze střední počáteční hmotnosti populace v nádrži.

        1. účinné od 1. 5. 2004XIV.1.3 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY

          účinné od 1. 5. 2004Nedospělé ryby v exponenciální fázi růstu se po zvážení umístí do zkušebních nádrží a vystaví se řadě subletálních koncentrací zkoušené látky nejlépe za průtokových podmínek, nebo, pokud možno za vhodných semistatických podmínek (statické podmínky s obnovením média). Zkouška trvá 28 dnů. Ryby se krmí denně. Přísun potravy se řídí počáteční hmotností ryb a může být po 14 dnech nově vypočten. Na konci zkoušky se ryby opět zváží. Účinky na rychlost růstu se analyzují pomocí regresního modelu s cílem odhadnout koncentraci, která vyvolává x% změnu rychlosti růstu, tj. ECx (např. EC10, EC20 nebo EC30). Data mohou být popřípadě porovnána s hodnotami pro kontrolní skupiny s cílem stanovit nejnižší koncentraci s pozorovanými účinky (LOEC) a tím i koncentraci bez pozorovaných účinků (NOEC).

        1. účinné od 1. 5. 2004XIV.1.4 INFORMACE O ZKOUŠENÉ LÁTCE

          účinné od 1. 5. 2004Výsledky zkoušky akutní toxicity (viz zkušební metoda C.1) provedené nejlépe na druhu zvolenému pro tuto zkoušku již musí být předloženy. To znamená, že jsou známy rozpustnost zkoušené látky ve vodě a tlak jejích par a je k dispozici vhodná analytická metoda pro kvantitativní stanovení látky ve zkušebních roztocích, a to se známou a doloženou správností a známou mezí stanovitelnosti.

          účinné od 1. 5. 2004Užitečnými informacemi jsou strukturní vzorec, čistota látky, její stálost ve vodě a na světle, pKa, Po/v a výsledky zkoušky snadné biologické rozložitelnosti (viz zkušební metoda C.4).

        1. účinné od 1. 5. 2004XIV.1.5 VALIDITA ZKOUŠKY
          1. účinné od 1. 5. 2004Má-li být zkouška platná, musí být splněny následující podmínky:
            1. účinné od 1. 5. 2004— mortalita v kontrolních zkouškách nesmí být na konci zkoušky větší než 10 %,
            2. účinné od 1. 5. 2004— nárůst střední hodnoty hmotnosti ryb v kontrolní skupině (skupinách) musí být dostatečný na to, aby umožnil rozeznat minimální významnou změnu rychlosti růstu. Okružní test (3) ukázal, že u pstruha duhového musí střední hmotnost ryb v kontrolních skupinách vzrůst alespoň o polovinu (tj. o 50 %) jejich počáteční hmotnosti za 28 dnů; např. počáteční hmotnost: 1 g/rybu (= 100 %), konečná hmotnost po 28 dnech: ≥ 1,5 g/rybu (≥ 150 %),
            3. účinné od 1. 5. 2004— koncentrace rozpuštěného kyslíku musí dosahovat alespoň 60 % hodnoty nasycení vzduchem (ASV) po celou dobu zkoušky,
            4. účinné od 1. 5. 2004— teplota vody se po celou dobu zkoušky nesmí mezi zkušebními nádržemi lišit o více než ± 1 °C a měla by být udržována v rozpětí 2 °C v rozsahu teplot stanovených pro zkušební druh (dodatek 1).
        1. účinné od 1. 5. 2004XIV.1.6 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY
          1. účinné od 1. 5. 2004XIV.1.6.1 Přístroje a pomůcky
            1. účinné od 1. 5. 2004Normální laboratorní vybavení a zejména:
              1. účinné od 1. 5. 2004a) oxymetr a pH metr;
              2. účinné od 1. 5. 2004b) vybavení pro stanovení tvrdosti vody a alkality;
              3. účinné od 1. 5. 2004c) vhodné zařízení pro regulaci teploty a pro její pokud možno nepřetržité sledování;
              4. účinné od 1. 5. 2004d) nádrže z chemicky inertního materiálu o vhodném objemu vzhledem k doporučenému nasazování a obsádce (viz bod 1.8.5 a dodatek 1);
              5. účinné od 1. 5. 2004e) vhodné přesné váhy (tj. vážící s přesností na ± 0,5 %).
          1. účinné od 1. 5. 2004XIV.1.6.2 Voda

            účinné od 1. 5. 2004Jako zkušební voda může být použita jakákoli voda, v níž zkušební druh dlouhodobě přežívá a roste. Měla by mít po celou dobu zkoušky stejnou kvalitu. Hodnota pH vody by měla být v rozmezí 6,5 až 8,5, avšak během zkoušky by se pH nemělo lišit o více než ± 0,5. Doporučuje se tvrdost nad 140 mg/l (jako CaCO3). S cílem zajistit, aby ředicí voda neměla nadměrný vliv na výsledek zkoušky (například v důsledku tvorby komplexů zkušební látky), by měly být v určitých intervalech odebírány vzorky k analýze. Je-li kvalita ředicí vody relativně konstantní, mělo by být stanovení těžkých kovů (např. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd a Ni), hlavních aniontů a kationtů (např. Ca, Mg, Na, K, Cl a SO4), pesticidů (např. celkový obsah organických fosforových a chlorových pesticidů), celkový obsah organického uhlíku a suspendovaných látek provedeno např. každé tři měsíce. Je-li prokázáno, že kvalita vody je konstantní po dobu alespoň jednoho roku, mohou být stanovení méně častá a intervaly lze prodloužit (např. každých šest měsíců). Některé chemické charakteristiky přijatelné ředicí vody jsou uvedeny v dodatku 2.

          1. účinné od 1. 5. 2004XIV.1.6.3 Zkušební roztoky

            účinné od 1. 5. 2004Zkušební roztoky o zvolených koncentracích se připraví ředěním zásobního roztoku.

            účinné od 1. 5. 2004Zásobní roztok by měl být připraven nejlépe jednoduchým mechanickým mícháním nebo protřepáváním zkoušené látky v ředicí vodě (např. mechanickým mícháním nebo sonifikací). Pro dosažení vhodné koncentrace zásobního roztoku mohou být použity saturační kolony.

            účinné od 1. 5. 2004V některých případech může být pro vytvoření zásobního roztoku o vhodné koncentraci nezbytné použití rozpouštědel nebo dispergátorů (solubilizačních činidel). Ke vhodným rozpouštědlům patří aceton, ethanol, methanol, dimethylsulfoxid, dimethylformamid a triethylenglykol. Ke vhodným dispergátorům patří Cremophor RH40, Tween 80, 0,01% methylcelulosa a HCO-40. Snadno biologicky rozložitelná činidla (např. aceton) nebo vysoce těkavé sloučeniny je třeba používat rozvážně, neboť mohou způsobit problémy s růstem bakterií v průtokových zkouškách. Je-li použito solubilizační činidlo, nesmí mít významné účinky na růst ryb ani viditelné nepříznivé účinky na nedospělé ryby, což musí být prokázáno na kontrolní skupině vystavené pouze rozpouštědlu.

            účinné od 1. 5. 2004Při průtokových zkouškách je pro zajištění řady koncentrací nezbytný systém, který nepřetržitě dávkuje a ředí zásobní roztok zkoušené látky (např. dávkovací čerpadlo, zařízení pro proporcionální ředění, saturační systém). Průtok zásobních roztoků a ředicí vody by měl být v průběhu zkoušky kontrolován v určitých intervalech, nejlépe denně, a neměl by se v průběhu zkoušky měnit o více než 10 %. Okružní test (3) ukázal, že u pstruha duhového je přijatelná výměna vody 6 litrů na gram ryb za den (viz bod 1.8.2.2).

            účinné od 1. 5. 2004U semistatických zkoušek (s obnovením média) bude častost obnovování média záviset na stálosti zkoušené látky, avšak doporučuje se obnovovat vodu denně. Není-li podle předběžných zkoušek stálosti (viz bod 1.4) koncentrace zkoušené látky mezi obnoveními média stálá, (tj. nepohybuje se v intervalu 80 – 120 % nominální koncentrace nebo klesá pod 80 % naměřené počáteční koncentrace), měla by být zvážena průtoková zkouška.

          1. účinné od 1. 5. 2004XIV.1.6.4 Výběr druhů

            účinné od 1. 5. 2004Pstruh duhový (Oncorhynchus mykiss) je doporučeným druhem pro tuto zkoušku, neboť u něj bylo v okružních testech získáno nejvíce zkušeností (1, 3). Mohou však být použity jiné dobře popsané druhy, může však být nutné zkušební postup upravit, aby byly vytvořeny vhodné zkušební podmínky. Jsou například zkušenosti s daniem pruhovaným (Danio rerio) (4, 5) a halančíkem japonským (Oryzias latipes) (6, 7, 8). V takovém případě by měly být uvedeny v závěrečné zprávě důvody pro výběr druhu a experimentální podmínky.

          1. účinné od 1. 5. 2004XIV.1.6.5 Chov ryb

            účinné od 1. 5. 2004Testovací ryby by měly pocházet z jednoho chovu (nejlépe ze stejného tření), který se alespoň dva týdny před zkouškou udržuje v podmínkách kvality vody a osvětlení, které jsou podobné podmínkám použitým ve zkoušce. V průběhu chovu a v průběhu zkoušky by měly být krmeny množstvím potravy odpovídajícím minimálně 2 % tělesné hmotnosti za den a nejlépe 4 % tělesné hmotnosti za den.

            1. účinné od 1. 5. 2004Po 48hodinové aklimatizaci se zaznamená mortalita a použijí se následující kritéria:
              1. účinné od 1. 5. 2004— mortality vyšší než 10 % populace za sedm dnů: vyměnit celou obsádku;
              2. účinné od 1. 5. 2004— mortality od 5 % do 10 % populace: aklimatizace dalších sedm dnů; je-li mortalita během následujících sedmi dnů vyšší než 5 %, vymění se celá obsádka,
              3. účinné od 1. 5. 2004— mortalita nižší než 5 % populace za sedm dnů: obsádka se přijme.

            účinné od 1. 5. 2004Dva týdny před zkouškou nebo v průběhu zkoušky nesmí být léčeny u ryb žádné nemoci.

        1. účinné od 1. 5. 2004XIV.1.7 USPOŘÁDÁNÍ ZKOUŠKY
          1. účinné od 1. 5. 2004„Uspořádáním zkoušky“ se rozumí výběr počtu zkušebních koncentrací a jejich odstupňování, počet nádrží pro každou koncentraci a počet ryb v nádrži. Uspořádání by mělo být v ideálním případě zvoleno s ohledem na:
            1. účinné od 1. 5. 2004a) cíl studie;
            2. účinné od 1. 5. 2004b) metodu statistické analýzy, která bude použita;
            3. účinné od 1. 5. 2004c) dostupnost a cenu prostředků pro experiment.