Vyhláška Ministerstva zdravotnictví, kterou se mění vyhláška Ministerstva zdravotnictví č. 1/1998 Sb., kterou se stanoví požadavky na jakost, postup při přípravě, zkoušení, uchovávání a dávkování léčiv (Český lékopis 1997)

Výsledky jsou platné pouze tehdy, jsou-li pozitivní kontroly jednoznačně pozitivní a negativní kontroly jednoznačně negativní. Vysoká citlivost PCR metody a potenciální riziko kontaminace vyžaduje potvrzení pozitivních výsledků dvojím opakováním celého zkušebního postupu, pokud možno s novým množstvím vzorku. Vzorky se považují za pozitivní, jestliže alespoň jedna z opakovaných zkoušek je pozitivní.

1. 7 Jištění jakosti
   1. 7.1 Validace systému zkoušky PCR

      Validační program zahrnuje validaci přístrojů a validaci použitých metod PCR. Doporučení jsou obsažena v Předpisu ICH (hlava Q2B) Validace analytických metod: Metodologie.

      Vhodné národní referenční přípravky nebo pracovní referenční přípravky se kalibrují proti mezinárodnímu standardu na cílové sekvence, pro které bude zkouška používána, a tato kalibrace je nezbytná pro validaci PCR zkoušky.

      Při validaci se stanoví pozitivní limitní hodnota. Pozitivní limitní hodnota je definována jako minimální počet cílových sekvencí v objemu vzorku, které mohou být detegovány v 95 % zkušebních sérií. Pozitivní limitní hodnota závisí na vzájemně souvisejících faktorech, jako jsou objem extrahovaného vzorku a účinnost extrakční metody, přepis cílové RNK na cDNK, amplifikační postup a detekce.

      Pro stanovení detekčního limitu zkušebního systému se uvede odkaz na pozitivní limitní hodnotu pro každou cílovou sekvenci a provedení zkoušky nad a pod tímto bodem.

   1. 7.2 Kontrola jakosti zkoumadel

      Všechna zkoumadla potřebná pro metodiku se kontrolují dříve, než se běžně použijí. Jejich vhodnost nebo nepřijatelnost je dána předem definovanými kritérii jakosti.

      Primery jsou klíčovou složkou zkoušky PCR a je nutné věnovat pečlivou pozornost jejich složení, čistotě a validaci jejich použití ve zkoušce PCR. Každá nová šarže primem se před přijetím zkouší na specificitu, amplifikační účinnost a inhibiční nečistoty. Primery mohou být modifikovány (např. konjugací s fluoroforem nebo antigenem), aby umožnily použití specifické metody detekce amplikonu a to za předpokladu, že tyto modifikace neinhibují přesnost a účinnost amplifíkace cílové sekvence.

   1. 7.3 Průběžná kontrola
      1. 7.3.1 Vnější kontroly

         Ke snížení rizika kontaminace a zajištění dostatečné citlivosti jsou do každé PCR zkoušky zařazeny následující vnější kontroly:

         1. - pozitivní kontrola: obsahuje definovaný počet kopií cílových sekvencí, jejichž počet je stanoven zvlášť pro každý zkušební systém a je určen jako násobek pozitivní limitní hodnoty zkušebního systému,
         2. - negativní kontrola: vzorek téže matrice prokazatelné neobsahující cílové sekvence.
      1. 7.3.2 Vnitřní kontroly

         Vnitřní kontroly jsou definované sekvence nukleových kyselin obsahující vazebná místa pro příměry. Vnitřní kontroly jsou amplifikovány s podobnou účinností jako zkoušená cílová sekvence, ale amplikony jsou jasně rozpoznatelné. Vnitřní kontroly jsou téhož typu nukleové kyseliny (DNK/RNK) jako zkoušený materiál. Vnitřní kontrola se přidává ke zkoušenému materiálu před izolací nukleové kyseliny, a slouží proto jako celková kontrola (extrakce, reverzní transkripce, amplifikace, detekce).

   1. 7.4 Vnější hodnocení jakosti

      Účast v programech vnějšího hodnocení jakosti je důležitým postupem jištění jakosti PCR pro každou laboratoř a každého pracovníka.

1. 2.7 Metody stanovení účinnosti

   2.7.2 Mikrobiologické stanovení účinnosti antibiotik

   Účinnost antibiotika se stanoví porovnáním inhibice růstu citlivých mikroorganismů vyvolané známými koncentracemi zkoušeného antibiotika a referenční látky.

   Referenční látky použité ke stanovení jsou ty, jejichž účinnost byla přesně stanovena v poměru k odpovídajícímu mezinárodnímu standardu nebo mezinárodnímu referenčnímu přípravku.

   Plán stanovení je takový, aby dovolil ověřit validitu matematického modelu, na němž je založeno porovnání účinnosti. Je-li vybrán model rovnoběžných přímek, dvě logaritmické přímky dávky a odpovědi (nebo transformované odpovědi) zkoušeného přípravku a referenčního přípravku jsou rovnoběžné a jsou lineární v intervalu dávek použitých k výpočtu. Tyto podmínky se validují pro danou hladinu pravděpodobnosti, obvykle P = 0,05. Jiné matematické modely, jako model např. regresního poměru, mohou být též použity, je-li prokázána validita zkoušky.

   Pokud není v článku uvedeno jinak, je interval spolehlivosti (P = 0,95) stanovení nejméně 95 % a nejvýše 105 % stanovené účinnosti.

   Stanovení se provádí metodou A nebo metodou B.

   1. A. Difuzní metoda

      Živná půda vhodná pro stanovení se rozehřeje a při vhodné teplotě, např. 48 °C až 50 °C pro vegetativní formy, se naočkuje suspenzí mikroorganismů citlivých na zkoušené antibiotikum v takovém množství, které vytváří zřetelně ohraničené inhibiční zóny o průměru přiměřeném koncentraci zkoušeného antibiotika. Naočkovaná půda se ihned vylije do Petriho misek nebo velkých pravoúhlých misek (ploten) v takovém množství, aby se vytvořila jednolitá vrstva silná 2 mm až 5 mm. Živná půda může být též vylita ve dvou vrstvách, z nichž jenom vrchní je naočkována. Takto připravené misky se uchovávají tak, aby před použitím nedošlo k viditelnému růstu mikroorganismů nebo k jejich usmrcení a aby povrch půd byl v čase použití suchý.

      Pro přípravu roztoků stejných účinností a známých koncentrací zkoušeného antibiotika a referenční látky se použijí rozpouštědla a tlumivé roztoky uvedené v tabulce 2.7.2-1. Roztoky se nanesou buď na povrch půdy, např. do sterilních cylindříků z porcelánu, z nerezavějící oceli, případně z jiných vhodných materiálů, nebo do otvorů vyříznutých v živné půdě. Do každého cylindříku nebo otvoru se přidá stejný objem roztoků. Lze též použít sterilní disky z absorbujícího papíru vhodné kvality, které se před položením na půdu napustí roztoky referenční látky nebo zkoušeného antibiotika.

      K ověření platnosti stanovení se použijí nejméně tři rozdílné dávky referenční látky a tři odpovídající dávky zkoušeného antibiotika s předpokládanou stejnou účinností jako dávky referenční látky. Doporučuje se používat geometrickou řadu dávek. Při běžných stanoveních, u nichž je prokázán lineární průběh systému na přiměřeném počtu třídávkových stanovení, a pokud s tím souhlasí oprávněná autorita, může postačovat i dvoudávkové stanovení. Ve všech sporných případech se však použije metoda třídávková, jak je předepsáno výše.

      Do každé Petriho misky nebo pravoúhlé misky se nanesou roztoky podle statisticky vhodného plánu. V případě malých misek, které nepojmou více než šest roztoků, se doporučuje měnit umístění roztoku zkoušeného antibiotika a referenční látky, aby se zabránilo interakcím koncentrovanějších roztoků.

      Inkubuje se při vhodné teplotě asi 18 h. Doba předinkubační difuze, obvykle 1 h až 4 h, při pokojové teplotě nebo 4 °C, jak je vhodné, se může použít k potlačení účinku časových rozdílů mezi aplikací roztoků a tak zlepšit regresi.

      Změří se průměry kruhových inhibičních zón s přesností nejméně 0,1 mm nebo jejich plochy s přesností. Pomocí vhodných statistických metod se vypočítá účinnost zkoušeného antibiotika.

      V každé zkoušce se použije pro každou dávku tolik inhibičních zón, aby byla zajištěna požadovaná přesnost. Stanovení účinnosti se může opakovat a výsledky mohou být statisticky sloučeny, aby se dosáhlo požadované přesnosti stanovení a ověřilo se, že účinnost zkoušeného antibiotika není menší než požadované minimum.

      Tab. 2.7.2-1 Difuzní metoda

      Tab. 2.7.2-1 Difuzní metoda

      Antibiotikum	Referenční látka	Rozpouštědlo k přípravě základního roztoku	Tlumívý roztok (pH)	Mikroorganis-mus	Půda a konečné pH (± 0,1)	Inkubační teplota (°C)
      Amphotericinum B	Amphotericinum B CRL	Dimethyl-formamid R	pH 10,5 (0,2 mol/l)	Saccharomy-cescerevisiae IP 1432.83 ATCC 9763 CCM 8191 CNCTC 51/65	F – pH 6,1	35 až 37
      Bacitracinum zincium	Bacitracinum zincicum CRL	kyselina chlorovodíková 0,01 mol/l VS	pH 7,0 (0,05 mol/l)	Micrococcus flavus NCTC 7743 CIP 53.160 ATCC 10240 CCM 732 CNCTC M 8/58	A – pH 7,0	35 až 39
      Bleomycini sulfas	Bleomycini sulfas CRL	voda R	pH 6,8 (0,1 mol/l)	Mycobacterium smegmatis ATCC 607 CCM 4622 CNCTC My 23/64	G – pH 7,0	35 až 37
      Colistini sulfas	Colistini sulfas CRL			Bordetella bronchiseptica NCTC 8344 CIP 53.157 ATCC 4617	B – pH 7,3	35 až 39
      Colistimethatum natricum	Colistimethatum natricum CRL	voda R	pH 6,0 (0,05 mol/l)	CCM 4416 CNCTC Brb 5/63 Escherichia coli NCIB 8879 CIP 54.127 ATCC 10536 CCM 3988 CNCTC Ec 326/71	B – pH 7,3	35 až 39
      Dihydro- streptomycini sulfas	Dihydro-streptomycini sulfas CRL	voda R	pH 8,0 (0,05 mol/l)	Bacillus subtilis NCTC 8236 CIP 1.83 CCM 2217	A – pH 7,9	30 až 37
      				CNCTC Bs 17/65 Bacillus subtilis NCTC 10400 CIP 52.62 ATCC 6633 CCM 1999 CNCTC Bs 8/58	A – pH 7,9	30 až 37
      Erythromycini estolas	Erythromycinum CRL	methanol R viz články		Bacillus pumilus NCTC 8241 CIP 76.18 CCM 2218 CNCTC Bac 2/65	A – pH 7,9	30 až 37
      Erythromycini ethylsuccinas		methanol R	pH 8,0 (0,05 mol/l)
      				Bacillus subtilis NCTC 10400 CIP 52.62 ATCC 6633 CCM 1999 CNCTC Bs 8/58	A – pH 7,9	30 až 37
      Erythromycini stearas
      Framycetini sulfas	Framycetini sulfas CRL	voda R	pH 8,0 (0,05 mol/l)	Bacillus subtilis	E – pH 7,9	30 až 37
      				NCTC 10400 CIP 52.62 ATCC 6633 CCM 1999 CNCTC Bs 8/58 Bacillus pumilus NCTC 8241 CIP 76.18 CCM 2218 CNCTC Bac 2/65	E – pH 7,9	30 až 37
      Gentamicini sulfas	Gentamicini sulfas CRL	voda R	pH 8,0 (0,05 mol/l)	Bacillus pumilus NCTC 8241 CIP 76.18 CCM 2218 CNCTC Bac 2/65 Staphylococcus epidermidis NCIB 8853 CEP 68.21 ATCC 12228 CCM 4418 NCTC M 12/63	A – pH 7,9 A – pH 7,9	35 až 39 35 až 39
      Kanamycini monosulfas				Bacillus Subtilis NCTC 10400 CIP 52.62 ATCC 6633 CCM 1999 CNCTC Bs 8/58 Staphylo coccus aureus NCTC 7447 CEP 53.156 ATCC 6538P CCM 2022 CNCTC Mau 28/58	A – pH 7,9	30 až 37
      	Kanamycini monosulfas CRL	voda R	pH 8,0 (0,05 mol/l)
      Kanamycini sulfas acidus					A – pH 7,9	35 až 39
      Neomycini sulfas	Neomycini sulfas CRL	voda R	pH 8,0 (0,05 mol/l)	Bacillus pumilus NCTC 8241 CIP 76.18 CCM 2218 CNCTC Bac 2/65 Bacillus subtilis NCTC 10400 CIP 52.62 ATCC 6633 CCM 1999 CNCTC Bs 8/58	E – pH 7,9	30 až 37
      					E – pH 7,9	30 až 37
      Netilmicini sulfas	Netilmicini sulfas CRL	voda R	pH 8 ± 0,1	Staphylococcus aureus CIP 53.156 ATCC 6538P CCM 2022 CNCTC Mau 28/58	A – pH 7,9	32 až 35
      Nystatinum	Nystatinum CRL	dimethyl-formamid R	pH 6,0 (0,05 mol/l) obsahující 5 % (V/V) dimethyl-formamidu R	Candida tropicalis CIP 1433-83 NCYC 1393 CCM8223 Saccharomyces cerevisiae NCYC 87 CIP 1432.83 ATCC 9763 CCM 8191 CNCTC 51/65	F – pH 6,0	30 až 37 30 až 32
      Polymyxini B sulfas	Polymyxini B sulfas CRL	voda R	pH 6,0 (0,05 mol/l)	Bordetella bronchiseptica NCTC 8344 CEP 53.157 ATCC 4617 CCM 4416 CNCTC Brb 5/63	B – pH 7,3	35 až 39
      Rifamycinum natricum	Rifamycinum natricum CRL	methanol R	pH 7,0 (0,05 mol/l)	Micrococcus flavus NCTC 8340 CIP 53.45 ATCC 9341 CCM 552 CNCTC Sar 5/58	A – pH 6,6	35 až 39
      Spiramycinum	Spiramycinum CRL	methanol R	pH 8,0 (0,05 mol/l)	Bacillus subtilis NCTC 10400 CIP 52.62 ATCC 6633 CCM 1999 CNCTC Bs 8/58	A – pH 7,9	30 až 32
      Streptomycini sulfas	Streptomycini sulfas CRL	voda R	pH 8,0 (0,05 mol/l)	Bacillus subtilis NCTC 8236 CIP 1.83 CCM 2217 CNCTC Bs 17/65 Bacillus subtilis NCTC 10400 CIP 52.62 ATCC 6633 CCM 1999 CNCTC Bs 8/58	A – pH 7,9	30 až 32
      					A – pH 7,9	30 až 32
      Tobramycinum	Tobramycinum CRL	voda R	pH 8,0 (0,05 mol/l)	Bacillus subtilis NCTC 10400 CIP 52.62 ATCC 6633 CCM 1999 CNCTC Bs 8/58	A – pH 7,9	30 až 37
      Tylosinum a.u.v.	Tylosinum CRL	roztok methanolu R (2,5 % (V/V)) v tlumivém roztoku fosforečnano-vém o pH 7,0 (0,1 mol/l)	směs objemových dílů methanolu R a tlumivého roztoku fosforečnanové-ho o pH 8,0 (0,1 mol/l) (40 + 60)	Micrococcus flavus NCTC 8340 CIP 53.45 ATCC 9341 CCM 552 CNCTC Sar 5/58	A – pH 8,0	32 až 35
      Tylosini tartras a.u.v.
      Vancomycini hydrochloridum	Vancomycini hydrochloridum CRL	voda R	pH 8,0	Bacillus subtilis NCTC 10400 CIP 52.62 ATCC 6633 CCM 1999 CNCTC Bs 8/58	A – pH 8,0	37 až 39

   1. B. Turbidimetrická metoda

      Vhodná živná půda se naočkuje suspenzí vybraného mikroorganismu, který je citlivý na zkoušené antibiotikum tak, aby se v podmínkách zkoušky docílilo vhodně rozsáhlého potlačení růstu mikrobiální kultury. Použije se známé množství suspenze vybrané tak, aby byl asi po čtyřhodinové inkubaci dobře měřitelný zákal.

      Naočkovaná půda se použije ihned po naočkování.

      Pro přípravu roztoků referenční látky a roztoků zkoušeného antibiotika ve známých koncentracích, u nichž se předpokládá stejná účinnost, se použije rozpouštědlo a tlumivý roztok uvedený v tabulce 2.7.2-2. K ověření platnosti stanovení se použijí nejméně tři dávky referenční látky a tři dávky zkoušeného antibiotika s předpokládanou stejnou účinností jako dávky referenční látky. Doporučuje se použít geometrickou řadu dávek. K dosažení linearity je někdy nutné vybrat z většího počtu tři následující dávky za použití odpovídajících dávek referenční látky a zkoušeného antibiotika.

      Použijí se stejné zkumavky. Do každé z nich se převede stejný objem jednoho z roztoků a stejný objem naočkované živné půdy (např. 1 ml roztoku a 9 ml živné půdy).

      Zároveň se připraví dvě kontrolní zkumavky bez antibiotika s naočkovanou živnou půdou a do jedné se ihned přidá 0,5 ml formaldehydu R. Tyto zkumavky slouží ke standardizaci optického přístroje použitého k měření růstu.

      Zkumavky se umístí buď náhodně, nebo podle latinského čtverce, nebo náhodného bloku do vodní lázně nebo jiného vhodného přístroje, dovolujícího uvést rychle všechny zkumavky na uvedenou inkubační teplotu. Uchovávají se při této teplotě 3 h až 4 h a zabezpečí se stejná teplota a stejná doba inkubace.

      Po inkubaci se zastaví ve všech zkumavkách růst mikroorganismů přidáním 0,5 ml formaldehydu R nebo zahřátím a změří se zákal s přesností na tři místa za použití vhodného optického přístroje. Alternativně lze použít jiný postup, který dovoluje měřit zákal každé zkumavky po přesně stejné době inkubace.

      Vypočítá se účinnost za pomoci vhodných statistických metod.

      Linearita vztahu dávka – odpověď, transformovaná nebo netransformovaná, je často získána pouze ve velmi omezeném intervalu; je to ten interval, který se má použít pro výpočet účinnosti a obsahuje nejméně tři následné dávky dovolující ověřit linearitu. Při běžných stanoveních, u nichž je prokázán lineární průběh systému, pokud byla na přiměřeném počtu třídávkových stanovení a pokud s tím souhlasí oprávněná autorita, může postačovat dvoudávkové stanovení. Ve všech sporných případech se však použije třídávková metoda.

      V každé zkoušce se použije pro každou dávku tolik zkumavek, aby byla zajištěna požadovaná přesnost. Stanovení účinnosti se může opakovat a výsledky mohou být statisticky sloučeny, aby se dosáhlo požadované přesnosti stanovení a ověřilo se, že účinnost zkoušeného antibiotika není menší než požadované minimum.

      Tab. 2.7.2-2 Turbidimetrická metoda

      Tab. 2.7.2-1 Difuzní metoda Tab. 2.7.2-2 Turbidimetrická metoda

      Antibiotikum	Referenční látka	Rozpouštědlo k přípravě základního roztoku	Tlumivý roztok (pH)	Mikroorganis-mus	Půda a konečné pH (± 0,1)	Inkubační teplota (°C)
      Colistini sulfas Colistimethatum natricum	Colistini sulfas CRL Colistimethatum natricum CRL	voda R	pH 7,0	Escherichia coli NCIB 8666 CIP 2.83 ATCC 9637 CCM 2024	C – pH 7,0	35 až 37
      Dihydrostrep- tomycini sulfas	Dihydrostrepto-mycini sulfas CRL	voda R	pH 8,0	Klebsiella pneumoniae NCTC 7427 CIP 53.153 ATCC 10031 CCM 4415 CNCTC Klp 85/69	C – pH 7,0	35 až 37
      Erythromycini estolas Erythromycini ethylsuccinas	Erythromycin CRL	methanol R viz články	pH 8,0	Klebsiella pneumoniae NCTC 7427 CIP 53.153 ATCC 10031 CCM 4415	D – pH 7,0	35 až 37
      Erythromycini stearas				CNCTC Klp 85/69 Staphylococcus aureus NCTC 7447 CEP 53.156 ATCC 6538P CCM 2022 CNCTC Mau 28/58	C – pH 7,0	35 až 37
      Framycetini sulfas	Framycetini sulfas CRL	voda R	pH 8,0	Staphylococcus aureus NCTC 7447 CIP 53.156 ATCC 6538P CCM 2022 CNCTC Mau 28/58	C – pH 7,0	35 až 37
      Gentamicini sulfas	Gentamicini sulfas CRL	voda R	pH 7,0	Staphylococcus aureus NCTC 7447 CIP 53.156 ATCC 6538P CCM 2022 CNCTC Mau 28/58	C – pH 7,0	35 až 37
      Gramicidinum	Gramicidinum CRL	methanol R	pH 7,0 K zamezení ztrát způsobených adsorpcí v průběhu ředění může být nutná přísada detergentu, např. poly-sorbátu 80 R (0,1 mg/ml)	Streptococcus faecalis ATCC 10541 CCM 4533 CNCTC Str 6/58 Staphylococcus aureus ATCC 6538P CCM 2022 CNCTC Mau 28/58	C – pH 7,0	35 až 37
      Kanamycini monosulfas	Kanamycini monosulfas CRL	voda R	pH 8,0	Staphylococcus aureus NCTC 7447 CIP 53.156 ATCC 6538P CCM 2022 CNCTC Mau 28/58	C – pH 7,0	35 až 37
      Kanamycini sulfas acidus
      Neomycini sulfas	Neomycini sulfas CRL	voda R	pH 8,0	Staphylococcus aureus NCTC 7447 CIP 53.156 ATCC 6538P CCM 2022 CNCTC Mau 28/58	C – pH 7,0	35 až 37
      Rifamycinum natricum	Rifamycinum natricum CRL	methanol R	pH 7,0	Escherichia coli NICB 8879 CIP 54.127 ATCC 10536 CCM 3988 CNCTC Ec 326/71	C – pH 7,0	35 až 37
      Spiramycinum	Spiramycinum CRL	methanol R	pH 7,0	Staphylococcus aureus NCTC 7447 CIP 53.156 ATCC 6538P CCM 2022 CNCTC Mau 28/58	C – pH 7,0	35 až 37
      Streptomycini sulfas	Streptomycini sulfas CRL	voda R	pH 8,0	Klebsiella pneumoniae NCTC 7427 CIP 53.153 ATCC 10031 CCM 4415 CNCTC Klp 85/69	C – pH 7,0	35 až 37
      Tobramycinum	Tobramycinum CRL	voda R	pH 7,0	Staphylococcus aureus NCTC 7447 CIP 53.156 ATCC 6538P CCM 2022 CNCTC Mau 28/58	C – pH 7,0	35 až 37
      Tylosinum a.u.v. Tylosini tartras a.u.v.	Tylosinum CRL	roztok methanolu R (2,5 % (V/V)) v tlumivém roztoku fosforečnano-vém o pH 7,0 (0,1 mol/l)	směs objemových dílů methanolu R a tlumivého roztoku fosforečnanové-ho o pH 8,0 (0,1 mol/l) (40 + 60)	Staphyloco-ccusaureus NCTC 6571 CIP 53.154 ATCC 9144 CCM 2107 CNCTC Mau 76/69	C – pH 7,0	37
      Vancomycini hydrochloridum	Vancomycini hydrochloridům CRL	voda R	pH 8,0	Staphylococcus aureus NCTC 7447 CIP 53.156 ATCC 6538P CCM 2022 CNCTC Mau 28/58	C – pH 7,0	37 až 39

      Následující část se uvádí pro informaci a jako návod, netvoří závaznou součást obecné metody.

   Doporučené mikroorganismy

   Následující text uvádí doporučené mikroorganismy a podmínky jejich použití. Jiné mikroorganismy se mohou použít, pokud mají prokazatelně stejnou citlivost na zkoušené antibiotikum a použijí se ve vhodné živné půdě a ve vhodných podmínkách teploty a pH. Výběr koncentrací roztoků se má provést tak, aby zaručil, že v podmínkách zkoušky existuje lineární vztah mezi logaritmem dávky a odpovědí.

   Příprava inokula

   Bacillus subtilis a Bacillus pumilus. Suspenze spor mikroorganismu použitého k naočkování se připraví takto:

   Mikroorganismy se kultivují 7 dní při 35 °C až 37 °C na vhodné pevné půdě, do které byl přidán síran manganatý R (1 mg/l). Nárůst, který obsahuje zejména spory, se spláchne sterilní vodou R. Suspenze se 30 min zahřívá při 70 °C a potom se zředí na přiměřenou koncentraci spor, obvykle 10.10⁶ až 100.10⁶ v ml. Suspenze spor se mohou uchovávat po dlouhou dobu při teplotě nepřevyšující 4 °C.

   Alternativně se mohou suspenze spor připravit kultivací mikroorganismů v půdě C při 26 °C po dobu 4 dní až 6 dní. Potom se asepticky přidá dostatek síranu manganatého R do koncentrace 1 mg/l a inkubuje se dalších 48 h. V suspenzi se mikroskopicky zjistí, zda proběhla přiměřená tvorba spor (asi 80 %), a suspenze se odstředí. Sediment se resuspenduje ve sterilní vodě R tak, aby se dosáhla koncentrace spor v ml 10.10⁶ až 100.10⁶, a potom se zahřívá 30 min na 70 °C. Suspenze se uchovává při teplotě nepřevyšující 4 °C.

   Bordetella bronchiseptica. Testovací mikroorganismus se kultivuje na půdě B 16 h až 18 h při 35 °C až 37 °C. Nárůst se smyje sterilní vodou R a zředí na vhodný zákal.

   Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Micrococcus flavus, Staphylococcus epidermidis. Připraví se stejně, jak je popsáno v odstavci Bordetella bronchiseptica, ale použije se půda A a naředí se na takový zákal, který při turbidimetrickém stanovení prokazatelně poskytuje uspokojující vztah dávky k odpovědi nebo při difuzním stanovení vytváří zřetelně ohraničené inhibiční zóny postačujícího průměru.

   Sacharomyces cerevisiae, Candida tropicalis. Testovací mikroorganismus se kultivuje 24 h na půdě F při 30 °C až 37 °C. Nárůst se smyje sterilním roztokem chloridu sodného R (9 g/l) a zředí se jím na vhodný zákal.

   Tlumivé roztoky

   Tlumivé roztoky o pH v rozmezí 5,8 až 8,0 se připraví smícháním 50,0 ml dihydrogenfosforečnanu draselného 0,2 mol/l RS s množstvím hydroxidu sodného 0,2 mol/l RS, uvedeným v následující tabulce a doplněním čerstvě připravenou vodou destilovanou R na 200,0 ml.

   Tab. 2.7.2-3

   Tab. 2.7.2-1 Difuzní metoda Tab. 2.7.2-2 Turbidimetrická metoda Doporučené mikroorganismy Příprava inokula Tlumivé roztoky Tab. 2.7.2-3

   pH	množství hydroxidu sodného 0,2 mol/l RS v ml
   5,8	3,72
   6,0	5,70
   6,2	8,60
   6,4	12,60
   6,6	17,80
   6,8	23,65
   7,0	29,63
   7,2	35,00
   7,4	39,50
   7,6	42,80
   7,8	45,20
   8,0	46,80

   Tyto tlumivé roztoky se použijí pro všechny mikrobiologické zkoušky uvedené v tabulce 2.7.2-1 s výjimkou:

   1. 1) bleomyciniumsulfatu, pro který se tlumivý roztok o pH 6,8 připraví takto: rozpustí se 6,4 g dihydrogenfosforečnanu draselného R a 18,9 g hydrogenfosforečnanu sodného R ve vodě R a zředí se jí na 1000,0 ml.
   2. 2) amfotericinu, na který se tlumivý roztok o pH 10,5 (0,2 mol/l) připraví takto: 35,08 g hydrogenfosforečnanu draselného R se rozpustí ve vodě destilované R, přidá se 1,12 g hydroxidu draselného R a zředí se vodou destilovanou R na 1000,0 ml.

   Živné půdy

   Mohou se použít následující půdy nebo půdy jím rovnocenné.

   Tab. 2.7.2-1 Difuzní metoda Tab. 2.7.2-2 Turbidimetrická metoda Doporučené mikroorganismy Příprava inokula Tlumivé roztoky Tab. 2.7.2-3 Živné půdy

   Půda A
   pepton	6 g
   pankreatický hydrolyzát kaseinu	4 g
   hovězí výtažek	1,5 g
   kvasničný výtažek	3 g
   glukosa monohydrát	1 g
   agar	15 g
   voda	do 1000 ml
   Půda B
   pankreatický hydrolyzát kaseinu	17 g
   papainový hydrolyzát sóji	3 g
   chlorid sodný	5 g
   hydrogenfosforečnan draselný	2,5 g
   glukosa monohydrát	2,5 g
   agar	15 g
   polysorbát 80	10 g
   voda	do 1000 ml

   Polysorbát 80 se přidá k horkému roztoku ostatních složek po jejich rozvaření a bezprostředně před upravením objemu.

   Tab. 2.7.2-1 Difuzní metoda Tab. 2.7.2-2 Turbidimetrická metoda Doporučené mikroorganismy Příprava inokula Tlumivé roztoky Tab. 2.7.2-3 Živné půdy

   Půda C
   pepton	6 g
   hovězí výtažek	1,5 g
   kvasničný výtažek	3 g
   chlorid sodný	3,5 g
   glukosa monohydrát	1 g
   hydrogenfosforečnan draselný	3,68 g
   dihydrogenfosforečnan draselný	1,32 g
   voda	do 1000 ml
   Půda D
   výtažek ze srdce	1,5 g
   kvasničný výtažek	1,5 g
   pepton z kaseinu	5,0 g
   glukosa monohydrát	1 g
   chlorid sodný	3,5 g
   hydrogenfosforečnan draselný	3,68 g
   dihydrogenfosforečnan draselný	1,32 g
   dusičnan draselný	2 g
   voda	do 1000 ml

   Tab. 2.7.2-1 Difuzní metoda Tab. 2.7.2-2 Turbidimetrická metoda Doporučené mikroorganismy Příprava inokula Tlumivé roztoky Tab. 2.7.2-3 Živné půdy

   Půda E
   pepton	5 g
   masový výtažek	3 g
   hydrogenfosforečnan sodný dodekahydrát	26,9 g
   agar	10 g
   voda	do 1000 ml

   Hydrogenfosforečnan sodný se přidá jako sterilní roztok po sterilizaci půdy.

   Tab. 2.7.2-1 Difuzní metoda Tab. 2.7.2-2 Turbidimetrická metoda Doporučené mikroorganismy Příprava inokula Tlumivé roztoky Tab. 2.7.2-3 Živné půdy

   Půda F
   pepton	9,4 g
   kvasničný výtažek	4,7 g
   hovězí výtažek	2,4 g
   chlorid sodný	30,0 g
   glukosa monohydrát	10,0 g
   agar	23,5 g
   voda	do 1000 ml
   Půda G
   glycerol	10 g
   pepton	10 g
   masový výtažek	10 g
   chlorid sodný	3 g
   agar	15 g
   voda	do 1000 ml

   pH 7 ± 0,1 po sterilizaci

   Tab. 2.7.2-1 Difuzní metoda Tab. 2.7.2-2 Turbidimetrická metoda Doporučené mikroorganismy Příprava inokula Tlumivé roztoky Tab. 2.7.2-3 Živné půdy

   2.7.10 Stanovení účinnosti lidského koagulačního faktoru VII

   Podstata zkoušky. Při stanovení účinnosti koagulačního faktoru VII se využívá jeho biologické aktivity v komplexu faktor Vlla-tkáňový faktor při aktivaci faktoru X za přítomnosti vápenatých iontů a fosfolipidů. Účinnost přípravku faktoru VII se stanoví porovnáním množství přípravku potřebného k dosažení určitého stupně tvorby faktoru Xa ve zkoušené směsi obsahující látky účastnící se aktivace faktoru X s množstvím mezinárodního standardu nebo porovnávacího přípravku kalibrovaného v mezinárodních jednotkách, které je zapotřebí ke stejnému stupni tvorby faktoru Xa.

   Mezinárodní jednotka je účinnost faktoru VII obsažená v deklarovaném množství mezinárodního standardu, kterým je lyofilizovaná plazma. Hodnotu účinnosti mezinárodního standardu v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Světová zdravotnická organizace.

   Metoda chromogenního stanovení účinnosti se skládá ze dvou fází: z aktivace reakční směsi faktoru X, která obsahuje tkáňový faktor, fosfolipidy a vápenaté ionty a závisí na faktoru VII, a z následného enzymatického rozštěpení chromogenního substrátu faktoru Xa na chromofor, jehož množství se může stanovit spektrofotometricky.

   Za vhodných podmínek stanovení účinnosti je lineární závislost mezi stupněm tvorby faktoru Xa a koncentrací faktoru VII. Stanovení účinnosti je shrnuto ve schématu na obrázku 2.7.10-1.

   V obou fázích se používají zkoumadla, která lze získat komerčně z různých zdrojů. Ačkoliv se složení jednotlivých zkoumadel může lišit, existují jejich nezbytné vlastnosti, které jsou dále podrobně popsány.

   Fáze 1: a) faktor VIIfaktor VIIa

   1. b) faktor Xfaktor Xa

   Fáze 2: chromogenní substrátpeptid + chromofor

   Obr. 2.7.10-1. Schematické znázornění stanovení účinnosti lidského koagulačního faktoru VII

   Zkoumadla

   Názvem zkoumadla koagulačního faktoru se označuje skupina přečištěných bílkovin lidského či hovězího původu. Zahrnuje faktor X a tromboplastinový tkáňový faktor/fosfolipid jako aktivátor faktoru VII. Tyto bílkoviny jsou částečně přečištěny a neobsahují nečistoty, které zasahují do aktivace faktoru VII nebo faktoru X. Faktor X je přítomen v množství, které během první fáze stanovení dává konečnou koncentraci 10 nmol/l až 350 nmol/l, přednostně 14 nmol/l až 70 nmol/l. Jako tkáňový faktor/fosfolipid se mohou používat tromboplastin přírodního původu (hovězí nebo králičí mozek) nebo syntetické přípravky. Tromboplastin vhodný ke stanovení tromboplastinového času se ředí 1 : 5 až 1 : 50 tlumivým roztokem tak, aby konečná koncentrace vápenatých iontů byla 15 mmol/l až 25 mmol/l. Konečná tvorba faktoru Xa probíhá v roztoku, který obsahuje lidský nebo hovězí albumin v takové koncentraci, že nedochází k adsorpčním ztrátám, a jehož pH je vhodně upraveno na 7,3 až 8,0. V konečné inkubační směsi je faktor VII jedinou složkou limitující stupeň tvorby faktoru Xa a žádná reakční složka nemá mít vlastní schopnost tvořit faktor Xa.

   Ve druhé fázi se určí množství vzniklého faktom Xa za použití chromogenního substrátu, který je specifický pro faktor Xa. Obvykle je tvořen krátkým peptidem o třech až pěti aminových kyselinách vázaným na chromoforovou skupinu. Při odštěpení této skupiny od peptidového substrátu se její absorpční maximum posune k vlnové délce umožňující spektrofotometrické stanovení množství. Substrát se obvykle rozpustí ve vodě R a používá se ve výsledné koncentraci 0,2 mmol/l až 2 mmol/l. Substrát může také obsahovat vhodné inhibitory k zastavení další tvorby faktoru Xa (přidání edetanu).

   Postup stanovení účinnosti

   Celý obsah jedné ampule porovnávacího přípravku a zkoušeného přípravku se rozpustí přidáním vhodného množství vody R; použije se během 1 h. Rozpuštěné přípravky se dále naředí tak, aby vznikly roztoky obsahující 0,5 m.j. až 2,0 m.j. faktoru VII v mililitru.

   Připraví se další ředění porovnávacího a zkoušeného přípravku za použití izotonického tlumivého roztoku nevázajícího vápník, která obsahují 1 % hovězího nebo lidského albuminu a přednostně mají pH 7,3 až 8,0. Připraví se nejméně tři oddělená nezávislá ředění pro každý přípravek, nejlépe ve dvojici. Ředění se připraví tak, aby konečná koncentrace faktoru VII byla nižší než 0,005 m.j. v mililitru.

   Připraví se kontrolní roztok, který obsahuje všechny složky kromě faktoru VII.

   Všechna ředění se připravují ve zkumavkách z plastů a použijí se během 1 h.

   1. 1. fáze. Ředění porovnávacího přípravku faktoru VII a zkoušeného přípravku se smíchají s vhodným objemem předehřátého zkoumadla koagulačního faktoru nebo s kombinací jeho jednotlivých složek a směs se inkubuje ve zkumavkách z plastů nebo na mikrotitračních deskách při 37 °C. Koncentrace různých složek během tvorby faktoru Xa odpovídá specifikaci uvedené v popisu zkoumadla.

      Aktivace faktoru X se nechá probíhat po vhodnou dobu. Obvykle se reakce ukončí předtím, než koncentrace faktoru Xa dosáhne své maximální hladiny, aby se docílila uspokojivá lineární závislost mezi dávkou a odpovědí. Doba aktivace se volí také tak, aby tvorba faktoru Xa byla lineárně závislá na čase. Vhodné doby aktivace obvykle kolísají mezi 2 min a 5 min, ale jsou přípustné odchylky, pokud je dosaženo přijatelné linearity ve vztahu mezi dávkou a odpovědí.

   1. 2. fáze. Aktivace se ukončí přidáním předehřátého zkoumadla s obsahem chromogenního substrátu. Provádí se hodnocení stupně štěpení substrátu, které musí být lineární s koncentrací vzniklého faktoru Xa, měřením změny absorbance při vhodné vlnové délce za použití spektrofotometru. Použije se bud’ průběžné sledování absorbance, které umožňuje vypočítat počáteční stupeň štěpení substrátu, nebo se po vhodné době ukončí hydrolýza snížením pH po přidání vhodné látky, jako je kyselina octová (500 g/l C₂H₄O₂) nebo roztok citronanu (1mol/l) na pH 3. Doba hydrolýzy se nastaví tak, aby se dosáhlo lineární závislosti tvorby chromoforu na čase. Vhodné trvání hydrolýzy obvykle kolísá mezi 3 min a 15 min, ale jsou přípustné odchylky, pokud se dosáhne lepší lineární závislosti mezi dávkou a odpovědí.

      Zkontroluje se validita stanovení a vypočítá se účinnost zkoušeného přípravku obvyklými statistickými metodami (např. 5.3. Statistické analýzy výsledků biologických zkoušek).

   Tab. 2.7.2-1 Difuzní metoda Tab. 2.7.2-2 Turbidimetrická metoda Doporučené mikroorganismy Příprava inokula Tlumivé roztoky Tab. 2.7.2-3 Živné půdy Zkoumadla Postup stanovení účinnosti

   2.7.11 Stanovení účinnosti lidského koagulačního faktoru IX

   Podstata zkoušky. Účinnost zkoušeného přípravku se stanoví porovnáním množství přípravku potřebného ke zkrácení srážecího času zkušební směsi obsahující jiné látky než faktor IX, jež se podílejí na srážení krve, s množstvím porovnávacího přípravku kalibrovaného v mezinárodních jednotkách, které je zapotřebí k vyvolání stejného účinku.

   Mezinárodní jednotka je účinnost deklarovaného množství mezinárodního standardu, kterým je lyofilizovaný koncentrát lidského koagulačního faktoru IX. Hodnotu účinnosti mezinárodního standardu v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Světová zdravotnická organizace.

   Postup stanovení. Zkoušený přípravek a porovnávací přípravek se odděleně rozpustí podle návodu uvedeného v označení na obalu a ihned se použijí. Pokud přípravek obsahuje heparin, stanoví se jeho množství (2.7.12) a heparin se neutralizuje přidáním protaminiumsulfatu R (10 μg protaminiumsulfatu neutralizuje 1 m.j. heparinu). Zkoušený přípravek a porovnávací přípravek se zředí dostatečným množstvím tlumivého roztoku imidazolového o pH 7,3 tak, aby se získaly roztoky obsahující 0,5 m.j. až 2,0 m.j. v mililitru. Směsí objemových dílů roztoku citronanu sodného R (38 g/l) a tlumivého roztoku imidazolového o pH 7,3 (1 + 5) se připraví řada dvojnásobných ředění v rozmezí 1 : 10 až 1 : 80. Tato ředění je třeba připravit přesně a ihned je použít.

   Použijí se např. inkubační zkumavky, které se ponechají ve vodní lázni při 37 °C. Do každé z nich se dá 0,1 ml plazmy substrátu RS2 a 0,1 ml příslušného ředění zkoušeného nebo porovnávacího přípravku. Do každé zkumavky se přidá 0,1 ml vhodného ředění zkoumadla cefalinového R nebo krevních destiček náhrady R a 0,1 ml suspenze 0,5 g kaolinu lehkého R ve 100 ml roztoku chloridu sodného R (9 g/l). Pak se obsah zkumavek inkubuje 10 min za stálého protřepávání. Do každé zkumavky se přidá 0,1 ml chloridu vápenatého R (7,4 g/l).

   Pomocí stopek se změří srážecí čas, tj. interval mezi přidáním chloridu vápenatého a prvními známkami tvorby fibrinu, což je možno určit vizuálně nebo vhodným přístrojem. K výpočtu účinnosti se použijí obvyklé statistické metody (např. 5.3 Statistické analýzy výsledků biologických zkoušek).

   Aby se zajistilo, že plazma substrát RS2 neobsahuje zjistitelnou kontaminaci faktorem IX, provede se slepá zkouška, v níž se místo zkoušeného přípravku použije odpovídající množství směsi objemových dílů roztoku citronanu sodného R (38 g/l) a tlumivého roztoku imidazolového o pH 7,3 R (1 + 5). Zkoušku lze hodnotit, jestliže srážecí čas slepé zkoušky je v rozmezí 100 s až 200 s.

   Tab. 2.7.2-1 Difuzní metoda Tab. 2.7.2-2 Turbidimetrická metoda Doporučené mikroorganismy Příprava inokula Tlumivé roztoky Tab. 2.7.2-3 Živné půdy Zkoumadla Postup stanovení účinnosti

   2.7.12 Stanovení účinnosti heparinu v koncentrátech koagulačních faktorů

   Podstata zkoušky. Měří se absorbance při 405 nm roztoku zkoušeného vzorku a roztoku referenčního přípravku heparinu po inkubaci s definovaným nadbytkem trombinu a chromogenního substrátu specifického pro trombin. Nárůst absorbance (v závislosti na množství uvolněného p-nitroanilinu) při 405 nm je nepřímo úměrný množství heparinu ve vzorku.

   Zkoušené roztoky. Přípravek se rozpustí předepsaným způsobem a naředí se vhodným tlumivým roztokem (např. roztok chloridu sodného R (7 g/l) a citronanu sodného R (6 g/l) o pH 7,3) na koncentraci asi 0,25 m.j. heparinu v mililitru. Připraví se řada ředění (až do 1 : 32) za použití vhodného tlumivého roztoku (např. roztok trometamolu R (6 g/l), kyseliny edetové R (2,2 g/l), chloridu sodného R (11,3 g/l) o pH 8,4). Naředěné roztoky se nechají stát 30 min.

   Porovnávací roztoky. Referenční přípravek heparinu se naředí vhodným tlumivým roztokem (např. roztok trometamolu R (6 g/l), kyseliny edetové R (2,2 g/l), chloridu sodného R (11,3 g/l) o pH 8,4) na koncentraci asi 0,25 m.j. heparinu v mililitru a připraví se řada ředění (až do 1 : 32).

   Postup stanovení. Do řady zkumavek z plastu se napipetuje po 200 μl zkoušeného roztoku nebo porovnávacího roztoku nebo kontrolního roztoku (tlumivý roztok použitý k ředění) a po 200 μl roztoku antitrombinu III R (3 m.j./ml). Směs se nechá stát 30 min a přidá se po 200 μl roztoku trombinu hovězího R (20 m.j./ml). Řádně se promíchá pomocí vibrační míchačky a nechá se stát 90 s při 37 °C.

   Připraví se roztok chromogenního substrátu specifického pro trombin v koncentraci odpovídající nejméně dvojnásobku hodnoty K_m (Michaelisovy konstanty).

   Substrátový roztok se ohřeje na 37 °C a přidá se po 200 μl do každé zkumavky, která obsahuje zkoušený roztok, porovnávací roztok nebo kontrolní roztok. Vše se řádně promíchá pomocí vibrační míchačky. Inkubuje se 90 s při 37 °C a reakce se zastaví přidáním po 200 μl roztoku kyseliny octové R (500 g/l C₂H₄O₂) a změří se absorbance při 405 nm.

   Obsah heparinu ve zkoušeném přípravku se vypočítá za použití obvyklých statistických metod (např. 5.3. Statistické analýzy výsledků biologických zkoušek).

1. 2.9 Metody farmaceutické technologie

   Tab. 2.7.2-1 Difuzní metoda Tab. 2.7.2-2 Turbidimetrická metoda Doporučené mikroorganismy Příprava inokula Tlumivé roztoky Tab. 2.7.2-3 Živné půdy Zkoumadla Postup stanovení účinnosti

   2.9.18 Přípravky k inhalaci: aerodynamické stanovení jemných částic

   Podstata zkoušky. Zkouškou se stanovují jemné částice charakterizující obláčky aerosolů vytvářené přípravky k inhalaci.

   Pokud není uvedeno a schváleno jinak, použijí se ke zkoušce níže uvedené přístroje a zkušební postupy.

   Přístroj 1. Vícestupňový kapalinový odlučovač

   Přístroj se skládá z prvního patra (předseparátoru), odlučovacích pater 2, 3, 4 a z filtračního patra 5, které s nimi tvoří celek, viz obrázky 2.9.18-1/3.

   K odlučovacímu patru patří horní kovová přepážka (B), kterou prochází vstupní kovová trubice – tryska (A) s odlučovací deskou (D), skleněný válec (E) opatřený vzorkovacím okénkem (F), tvořící svislou stěnu patra, a vodorovná spodní kovová přepážka (G), kterou prostupuje trubice (H) spojující patro s nejblíže nižším patrem. Trubice (U) vedoucí do 4. patra je zakončena sadou trysek. Odlučovací deska (D) je zajištěna kovovým rámem (J) upevněným dvěma dráty (K) k objímce (L) na přepadové trubce (C). Vodorovný povrch sběrné desky je kolmý k ose přepadové trubky. Sběrné desky mají soustředné uspořádání.

   Horní povrch odlučovací desky poněkud převyšuje okraj kovového rámu. Vybrání podél obvodu vodorovné příčky slouží ke správnému umístění skleněného válce. Skleněné válce jsou v přepážkách zajištěny těsněním (M) a dohromady jsou sepnuty šesti svorníky (N). Vzorkovací okénka se uzavírají zátkami. Spodní strana nižší přepážky čtvrtého patra má soustředný výstupek opatřený gumovým kroužkem (P), který utěsňuje okraj filtru zachycený v držáku filtru. Držák filtru (R) je konstruován jako miska se soustředným vybráním, v němž je zapuštěna perforovaná podpěra filtru (S). Soustava odlučovacích pater je sepnuta s držákem filtru pomocí dvou úchytných uzávěrů (T). Držák filtru je upraven pro filtry o průměru 76 mm. Na vstup do prvního patra se připojí vstupní díl tvořený trubkou s pravoúhlým kolenem - viz obrázek 2.9.18-4. Vzduchotěsnost spojení se zajistí pryžovým těsnicím kroužkem. Ke vstupnímu dílu, pomocí vhodného adaptéru, se vzduchotěsně připojí náustek inhalačního přípravku. Konec náustku je zarovnán s čelem vstupního dílu.

   

   Obr. 2.9.18-1 Vícestupňový kapalinový odlučovač

   Tab. 2.9.18-1 Specifikace dílů k obrázkům 2.9.18-1/3

   Tab. 2.7.2-1 Difuzní metoda Tab. 2.7.2-2 Turbidimetrická metoda Doporučené mikroorganismy Příprava inokula Tlumivé roztoky Tab. 2.7.2-3 Živné půdy Zkoumadla Postup stanovení účinnosti Přístroj 1. Vícestupňový kapalinový odlučovač

   Označení(1)	Předmět	Popis	Rozměry(2)
   A, Η	tryska-trubice	kovová trubice zašroubovaná do	viz obrázek 2.9.18-2
   B, G	mezistěna	kruhová kovová deska	120
   C	těsnění	např. PTFE	dle potřeby k utěsnění trysky
   D	odlučovací deska	disk ze slinutého skla porozita 0	viz obrázek 2.9.18-2
   E	skleněný válec	skleněná leštěná trubice
   		- výška, včetně těsnění	46
   		- vnější průměr	100
   		- tloušťka stěny	3,5
   		- vzorkovací okénko (F)
   		- průměr	18
   		- zátka do okénka	ISO 24/25
   J	kovový rám	kruhový rám profilu L se zářezem
   		- vnitřní průměr	pro zachycení odluč, desky
   		- výška	4
   		- tloušťka horizontální části	0,5
   		- tloušťka vertikální části	2
   K	drát	ocelový drát spojující kovový rám
   		- průměr	1
   L	objímka	kovová objímka připojená šrou-
   		- vnitřní průměr	vhodný k upevnění trysky
   		- výška	6
   		- tloušťka	5
   M	těsnění	např. silikonové	k upevnění skleněn. válce
   N	svorník	kovový svorník s maticí (6 párů)
   		- délka	205
   		- průměr	4
   P	O-kroužek	gumový kroužek
   		- průměr x tloušťka	66,34 x 2,62
   Q	O-kroužek	gumový kroužek
   		- průměr x tloušťka	29,1 x 1,6
   R	držák filtru	Kovové pouzdro s podstavcem	viz obrázek 2.9.18-3
   S	podpěra filtru	perforovaná kovová destička
   		- průměr	65
   		- průměr otvoru	3
   		- vzdálenost mezi středy otvorů	4
   T	úchytné uzávěry
   U	soustava trysek	trubice (H) zakončená soustavou	viz obrázek 2.9.18-2

   ⁽¹⁾ Vztaženo na obrázek 2.9.18-1.

   ⁽²⁾ Rozměry v milimetrech, tolerance dle ISO 2768-m, pokud není uvedeno jinak.

   

   Obr. 2.9.18-2 Detaily kovové trubice a sběrné desky

   Vlevo detaily zakončení trubice U vedoucí do 4. patra (vysvětlivky označení a rozměry viz obrázek 2.9.18-1)

   

   Obr. 2.9.18-3 Detaily filtračního patra (5. patro)

   Uvedeny rozměry ( Ø průměr). Návaznost na označení v tab. 2.9.18-1.

   Tab. 2.9.18-2 Rozměry ⁽¹⁾ trysky s odlučovací deskou

   Tab. 2.7.2-1 Difuzní metoda Tab. 2.7.2-2 Turbidimetrická metoda Doporučené mikroorganismy Příprava inokula Tlumivé roztoky Tab. 2.7.2-3 Živné půdy Zkoumadla Postup stanovení účinnosti Přístroj 1. Vícestupňový kapalinový odlučovač

   Druh	Označení	1. patro	2. patro	3. patro	4. patro	Filtr (5. patro)
   Vzdálenost	1	9,5(-,0+,5)	5,5(-,0+,5)	4,0(-,0+,5)	6,0(-,0+,5)	n
   Vzdálenost	2	26	31	33	30,5	0
   Vzdálenost	3	8	5	5	5	5
   Vzdálenost	4	3	3	3	3	n
   Vzdálenost	5	0	3	3	3	3
   Vzdálenost	6(3)	20	25	25	25	25
   Vzdálenost	7	n	n	n	8,5	n
   Průměr	c	25	14	8,0(±,1)	21	14
   Průměr	d	50	30	20	30	n
   Průměr	e	27,9	16,5	10,5	23,9	n
   Průměr	f	31,75 (,0+,5)	22	14	31	22
   Průměr	g	25,4	21	13	30	21
   Průměr	h	n	n	n	2,70(±,5)	n
   Průměr	j	n	n	n	6,3	n
   Průměr	k	n	n	n	12,6	n
   Poloměr(4)	r	16	22	27	28,5	0
   Poloměr	s	46	46	46	46	n
   Poloměr	t	n	50	50	50	50
   Úhel	w	10°	53°	53°	53°	53°
   Úhel	u	n	n	n	45°	n
   Úhel	v	n	n	n	60°	n

   ⁽¹⁾ Rozměry v milimetrech, tolerance dle ISO 2768-m, pokud není uvedeno jinak.

   ⁽²⁾ Vztahuje se k obrázku 2.9.18-2.

   ⁽³⁾ Včetně těsnění.

   ⁽⁴⁾ Vztaženo na střed komory.

   n - nevztahuje se na tuto položku

   

   Obr. 2.9.18-4 Vstupní díl

   Rozměry v milimetrech, není-li určeno jinak.

   Poznámky

   (1) Materiál je z hliníku nebo nerezové oceli.

   (2) Strojní opracování z materiálu tvaru tyč kulatá (v průřezu) průměr 38 mm (15").

   (3) Díra 19 mm procházející celou tyčí.

   (4) Seříznutí trubice přesně 45°.

   (5) Vnitřek trubice a úkosu musí být hladký – cca 0,40 μm (16 μm) – leštěný.

   (6) Zabroušení spojovacích míst trubice k dosažení vodotěsnosti.

   (7) Dva díly trubice s vnitřním otvorem 19 mm se sestaví a po vyvrtání a vyřezání otvorů a závitů šrouby M4 x 0,7 nebo 8-32 se sešroubují. Spoj uvnitř trubice musí být dokonalý, bez převisů a dutin.

   Postup pro dávkované tlakové přípravky pro inhalaci

   Do každého ze čtyř horních pater přístroje se odměří 20 ml vhodného rozpouštědla schopného rozpustit účinnou látku a nasadí se zátky. Nakloněním přístroje se navlhčí zátky, tím se neutralizují elektrostatické náboje. Na patro č. 5 se vloží vhodný filtr a přístroj se sestaví. Na konci vstupního dílu se upevní vhodný adaptér náustku do takové polohy, aby konec náustku rozprašovače (inhalačního přípravku) byl po zasunutí ve vodorovné poloze shodné s osou vstupního dílu a rozprašovač byl v poloze odpovídající jeho použití. Výpust přístroje se spojí s vhodným odsávacím zařízením (vývěvou) a průtok vzduchu přístrojem se upraví tak, aby do vstupního dílu přicházelo (30 ± 1,5) 1/min vzduchu. Pak se průtok vzduchu vypne.

   Není-li v instrukcích pro pacienty předepsáno jinak, protřepává se 5 s inhalátorem, vystříkne se jednou do odpadu. Zapne se odsávání z přístroje. Konec náustku se vsune do spojovacího adaptéru přístroje a stlačí se ventil po dobu zaručující kompletní výstřik (podání). Odpojí se inhalátor od adaptéru a postup se opakuje. Má se uskutečnit jen minimální počet podání, běžně je tento počet nejvíce deset. Při tomto počtu podání má však být zamčeno přesné a správné stanovení dávky jemných částic. Po posledním podání se čeká 5 s a pak se vypne odsávání.

   Filtrační patro přístroje se rozebere, opatrně se vyjme filtr a účinná složka se rozpouštědlem kvantitativně vyextrahuje. Pak se z přístroje vyjme vstupní díl a adaptér pro náustek a léčivá látka se opět vyextrahuje. Je-li třeba, vnitřek trubice vedoucí na první patro se propláchne rozpouštědlem, které je na prvním patře a které se pak nechá stéci na patro zpět. Léčivá látka se pak vyextrahuje i z vnitřních stěn a sběrných desek všech čtyř horních pater přístroje, vždy do roztoku, který je na daném patře tak, že se přístroj naklání a otáčí, přičemž je třeba dbát na to, aby tekutina nepřetekla na jiné patro.

   Za použití vhodné analytické metody se stanoví množství účinné složky obsažené v každém z šesti objemů roztoku.

   Vypočte se množství účinné složky (viz níže uvedené).

   Postup pro inhalátory prášku

   Na páté patro se vloží vhodný nízkoodporový filtr schopný kvantitativně zachytit léčivou látku a přístroj se sestaví. Přístroj se připojí k odsávacímu systému podle schématu na obrázku 2.9.18-5. Není-li předepsáno jinak, uskuteční se zkouška při průtokové rychlosti Q použité ve zkoušce Stejnoměrnosti podané dávky prosáním 4 litrů vzduchu přes přístroj.

   Ke vstupnímu dílu přístroje se připojí průtokoměr kalibrovaný na průtočný objem na výstupu z měřiče. Průtočný kontrolní ventil se nastaví tak, aby průtoková rychlost dosahovala požadované hodnoty Q (± 5 %). Pak se vypne průtok.

   Nastaví se kritický průtok přes průtočný kontrolní ventil. U přístroje s připojeným inhalátorem se měří absolutní hodnoty tlaků na obou stranách kontrolního ventilu (odečítací místa P2 a P3 na obrázku 2.9.18-5). Poměr P3/P2 ≤ 0,5 určuje kritický průtok. Když není dosaženo požadovaných hodnot, použije se účinnější vakuová pumpa a měření se opakuje.

   Do každého ze čtyř horních pater přístroje se odměří 20 ml vhodného rozpouštědla a nasadí se zátky. Nakloněním přístroje se navlhčí zátky, tím se vyruší elektrostatické náboje. Na konec vstupního dílu se nasadí vhodný adaptér pro náustek přípravku.

   Inhalační práškový přípravek se připraví k použití podle instrukcí pro pacienty. Při běžícím odsávání a uzavření dvoucestného ventilu vsune se náustek přípravku do adaptéru vstupního dílu. Otevřením ventilu po doporučenou dobu T (± 5 %) se vefoukne (insufluje) prášek do přístroje. Postup se opakuje. Má se uskutečnit jen minimální počet podání, běžně je tento počet nejvíce deset. Při tomto počtu podání má však být zaručeno přesné a správné stanovení dávky jemných částic. Po posledním podání se čeká 5 s a pak se vypne odsávání.

   Filtrační patro přístroje se rozebere, opatrně se vyjme filtr a léčivá látka se rozpouštědlem kvantitativně vyextrahuje. Pak se z přístroje vyjme vstupní díl a adaptér pro náustek a léčivá látka se opět vyextrahuje. Je-li třeba, vnitřek trubice vedoucí na první patro se propláchne rozpouštědlem, které je na prvním patře a které se pak nechá stéci na patro zpět. Léčivá látka se pak vyextrahuje i z vnitřních stěn a sběrných desek všech čtyř horních pater přístroje, vždy do roztoku, který je na daném patře tak, že se přístroj naklání a otáčí, přičemž je třeba dbát na to, aby tekutina nepřetekla na jiné patro.

   Za použití vhodné analytické metody se stanoví množství léčivé látky obsažené v každém z šesti objemů roztoku.

   Vypočte se množství léčivé látky (viz dále uvedené).

   

   Obr. 2.9.18-5 Aparatura k měření prášků pro inhalaci

   Tab. 2.9.18-3 Specifikace dílů k obrázku 2.9.18-5

   Tab. 2.7.2-1 Difuzní metoda Tab. 2.7.2-2 Turbidimetrická metoda Doporučené mikroorganismy Příprava inokula Tlumivé roztoky Tab. 2.7.2-3 Živné půdy Zkoumadla Postup stanovení účinnosti Přístroj 1. Vícestupňový kapalinový odlučovač Postup pro dávkované tlakové přípravky pro inhalaci Postup pro inhalátory prášku

   Označení	Název	Popis
   Aa	spojka	vnitřní průměr ≥8 mm, např. krátká kovová spojka s odbočkou o menším průměru k P3
   B	vakuová hadice	Vnitřní průměr (8 ± 0,5) mm, délka (50 ± 10) cm, např. silikonová hadice vnějšího průměru 14 mm a vnitřního průměru 8 mm
   C	dvoucestný solenoidový ventil	ústí s minimálním odporem průtoku vzduchu, vnitřní průměr ≥8 mm a maximální reakční dobou 100 ms (např. typ 256 A08, Bürkert GmbH, D7118), nebo ekvivalentní
   D	vývěva	vyhovuje kapacitou pro požadovanou rychlost toku vzduchu přes sestavenou aparaturu s práškovým inhalačním přípravkem připojeným k adaptéru náustku (např. výrobky typ 1023, 1423 nebo 2565, Gast Manufacturing Inc., Benton Harbor, MI 49022), nebo ekvivalentní. Spojení vývěvy se solenoid, ventilem pomocí krátké a/nebo široké (≥10 mm vnitřní průměr) vakuové hadice, spoje minimalizující ztrátu kapacity vývěvy
   E	časový spínač	schopný řízení solenoidového ventilu v požadovaných intervalech (např. typ G814, RS Components International, Corby, NN17 9RS, UK), nebo ekvivalentní
   P2, P3	manometry	měření za podmínek stálého toku s převodníkem na absolutní tlak
   F	průtočný kontrolní ventil	nastavitelný regulační ventil s maximem Cv ≥1, (např. typ 8FV 12LNSS, Parker Hannifin plc., Barnstaple, EX31 1NP, UIK), nebo ekvivalentní

   Přístroj 2 - “Andersenův“ vzorkovač velikostí

   Andersenův 1 ACFM vzorkovač velikostí neživých částic z prostředí tvoří 8 hliníkových pater společně s konečnou filtrací. Jednotlivá patra jsou spojena a utěsněna těsněním (O-kroužek). V provedení používaném pro tlakové inhalátory, viz obrázku 2.9.18-6, kuželový vstup vzorkovače je připojen k pravoúhlému, kovovému vstupnímu dílu popsanému na obrázku 2.9.18-4. Použije se vhodný adaptér ke vzduchotěsnému spojení náustku a vstupního dílu. Čelo náustku musí být zarovnáno s čelem vstupního dílu. V sestavě přístroje pro hodnocení práškových inhalačních přípravků umístí se na horní patro předseparátor sloužící k zachycení velkých, nevdechnutelných částic prášku. Připojí se ke vstupnímu dílu, viz obrázek 2.9.18-7. K dosažení vysoké tokové rychlosti přes vzorkovač se připojí přístroj k odsávacímu systému přípojkou o vnitřním průměru ≥8 mm.

   

   Obr. 2.9.18-6 Andersenův vzorkovač velikostí v úpravě pro tlakové přípravky pro inhalaci

   

   Obr. 2.9.18-7 Přípojka vstupního dílu k předseparátoru Andersenova přístroje

   Materiál: hliník (lze poniklovat z důvodu chemické inertnosti).

   S výjimkou označené, všechny další hrany srazit.

   Povrchy strojově leštěné.

   Vnitřek trubice zaleštěný na Ra 0,40 μm.

   O-kroužek: rozměry: vnitřní průměr 29 mm, vnější průměr 32 mm, šířka 1,8 mm.

   Postup pro tlakové inhalační přípravky

   Andersenův přístroj se sestaví, včetně vhodného filtru, a zajistí se jeho vzduchotěsnost. Na konci vstupního dílu se upevní vhodný adaptér náustku do takové polohy, aby konec náustku rozprašovače byl po zasunutí ve vodorovné poloze shodné s osou vstupního dílu a rozprašovač byl v poloze odpovídající jeho použití. Výstup z přístroje se spojí s vhodným odsávacím zařízením (vakuovou pumpou) a průtok vzduchu přístrojem se upraví tak, aby do vstupního dílu přicházelo (28,3 ± 1,5) 1/min vzduchu. Pak se průtok vzduchu vypne.

   Není-li v instrukcích pro pacienty předepsáno jinak, protřepává se 5 s inhalátorem a vystříkne se jednou do odpadu. Zapne se odsávání z přístroje. Náustek se vsune do adaptéru a z nádobky přípravu v převrácené poloze, stisknutím ventilu po dostatečnou dobu se uskuteční úplný výstřik. Vyjme se inhalační přípravek z adaptéru a postup se opakuje. Má se uskutečnit jen minimální počet podání, běžně je tento počet nejvíce deset. Při tomto počtu podání má však být zamčeno přesné a správné stanovení dávky jemných částic. Po posledním podání se čeká 5 s a pak se vypne odsávání.

   Přístroj se rozebere, opatrně se vyjme filtr a léčivá látka se rozpouštědlem kvantitativně vyextrahuje. Vyjme se vstupní díl a adaptér pro náustek a léčivá látka se opět vyextrahuje. Léčivá látka se pak vyextrahuje i z vnitřních stěn a sběrných desek všech pater přístroje.

   Za použití vhodné analytické metody se stanoví množství léčivé látky obsažené v každém z devíti objemů roztoku.

   Vypočte se množství léčivé látky (viz dále uvedené).

   Postup pro inhalátory prášku

   Aby Andersenův přístroj mohl být použit pro stanovení u práškových inhalačních přípravků, volí se jiná průtoková rychlost než 28,3 l/min. Dosud nejsou k dispozici všeobecná kalibrační data, a tudíž každý uživatel musí validovat zařízení při jím použitých podmínkách. Lze použít následující postup.

   Přístroj se sestaví, připojí se předseparátor, vloží se vhodný filtr a zajistí se vzduchotěsnost zařízení. K zajištění dostatečného zachycení částic se pokryjí povrchy všech desek glycerolem nebo jinou vhodnou viskózní tekutinou. Stejně se pokryje i předseparátor, případně by mohl obsahovat 10 ml vhodného rozpouštědla. Přístroj se připojí k odsávacímu systému tak, jak je uvedeno na obrázku 2.9.18-5.

   Není-li předepsáno jinak, uskuteční se zkouška při průtokové rychlosti použité ve zkoušce Stejnoměrnost podané dávky prosáním 4 litrů vzduchu přes přístroj. K dosažení vyšší průtokové rychlosti, je-li potřebné, lze odstranit nejnižší patro ze sestavy přístroje. Ke vstupnímu dílu přístroje se připojí průtokoměr kalibrovaný na průtočný objem na výstupu z měřiče. Průtočný kontrolní ventil se nastaví tak, aby průtoková rychlost dosahovala požadované hodnoty Q (± 5 %). Kritická hodnota průtoku přes kontrolní ventil se nastaví tak, jak je popsáno pro přístroj 1. Vypne se průtok.

   Inhalační práškový přípravek se připraví k použití podle instrukcí pro pacienty. Při běžícím odsávání a uzavření dvoucestného ventilu, se vsune náustek přípravku do adaptéru vstupního dílu. Otevřením ventilu po doporučenou dobu T (± 5%) se vefoukne (insufluje) prášek do přístroje. Postup se opakuje. Má se uskutečnit jen minimální počet podání, běžně je tento počet nejvíce deset. Při tomto počtu podání má však být zamčeno přesné a správné stanovení dávky jemných částic. Po posledním podání se čeká 5 s a pak se vypne odsávání.

   Přístroj se rozebere, opatrně se vyjme filtr a léčivá látka se rozpouštědlem kvantitativně vyextrahuje. Vyjme se vstupní díl a adaptér pro náustek a léčivá látka se opět vyextrahuje. Léčivá látka se pak vyextrahuje i z vnitřních stěn a sběrných desek všech pater přístroje.

   Za použití vhodné analytické metody se stanoví množství léčivé látky obsažené v každém z devíti objemů roztoku.

   Vypočte se množství léčivé látky (viz dále uvedené).

   Výpočty

   Po analýzách všech roztoků se vypočte množství léčivé látky na jedno podání (vstříknutí nebo insuflaci) pro každé patro a množství léčivé látky na jedno podání ve vstupním dílu, adaptéru náustku a i předseparátoru, kde byl použit. Celkové množství léčivé látky není menší než 75 % a není větší než 125 % průměrné podané dávky stanovené při zkoušce na Stejnoměrnost podané dávky. Je-li celkové množství mimo uvedené rozmezí, zkouška se opakuje.