Vyhláška Ministerstva zdravotnictví, kterou se mění vyhláška Ministerstva zdravotnictví č. 1/1998 Sb., kterou se stanoví požadavky na jakost, postup při přípravě, zkoušení, uchovávání a dávkování léčiv (Český lékopis 1997)

Endotoxiny pocházející z gramnegativních bakterií jsou nejčastější příčinou toxických reakcí přisuzovaných kontaminaci farmaceutických přípravků pyrogenními látkami; pyrogenní účinnost endotoxinů je mnohem vyšší než účinnost jiných pyrogenních látek. Endotoxiny jsou lipopolysacharidy. Ačkoli množství pyrogenních látek s odlišnou strukturou je malé, obecně platí, že nepřítomnost bakteriálních endotoxinů v přípravku je známkou absence pyrogenních složek za předpokladu, že lze vyloučit přítomnost neendotoxinových pyrogenních látek.

Přítomnost endotoxinů v přípravku může být zakryta faktory interferujícími s reakcí mezi amebocytárním lyzátem a endotoxiny. Proto analytik, chce-li nahradit zkoušku na pyrogenní látky na králících, která je požadována lékopisným článkem, zkouškou na endotoxin, prokáže, že přípravek lze zkoušet validovaným způsobem, který může obsahovat postup na odstranění interferujících faktorů.

Jak je uvedeno ve zkoušce na bakteriální endotoxiny, je třeba mít dostatečné informace o následujících aspektech dříve, než bude zkouška se vzorkem uznána za validovanou:

1. 1.1 Prokáže se vhodnost materiálů ke zkoušce. Má se prokázat nepřítomnost endotoxinu ve vodě pro LAL a v ostatních zkoumadlech a má se ověřit citlivost lyzátu, aby se ověřila citlivost deklarovaná výrobcem.
2. 1.2 Protože zkoušený přípravek může ve zkoušce interferovat, přezkouší se citlivost lyzátu v nepřítomnosti i v přítomnosti zkoušeného přípravku. Mezi oběma hodnotami citlivosti se nezjistí signifikantní rozdíl.

Zkouška na bakteriální endotoxin uvádí též způsob odstranění interferujících faktorů (viz Gelové metody); v případě interference se po použití takového postupu provede další zkouška, aby se ověřilo, zda použitá metoda skutečně neutralizovala nebo odstranila interferenci.

Jestliže zkoušený vzorek nevyhovuje zkoušce (pozitivní výsledek), je možno zkoušku opakovat. Zřejmé nevyhovění přípravku požadavkům zkoušky může být způsobeno chybou v jeho přípravě, ředěním nebo jinou náhodnou laboratorní kontaminací.

V této části jsou vysvětleny důvody pro požadavky obsažené ve zkoušce na bakteriální endotoxiny a potom je pojednáno o odečítání a interpretaci výsledků.

Nahrazení lékopisné zkoušky na pyrogenní látky prováděné na králících LAL testem v podstatě představuje použití alternativní metody analýzy, a proto vyžaduje validaci. Některé pokyny k jejímu provedení jsou uvedeny v této části.

Referenční metoda na stanovení bakteriálních endotoxinů je uvedena v článku daného přípravku; není-li metoda uvedena, použije se jako referenční metoda A. Má-li se použít jiná než referenční metoda, musí analytik prokázat, že tato metoda je vhodná pro přípravek a dává výsledky, které jsou shodné s výsledky získanými referenční metodou (viz též část 11).

Ačkoliv ve zkoušce na bakteriální endotoxiny je určen jako zdroj lyzátu druh Limulus polyphemus, je možno aktivní lyzát též získat z blízce příbuzných druhů, jako je rod Tachypleus. Výraz ”amebocytární lyzát” se v textu používá pro označení validovaného amebocytárního lyzátu bez ohledu na jeho biologický původ.

1. 2. Metoda

   Ačkoliv přidání endotoxinu k roztoku amebocytárního lyzátu může vést ke vzniku zákalu, sraženiny nebo gelu, pouze vznik gelu byl zvolen jako rozhodující u prvního typu zkoušky na bakteriální endotoxiny. Výhodou byla jednoduchost založená na rozhodnutí, zda přípravek vyhovuje nebo nevyhovuje na základě prostým okem patrné tvorby nebo nepřítomnosti gelu. Kvantitativní metody uvedené jako metody C, D, E byly vyvinuty později: vyžadují více přístrojového vybavení, ale jsou vhodnější pro automatické zkoušení velkého počtu vzorků jednoho přípravku.

   Endotoxiny se mohou adsorbovat na povrch zkumavek nebo pipet z určitých plastů nebo typů skla. Uvolnění látek z plastických materiálů může vyvolat interferenci. Proto se mají používané materiály kontrolovat; složení následujících šarží zkumavek nebo pipet se mohou mírně lišit, a proto se doporučuje, aby laboratorní pracovník opakoval takové zkoušení u každé nové šarže materiálů.

   Zatímco výsledky zkoušky na pyrogenní látky na králících jsou závislé na dávce pyrogenu, výsledky zkoušky na bakteriální endotoxiny závisí na koncentraci endotoxinu ve směsi. Rozhodnutí použít zkoušku na bakteriální endotoxiny jako limitní zkoušku je dáno tím, že za prvé musí být definována prahová koncentrace endotoxinu pro zkoušený přípravek a za druhé analytik provádějící zkoušku má vědět, kdy je koncentrace endotoxinu v přípravku pod nebo nad hranicí této prahové hodnoty. Kvantitativními metodami C, D, E je stanovení koncentrace endotoxinu ve zkoušeném vzorku jednoduché, ale v rutinní kontrole kvality je základním požadavkem otázka, zda-li tato koncentrace je nebo není vyšší než požadovaný limit.

   Při stanovování prahové koncentrace endotoxinu u zkoušeného přípravku je nutno brát zřetel na lidskou dávku přípravku, s cílem mít jistotu, že pokud je koncentrace endotoxinu v přípravku pod prahovou hodnotou, pak výsledná maximální dávka podaná odpovídajícím způsobem za hodinu neobsahuje dostatečné množství endotoxinu k rozvoji toxické reakce.

   Jestliže je koncentrace endotoxinu v přípravku přesně rovna prahové hodnotě, dojde ke vzniku gelu jako v případě, kdy je koncentrace endotoxinu mnohem vyšší a přípravek nevyhoví zkoušce, protože nelze rozlišit mezi koncentrací přesně se rovnající prahové koncentraci a mezi koncentrací vyšší. Pouze v případě, kdy nedojde ke vzniku gelu, může analytik rozhodnout, že koncentrace endotoxinu nepřesáhla koncentraci prahovou.

   U pevných přípravků je třeba prahovou koncentraci endotoxinu na jednotku hmotnosti nebo mezinárodní jednotku přípravku převést na koncentraci endotoxinu v mililitru zkoušeného roztoku, neboť zkoušku lze provádět pouze u roztoků. Přípravky, které existují pouze v tekutém stavu, jako jsou infuzní roztoky, jsou uvedeny dále.

   Stanovení prahové koncentrace endotoxinu v mezinárodních jednotkách endotoxinu v jednotce přípravku (jednotka hmotnosti nebo mezinárodní jednotka) vyžaduje definovat:

   M = maximální dávka přípravku pro dospělé vyjádřená v jednotkách hmotnosti nebo mezinárodních jednotkách na kilogram tělesné hmotnosti za hodinu, pokud se podává zamýšleným způsobem. Při stanovení maximální dávky pro dospělé se má použít hmotnost 70 kg pro dospělou osobu. Dětská dávka na kilogram hmotnosti za hodinu se má použít jen v případě, jeli vyšší než odpovídající dávka pro dospělé,

   K = maximální dávka endotoxinu v mezinárodních jednotkách endotoxinu na kilogram tělesné hmotnosti za hodinu, kterou může pacient dostat předepsaným způsobem bez nežádoucích účinků (Tabulka 2.6.14-1).

   Předpokládá se ke zkoušení roztok obsahující c mg (nebo mezinárodních jednotek) přípravku v mililitru. Potom objem M/c ml je objem obsahující maximální dávku M. Jestliže tento objem obsahuje K mezinárodních jednotek endotoxinu, bude výsledek zkoušky pozitivní.

   Proto limitní koncentrace endotoxinu (ELC) v mezinárodních jednotkách endotoxinu v mililitru, jež je shodná s prahovou koncentrací endotoxinu v miligramu nebo v mezinárodní jednotce přípravku v pevném stavu, je rovna:

   v němž značí:

   K - nejvyšší přijatelnou dávku endotoxinu v mezinárodních jednotkách na kilogram hmotnosti za hodinu,

   c - koncentraci roztoku v miligramech nebo mezinárodních jednotkách přípravku v mililitru,

   M - maximální dávku přípravku v miligramech nebo mezinárodních jednotkách na kilogram hmotnosti za hodinu.

   U přípravků, které jsou již v tekuté formě, se vyjádří maximální dávka pro dospělého na kilogram hmotnosti za hodinu v mililitrech. Výše uvedené vyjádření limitní koncentrace endotoxinu platí též pro přípravky, u nichž je uvedena maximální dávka v mililitrech na kilogram hmotnosti za hodinu nahrazením M a c hodnotou jedna.

   Prahová koncentrace endotoxinu byla v minulosti definována jako maximální povolená koncentrace endotoxinu (MAEC). Avšak prakticky přípravek obsahující množství endotoxinu, které se rovná přesně MAEC, by nevyhověl zkoušce stejně jako přípravek obsahující endotoxinu více. Jediný způsob, jak se přesvědčit, že MAEC v přípravku nebyla překročena, je prokázat, že koncentrace endotoxinu v přípravku je nižší než MAEC; takže je mnohem logičtější používat termín limitní koncentrace endotoxinu (ELC) jako koncentraci endotoxinu, která nesmí být dosažena.

   Limitní koncentrace endotoxinu závisí na druhu přípravku a jeho použití a je uvedena v jednotlivých článcích, do nichž je třeba nahlédnout. Hodnoty K jsou uvedeny v tabulce 2.6.14-1.

   Tab. 2.6.14-1

   Tab. 2.6.14-1

   Zamýšlený způsob podání	K v mezinárodních jednotkách endotoxinu na kilogram tělesné hmotnosti za hodinu
   Intravenózní	5,0
   Intravenózní pro radiofarmaka	2,5
   Intrathekalní	0,2

   Které ředění přípravku se má použít ve zkoušce, aby byla naprostá jistota, že negativní výsledek zkoušky znamená, že koncentrace endotoxinu v přípravku je nižší než ELC a že pozitivní výsledek znamená, že lyzát detegoval alespoň ELC. Toto ředění závisí na ELC a na citlivosti lyzátu: označuje se jako maximální platné ředění (MVD) a tato hodnota se může vypočítat ze vzorce.

   v němž značí:

   λ - uvedenou citlivost lyzátu v mezinárodních jednotách endotoxinu v mililitru.

   Jestliže hodnota maximálního platného ředění není celým číslem, pak je možno pro rutinní účel zvolit odpovídající celé číslo nižší, než je MVD (čímž je míněna hodnota ředění roztoku přípravku nižší, než je udaná hodnota MVD). V tomto případě negativní výsledek zkoušky ukazuje, že koncentrace endotoxinu v přípravku se nachází pod hladinou limitní hodnoty. Je-li však koncentrace endotoxinu v přípravku v takovéto zkoušce nižší než ELC, ale dostatečně vysoká k tomu, aby při reakci s lyzátem došlo k tvorbě gelu, může být zkouška hodnocena za těchto podmínek jako pozitivní. Tudíž, je-li zkouška s tímto "vhodným" ředícím faktorem pozitivní, je nutno přípravek ředit na MVD a zkoušku opakovat. V jakémkoli případě pochybností nebo sporu se použije MVD.

   To zdůrazňuje důležitost potvrzení citlivosti lyzátu.

   Příklad

   Zkouší se roztok sodné soli fenytoinu obsahující 50 mg/ml (zamýšlený pro intravenózní podání). Stanoví se MVD za použití následujících proměnných:

   M - maximální lidská dávka = 15 mg na kilogram hmotnosti za hodinu,

   c - 50 mg/ml,

   K - 5 m.j. endotoxinu na kilogram za hodinu v mezinárodních jednotkách,

   λ - 0,4 m.j. endotoxinu v mililitru.

   Řešení:

   Pro rutinní zkoušení tohoto přípravku je vhodné ředit 1 ml roztoku ke zkoušce na 20 ml (MVD/2 zaokrouhleno na nejbližší menší celé číslo). Je-li však zkouška pozitivní, bude analytik muset ředit 1 ml na 41,67 ml a opakovat zkoušku. Ředění na 41,67 ml je rovněž nutné, jestliže se zkoušením má vyřešit sporný výsledek.

1. 3. Referenční materiál

   Referenční endotoxin BRP je určen pro použití jako porovnávací přípravek. Byl přezkoušen proti mezinárodnímu standardu endotoxinu a jeho účinnost je vyjádřena v mezinárodních jednotkách endotoxinu v mililitru. Mezinárodní jednotka endotoxinu je definována jako specifická účinnost obsažená v definovaném množství mezinárodního standardu.

   Pro rutinní účely je možno použít jiný přípravek endotoxinu, jestliže byl přezkoušen proti mezinárodnímu standardu endotoxinu nebo endotoxinu BRP a jeho účinnost je vyjádřena v mezinárodních jednotkách endotoxinu.

   Jedna ampule referenčního přípravku obvykle obsahuje větší množství, než je množství potřebné pro jednu zkoušku, a analytik potřebuje vědět, jak dlouho lze obsah otevřené ampule používat. Pokles účinnosti nebyl pozorován v ampulích, které byly otevřeny v laminárním boxu, uzavřeny vhodným materiálem a dva týdny skladovány při +4 °C. Analytik samozřejmě musí ověřit účinnost takovéto ampule při rutinním laboratorním režimu, je-li odkázán na prodloužené používání otevřené ampule.

1. 4. Voda pro LAL

   Zkoušení na nepřítomnost endotoxinu v této látce zkouškou na pyrogenní látky na králíku bylo vyloučeno z praktických a teoretických důvodů:

   1. - králík není dostatečně citlivý, aby mohl detegovat endotoxin ve vodě pro LAL určené ke zkoušení přípravků s velice nízkou limitní koncentrací endotoxinu,
   2. - relativně nízká přesnost teplotní odpovědi u králíka vede k opakování na mnoha králících,
   3. - termíny “pyrogenní látky“ a “endotoxiny“ označují skupiny látek, které nejsou zcela totožné.

   Text zkoušky na bakteriální endotoxiny ukazuje, že i jiná metoda, než je trojnásobná destilace, se může použít k přípravě vody pro LAL. Reverzní osmosa byla použita s dobrým výsledkem; někteří analytici mohou dávat přednost vodě destilované více než třikrát. V každém případě použitá metoda musí zaručit, že výsledný produkt je prost zjistitelných endotoxinů.

1. 5. Hodnota pH směsi

   Ve zkoušce na bakteriální endotoxiny dochází ke vzniku gelu nejvhodněji při pH 6,0 až 7,5. Při přidání lyzátu ke vzorku může však dojít k poklesu pH. Proto, aby byla jistota, že pH směsi není nižší než 6,0, má se analytik přesvědčit o tom, že hodnota pH zkoušeného vzorku není nižší než 6,5.

1. 6. Validace lyzátu

   Při přípravě roztoku lyzátu je důležité se řídit návodem výrobce.

   Poslední pozitivní ředění u gelové metody A a B se převedou na logaritmy. Důvodem toho graficky znázorněné rozložení četnosti těchto logaritmických hodnot dává obvykle normální distribuční křivku mnohem vyrovnanější, než je distribuční rozložení ředících faktorů jako takových; v podstatě jde o tak podobné hodnoty, že je přijatelné použít normální frekvenční distribuci jako matematický model a stanovit interval spolehlivosti Studentovým t-testem.

   Kinetické metody C a D používají logaritmus koncentrace endotoxinu, protože lze použít model lineární regrese log reakčního času na log koncentrace endotoxinu. Chromogenní metoda konečného bodu, metoda E, používá odlišný model. V tomto případě výsledek (absorbance závislá na uvolněném barvivu) může být hodnocen jako lineární funkce koncentrace endotoxinu v použitém koncentračním rozmezí.

1. 7. Předběžná zkouška na interferující faktory

   Některé přípravky nelze přímo zkoušet na přítomnost endotoxinu, protože je nelze smíchat se zkoumadly, nelze u nich upravit hodnotu pH v rozmezí 6,5 až 7,5 nebo inhibují nebo aktivují tvorbu gelu. Proto je nutno provést předběžnou zkoušku na zjištění přítomnosti interferujících faktorů: jsou-li nalezeny, pak analytik prokáže, že postup použitý k jejich odstranění byl dostatečně účinný.

   Předmětem předběžného zkoušení je nulová hypotéza, že citlivost lyzátu v přítomnosti zkoušeného přípravku se signifikantně neliší od citlivosti lyzátu bez přítomnosti vzorku. Jednoduché kritérium je použito v metodě A a B: nulovou hypotézu lze přijmout, jestliže citlivost lyzátu v přítomnosti přípravku je nejméně poloviční a nejvýše dvojnásobná, než je citlivost lyzátu samotného.

   Klasickým způsobem se stanoví průměrné hodnoty logaritmů ředících faktorů lyzátu pro citlivost s přípravkem a bez něho a vypočítá se rozdíl mezi oběma průměrnými hodnotami Studentovým t-testem.

   Zkouška na interferující faktory v gelových metodách A a B vyžaduje použití vzorku přípravku, u něhož nebyla zjištěna přítomnost endotoxinu. To představuje teoretický problém, když se má zkoušet zcela nový přípravek. V důsledku různých přístupů byly navrženy kvantitativní metody C, D, E.

1. 8. Odstranění interferujících faktorů

   Postup k odstranění interference nemá ani zvyšovat ani snižovat množství endotoxinu ve zkoušeném přípravku (např. nesmí dojít ke snížení vlivem adsorbce). Správný způsob jak toto ověřit je, že se do zkoušky zařadí vzorek přípravku, ke kterému se přidá známé množství endotoxinu a poté se měří zpětně koncentrace endotoxinu.

   Metody C a D. Jestliže zkoušený přípravek vykazuje interferenci, kterou nelze odstranit klasickými metodami, provede se CSE křivka se stejným typem přípravku zbaveného endotoxinů vhodným způsobem nebo ředěním přípravku. Zkouška na endotoxiny se provede porovnáním s touto standardní křivkou.

   Ukazálo se, že v mnoha případech je dostatečně účinná ultrafiltrace přípravku na asymetrických membránových filtrech z triacetatcelulosy. Filtry mají být patřičně validovány, protože v některých případech mohou deriváty celulosy (β-D-glykany) způsobovat falešně pozitivní výsledky.

   Polysulfonové filtry uvedené v dřívějším textu byly shledány nevhodnými, protože někteří uživatelé při jejich použití získali falešně pozitivní výsledky.

1. 9. Poslání kontrol

   Účelem kontroly vody pro LAL a referenčního přípravku endotoxinu ve dvojnásobné koncentraci, než je vyznačená citlivost lyzátu, je ověřit aktuální citlivost lyzátu v podmínkách zkoušky. Účelem negativní kontroly je ověřit nepřítomnost měřitelné koncentrace endotoxinu ve vodě pro LAL.

   Druhá pozitivní kontrola, která obsahuje zkoušený přípravek v koncentraci použité ve zkoušce, je zařazena proto, aby byla prokázána nepřítomnost interferujících faktorů v průběhu a v podmínkách prováděné zkoušky.

1. 10. Hodnocení a interpretace výsledků

   Jak je uvedeno v úvodním odstavci textu, zkouška s lyzátem z amebocytů se používá jako limitní test a stanovení limitu závisí na popsaných faktorech. Nepatrné množství endotoxinu ve vodě pro LAL nebo v některém jiném zkoumadle nebo materiálu, jemuž je vystaven lyzát při zkoušce, nemusí být zjištěno, pokud nedosáhne limitu citlivosti lyzátu. Může však zvyšovat množství endotoxinu v roztoku se zkoušeným přípravkem právě na hranici hodnoty citlivosti lyzátu a způsobovat pozitivní reakci.

   Riziko tohoto případu lze snížit přezkoušením vody pro LAL a ostatních zkoumadel a materiálů s co nejcitlivějším lyzátem, který je dostupný, nebo s takovým, který je mnohem citlivější, než je lyzát použitý pro zkoušený přípravek. Ani takto nelze zcela vyloučit riziko falešně pozitivního výsledku. Tento postup by měl být zařazen, aby byla zajištěna bezpečná interpretace výsledků oproti případu falešně negativního testu, který může vést k propuštění nevyhovujícího přípravku ohrožujícího zdraví pacienta.

1. 11. Náhrada zkoušky na pyrogenní látky na králících nebo zkoušky na endotoxin předepsané v lékopisném článku

   V článcích na přípravky pro parenterální použití, které mohou obsahovat toxická množství bakteriálních endotoxinů, se požaduje buď zkouška na pyrogenní látky na králících, nebo zkouška na bakteriální endotoxiny. Je-li předepsána zkouška na bakteriální endotoxiny a není uvedena žádná z pěti metod (A až E) popsaných ve stati 2.6.14, pak se pro tento přípravek validovala gelová limitní metoda A. Je-li uvedena jedna z dalších metod (B až E), je to ta, která byla validována pro tento přípravek. Náhrada zkoušky na pyrogenní látky na králících zkouškou na bakteriální endotoxin nebo náhrada uvedené či předpokládané metody na stanovení endotoxinu jinou metodou je považována za použití alternativní metody místo lékopisné zkoušky, jak je uvedeno v části

   1. 1. Obecné zásady:

      Zkoušky na čistotu a stanovení obsahu nebo účinnosti popsané v lékopisu jsou oficiální metody, na nichž jsou založeny lékopisné normy. Se souhlasem oprávněné autority se pro kontrolní účely mohou použít alternativní analytické metody za předpokladu, že bude dosaženo shody s metodami oficiálními. V případě pochybností nebo sporu jsou rozhodující pouze oficiální metody analýzy.

      Pro validaci jiné zkoušky na bakteriální endotoxin, než je obsažena nebo určena v lékopisném článku, jsou navrženy následující postupy:

      1. 11.1 Postup, materiály a zkoumadla používané v metodě se validují, jak je popsáno v příslušné zkoušce.
      2. 11.2 Přítomnost interferujících faktorů (a je-li to třeba, postupy k jejich odstranění) se prověří na vzorkách nejméně ze tří výrobních šarží. Je vhodné pamatovat na to, že metody D a E používají chromogenní peptid a vyžadují zkoumadla, která chybějí u metody A, B a C, takže vyhovující výsledek v metodě A, B nebo C v metodě na interferující faktory nelze vztáhnout na metodu D nebo E bez dalšího zkoušení.
      3. 11.3 Jestliže jsou dostupné vzorky z výrobní šarže, které ve zkoušce na pyrogenní látky na králících byly pozitivní, měly by se také přezkoušet na bakteriální endotoxiny metodou, o níž se uvažuje jako o alternativní. Nejsou-li tyto vzorky dostupné, pak je rozhodující zkouška na pyrogenní látky a zkouška na bakteriální endotoxiny zbytečná.

1. 12. Validace zkoušky pro nové přípravky

   Postup uvedený v části 11.1 a 11.2 se použije u všech nových přípravků pro parenterální podání, které se mají zkoušet na přítomnost bakteriálních endotoxinů podle požadavků lékopisu.

1. 13. Nové přípravky ovlivňující tělní teplotu

   Jestliže se u nového přípravku během jeho vývoje ukáže, že by mohl ovlivňovat tělní teplotu, je možno použít jednu z metod (A až E) k důkazu nepřítomnosti bakteriálních endotoxinů; zejména kvantitativní metoda (B, C, D nebo E) může dát užitečnou informaci. V tomto případě se postupuje, jak je uvedeno v části 11.1 a 11.2. Avšak jsou-li patrné známky kontaminace přípravku neendotoxinovými pyrogenními látkami, je nutno získat podklady z mnohem rozsáhlejšího zkoušení.

Tab. 2.6.14-1 Příklad

2.6.16 Důkaz cizích antigenů v humánních virových vakcínách

Pokud tyto zkoušky vyžadují nejprve neutralizaci viru, použijí se specifické protilátky, které nejsou humánního ani opičího původu: jestliže byl virus pomnožen na tkáni ptačího původu, nemohou to být ani protilátky ptačího původu. K přípravě antiséra se užívá imunizační antigen připravený na buněčné kultuře z odlišného druhu, než je kultura užívaná pro přípravu vakcíny a prosté cizích agens. Jestliže je předepsáno použití SPF vajec, tato vejce se získávají z chovů prostých specifikovaných patogenů (5.2.2).

Virové inokulum

Vzorky virového inokula se odeberou při sklizni, a jestliže se ihned nezkoušejí, uchovávají se při teplotě nižší než –40 °C.

Dospělé myši. Každé z nejméně deseti dospělých myší o hmotnosti 15 g až 20 g se vstříkne intracerebrálně 0,03 ml a intraperitoneálně 0,5 ml virového inokula. Myši se pozorují nejméně 21 dní. U všech myší uhynulých po uplynutí prvních 24 h, nebo které mají příznaky nemoci, se provede pitva, aby se odhalily známky infekčního onemocnění. Postupuje se jednak makroskopickým pozorováním, jednak přeočkováním vhodné tkáňové suspenze intracerebrálně a intraperitoneálně nejméně dalším pěti dospělým myším, které se pozorují 21 dní. Virové inokulum vyhovuje, jestliže žádná myš nevykazuje známky infekce, jež by se mohly přičíst inokulu. Zkoušku lze hodnotit, jestliže dobu pozorování přežije nejméně 80 % původně inokulovaných myší.

Sající myši. Každé z nejméně dvaceti myší mladších než 24 h se vstříkne intracerebrálně 0,01 ml a intraperitoneálně 0,1 ml virového inokula. Myši se pozorují denně nejméně 14 dní. U všech myší uhynulých po uplynutí prvních 24 h, nebo které mají příznaky nemoci, se provede pitva, aby se odhalily známky infekčního onemocnění. Postupuje se jednak makroskopickým pozorováním, jednak přeočkováním vhodné tkáňové suspenze intracerebrálně a intraperitoneálně nejméně dalším pěti sajícím myším, které se denně pozorují 14 dní. Virové inokulum vyhovuje, jestliže žádná sající myš nevykazuje známky infekce, jež by se mohly přičíst inokulu. Zkoušku lze hodnotit, jestliže dobu pozorování přežije nejméně 80 % původně inokulovaných sajících myší.

Morčata. Nejméně pěti morčatům o hmotnosti 350 g až 450 g se vstříkne intraperitoneálně po 5 ml virového inokula. Zvířata se pozorují nejméně 42 dní, aby se odhalily všechny příznaky nemoci. U všech zvířat, která po uplynutí prvních 24 h uhynou, nebo která mají příznaky nemoci, se provede pitva s makroskopickým vyšetřením; tkáně se vyšetří mikroskopicky a kultivačně na přítomnost infekce. Zvířata, která přežila dobu pozorování, se usmrtí a vyšetří se stejným způsobem. Virové inokulum vyhovuje, jestliže žádné morče nevykazuje známky infekce, jež by se mohly přičíst inokulu. Zkoušku lze hodnotit, jestliže dobu pozorování přežije nejméně 80 % původně inokulovaných morčat.

Virové inokulum a sklizený virus

Vzorky se odeberou při sklizni, a jestliže se ihned nezkoušejí, uchovají se při teplotě nižší než –40 °C.

Bakteriální a houbová sterilita. 10 ml vzorku vyhovuje zkoušce na sterilitu (2.6.1).

Mykoplazmata. 10 ml vzorku vyhovuje zkoušce na mykoplazmata (2.6.7).

Mykobakterie (2.6.2). 5 ml vzorku se zkouší na přítomnost Mycobacterium spp. kultivačními metodami uznanými za citlivé pro detekci těchto organismů.

Zkoušky na jiná cizí agens na tkáňových kulturách. Množství neutralizovaného vzorku, jestliže není předepsáno jinak, které odpovídá 500 lidských dávek nebo 50 ml vakcíny, podle toho, co je více, se zkouší na přítomnost cizích agens naočkováním do kultur buněk kontinuální linie opičí ledviny a lidských buněk. Jestliže virus rostl na lidských diploidních buňkách, neutralizovaný sklizený virus se také zkouší na oddělené kultuře diploidních buněk. Jestliže byl vakcinační virus pomnožován v buněčném systému jiném než opičím nebo lidském, naočkují se také buňky tohoto druhu, ale z odlišné šarže. Tyto buňky se kultivují při 36 °C ± 1 °C a prohlížejí se 14 dní. Virové inokulum nebo sklizený virus vyhovují, jestliže žádná z buněčných kultur nevykazuje známky přítomnosti jakéhokoli cizího agens, jež nelze přičíst náhodné kontaminaci. Zkoušku lze hodnotit, jestliže přežívá nejméně 80 % buněčných kultur.

Ptačí viry (pouze pro viry pomnožené na tkáni ptačího původu). Neutralizuje se množství vzorku odpovídající bud’ 100 lidským dávkám, nebo 10 ml, podle toho, co je více. Na jedno kuřecí embryo se použije 0,5 ml. Skupina oplozených SPF vajec 9 až 11 dní starých se inokuluje alantoidní cestou a druhá skupina, 5 až 7 dní starých, do žloutkového vaku. Inkubuje se 7 dní. Virové inokulum nebo sklizený virus vyhovují, jestliže alantoidní tekutiny ani tekutiny žloutkového vaku nevykazují přítomnost hemaglutinačního agens a jestliže všechna embrya a chorioalantoidní membrány makroskopicky vyšetřené, jsou normální. Zkoušku lze hodnotit, jestliže nejméně 80 % embryí přežije 7 dní.

Kultura produkčních buněk: kontrolní buňky

Aby se ověřila nepřítomnost virů způsobujících cytopatickou degeneraci, posuzují se kontrolní buňky mikroskopicky buď po celou dobu inkubace, nebo po nejméně 14 dní od naočkování výrobních nádob, podle toho, která doba je delší. Zkoušku lze hodnotit, jestliže dobu pozorování přežije nejméně 80 % kontrolních kultur.

Po 14 dnech nebo v čase poslední sklizně, podle toho, které období je delší, se provedou dále popsané zkoušky.

Zkouška na hemadsorbující viry. Nejméně 25 % kontrolních kultur se zkouší na přítomnost hemadsorbujících virů přidáním morčecích červených krvinek. Jestliže jsou morčecí krvinky skladovány, uchovávají se nejdéle 7 dní při 5 °C ± 3 °C. Polovina kultur se odečítá po 30 min inkubace při 5 °C ± 3 °C, druhá polovina po 30 min inkubace při 20 °C až 25 °C. Nezjistí se přítomnost hemadsorbujících agens.

Zkouška na jiná cizí agens v tkáňových kulturách. Směs supernatantních tekutin z kontrolních buněk se zkouší na přítomnost cizích agens naočkováním do kultur buněk opičí ledviny a lidských buněk. Jestliže byl vakcinační virus pomnožován v buněčném systému jiném než opičím nebo lidském, naočkují se také buňky tohoto druhu, ale z odlišné šarže. V každém buněčném systému se zkouší nejméně 5 ml. Naočkované kultury se inkubují při 36 °C ± 1 °C a pozorují se 14 dní. Nezjistí se přítomnost cizího agens.

Jestliže se kultura produkčních buněk uchovává při jiné teplotě než 36 °C ± 1 °C, provede se doplňující zkouška na cizí agens při produkční teplotě na buňkách stejného typu, jaký se použil pro pomnožení viru.

Viry ptačí leukózy (pouze pro viry pomnožené na tkáni ptačího původu). Zkouška na viry ptačí leukózy se provede s 5 ml supernatantní tekutiny z kontrolních buněk.

Kontrolní vejce

Hemaglutinační agens. 0,25 ml alantoidní tekutiny z každého vejce se zkouší na přítomnost hemaglutinačního agens přímým smísením s kuřecími červenými krvinkami. Po pasáži na SPF vejcích se postupuje takto: 5 ml vzorku ze směsi amniových tekutin z kontrolních vajec se naočkuje po 0,5 ml do alantoidních dutin a do amniových dutin SPF vajec. Kontrolní vejce vyhovují, jestliže se v žádné z obou zkoušek nezjistí známky přítomnosti hemaglutinačních agens.

Viry ptačí leukózy. Použije se 10 ml směsné amniové tekutiny z kontrolních vajec. Provede se rozhojnění pěti pasážemi na buněčných kulturách z kuřecích embryí, které prokazatelně neobsahují viry ptačí leukózy; zkouška na přítomnost ptačí leukózy se provede použitím buněk z páté pasáže. Kontrolní vejce vyhovují, jestliže se zkouškou neprokážou žádné známky přítomnosti viru ptačí leukózy.

Ostatní cizorodá agens. 5 ml směsné amniotické tekutiny z kontrolních vajec se naočkuje do lidských a opičích buněčných kultur. Buněčné kultury se pozorují 14 dní. Kontrolní vejce vyhovují, jestliže se nezjistí přítomnost cizích agens. Zkoušku lze hodnotit, jestliže dobu pozorování přežije nejméně 80 % naočkovaných kultur.

Tab. 2.6.14-1 Příklad Virové inokulum Virové inokulum a sklizený virus Kultura produkčních buněk: kontrolní buňky Kontrolní vejce

2.6.21 Techniky amplifikace nukleových kyselin

1. 1 Úvod

   Techniky amplifikace nukleových kyselin jsou založeny na dvou rozdílných přístupech:

   1. 1. amplifikace cílové sekvence nukleové kyseliny používající např. polymerasovou řetězovou reakci (PCR), ligasovou řetězovou reakci (LCR) nebo izotermální amplifikaci ribonukleové kyseliny (RNK),
   2. 2. amplifikace hybridizačního signálu používající např. pro kyselinu deoxyribonukleovou metodu tzv. větvené DNK (bDNK). V tomto případě se amplifikace signálu docílí bez vystavení nukleové kyseliny opakovaným amplifikačním cyklům.

   V této všeobecné kapitole se jako referenční technika popisuje metoda PCR. Mohou se používat alternativní metody, pokud splňují dále popsané požadavky na kvalitu.

1. 2 Rozsah působnosti

   Tato stať zavádí požadavky na přípravu vzorku, na amplifikaci sekvencí DNK in vitro a na detekci specifického produktu PCR. Za pomoci PCR se mohou detegovat definované sekvence DNK. Rovněž sekvence RNK se mohou detegovat po reverzní transkripci RNK na komplementární DNK (cDNK) a následné amplifikaci.

1. 3 Princip metody

   PCR je postup umožňující in vitro specifickou amplifikaci segmentů DNK nebo segmentů RNK po jejich reverzní transkripci na cDNK.

   Po denaturaci dvouřetězcové DNK na jednořetězcovou DNK dva syntetické oligonukleotidové primery opačné polarity se přihybridizují k odpovídajícím komplementárním sekvencím DNK, která má být amplifikována. Krátké dvouřetězcové úseky, které jsou výsledkem specifického párování mezi primerem a komplementární sekvencí DNK, ohraničují segment DNK, který bude amplifikován a slouží jako výchozí body pro syntézu DNK in vitro pomocí tepelně stabilní DNK polymerasy.

   Amplifikace DNK probíhá v cyklech, které tvoří:

   1. - tepelná denaturace nukleové kyseliny (cílové sekvence) na dva jednoduché řetězce,
   2. - specifické přihybridizování primerů k cílové sekvenci za vhodných reakčních podmínek,
   3. - prodloužení primerů, které jsou navázány na oba jednoduché řetězce, DNK polymerasou při vhodné teplotě (syntéza DNK).

   Opakované cykly tepelné denaturace, přihybridizování primerů a syntéza DNK vedou k exponenciální amplifikaci segmentu DNK omezeného primery.

   Specifický produkt PCR známý jako amplikon může být detegován různými metodami s vhodnou specifitou a citlivostí.

1. 4 Zkoušený materiál

   Z důvodu vysoké citlivosti PCR je nutno vzorky optimálně chránit před vnější kontaminací cílovými sekvencemi.

   Vzorkování, uchovávání a doprava zkoušeného materiálu se provádějí za podmínek minimalizujících degradaci cílové sekvence. Pro cílové sekvence RNK je třeba zvláštní opatrnost, neboť RNK je vysoce citlivá na degradaci ribonukleasami. Je třeba věnovat pozornost i tomu, že některé přidávané látky, jako jsou zkoumadla, antikoagulancia nebo konzervační látky, mohou interferovat v postupu zkoušky.

1. 5 Zkušební metoda
   1. 5.1 Zamezení kontaminaci

      Riziko kontaminace vyžaduje přísné oddělení prostor podle zpracovávaného materiálu a používané technologie. Faktory, které je třeba uvážit, jsou pohyb personálu, pracovní oděv, pohyb materiálu, větrání a dekontaminační postupy.

      Systém se má rozdělit do několika oddělení, jako jsou např.:

      1. - prostor, kde se připravují základní zkoumadla, jako jsou např. primery, tlumivé roztoky, a kde se zachází výhradně s materiály neobsahujícími matrice,
      2. - pre-PCR - prostor, kde se zachází se zkoumadly, vzorky a kontrolami,
      3. - PCR-amplifikace - s amplifikovaným materiálem se zachází v uzavřeném systému,
      4. - detekce post-PCR - jediný prostor, kde se zachází s amplifikovaným materiálem v otevřeném systému.
   1. 5.2 Příprava vzorku

      Při přípravě vzorku se cílová sekvence extrahuje nebo uvolňuje z testovaného materiálu účinným a reprodukovatelným způsobem tak, aby bylo možné za zvolených reakčních podmínek provést amplifikaci.

      Mohou se použít různé způsoby fyzikálně-chemické extrakce anebo obohacovací metody. Aditivá přítomná ve zkoušeném materiálu mohou interferovat s PCR. Pro kontrolu nepřítomnosti inhibitorů pocházejících ze zkoušeného materiálu se použijí postupy uvedené v odstavci 7.3.2.

      V případě matric RNK je třeba zabránit působení ribonukleas.

   1. 5.3 Amplifíkace

      Amplifikace cílové sekvence metodou PCR se provádí opakovanými cykly v optimalizovaných podmínkách (teplotní profil pro denaturaci dvouřetězcové DNK, přihybridizování primerů a jejich prodlužování, inkubační časy při zvolených teplotách, rychlost nabíhání zvolených teplot).

      Tyto podmínky závisejí na různých parametrech, jako jsou:

      1. - délka a složení bází primerů a cílových sekvencí;
      2. - typ DNK polymerasy, složení tlumivého roztoku a reakční objemy použité pro amplifikaci;
      3. - typ použitého termocykleru a koeficient teplotní vodivosti mezi přístrojem, reakční zkumavkou a reagující tekutinou.
   1. 5.4 Detekce

      Amplikon vytvořený PCR se může identifikovat velikostí, sekvencí, chemickou modifikací nebo kombinací těchto parametrů. Charakterizace na základě velikosti se může dosáhnout gelovou elektroforézou (použije se vrstva agarosového nebo polyakrylamidového gelu nebo kapilární elektroforéza), nebo chromatografií na koloně (např. HPLC). Charakterizace na základě složení sekvencí se může provést specifickou hybridizací vzorků majících komplementární sekvence k cílové sekvenci nebo štěpením amplifikovaného materiálu restrikčním enzymem ve specifických místech pro cílovou sekvenci.

      Charakteristika chemickou modifikací se může provést např. inkorporací fluoroforu do amplikonu a následnou detekcí fluorescence po excitaci.

      Detekce amplikonů se může provést použitím značených vzorků umožňujících následnou radioizotopovou nebo imunoenzymatickou detekci.

1. 6 Hodnocení a interpretace výsledků