Vyhláška Ministerstva zdravotnictví, kterou se mění vyhláška Ministerstva zdravotnictví č. 1/1998 Sb., kterou se stanoví požadavky na jakost, postup při přípravě, zkoušení, uchovávání a dávkování léčiv (Český lékopis 1997)

Čelenžní kmen pro zkoušku účinnosti je volen tak, aby zajistil čelenž všech A_p toxinů ¹) vytvářených sérotypy uvedenými ve složení vakcíny. Může být nezbytné provést více než jednu zkoušku s různými čelenžními kmeny.

Nejméně sedm prasat nejnižšího stáří doporučeného pro vakcinaci, která nemají protilátky proti A. pleuropneumoniae a A_p toxinům, se vakcinuje podle doporučeného schématu. Nejméně sedm nevakcinovaných prasat stejného stáří se použije jako kontrola. Za tři týdny po poslední vakcinaci se všechna prasata čelenžují intranazálně nebo intratracheálně nebo aerosolem ve vhodném množství sérotypem A. pleuropneumoniae. Zvířata se pozorují 7 dní. K zamezení zbytečného týrání se zvláště nemocná kontrolní zvířata porazí a považují se za uhynulá v důsledku nemoci. Na konci doby pozorování se usmrtí všechna přežívající zvířata. Provede se pitva všech zvířat. Plíce, tracheobronchiální mízní uzliny a mandle se vyšetřují na přítomnost A. pleuropneumoniae. Hodnotí se rozsah poškození plic při pitvě. Každému ze sedmi plicních laloků se přidělí nejvyšší možný stupeň poškození z pětičlenné stupnice²) hodnocení. Každé místo v laloku vykazující pneumonii nebo pleuritidu se ohodnotí číslem z pětičlenné stupnice, součet těchto hodnot dává skóre projeden lalok (nejvyšší možné skóre pro celé plíce je 35). Celkové skóre se počítá odděleně pro vakcinovaná a kontrolní zvířata (jestliže je ve skupině sedm prasat, maximální skóre celé skupiny je 245).

Vakcína vyhovuje zkoušce, pokud vakcinovaná zvířata ve srovnání s kontrolními vykazují nižší úmrtnost; nižší výskyt typických klinických příznaků (dušnost, kašel a zvracení); menší rozsah typického poškození plic; menší počet reizolací A. pleuropneumoniae z plic, tracheobronchiálních mízních uzlin a mandlí. Kde je to možné, hodnotí se incidence statisticky, u skupiny vakcinováných zvířat je významně nižší.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

V označení na obalu se uvedou:

1. - antigeny obsažené ve vakcíně,
2. - sérotypy A. pleuropneumoniae, proti kterým vakcína chrání.

Vaccinum adenovirosis caninae inactivatum

Inaktivovaná vakcína proti adenoviróze psů

Je to suspenze jednoho nebo více vhodných kmenů psího adenoviru 1 (virus infekční hepatitidy psů) anebo psího adenoviru 2. Je inaktivovaná způsobem, který uchová odpovídající imunogenitu.

Výroba

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Ke zkoušce inaktivace se použije množství viru, které odpovídá nejméně deseti dávkám vakcíny. Provedou se dvě pasáže v buněčných kulturách takového typu, jaký byl použit při výrobě, nebo v buněčných kulturách s prokazatelně nejméně stejnou citlivostí. Nezjistí se žádný živý virus.

Vakcína může obsahovat adjuvans.

Složení vakcíny

Vakcína prokazatelně vyhovuje z hlediska bezpečnosti (5.2.6) a imunogenity (5.2.7). K prokázání bezpečnosti a imunogenity se mohou použít následující zkoušky.

Bezpečnost. Zkouška se provádí pro každý doporučený způsob podání na zvířatech nejnižšího stáří doporučeného pro vakcinaci. Použije se šarže vakcíny, u které byla zjištěna nejvyšší účinnost.

Pro každou zkoušku se použije nejméně deset psů, kteří nemají protilátky proti psímu adenoviru 1 nebo 2. Každému psovi se podají dvě vakcinační dávky. Jestliže doporučené schéma požaduje další dávku, podá se jedna dávka v doporučeném intervalu. Zvířata se pozorují 14 dnů od poslední vakcinace. Psi zůstanou v dobrém zdravotním stavu bez nadměrných místních nebo systémových reakcí.

Je-li vakcína určena pro březí samice, vakcinují se zvířata v předepsaném stupni březosti nebo v různých stupních březosti podle doporučené tabulky. Pozorování se prodlouží až do prvního dne po porodu. Zvířata zůstanou v dobrém zdravotním stavu bez nadměrných místních nebo systémových reakcí. Nezjistí se nežádoucí účinky na březost ani na potomstvo.

Imunogenita. U vakcíny určené k ochraně proti hepatitidě je vhodná pro průkaz imunogenity zkouška popsaná v odstavci Stanovení účinnosti. Jestliže je vakcína určena k ochraně proti respiratomím příznakům, je pro průkaz imunogenity nezbytná další zkouška v této indikaci.

Zkoušení šarže

Zkouška účinnosti šarže. Zkouška se neprovádí při běžné kontrole šarží vakcíny, dělá se u určené vakcíny při jedné nebo více příležitostech, podle rozhodnutí nebo po dohodě s oprávněnou autoritou. Pokud zkouška není provedena, dělá se jiná vhodná validovaná zkouška, jejíž kritéria pro přijetí jsou v souladu s šarží vakcíny, která vykázala vyhovující výsledky ve zkoušce popsané v odstavci Stanovení účinnosti.

Zkouška totožnosti

Po podání vakcíny vnímavým zvířatům se vytváří specifické protilátky proti typu nebo typům psího adenoviru, které jsou uvedeny v označení na obalu.

Zkoušky na čistotu

Bezpečnost. Dvěma psům nejnižšího stáří doporučeného pro vakcinaci, kteří nemají neutralizační protilátky proti psímu adenoviru, se doporučeným způsobem podají dvě dávky vakcíny. Zvířata se pozorují 14 dnů. Psi zůstanou v dobrém zdravotním stavu bez nadměrných místních nebo systémových reakcí.

Inaktivace. Provede se zkouška na zbytky infekčního psího adenoviru. Deset dávek vakcíny se naočkuje na vnímavou buněčnou kulturu, za 6 až 8 dnů se provede pasáž. Kultura se udržuje 14 dnů. Nezjistí se živý virus. Jestliže vakcína obsahuje adjuvans, oddělí se adjuvans od tekuté fáze způsobem, který neinaktivuje živý virus nebo jinak nebrání jeho zjištění.

Sterilita. Vakcína vyhovuje zkoušce na sterilitu předepsané v odstavci Vaccina ad usum veterinarium.

Stanovení účinnosti

Použije se sedm psů nejnižšího stáří doporučeného pro vakcinaci, kteří nemají protilátky proti psímu adenoviru. Doporučeným způsobem a podle doporučeného schématu se vakcinuje pět zvířat. Dvě zvířata slouží jako kontrolní. Za 21 dnů se každému ze sedmi zvířat vstříkne intravenózně takové množství virulentního kmene psího adenoviru, které je schopné u vnímavých psů způsobit úhyn nebo typické příznaky onemocnění. Zvířata se pozorují dalších 21 dnů. Aby se předešlo zbytečnému utrpení, jsou psi s typickými příznaky infekce psím adenovirem šetrným způsobem utraceni. Zkouška je neplatná a opakuje se, pokud jedno nebo obě kontrolní zvířata neuhynou nebo nevykazují typické příznaky vážné infekce psím adenovirem. Vakcína vyhovuje, pokud se vakcinovaná zvířata nacházejí v dobrém zdravotním stavu.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

V označení na obalu se uvede typ nebo typy psího adenoviru obsaženého ve vakcíně.

Vaccinum clostridii chauvoei ad usum veterinarium¹)

Vakcína proti Clostridium chauvoei pro veterinární použití

Synonymum. Očkovací látka proti Clostridium chauvoei pro veterinární použití

Připravuje se z kultury jednoho či více vhodných kmenů Clostridium chauvoei v tekuté živné půdě. Celá kultura se inaktivuje tak, aby se odstranila toxicita, ale imunogenita zůstala zachována. K inaktivované kultuře se může přidat vhodné adjuvans.

Zkouška totožnosti

Přípravek chrání vnímavá zvířata proti infekci Clostridium chauvoei.

Zkoušky na čistotu

Bezpečnost. Použijí se dvě zdravá a vnímavá zvířata toho druhu, pro který je přípravek určen. Každému z nich se na jedno místo vstříkne doporučeným způsobem dvojnásobek nejvyšší dávky uvedené v označení. Zvířata se pozorují 7 dní. Neprojeví se žádná výrazná místní ani systémová reakce.

Sterilita. Vyhovuje zkoušce na sterilitu předepsané v článku Vaccina ad usum veterinarium.

Stanovení účinnosti

Nejméně deseti zdravým morčatům o hmotnosti 350 g až 450 g se podkožně vstříkne množství nepřesahující nejnižší dávku uvedenou v označení jako první dávka. Po 28 dnech se těmto zvířatům vstříkne množství nepřesahující nejmenší dávku uvedenou v označení jako druhá dávka. Za 14 dní po revakcinaci se vakcinovaným i pěti nevakcinovaným kontrolním morčatům nitrosvalově vstříkne vhodné množství virulentní kultury nebo suspenze spor Cl. chauvoei, aktivovaných, je-li třeba, aktivačním agens, jako je chlorid vápenatý. Přípravek vyhovuje, pokud během pěti dnů nejvýše 10 % z vakcinovaných morčat uhyne na infekci Cl chauvoei a naopak všechna kontrolní zvířata uhynou na infekci Cl chauvoei do 48 h po čelenži virulentní kulturou nebo 72 h po čelenži suspenzí spor. Uhyne-li více než 10 %, ale méně než 20 % vakcinovaných morčat, zkouška se opakuje. Přípravek vyhovuje, jestliže v druhé zkoušce uhyne nejvýše 10% morčat z vakcinované skupiny a všechna kontrolní zvířata uhynou do 48 h po čelenži virulentní kulturou nebo do 72 h po čelenži suspenzí spor. Aby se předešlo zbytečnému utrpení v důsledku virulentní čelenže, utratí se umírající zvířata a považují se za uhynulá na infekci Cl chauvoei.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

V označení na obalu se uvede, že se přípravek před použitím roztřepe.

Vaccinum encefalitidis ixodibus advectae inactivatum

Inaktivovaná vakcína proti klíšťové encefalitidě

Je to tekutý přípravek připravený z vhodného kmene viru klíšťové encefalitidy pomnoženého v kulturách kuřecích embryonálních buněk nebo v jiných vhodných buněčných kulturách a inaktivovaného vhodnou validovanou metodou.

Výroba

Výroba vakcíny je založena na systému jednotné inokulace. Výrobní metoda prokazatelně poskytuje stejnorodou vakcínu srovnatelnou s vakcínou, jejíž klinická účinnost a bezpečnost pro člověka byly prokázány. Není-li předepsáno a schváleno jinak, pasáž viru v konečné šarži není vyšší než pasáž viru ve vakcíně použité pro klinické zkoušení.

Výrobní postup se validuje, aby se prokázalo, že pokud bude přípravek zkoušen, vyhoví zkoušce na neškodnost imunních sér a vakcín pro humánní použití (2.6.9).

Substrát pro pomnožení viru

Virus se pomnožuje v kuřecích embryonálních buňkách připravených z vajec pocházejících z chovu kuřat prostého specifikovaných patogenů (5.2.2) nebo v jiné vhodné buněčné kultuře (5.2.3).

Virová inokula

Použitý kmen viru je specifikován vývojovými záznamy, které obsahují informace o jeho původu a následném zacházení. Virové inokulum se uchovává při teplotě nižší než –60 °C.

Pouze virové inokulum vyhovující následujícím požadavkům se může použít pro pomnožování viru.

Zkouška totožnosti. V každém virovém inokulu se vakcinační kmen viru klíšťové encefalitidy prokáže vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1), nejlépe za použití monoklonálních protilátek.

Koncentrace viru. Pro zajištění pravidelnosti výroby se stanoví koncentrace viru v každém virovém inokulu titrací na vhodné buněčné kultuře.

Cizí agens (2.6.16). Každé virové inokulum vyhovuje požadavkům na cizí agens ve vakcínách pro humánní použití; zkoušky na buněčných kulturách se provedou jen na lidských a opičích buňkách. K neutralizaci vakcinačního viru se přednostně použijí monoklonální protilátky.

Pomnožování a sklizeň viru

Všechny práce s buněčnými kulturami se provádějí za aseptických podmínek v prostředí, kde se nepracuje s jinými buňkami. Sérum a trypsin použité při přípravě buněčných suspenzí jsou prokazatelně prosty cizích agens. Média pro buněčné kultury mohou obsahovat indikátor pH, jako je červeň fenolová, a schválená antibiotika v nejnižší účinné koncentraci. Nejméně 500 ml buněčné kultury použité při výrobě vakcíny se ponechá neinfikovaných (kontrolní buňky).

Pouze jednotlivá sklizeň, která vyhovuje následujícím požadavkům, se může použít pro přípravu inaktivované sklizně.

Zkouška totožnosti. Obsah viru klíšťové encefalitidy v jednotlivé sklizni se prokáže vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1), přednostně použitím monoklonálních protilátek nebo neutralizací viru v buněčné kultuře.

Bakterie a houby (2.6.1). Jednotlivá sklizeň vyhovuje zkoušce na sterilitu; na každou živnou půdu se použije 10 ml.

Mykoplazmata (2.6.7). Jednotlivá sklizeň vyhovuje ve zkoušce na mykoplazmata; na každou půdu se použije 1 ml.

Kontrolní buňky. Kontrolní buňky vyhovují ve zkoušce na cizí antigeny (2.6.16). Vyrábí-li se vakcína pomocí systému buněčných bank, vyhovují kontrolní buňky ve zkoušce totožnosti.

Koncentrace viru. K prokázání pravidelnosti výroby se stanoví virová koncentrace titrací na vhodné buněčné kultuře.

Inaktivace

Aby se zabránilo interferenci, odstraní se virové agregáty bezprostředně před inaktivačním procesem. Virová suspenze se inaktivuje validovanou metodou; metoda má být prokazatelně trvale schopná inaktivovat virus klíšťové encefalitidy bez zničení antigenní a imunologické aktivity. Součástí validační studie je inaktivační křivka, znázorňující koncentraci zbytkového živého viru měřenou nejméně třikrát. Použije-li se k inaktivaci formaldehyd, ověří se přítomnost zbytků volného formaldehydu na konci inaktivačního procesu.

Pouze inaktivovaná sklizeň, která vyhovuje následujícím požadavkům, se může použít pro přípravu konečné várky vakcíny.

Reziduální infekční virus. Množství inaktivované sklizně, odpovídající nejméně deseti lidským dávkám vakcíny, se inokuluje na buňky primárních kuřecích fibroblastů nebo na jiné buňky prokazatelně nejméně stejně citlivé k viru klíšťové encefalitidy, a to nejméně v množství 3 cm² buněčné kultury na 1 ml inokula. Inkubuje se 14 dnů při 37 °C ± 1 °C.

Na konci inkubačního období není patrný cytopatický efekt. Odebere se kultivační médium a inokuluje se po 0,03 ml intracerebrálně nejméně deseti myším starým asi 4 týdny. Myši se pozorují 14 dní. Neprojeví se u nich známky infekce virem klíšťové encefalitidy.

Purifikace

Několik inaktivovaných jednotlivých sklizní se spojí před koncentrací a purifikací vhodnými metodami, nejlépe kontinuálním odstřeďováním v sacharosovém gradientu.

Pouze purifikovaná, inaktivovaná sklizeň vyhovující následujícím požadavkům se může použít k přípravě konečné várky vakcíny.

Sterilita (2.6.1). Purifikovaná inaktivovaná sklizeň vyhovuje ve zkoušce na sterilitu; na každou živnou půdu se použije 10 ml.

Specifická účinnost. Obsah antigenu v purifikované inaktivované sklizni se stanoví vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1). Vhodnou metodou se stanoví celkový obsah bílkovin. Specifická účinnost, stanovená jako obsah antigenu v jednotce hmotnosti bílkovin, je v rozmezí schváleném pro přípravek.

Konečná várka vakcíny

Konečná várka vakcíny se připraví z jedné nebo více purifikovaných inaktivovaných sklizní.

Pouze konečná várka vakcíny vyhovující následujícím požadavkům se může použít k výrobě šarže.

Sterilita (2.6.1). Konečná várka vakcíny vyhovuje ve zkoušce na sterilitu; na každou živnou půdu se použije 10 ml.

Šarže

Pouze šarže, která odpovídá všem požadavkům uvedeným dále v odstavcích Zkouška totožnosti, Zkoušky na čistotu a Stanovení účinnosti, se může uvolnit k použití. Jestliže zkoušky na volný formaldehyd, bovinní sérumalbumin (je-li použit), pyrogenní látky a stanovení účinnosti byly provedeny s vyhovujícím výsledkem na konečné várce vakcíny, mohou se u šarže vypustit.

Zkouška totožnosti

Vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1) se prokáže, že vakcína obsahuje virus klíšťové encefalitidy. Použijí se monoklonální protilátky nebo zkouška imunogenity na myších popsaná v odstavci Stanovení účinnosti.

Zkoušky na čistotu

Hliník. Je-li jako adjuvans použit hydroxid hlinitý nebo hydratovaný fosforečnan hlinitý, vakcína vyhovuje zkoušce uvedené v článku Vaccina ad usum humanum.

Volný formaldehyd (2.4.18). Nejvýše 0,1 g/l.

Bovinní sérumalbumin. Použije-li se při přípravě vakcíny bovinní sérumalbumin, obsahuje vakcína nejvýše 50 ng v jedné lidské dávce. Stanoví se vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1).

Sterilita (2.6.1). Vakcína vyhovuje zkoušce na sterilitu.

Pyrogenní látky (2.6.8). Vakcína vyhovuje zkoušce na pyrogenní látky, při níž se na 1 kg hmotnosti králíka vstříkne nitrožilně jedna lidská dávka.

Stanovení účinnosti

Účinnost se stanoví porovnáním dávky nezbytné k ochraně myši před působením letální dávky viru klíšťové encefalitidy podané intraperitoneálně s množstvím referenčního přípravku vakcíny proti klíšťové encefalitidě k vytvoření stejné ochrany. Pro toto porovnání je nutné použít schválený referenční přípravek viru klíšťové encefalitidy a pro čelenž vhodný virus klíšťové encefalitidy ze schváleného kmene.

Následující postup je uveden jako příklad metody vhodné pro danou vakcínu.

Výběr a rozdělení zkoušených zvířat. Použijí se zdravé myši o hmotnosti 11 g až 17 g pocházející z jednoho chovu. Myši se rozdělí nejméně do šesti skupin o vhodném počtu pro zajištění validity zkoušky a pro titraci čelenžní suspenze se použijí nejméně čtyři skupiny myší po deseti jedincích. Použijí se myši téhož pohlaví nebo se samci a samice rovnoměrně rozdělí do skupin.

Stanovení účinnosti vakcíny. Připraví se nejméně tři vhodná ředění zkoušené vakcíny a referenčního přípravku; pro splnění validačních požadavků jsou obvykle nezbytná čtyři až pět ředění. Připraví se ředění tak, aby nejvíce koncentrovaná suspenze ochránila více než 50 % zvířat a nejméně koncentrovaná suspenze méně než 50 %. Jednotlivá ředění pro různé skupiny myší se aplikují subkutánně po 0,2 ml každému zvířeti ve skupině. Po sedmi dnech se injekce opakují za použití stejné řady ředění. Čtrnáct dní po druhé injekci se připraví suspenze čelenžního viru obsahující dávku nejméně 100 LD₅₀ v 0,2 ml. Každé vakcinované myši se intraperitoneálně vstříkne 0,2 ml suspenze. Pro ověření čelenžní dávky se připraví série nejméně tří ředění čelenžní virové suspenze v nejvýše stonásobných ředěních. Myši se rozdělí na pět skupin po deseti myších. Každé skupině se přidělí jedno ředění (jedné skupině čelenžní dávka) a každé myši se intraperitoneálně aplikuje 0,2 ml příslušného ředění. Myši se pozorují 21 dní po čelenži a počítají se myši uhynulé mezi 7. a 21. dnem po čelenži.

Výpočty. Výsledky se počítají obvyklými statistickými metodami pro kvantální odpověď (např. 5.3 Statistická analýza výsledků biologických zkoušek).

Validační kritéria. Zkoušku lze hodnotit, jestliže:

1. - koncentrace čelenžního viru je nejméně 100 LD₅₀,
2. - pro zkoušenou i srovnávací vakcínu leží ochranná dávka (PD₅₀) mezi nejvyšší a nejnižší podanou dávkou,
3. - statistická analýza nevykazuje signifikantní odchylku od linearity nebo rovnoběžnosti,
4. - interval spolehlivosti (P = 0,95) je nejméně 33 % a nejvýše 300 % stanovené účinnosti.

Požadavky na účinnost. K výpočtu průměrné účinnosti se použijí výsledky všech platných zkoušek a jejich intervaly spolehlivosti. Při výpočtu váženého průměru se jako váha použije převrácená hodnota druhé mocniny směrodatné odchylky. Vakcína vyhovuje zkoušce, jestliže stanovená účinnost není menší než účinnost schválená oprávněnou autoritou na základě údajů o účinnosti v klinických zkouškách.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

V označení na obalu se uvede:

1. - kmen viru použitého pro přípravu,
2. - typ buněk použitých pro výrobu vakcíny.

Vaccinum febris flavae vivum

Živá vakcína proti žluté zimnici

Je to lyofilizovaný přípravek kmene 17D viru žluté zimnice (Flavivirus hominis) pomnoženého na kuřecích embryích. Vakcína se rekonstituuje bezprostředně před použitím předepsaným způsobem na čirou tekutinu.

Výroba

Výroba vakcíny je založena na systému jednotné inokulace. Výrobní metoda prokazatelně poskytuje stejnorodou živou vakcínu proti žluté zimnici s přijatelnou imunogenitou a bezpečností pro člověka.

Výrobní metoda se validuje, aby se prokázalo, že bude-li přípravek zkoušen, vyhoví zkoušce na neškodnost imunních sér a vakcín pro humánní použití (2.6.9) s následující úpravou zkoušky na morčatech: každému morčeti se vstříkne deset lidských dávek a pozorují se 21 dní.

Referenční přípravek. Ve zkoušce na neurotropismus se použije jako referenční přípravek taková šarže vakcíny, která byla s uspokojivými výsledky použita u člověka.

Substrát pro pomnožení viru

Virus pro přípravu matečného a pracovního inokula a všech šarží vakcíny se pomnožuje v tkáních kuřecích embryí z chovu kuřat prostého specifikovaných patogenů (5.2.2).

Inokula

Kmen 17D je určen podle původních záznamů, které obsahují informaci o původu kmene a následné manipulaci s ním. Inokula viru se připravují ve velkých množstvích a uchovávají se při teplotě pod –60 °C. Matečné a pracovní inokulum neobsahují žádnou lidskou bílkovinu ani přidané sérum.

Není-li jinak vysvětleno a schváleno, virus v konečné vakcíně je na úrovni 204. až 239. pasáže z původně izolovaného kmene 17D. Pracovní inokulum je pouze jedinou pasáží z matečného inokula. Pracovní inokulum se použije bez zprostředkující pasáže jako inokulum pro infikování tkání použitých k výrobě šarže vakcíny, aby bylo zajištěno, že vakcína byla vyrobena pouze jedinou pasáží z matečného inokula, které vyhovělo všem zkouškám na bezpečnost.

Pouze virové inokulum, které vyhovuje následujícím požadavkům, se může použít k pomnožení viru.

Zkoušky totožnosti. V matečném a pracovním inokulu se virus žluté zimnice prokáže neutralizací sérem v buněčné kultuře za použití specifických protilátek.

Cizí agens (2.6.16). Každé pracovní inokulum vyhovuje následujícím zkouškám:

1. Bakterie a houby - sterilita
2. Mykoplazmata
3. Mykobakterie
4. Ptačí viry
5. Zkouška na dospělých myších (pouze intraperitoneální inokulace)
6. Zkouška na morčatech

Zkouška na opicích. Každé matečné a pracovní inokulum vyhovuje následujícím zkouškám na opicích na virémii (viscerotropismus), imunogenitu a neurotropismus.

Používají se opice druhu Macaca citlivé na virus žluté zimnice, které v době podání virové kultury nejsou prokazatelně imunní vůči žluté zimnici. Jsou zdravé a nebyly dříve intracerebrálně nebo intraspinálně očkovány. Mimo to nebyly očkovány jinými způsoby neurotropními viry nebo antigeny příbuznými viru žluté zimnice. Pro každou zkoušku se použije nejméně deset opic.

Použije se zkušební dávka 0,25 ml obsahující množství odpovídající nejméně 5000 myších LD₅₀ a nejvýše 50 000 myších LD₅₀, stanovená titrací infekčního viru a za použití stanoveného vztahu mezi koncentrací viru a myší LD₅₀ (viz Stanovení účinnosti). Zkušební dávka se pod anestezií vstříkne každé opici do frontálního laloku a opice se pozorují nejméně 30 dní.

Virémie (Viscerotropismus). Viscerotropismus je určen množstvím viru obsaženého v séru. Druhý, čtvrtý a šestý den po inokulaci se každé zkoušené opici odebere krev a z každého vzorku se připraví sérum. Z každého séra se připraví ředění 1 : 10, 1 : 100 a 1 : 1000 a každé ředění se naočkuje do skupiny nejméně šesti nádob s buněčnou kulturou používanou ke stanovení virové koncentrace. Inokulum vyhovuje zkoušce, jestliže žádné sérum neobsahuje více než ekvivalent 500 myších LD₅₀ v 0,03 ml a nejvýše jedno sérum obsahuje více než ekvivalent 100 myších LD₅₀ v 0,03 ml.

Imunogenita. Za 30 dní od podání zkušební dávky se každé opici odebere krev a z každého vzorku se připraví sérum. Inokulum vyhovuje zkoušce, jestliže se nejméně 90 % zkoušených opic ukáže jako imunních, což se stanoví vyšetřením jejich séra v dále popsané zkoušce na neutralizaci viru žluté zimnice.

Ukázalo se, že malé ředění séra (např. 1 : 10) může obsahovat nespecifické inhibitory, které ovlivňují tuto zkoušku; takové sérum se upraví, aby se inhibitory odstranily. Alespoň ředění séra 1 : 10, 1 :40 a 1 : 160 od každé opice se smíchají se stejným objemem kultury vakcinačního viru 17D na ředění, které poskytne nejvhodnější počet plaků při použité titrační metodě. Směsi séra s virem se 1 h inkubují ve vodní lázni při 37 °C a pak se ochladí ve vodě s ledem; po 0,2 ml směsi séra s virem se dá na čtyři misky s buněčnou kulturou a postupuje se jako při stanovení koncentrace viru. Podobně se naočkuje deset misek stejným množstvím virové kultury smíchané se stejným objemem zředěného 1 : 10 séra, o němž se ví, že neobsahuje žádné neutralizující protilátky proti viru žluté zimnice. Na konci pozorovací doby se porovná průměrný počet plaků na miskách obsahujících virovou kulturu a neimunní sérum s průměrným počtem plaků na miskách obsahujících virovou kulturu a jednotlivá ředění každého opičího séra. Nejvýše 10 % zkoušených opic má sérum, které při ředění 1:10 nestačí snížit počet plaků o 50 %.

Neurotropismus. Neurotropismus se stanoví z klinického pozorování encefalitidy, z výskytu klinických manifestací a histologických lézí při srovnání s deseti zvířaty očkovanými srovnávacím přípravkem. Virové inokulum není přijatelné, jestliže počet a trvání febrilních reakcí nebo klinických známek encefalitidy a patologické nálezy svědčí o změnách vlastnosti viru.

Klinické hodnocení. Opice se po 30 dní denně vyšetřují personálem dobře obeznámeným s klinickými příznaky encefalitidy u primátů (je-li třeba, opice se vyjmou z klecí a vyšetří se na příznaky motorické slabosti nebo křečí). Virové inokulum není přijatelné, jestliže opice po očkování vykazují známky encefalitidy, jako je paralýza nebo neschopnost stát po stimulaci, neboje mortalita vyšší než u referenčního přípravku. Tyto a jiné příznaky encefalitidy, jako jsou parézy, nekoordinace, letargie, třes nebo křeče, jsou převedeny do číselných hodnot, aby se síla příznaků mohla vyjádřit postupnou řadou. Každý den se každá opice ohodnotí počtem bodů na základě stupnice:

Klinické hodnocení jednotlivé opice odpovídá průměru denního bodování: klinické hodnocení inokula je součtem bodů jednotlivých opic. Inokulum není přijatelné, jestliže průměr klinického hodnocení u skupin opic naočkovaných tímto inokulem je signifikantně vyšší (P = 0,95) než u skupiny opic naočkovaných referenčním přípravkem. Při posuzování přijatelnosti inokula se bere ohled i na jednotlivá zvířata s neobvykle prudkými příznaky.

Histologické hodnocení. Vyšetřuje se těchto pět oblastí mozku:

Krční a bederní ztluštění páteřní míchy se každé rozdělí do šesti bloků: 15 μm řezy z tkáně zalité v parafínu se barví gallocyaninem. Numerické hodnocení každého řezu míchy a struktur v každém řezu mozku je uvedeno níže. Léze jsou hodnoceny následovně:

1. Stupeň 1 - minimální - 1 až 3 malé ohniskové zánětlivé infiltráty. Degenerace nebo ztráta několika neuronů.
2. Stupeň 2 - střední - 4 nebo více ohniskových zánětlivých infiltrátů. Degenerace nebo ztráta neuronů postihující nejvýše jednu třetinu buněk.
3. Stupeň 3 - těžký - střední ohniska nebo difuzní zánětlivé infiltráty. Degenerace nebo ztráta dvou třetin neuronů.
4. Stupeň 4 - záplava - různé, ale často prudké zánětlivé reakce. Degenerace nebo ztráta více než 90 % neuronů.

Bylo zjištěno, že inokulace vakcíny proti žluté zimnici do opičího mozku způsobuje léze v různých anatomických útvarech centrální nervové soustavy o různé frekvenci a síle (I. S. Levenbook et al., Journal of Biological Standardization, 1987, 15, 305-313). Na základě těchto dvou indikátorů se anatomické struktury mohou podle histologického hodnocení zařadit do tří skupin - cílová, chráněná a výběrová. Cílové zóny vykazují silné specifické léze u většiny opic bez ohledu na stupeň neurovirulence inokula. Chráněné zóny vykazují minimální specifické léze u menšiny zvířat. Výběrové zóny vykazují velmi signifikantní nárůst výskytu výrazných specifických lézí v závislosti na stupni neurovirulence inokula. Výběrové a cílové zóny pro opice Macaca cynomolgus a Macaca rhesus jsou uvedeny v tabulce.

Bodové hodnocení výběrové a cílové zóny se použije pro konečné hodnocení inokula. Pro hodnocení jednotlivých opic se sečtou počty reakcí v cílové zóně v každém řezu odděleně podle počtu zkoumaných oblastí. Podobně se vypočítá samostatné hodnocení pro výběrové zóny.

Průměr bodů pro zkoušenou skupinu se vypočítá dvěma způsoby: 1) dělením celkového počtu výběrových zón počtem opic; 2) dělením celkového počtu cílových a výběrových zón počtem opic. Tato dvě hodnocení je možno použít při rozhodování o vhodnosti inokula. Inokulum není možno použít, jestliže počet lézí je signifikantně vyšší (P = 0,95) než u skupiny opic inokulovaných referenčním přípravkem.

Pomnožováni a sklizeň viru

Všechny práce s kuřecími embryi se provádějí za aseptických podmínek v prostředí, kde se ve stejnou dobu nepracuje s jiným infekčním agens ani s jinými buňkami. Dvě procenta, ale nejméně dvacet embryí a nejvýše padesát embryí se ponechá jako neinfikovaná kontrola embryí. Po inokulaci a inkubaci v kontrolované teplotě se sklízí jen živá a typická embrya. Stáří embrya v době sklizně viru se odhadne z původního vložení vajec do inkubátoru a mělo by být nejvýše 12 dní. Po homogenizaci a vyčeření odstředěním se výtažek z embryonální dřeně zkouší, jak je popsáno dále, a do dalšího zpracování se uchovává při –70 °C nebo nižší teplotě. Virové sklizně, které vyhoví předepsaným zkouškám, se mohou smíchat. K virové suspenzi se v žádném stupni v průběhu výroby nepřidává žádná lidská bílkovina. Pokud se přidávají stabilizátory, pak prokazatelně nemají na člověka žádné antigenní ani senzibilizující působení.

Pouze jednotlivá sklizeň, která vyhovuje následujícím požadavkům, se může použít k přípravě konečné várky vakcíny.

Zkouška totožnosti. Jednotlivá sklizeň obsahuje viry, které se prokážou jako virus žluté zimnice v buněčné kultuře neutralizací specifickými protilátkami.

Cizí agens (2.6.16). Jednotlivá sklizeň vyhovuje ve zkouškách na cizí antigeny.

Kontrolní vejce (2.6.16). Kontrolní vejce vyhovují ve zkouškách na cizí antigeny.

Koncentrace viru. Aby se mohlo vypočítat ředění pro konečnou várku vakcíny, zkouší se každá jednotlivá sklizeň způsobem popsaným v odstavci Stanovení účinnosti.

Konečná várka vakcíny

Jednotlivé sklizně, které vyhověly výše předepsaným zkouškám, se spojí a znovu čeří. Provede se stanovení bílkovinného dusíku. Může se přidat vhodný stabilizátor a spojené sklizně se vhodně zředí.

Pouze taková konečná várka vakcíny, která vyhovuje následujícím požadavkům, se může použít k přípravě šarže.

Bakterie a houby. Provede se zkouška na sterilitu (2.6.1), na každou živnou půdu se použije 10 ml.

Obsah bílkovinného dusíku. Obsah bílkovinného dusíku před přidáním stabilizátoru je nejvýše 0,25 mg v lidské dávce.

Šarže

Konečná várka vakcíny se asepticky rozplní do sterilních zabezpečených obalů a lyofilizuje se na obsah vlhkosti, která je prokazatelně vhodná pro stabilitu vakcíny. Potom se obaly uzavřou tak, aby se předešlo kontaminaci a vniknutí vlhkosti.

Pouze šarže, která vyhovuje z hlediska tepelné stability a všem požadavkům uvedeným dále v odstavcích Zkouška totožnosti, Zkoušky na čistotu a Stanovení obsahu, se může uvolnit k použití. Pokud byla zkouška na ovalbumin provedena s uspokojivými výsledky v konečné várce vakcíny, může se u šarže vypustit.

Tepelná stabilita. Vzorky šarže lyofilizované vakcíny se inkubují v suchém stavu 14 dní při 37 °C. V inkubované i neinkubované vakcíně se souběžně stanoví koncentrace viru, jak je uvedeno v odstavci Stanovení účinnosti. Rozdíl v koncentraci viru mezi inkubovanou a neinkubovanou vakcínou nepřesáhne 1,0 log₁₀ a koncentrace viru v lidské dávce inkubované vakcíny je nejméně počet jednotek tvořících plaky (PFU), odpovídající 1 x 10³ myších LD₅₀.

Zkouška totožnosti

Když se vakcína rekonstituuje podle návodu a smíchá se specifickými protilátkami proti viru žluté zimnice, dojde k signifikantnímu snížení její schopnosti infikovat vnímavé buněčné kultury.

Zkoušky na čistotu

Bakterie a houby. Rekonstituovaná vakcína vyhovuje zkoušce na sterilitu (2.6.1).

Ovalbumin. Nejvýše 5 μg ovalbuminu v lidské dávce; stanoví se vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1).

Bakteriální endotoxiny (2.6.14). Nejvýše 5 m.j. bakteriálního endotoxinu v lidské dávce.

Voda, semimikrostanovení (2.5.12). Nejvýše 3,0 %.

Stanovení účinnosti

Infekční virus se titruje v buněčných kulturách. K validaci každého stanovení se použije vhodný virový referenční přípravek.

Koncentrace viru je nejméně ekvivalent v PFU 1 x 10³ myších LD₅₀ v lidské dávce. Vztah mezi myší LD₅₀ a PFU si stanoví každá laboratoř a schválí jej oprávněná autorita.

Ke stanovení myší LD₅₀ se může použít dále uvedená metoda nebo jiný vhodný postup.

Navržená metoda ke stanovení myší LD₅₀.

Myší LD₅₀. Je to statisticky vypočítané množství virové suspenze, u něhož se očekává vyvolání fatální specifické encefalitidy u 50 % myší vysoce vnímavého kmene, 4 až 6 týdnů starých, po intracerebrální inokulaci.

Připraví se vhodné sériové ředění rekonstituované vakcíny v rozpouštědle pro virus žluté zimnice, jako je např. roztok bovinního albuminu R (7,5 g/l) v tlumivém roztoku fosforečnanovém s chloridem sodným o pH 7,4 nebo jiné rozpouštědlo, které prokazatelně odpovídá udržením infekčnosti viru.

Myším vysoce vnímavého kmene, 4 až 6 týdnů starým, se intracerebrálně vstříkne při anestezii 0,03 ml ředění vakcíny. Pro každé ředění se použije skupina o nejméně šesti myších; série ředění se zvolí tak, aby zasahovala od 0 % do 100 % myší mortality. Myši se naočkují ihned po přípravě ředění a pozorují se 21 dní. Všechny úhyny se zaznamenávají. Do výpočtu se zahrnují jenom přežívající myši a úhyny způsobené typickou infekcí žlutou zimnicí. Myši paralyzované dvacátý první den pozorování se počítají jako přežívající.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

V označení na obalu se uvede:

1. - kmen viru použitý v přípravku,
2. - že je vakcína připravena z kuřecích embryí,
3. - minimální koncentrace viru,
4. - varování před stykem s dezinfekčními prostředky,
5. - doba, do které se má vakcína po rekonstituci použít.

Vaccimim haemophili stirpe b conjugatum

Konjugovaná vakcína proti hemofilům typu b

Je to tekutý nebo lyofilizovaný přípravek obsahující polysacharid získaný z vhodného kmene Haemophilus influenzae typ b, kovalentně vázaný na bílkovinný nosič. Polysacharid polyribosylribitolfosfat, označovaný jako PRP, je lineární kopolymer složený z opakujících se jednotek 3-β-d-ribofuranosyl-(1→1)-ribitol-5-fosfatu [C₁₀H₁₉O₁₂P)_n] s definovanou molekulovou hmotností. Bílkovinný nosič, je-li konjugován s PRP, je schopen navodit na B-lymfocytech závislou imunitní odpověď na tento polysacharid.

Vakcína vyhovuje článku Vaccina ad usum humanum.

Výroba

Všeobecná ustanovení

Výrobní proces má prokazatelně poskytovat stále stejné vakcíny, které jsou dostatečně imunogenní a neškodné. Výroba PRP a nosiče je založena na systému jednotné inokulace.

Výrobní postup se validuje, aby se prokázalo, že pokud bude výrobek zkoušen, vyhoví zkoušce na neškodnost imunních sér a vakcín pro humánní použití (2.6.9).

Stabilita šarže a odpovídajících meziproduktů se hodnotí jednou nebo více vybranými zkouškami. Tyto zkoušky mohou zahrnovat stanovení velikosti molekul, stanovení volného PRP v konjugátu a stanovení imunogenity u myší. Na základě výsledků stabilitních zkoušek se vytyčí pro tyto zkoušky požadavky na propuštění, aby se zajistilo, že vakcína bude na konci doby platnosti ještě uspokojivá.

Bakteriální inokula

Barvením podle Grama a inokulací na vhodné půdy se prokáže, že matečné inokulum H.influenzae typu b neobsahuje kontaminující látky. Několik zorných polí se při velkém zvětšení vyšetří tak, aby bylo prohlédnuto nejméně 10 000 mikroorganismů.

Polysacharid H. influenzae typu b (PRP)

H.influenzae typu b se pěstuje v tekuté půdě, která neobsahuje vysokomolekulámí polysacharidy; jestliže některá složka půdy obsahuje krevní substance, postup se validuje, aby se dokázalo, že po purifikačních krocích nejsou tyto substance dále detekovatelné. Bakteriální čistota kultury se prokazuje vhodnými metodami. Kultura může být inaktivovaná. PRP je separován z tekuté kultury a purifikován vhodnou metodou. Těkavé látky včetně vody se v purifikovaném polysacharidu stanoví vhodnou metodou, jako je termogravimetrie (2.2.34); výsledek se použije k přepočtu výsledků jiných zkoušek na vysušenou látku, jak je popsáno dále.

Pouze PRP, který vyhoví následujícím požadavkům, se může použít pro přípravu konjugátu.

Totožnost. PRP se dokáže imunochemickou metodou (2.7.1) nebo jinou vhodnou metodou.

Distribuce molekulové velikosti. Procento PRP vymývané před danou hodnotou K_D nebo v rozsahu hodnot K_D se stanoví vylučovací chromatografií (2.2.30). Přijatelná hodnota je stanovena pro jednotlivé přípravky a každá šarže PRP prokazatelně vyhovuje této hodnotě. Pro informaci jsou v tabulce uvedeny limity pro schvalované výrobky za použití uvedených stacionárních fází. Kde je to vhodné, stanoví se distribuce velikosti molekul po chemické modifikaci polysacharidu.

Validované stanovení stupně polymerizace nebo váženého průměru hmotnosti molekul a disperze molekulových hmotností se mohou použít místo stanovení distribuce molekulové velikosti.

Ribosa (2.5.31). Nejméně 32 %, počítáno na vysušenou látku.

Fosfor (2.5.18). 6,8 % až 9,0 %, počítáno na vysušenou látku.

Bílkoviny (2.5.16). Nejvýše 1,0%, počítáno na vysušenou látku. K detekci 1 % bílkoviny se použije dostatečné množství PRP.

Nukleová kyselina (2.5.17). Nejvýše 1,0 %, počítáno na vysušenou látku.

Bakteriální endotoxiny (2.6.14). Nejvýše 25 m.j. endotoxinu v mikrogramu PRP.

Zbytkové látky. Kde je to vhodné, provádějí se zkoušky na stanovení zbytkových látek použitých při inaktivaci a purifikaci. Přijatelná hodnota pro každou látku je stanovena pro jednotlivý přípravek a každá šarže PRP prokazatelně vyhovuje limitu. Jestliže validační studie prokázaly odstranění zbytkových látek, zkouška u PRP se může vypustit.

Bílkovinný nosič

Bílkovinný nosič je vybrán tak, aby po konjugaci s PRP byl schopen indukovat imunitní odpověď závislou na T-lymfocytech. Povolené nosiče a konjugační metody jsou uvedeny v tabulce 1.

Bílkovinný nosič je produkován v kultuře vhodných mikroorganismů, ověřené na bakteriální čistotu. Kultura může být inaktivovaná; bílkovinný nosič je purifikován vhodnou metodou. Pouze bílkovinný nosič, který vyhovuje následujícím požadavkům, se může použít k výrobě konjugátu.

Totožnost. Zkouška totožnosti se provede vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1)

Tab. 1. Charakteristiky přípravku a specifikace pro PRP a bílkovinný nosič u běžně schválených přípravků

Vysvětlivky:

Sterilita (2.6.1). Na každou půdu se inokuluje 10 ml nebo ekvivalent 100 dávek, podle toho, co je méně.

Difterický toxoid. Difterický toxoid se vyrábí tak, jak je popsáno v článku Vaccinum diphtheriae adsorbatum a vyhovuje požadavkům předepsaným pro várku purifíkováného toxoidu.

Tetanický toxoid. Tetanický toxoid se vyrábí tak, jak je popsáno v článku Vaccinum tetanicum adsorbatum a vyhovuje požadavkům předepsaným pro várku purifikovaného toxoidu vyjma antigenní čistoty; nejméně 1500 Lf na miligram bílkovinného dusíku.

Difterický protein CRM 197. Obsahuje nejméně 90% difterického CRM 197 proteinu, stanoveného vhodnou metodou. Provádějí se vhodné zkoušky bud’ pro validaci, nebo běžně, aby se prokázalo, že přípravek není toxický.

OMP (komplex bílkovin vnější membrány meningokoka skupiny B). OMP vyhovuje následujícím požadavkům pro lipopolysacharidy a pyrogenní látky.

Lipopolysacharidy. Nejvýše 8 % lipopolysacharidů, stanoveno vhodnou metodou.

Pyrogenní látky (2.6.8). Každému králíkovi se na kilogram živé hmotnosti vstříkne 0,25 μg OMP.

Várka konjugátu

PRP je chemicky modifikován k umožnění konjugace: obvykle je částečně depolymerizován před nebo během tohoto procesu. Před konjugací mohou být do bílkovinného nosiče nebo PRP zavedeny reaktivní funkční skupiny nebo vazebné můstky (spacery). Konjugát se získá kovalentní vazbou PRP a nosiče. Kde je to vhodné, nezreagované funkční skupiny se schopností potenciálně reagovat se blokují vhodnými krycími činidly.

Pouze várka konjugátu, která vyhovuje následujícím předpisům, se může použít k přípravě konečné várky vakcíny. Pro každou zkoušku a každou částečnou složku jsou stanoveny limity přijatelnosti a každá šarže konjugátu prokazatelně vyhoví těmto limitům. Limity jsou uvedeny v tabulce 2. Pro lyofilizovanou vakcínu mohou být některé ze zkoušek provedeny spíše v konečné šarži než ve várce konjugátu, neboť lyofilizační postup může ovlivnit zkoušenou složku.

PRP. Obsah PRP se určí ze stanovení fosforu (2.5.18) nebo ze stanovení ribosy (2.5.31) nebo některou imunochemickou metodou (2.7.1).

Bílkoviny. Obsah bílkovin se stanoví vhodnou imunochemickou metodou např. (2.5.16).

Poměr PRP k bílkovinám. Poměr se stanoví výpočtem.

Distribuce velikosti molekul. Distribuce velikosti molekul se stanoví vylučovací chromatografií (2.2.30).

Volný PRP. Nenavázaný PRP se stanoví po odstranění z konjugátu, například vylučovací chromatografií nebo hydrofobní chromatografií, ultrafiltrací nebo jinou validovanou metodou.

Volný bílkovinný nosič. Stanoví se vhodnou metodou (která může zahrnovat odvození obsahu výpočtem z výsledků ostatních zkoušek). Množství odpovídá rozmezí stanovenému pro jednotlivý přípravek.

Nezreagované funkční skupiny. Žádné nezreagované funkční skupiny nelze ve várce konjugátu detegovat, jestliže postup validace neprokázal, že nezreagované funkční skupiny detegovatelné v tomto stadiu se odstraní při následujících výrobních krocích (např. vzhledem ke krátkému poločasu).

Zbytkové látky. Odstranění zbytků látek, jako jsou kyanid, EDAC (ethydimethylaminopropylarbodiimid) a fenol, se prokáže vhodnými zkouškami nebo validací výrobního postupu.

Sterilita (2.6.1). Provede se zkouška, při níž se na každou půdu použije 10 ml nebo ekvivalent 100 dávek, podle toho, co je méně.

Tab. 2. Požadavky na várku konjugátu pro běžně schválené přípravky

Konečná várka vakcíny

K várce konjugátu se před ředěním na konečnou koncentraci vhodným rozpouštědlem může přidat adjuvans, protimikrobní konzervační látka a stabilizátor. Pouze konečná várka, která vyhovuje následujícím požadavkům, může být použita pro přípravu konečné šarže.

Protimikrobní konzervační látka. Je-li to vhodné, stanoví se množství protimikrobní konzervační látky vhodnou chemickou nebo ťýzikálně-chemickou metodou. Obsah jev rozmezí 85 % až 115 % zamýšleného množství.

Sterilita (2.6.1). Vyhovuje zkoušce na sterilitu, při níž se na každou půdu použije 10 ml.

Šarže

Pouze šarže, která vyhovuje každému z dále uvedených požadavků na Totožnost, Zkoušky na čistotu a Stanovení účinnosti, může být uvolněna pro použití.

Provedení zkoušky na protimikrobní konzervační látky a u tekutých vakcín stanovení účinnosti v konečné várce vakcíny umožňují vynechat tyto zkoušky v šarži.

Hodnota pH (2.2.3). pH vakcíny, je-li třeba, rekonstituované, je v rozmezí schváleném pro přípravek.

Zkouška totožnosti

Totožnost vakcíny je prokázána vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1) pro PRP nebo stanovení účinnosti slouží také jako zkouška totožnosti.

Zkoušky na čistotu

Obsah PRP. Nejméně 80 % deklarovaného množství PRP se stanoví buď jako obsah ribosy (2.5.31), nebo fosforu (2.5.18), nebo vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1).

Hliník. Je-li jako adsorbent použit hydroxid hlinitý, vakcína vyhovuje ve zkoušce předepsané v článku Vaccina ad usum humanum.

Protimikrobní konzervační látky. Kde je to vhodné, stanoví se množství protimikrobní konzervační látky vhodnou chemickou nebo fyzikálně-chemickou metodou. Obsahuje nejnižší prokazatelně účinné množství a nejvýše 115 % množství uvedeného na obalu.

Voda (2.5.12). U lyofilizovaných vakcín je obsah vody nejvýše 3 %.

Sterilita (2.6.1). Vyhovuje zkoušce na sterilitu.

Pyrogenní látky (2.6.8).Vyhovuje zkoušce na pyrogenní látky. Na 1 kg hmotnosti králíka se vstříkne nitrožilně následující množství: 1 μg PRP v případě vakcíny s difterickým toxoidem nebo CRM 197 difterickým proteinem jako nosičem; 0,1 μg PRP v případě vakcíny s tetanickým toxoidem jako nosičem; 0,025 μg PRP v případě vakcíny s OMP jako nosičem.

Stanovení účinnosti

Pokud není předepsáno a schváleno jinak, provede se vhodná zkouška imunogenity na myších k průkazu schopnosti indukovat imunitní odpověď závislou na T-lymfocytech. Následující text se uvádí jako příklad zkoušky, která se může používat po validaci.

Použijí se dvě skupiny zdravých myší 6 až 8 týdnů starých z jednoho chovu, nejméně po 8 zvířatech. Myším jedné skupiny se vstříkne ve dnech 0 a 14 podkožně vhodné množství vakcíny. Druhá skupina zůstává jako kontrolní. Ve 21. den se zvířata vykrvácejí. Séra kontrolní skupiny se smíchají. Provede se zkouška na PRP-protilátky v jednotlivých sérech imunizované skupiny a ve směsném vzorku kontrolní skupiny. Použije se vhodná imunochemická metoda, např. ELISA pro IgG (2.7.1). Nejméně polovina očkovaných myší vykazuje sérokonverzi, tj. titr protilátek je nejméně 4x vyšší než ve směsném kontrolním séru.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

V označení na obalu se uvede:

1. - počet mikrogramů PRP v lidské dávce,
2. - typ a nominální množství bílkovinného nosiče v jedné lidské dávce.

Vaccinum hepatitidis A inactivatum adsorbatum

Inaktivovaná vakcína proti hepatitidě A adsorbovaná

Je to tekutý přípravek z vhodného kmene viru hepatitidy A pomnoženého v buněčných kulturách, inaktivovaného validovanou metodou a adsorbovaného na minerální nosič. Vakcína je opalescentní suspenze.

Vakcína vyhovuje článku Vaccina ad usum humanum.

Výroba

Výroba vakcíny je založena na systému jednotné inokulace a na systému buněčné banky. Výrobní metoda prokazatelně poskytuje stejnorodou vakcínu, která vyhovuje požadavkům na imunogenitu, neškodnost a stabilitu.

Výrobní metoda se validuje, aby se prokázalo, že přípravek, bude-li zkoušen, vyhoví zkoušce neškodnosti pro imunní séra a humánní vakcíny (2.6.9).

Pokud není doloženo a schváleno jinak, virus v konečném přípravku neprojde více pasážemi z matečného inokula než virus použitý k přípravě vakcíny, která vyhověla v klinických studiích z hlediska neškodnosti a účinnosti.

Referenční přípravek. Část šarže, která byla prokazatelně nejméně tak imunogenní jako šarže, jež v klinické studii na mladých zdravých dospělých vykazovala nejméně 95% sérokonverzi, odpovídající hladině neutralizačních protilátek považované za ochrannou po úplné primární imunizaci, se používá jako referenční přípravek. Jako ochranná hladina protilátek se uznává 0,02 m.j./ml, stanoveno metodou ELISA.

Substrát pro pomnožování viru

Virus se pomnožuje v linii lidských diploidních buněk (5.2.3) nebo v kontinuální linii buněk schválené oprávněnou autoritou.

Inokula

Kmen viru hepatitidy A, který se používá k přípravě matečného inokula, se identifikuje vývojovými záznamy, které obsahují informace o původu kmene a o následné manipulaci s ním.

Pouze inokulum, které odpovídá následujícím požadavkům, se může použít pro pomnožování viru.

Zkouška totožnosti. Každé matečné a pracovní inokulum viru se identifikuje jako virus hepatitidy A pomocí specifických protilátek.

Koncentrace viru. Ke sledování pravidelnosti výroby se stanoví koncentrace viru v každém matečném a pracovním inokulu.

Cizí agens. Matečná a pracovní inokula vyhovují požadavkům na inokula pro virové vakcíny (2.6.16). Jestliže byla pro izolaci virového kmene použita kultura primárních opičích buněk, provedou se navíc opatření, aby se zajistilo, že kmen není kontaminován opičími viry, jako jsou virus opičí imunodeficience a filoviry.

Pomnožování viru a sklizeň

Veškeré činnosti s buněčnou bankou a následnými buněčnými kulturami se provádějí za aseptických podmínek v prostorách, kde nejsou zpracovávány jiné buňky. Při přípravě média pro kultivaci buněk se používá schválené sérum živočišného (nikoli lidského) původu. Sérum a trypsin používané při přípravě buněčné suspenze a médií jsou prokazatelně prosty cizích agens. Médium pro kultivaci buněk může obsahovat indikátor pH, jako je fenolová červeň, a schválená antibiotika v nejnižší účinné koncentraci. Nejméně 500 ml buněčných kultur použitých pro výrobu vakcíny se ponechá jako neinfikované buněčné kultury (kontrolní buňky). Několikanásobné sklizně z téže buněčné produkční kultury se mohou spojit a považovat za jednotlivou sklizeň.

Pouze jednotlivá sklizeň vyhovující následujícím požadavkům se může použít k přípravě vakcíny. Jestliže stanovení poměru virové koncentrace k obsahu antigenu provedené na vhodném počtu sklizní prokazuje pravidelnost výroby, může se tato zkouška následně vypustit při běžné kontrole.

Zkouška totožnosti. Zkouška na obsah antigenu slouží také jako zkouška totožnosti jednotlivé sklizně.

Bakterie a houby (2.6.1). Jednotlivá sklizeň vyhovuje zkoušce na sterilitu; na každou živnou půdu se použije 10 ml.

Mykoplazmata (2.6.7). Jednotlivá sklizeň vyhovuje zkoušce na mykoplazmata; na každou půdu se použije 1 ml.

Kontrolní buňky. Kontrolní buňky z kultur produkčních buněk vyhovují zkoušce totožnosti a požadavkům na cizí agens (2.6.16).

Obsah antigenu. Stanoví se obsah antigenu hepatitidy A vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1) ke sledování pravidelnosti výroby; obsah je v rozmezí schváleném pro jednotlivý přípravek.

Poměr koncentrace viru k obsahu antigenu. Stálost poměru koncentrace infekčního viru, stanoveného vhodnou metodou na buněčné kultuře, k obsahu antigenu je stanoven validací na vhodném počtu jednotlivých sklizní.

Purifikace a purifikovaná sklizeň

Sklizeň, která může být spojením několika jednotlivých sklizní, se purifikuje validovanými metodami. Jsou-li pro pomnožení viru použity kontinuální buněčné linie, purifikační proces prokazatelně zahrnuje také snížení hladiny DNK hostitelských buněk.

Pouze purifikovaná sklizeň, která vyhovuje následujícím požadavkům, může být použita k přípravě inaktivované sklizně.

Koncentrace viru. Koncentrace infekčního viru v purifikované sklizni se stanoví na vhodné tkáňové kultuře ke sledování pravidelnosti výroby a jako počáteční bod pro sledování inaktivační křivky.

Poměr antigenu k celkové bílkovině. Stanoví se obsah antigenu viru hepatitidy A vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1). Stanoví se obsah celkové bílkoviny validovanou metodou. Poměr obsahu antigenu viru hepatitidy A k obsahu celkové bílkoviny je v rozmezí schváleném pro jednotlivý přípravek.

Bovinní sérumalbumin. Nejvýše 50 ng v ekvivalentu jedné lidské dávky, stanoveno vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1). Jestliže to dovolí výrobní proces, lze použít jiné vhodné bílkovinné markéry k průkazu účinné purifikace.

Zbytková DNK hostitelských buněk. Je-li pro pomnožení viru použita kontinuální buněčná linie, obsah zbytkové DNK hostitelských buněk, stanovený vhodnou imunochemickou metodou, jak je popsáno v článku Producta ab ADN recombinante, je nejvýše 100 μg v ekvivalentu jedné lidské dávky.

Zbytky chemikálií. Pokud se při purifikačních postupech používají chemické látky, provedou se na purifikované sklizni (nebo na inaktivované sklizni) zkoušky na tyto látky, pokud validace postupu neprokáže úplné odstranění. Koncentrace nepřesahuje rozmezí schválené pro jednotlivý přípravek.

Inaktivace a inaktivovaná sklizeň

Několik puntíkovaných sklizní se před inaktivací může spojit. K zamezení interference v inaktivačním procesu se předchází tvorbě virových agregátů nebo se virové agregáty odstraňují bezprostředně před nebo během inaktivačního postupu. Virová suspenze se inaktivuje validovanou metodou; metoda je prokazatelně schopna stejnoměrně inaktivovat virus hepatitidy A bez poškození antigenní a imunogenní aktivity; součástí validační studie je inaktivační křivka, reprezentující koncentraci zbytkového živého viru, měřenou nejméně třikrát (např. ve dni 0, 1 a 2 inaktivačního postupu). Při použití formaldehydu k inaktivaci se zbytky volného formaldehydu stanoví na konci inaktivačního procesu.

Pouze inaktivovaná sklizeň, která vyhovuje následujícím požadavkům, se může použít pro přípravu konečné várky vakcíny.

Inaktivace. Provede se pomnožovací zkouška na přítomnost zbytků infekčního viru hepatitidy A inokulací určitého množství inaktivované sklizně. Toto množství odpovídá 5 % šarže, ale nejvýše 1500 dávek vakcíny. Inokuluje se do buněčných kultur téhož typu, který byl použit pro přípravu vakcíny, a inkubace probíhá 28 dní. Po dvou pasážích se provede zkouška vhodné citlivosti na přítomnost zbytkového infekčního viru. Ve vzorcích odebraných na konci inaktivace se nenaleznou známky pomnožení viru hepatitidy A. Jako pozitivní kontrola se souběžně použije infekční virus k prokázání vnímavosti buněk a nepřítomnosti interference.

Sterilita (2.6.1). Inaktivovaná virová sklizeň vyhovuje zkoušce na sterilitu; na každou živnou půdu se použije 10 ml.

Bakteriální endotoxiny (2.6.14). Jestliže se v konečném výrobku nemůže provést validní test na bakteriální endotoxiny, např. pro přítomnost adjuvans, provede se zkouška v inaktivované sklizni. Obsahuje nejvýše 2 m.j. endotoxinu v ekvivalentu jedné lidské dávky.

Obsah antigenu. Vhodnou imunochemickou metodou se stanoví obsah antigenu viru hepatitidy A (2.7.1).

Zbytky chemikálií. Viz odstavec Purifikace a purifikovaná sklizeň.

Konečná várka vakcíny

Konečná várka vakcíny se připraví z jedné nebo více inaktivovaných sklizní. Mohou se přidat schválená adjuvans, stabilizátory a protimikrobní konzervační látky.

Pouze taková konečná várka vakcíny, která vyhovuje následujícím požadavkům, se může použít k přípravě šarže.

Sterilita (2.6.1). Konečná várka vakcíny vyhovuje ve zkoušce na sterilitu; na každou živnou půdu se použije 10 ml.

Protimikrobní konzervační látky. Při jejich použití se stanoví množství protimikrobních konzervačních látek vhodnou chemickou nebo fyzikálně-chemickou metodou. Stanovené množství je v rozmezí 85 % až 115 % zamýšleného množství.

Šarže

Konečná várka vakcíny se asepticky rozplní do sterilních obalů. Obaly se potom uzavřou tak, aby se předešlo kontaminaci.

Pouze šarže, která vyhovuje všem požadavkům uvedeným dále v odstavcích Zkouška totožnosti, Zkoušky na čistotu a Stanovení účinnosti, se může uvolnit k použití. Za předpokladu, že zkouška na volný formaldehyd (přichází-li v úvahu) a stanovení obsahu protimikrobních konzervačních látek (přichází-li v úvahu) a stanovení účinnosti byly provedeny v konečné várce vakcín s vyhovujícími výsledky, lze je u šarže vypustit.

Zkouška totožnosti

Obsah antigenu viru hepatitidy A ve vakcíně se prokáže vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1) za použití specifických protilátek nebo zkouškou imunogenity na myších, popsanou v odstavci Stanovení účinnosti.

Zkoušky na čistotu

Hliník. Jestliže byl použit jako adsorbent hydrátovaný fosforečnan hlinitý nebo hydroxid hlinitý, vyhovuje vakcína zkoušce předepsané v článku Vaccina ad usum humanum.

Volný formaldehyd. Při použití formaldehydu k inaktivaci vyhovuje vakcína zkoušce předepsané v článku Vaccina ad usum humanum.

Protimikrobní konzervační látky. Při jejich použití se stanoví jejich množství vhodnou chemickou nebo fyzikálně-chemickou metodou. Množství není nižší než nejnižší prokazatelně účinné množství a vyšší než 115 % množství uvedeného v označení.

Sterilita (2.6.1). Vakcína vyhovuje zkoušce na sterilitu.

Stanovení účinnosti

Účinnost vakcíny se stanoví buď porovnáním množství nezbytného k vytvoření specifických protilátek u myší s množstvím referenčního přípravku potřebným k vyvolání téhož účinku, nebo se provede validované stanovení obsahu antigenu in vitro.

Dále uvedená zkouška na myších je příkladem metody, která byla shledána vhodnou pro danou vakcínu; mohou se použít i jiné validované metody.

Výběr a rozdělení zkoušených zvířat. Použijí se zdravé myši z jednoho chovu, staré 5 týdnů a prokazatelně vhodného kmene. Používají se zvířata téhož pohlaví. Zvířata se rozdělí do nejméně sedmi stejných skupin o počtech vhodných pro požadavky zkoušky.

Stanovení účinnosti zkoušené vakcíny. K ředění se použije roztok chloridu sodného R (9 g/l) obsahující hliníkové adjuvans použité pro vakcínu. Připraví se nejméně tři ředění zkoušené vakcíny a referenčního přípravku. Každému zvířeti ve skupině se subkutánně vstříkne nejvýše 1,0 ml ředění určeného pro skupinu. Kontrolní skupině neočkovaných zvířat se subkutánně vstříkne stejné množství výše uvedeného roztoku k ředění. Po 28 až 32 dnech se zvířatům podá anestezie, vykrvácejí se a jednotlivá séra se zpracují odděleně. V jednotlivých sérech se vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1) stanoví obsah specifických protilátek proti hepatitidě A (2.7.1).

Výpočet. Výpočet se provede obvyklými statistickými metodami pro zkoušky s kvantitativní odpovědí (např. 5.3 Statistické hodnocení výsledků biologických zkoušek, sekce 4).

Podle rozložení reakčních hladin naměřených ve všech sérech nevakcinované skupiny se stanoví maximální reakční hladina, kterou lze nalézt u nevakcinovaných zvířat pro tuto zvláštní zkoušku. Odpověď ve vakcinovaných skupinách, která přesahuje tuto hladinu, je definována jako sérokonverze.

Provede se vhodná transformace na procentové vyjádření zvířat vykazujících sérokonverzi v každé skupině (např. probitová transformace) a provede se analýza dat podle rovnoběžného modelu log dávky - odpověď. Stanoví se účinnost zkoušeného přípravku ve vztahu k referenčnímu přípravku.

Validační podmínky. Zkoušku lze hodnotit jestliže:

1. - pro zkoušenou i referenční vakcínu leží ED₅₀ mezi nejnižší a nejvyšší dávkou podanou zvířatům,
2. - statistická analýza nevykazuje signifikantní odchylku od linearity nebo rovnoběžnosti,
3. - předpokládané limity odhadované relativní účinnosti leží mezi 33 % a 300 % stanovené účinnosti.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

V označení na obalu se uvede biologický původ buněk a adjuvans použité pro přípravu vakcíny.

Vaccinum hepatitidis viralis anatis vivum

Živá vakcína proti infekčnímu zánětu jater kachen

Je to přípravek z vhodného kmene viru 1 infekčního zánětu jater kachen.

Výroba

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium. Kmen viru užívaného k výrobě se pomnožuje v alantoidní dutině kuřecích embryí pocházejících z chovu prostého specifikovaných patogenů (5.2.2) nebo ve vhodných buněčných kulturách (5.2.4). Virová suspenze se sklidí, smíchá se s vhodným stabilizujícím roztokem a může se lyofilizovat.

Výběr vakcinačního kmene

Vakcinační kmen je prokazatelně postačující z hlediska bezpečnosti (5.2.6) nevratnosti virulence aimunogenity (5.2.7) pro ptáky, kterým je určen. K důkazu bezpečnosti aimunogenity se mohou použít následující zkoušky.

Bezpečnost. Zkouška se provede všemi zamýšlenými způsoby podání. Pro každou zkoušku se použije nejméně dvacet vnímavých jednodenních kachňat, která nemají protilátky proti viru 1 infekčního zánětu jater kachen. Každému kachněti se podá nejméně desetinásobek nejvyššího možného titru viru, který může být obsažen v jedné dávce vakcíny. Zvířata se pozorují 21 dní. Vakcinační virus je vyhovující, jestliže žádné kachně nevykazuje nápadné příznaky onemocnění ani neuhyne z příčin, jež bylo možné přisoudit vakcinačnímu viru.

Návratnost virulence. Každému z pěti jednodenních domácích kachňat, která nemají protilátky proti viru 1 infekčního zánětu jater kachen, se oronazálně podá takové množství vakcinačního viru, které je vnejvyšší míře možné získat nazpět níže popsanou pasáží. Za 2 až 4 dny se z každého kachněte odeberou vzorky jater a připraví se směsný vzorek. Každému z dalších pěti sérologicky negativních domácích kachňat stejného stáří se oronazálně podá 1 ml směsné suspenze jater. Tento postup se opakuje pětkrát. V každé pasáži se ověřuje přítomnost viru. Jestliže se v některé úrovni pasáže virus nezjistí, provede se druhá série pasáží. Kachňata poslední pasáže se pozorují 21 dní. Vakcinační virus je vyhovující, jestliže není zjištěn náznak vzestupu virulence v nejvyšší pasáži ve srovnání s nepasážovaným virem. Pokud virus není zjištěn v jedné sérii pasáží, vakcinační virus je vyhovující, jestliže není zjištěn náznak vzestupu virulence v nejvyšší pasáži, ve které byl virus získán nazpět. Pokud se objeví náznak návratu virulence během pasáží, vydá se pro užití vakcíny doporučení varující před přenosem vakcinačního viru na vnímavá kachňata.

Imunogenita. Zkouška popsaná v odstavci Stanovení účinnosti je vhodná k průkazu imunogenity.

Zkoušení šarže

Jestliže zkouška na viry ptačí leukózy a zkoušky na cizí viry užívající buněčné kultury a užívající oplozená vejce vykázaly vyhovující výsledky s reprezentativní šarží vakcíny, mohou se při běžné kontrole jiných šarží vakcíny připravených ze stejného inokula tyto zkoušky se souhlasem oprávněné autority vypustit.

Zkouška totožnosti

Vakcína, je-li třeba, ředěná a neutralizovaná monospecifickým sérem, již neinfikuje buněčné kultury ani alantoidní dutiny kuřecích embryí pocházejících z chovu prostého specifikovaných patogenů (5.2.2), do nichž byla naočkována.

Zkoušky na čistotu

Bezpečnost. Použije se nejméně deset jednodenních domácích kachňat bez protilátek proti viru 1 infekčního zánětu jater kachen. Každému kachněti se předepsaným způsobem podá deset dávek vakcíny a pozorují se 21 dní. Zkoušku lze hodnotit, jestliže během pozorovací doby neuhynou více než dvě kachňata z důvodů, které nejsou způsobeny vakcínou. Vakcína vyhovuje, jestliže žádné kachně nevykazuje nadměrné klinické příznaky onemocnění a není zaznamenán úhyn, jejž by bylo možno připsat vakcíně.

Bakterie a houby. Vakcína i rozpouštědlo vyhovují zkoušce na sterilitu podle článku Vaccina ad usum veterinarium.

Mykoplazmata (2.6.7). Vakcína vyhovuje zkoušce na mykoplazmata.

Viry ptačí leukózy (2.6.4). Vakcína, je-li třeba, ředěná a neutralizovaná monospecifickým sérem, vyhovuje zkoušce na viry ptačí leukózy.

Cizí viry při použití buněčných kultur (2.6.5). Vakcína, je-li třeba, ředěná a neutralizovaná monospecifickým sérem, vyhovuje zkoušce na cizí viry při použití buněčných kultur.

Cizí antigeny při použití kuřat (2.6.6). Vakcína vyhovuje zkoušce na cizí antigeny při použití kuřat. Rovněž se provede se sérem vakcinovaných kuřat zkouška pomocí fluorescenční protilátky nebo enzymově imunosorbentové stanovení (ELISA) na virus ptačí retikuloendoteliózy.

Cizí viry na kuřecích embryích (2.6.3). Vakcína, je-li třeba, ředěná a neutralizovaná monospecifickým sérem, vyhovuje zkoušce na cizí viry na kuřecích embryích.

Titr viru. Titrace vakcíny se provádí očkováním do alantoidního vaku devíti- až jedenáctidenních kuřecích embryí nebo na vhodné buněčné kultury. Jedna dávka vakcíny obsahuje nejméně takové množství viru, které je jako nejmenší možné uvedeno v návodu.

Stanovení účinnosti

1. a) Pasivní imunizace vakcinací chovných kachen. Použije se nejméně deset nesoucích chovných kachen domácích stejného původu, které nemají protilátky proti viru 1 infekčního zánětu jater kachen. Nejméně pět kachen se vakcinuje podle návodu k použití. Nejméně pět kachen slouží jako kontrola. Namátkově se odebere nejméně dvacet čerstvě vylíhlých kachňat od nevakcinovaných kachen. Všechna kachňata se oronazálně čelenžují v sedmi dnech stáří dostatečným množstvím virulentního viru 1 infekčního zánětu jater kachen. Kachňata se pozorují 14 dní po čelenži. Zkoušku lze hodnotit, jestliže uhyne nejméně 90 % potomstva nevakcinovaných kachen. Vakcína vyhovuje, jestliže nejméně 80 % procent čelenžovaného potomstva vakcinovaných kachen přežívá a nemá příznaky onemocnění.
2. b) Aktivní imunizace domácích kachňat. Použije se nejméně třicet domácích kachňat stejného původu, která nemají protilátky proti viru 1 infekčního zánětu jater kachen. Vakcinuje se nejméně dvacet kachňat podle návodu k použití. Nejméně deset kachňat slouží jako kontrola. Za 5 dní po vakcinaci se čelenžují všechna kachňata oronazálně dostatečným množstvím virulentního viru 1 infekčního zánětu jater kachen. Kachňata se pozorují 14 dní po čelenži. Zkoušku lze hodnotit, jestliže uhyne nejméně 90 % kontrolních kachňat. Vakcína vyhovuje, jestliže nejméně 80 % vakcinovaných kachňat přežívá a nemá příznaky onemocnění.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Pokud se u vakcinačního viru objeví náznak návratu virulence, v návodu k použití se uvede takové opatření, které zabrání šíření virulentního viru na nevakcinovaná kachňata.

Vaccinum influenzae equi inacivatum

Inaktivovaná vakcína proti chřipce koní

Je to přípravek z jednoho nebo více vhodných kmenů virů chřipky koní, inaktivovaných takovým způsobem, aby se zachovala imunogenní účinnost. Vhodné jsou kmeny, které obsahují hemaglutinin a neuraminidázu.

Výroba

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Každý kmen viru se pomnoží odděleně v kuřecích embryích pocházejících ze zdravého chovu nebo ve vhodných buněčných kulturách (5.2.4). Virové suspenze se mohou purifikovat a koncentrovat. Obsah antigenu ve vakcíně se zakládá na obsahu hemaglutininu, jehož obsah ve virové suspenzi se stanovuje způsobem popsaným v odstavci Mezioperační zkoušky. Množství hemaglutininu u každého kmene není menší než množství ve vakcíně, která vykázala vyhovující výsledek ve zkoušce účinnosti.

Zkouška na zbytkovou infekčnost viru chřipky se provede buď metodou A, nebo metodou B, podle toho, která z nich je citlivější. Množství použitého inaktivovaného viru odpovídá nejméně deseti dávkám vakcíny.

1. A. Vakcína se očkuje na vhodné buňky. Po osmidenní inkubaci se provede přeočkování. Inkubuje se dalších 6 až 8 dnů. Odebere se 0,1 ml supernatantu a hemaglutinační zkouškou se ověřuje přítomnost živého viru. Jestliže byla zjištěna hemaglutinace, provede se další pasáž na buněčné kultuře a zkouška hemaglutinace. Nesmí být zjištěna hemaglutinace.
2. B. Do alantoidní dutiny každého z deseti kuřecích embryí se očkuje 0,2 ml vakcíny. Inkubuje se 3 až 4 dny při 33 °C až 37 °C. Zkoušku lze hodnotit, pokud přežije nejméně osm z deseti embryí. Z každého živého embrya se odebere 0,5 ml alantoidní tekutiny a vytvoří se směs. Do dalších deseti kuřecích embryí se očkuje po 0,2 ml směsné alantoidní tekutiny a inkubují se 3 až 4 dny při 33 °C až 37 °C. Zkoušku lze hodnotit, pokud přežije nejméně osm z deseti embryí. Z každého živého embrya se odebere 0,1 ml alantoidní tekutiny a každý jednotlivý odběr se vyšetří na živý virus hemaglutinační zkouškou. Jestliže byla zjištěna hemaglutinace u některého vzorku alantoidní tekutiny, provede se další pasáž této alantoidní tekutiny na kuřecích embryích a zkouška hemaglutinace. Nesmí být zjištěna hemaglutinace.

   Vakcína může obsahovat vhodné adjuvans.

Výběr složení vakcíny

Výběr kmenů použitých k přípravě vakcíny vychází z epidemiologické situace.

O.I.E. (Mezinárodní úřad pro nákazy zvířat) pravidelně kontroluje epidemiologické údaje, a je-li třeba, doporučuje nové odpovídající kmeny, které převažují při epidemiologických zjištěních. Tyto kmeny jsou použity v souladu se směrnicí a v působnosti států, které podepsaly Úmluvu o vypracování Evropského lékopisu.

Vakcína prokazatelně odpovídá z hlediska bezpečnosti a imunogenity na koních. Pokud je o nějakém plemenu koní známo, že je zvláště citlivé na tuto vakcínu, jsou do zkoušek bezpečnosti zahrnuti také koně z tohoto plemene. K prokázání bezpečnosti (5.2.6) a účinnosti (5.2.7) se mohou použít následující zkoušky.

Bezpečnost. Zkouška se provádí všemi doporučenými způsoby na takové kategorii zvířat, pro kterou je vakcína určena.

Nejméně deseti zvířatům se předepsaným způsobem vstříknou dvě dávky vakcíny. Po čtrnácti dnech se každému zvířeti podá jedna dávka vakcíny. Zvířata se pozorují dalších čtrnáct dnů. Během osmadvacetidenního zkoušení se nezjistí žádné nadměrné místní nebo systémové reakce. Je-li vakcína určena pro březí klisny, jsou klisny vakcinovány během náležitého trimestru nebo trimestrů březosti a období pozorování se prodlouží až do doby porodu. Nezjistí se žádný vliv na březost ani na potomstvo.

Imunogenita. Zkouška popsaná v odstavci Stanovení účinnosti je vhodná k průkazu imunogenity kmenů obsažených ve vakcíně.

Čelenž s virulentním kmenem se provede nejméně proti jednomu z kmenů obsažených ve vakcíně. Imunogenita ostatních kmenů obsažených ve vakcíně se může prokázat na základě sérologické odpovědi vyvolané po vakcinaci koní. Oprávnění k ochraně proti těmto kmenům může být založeno na publikovaných údajích o vztahu mezi titrem protilátek a ochranou proti kmenům antigenně příbuzným.

Je-li použita sérologie, provádí se zkouška popsaná v odstavci Stanovení účinnosti, ale místo virulentní čelenže se za dva týdny po poslední vakcinaci odeberou vzorky krve a vhodnými imunochemickými metodami (2.7.1), jako jsou jednoduchá radiální hemolýza nebo hemaglutinačně inhibiční test - jak je uvedeno dále, se stanoví u každého séra titr protilátek. K validaci zkoušky se používá referenční sérum. Podmínky pro přijetí závisí na kmenu a jsou založeny na dosažitelných údajích; pro kmen viru A/equi-2 jsou zpravidla vakcíny dostačující, jestliže titr protilátek každého séra (při vyšetření jednoduchou radiální hemolýzou) není menší než 85 mm². Jestliže se použije hemaglutinačně inhibiční test, nemá být titr nižší než 64 (před smícháním se suspenzí antigenu a erytrocytů).

Požadavky na výrobek vyjadřují druh prokázané imunogenity (chráněnost proti čelenži nebo tvorba protilátek).

Jednoduchá radiální hemolýza. Sérum se 30 min zahřívá na 56 °C. Zkouší se každé sérum s použitím antigenu nebo antigenů připravených z kmenů použitých při výrobě vakcíny. Smíchá se 1 ml suspenze objemových dílů ovčích erytrocytů v tlumivém roztoku barbitalovém (1 objemový díl erytrocytů do 10 objemových dílů finální suspenze) s 1 ml vhodného ředění kmene viru chřipky v tlumivém roztoku barbitalovém. Směs se inkubuje 30 min při 4 °C. Ke 2 ml směsi viru a erytrocytů se přidá 1 ml roztoku chloridu chromitého (hexahydrát) R (3 g/l), promíchá se a nechá se 10 min stát. Senzibilizované erytrocyty se zahřejí na 47 °C ve vodní lázni. Smíchá se 15 ml roztoku agar osy R (10 g/l) v tlumivém roztoku barbitalovém, 0,7 ml suspenze senzibilizovaných erytrocytů a vhodné množství ředěného morčecího komplementu v tlumivém roztoku barbitalovém při 47 °C. Směs se vyleje do Petriho misek a doplní se agar. Do vrstvy agaru se vykrojí jamky a do každé jamky se odpipetuje 5pl neředěného zkoušeného nebo kontrolního séra. Misky se inkubují 18 h při 37 °C. Měří se průměr zóny hemolýzy a vypočítá se její plocha, která vyjadřuje titr protilátek ve čtverečních milimetrech.

Hemaglutinačně inhibiční test. Sérum se 30 min inaktivuje při 56 °C. K jednomu objemovému dílu každého séra se doplní tři objemové díly tlumivého roztoku fosforečnanového s chloridem sodným o pH 7,4 a čtyři objemové díly suspenze kaolinu lehkého R (250 g/l) ve stejném tlumivém roztoku. Každá směs se třepe 10 min, odstředí se, oddělí se supernatant, který se smíchá s koncentrovanou suspenzí kuřecích erytrocytů. Inkubuje se 60 min při 37 °C a odstředí se. Dosáhne se tak ředění séra 1 : 8. Ke zkoušení sér se použije antigen připravený z kmenů použitých k výrobě vakcíny. Z každého zředěného séra se připraví řada dvojnásobných ředění. K 0,025 ml každého ředění séra se přidá 0,025 ml suspenze antigenu ošetřeného etherem R a obsahující čtyři hemaglutinační jednotky. Směs se nechá 30 min stát a přidá se 0,05 ml suspenze kuřecích erytrocytů obsahující 2 x 10⁷ erytrocytů v 1 ml. Nechá se 1 h stát a zaznamená se poslední ředění séra, ve kterém ještě došlo k úplné inhibici hemaglutinace.

Mezioperační zkoušky

Obsah hemaglutininu v suspenzi inaktivovaného viru po purifikaci a koncentraci, kde je to možné, se stanoví vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1), jako je jednoduchá radiální imunodifuze, s použitím vhodných referenčních přípravků hemaglutininu. Obsah se pohybuje v rozmezí limitů, u nichž se prokázalo, že dovolují přípravu vyhovující vakcíny. U vakcín vyráběných na kuřecích embryích se ke kontrole výroby stanovuje u sklizeného viru obsah bakteriálních endotoxinů.

Zkoušení šarže

Zkoušku popsanou v odstavci Stanovení účinnosti není nezbytné provádět při běžném zkoušení jednotlivých šarží vakcíny. Provádí se s danou vakcínou jednou nebo vícekrát podle dohody nebo rozhodnutí oprávněné autority. Pokud se tato zkouška neprovádí, použije se vhodná platná náhradní metoda. Podmínkou jejího použití je porovnání s šarží vakcíny, která dala vyhovující výsledek ve zkoušce popsané v odstavci Stanovení účinnosti. Mohou se použít následující zkoušky.

Zkouška účinnosti šarže. Každému z pěti morčat prostých specifických protilátek se podkožně podá jedna dávka vakcíny. Za 21 dnů se odeberou vzorky krve a oddělí se sérum. Provedou se zkoušky se sérem na přítomnost specifických protilátek vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1), např. jednoduchou radiální hemolýzou nebo inhibici hemaglutinace s použitím referenčního séra k validaci zkoušky. Titr protilátek není významně nižší než titr získaný od morčat, kterým byla podána referenční vakcína s prokazatelně dostatečnou účinností na koních.

Zkouška totožnosti

Vakcína u vnímavých zvířat podněcuje tvorbu specifických protilátek.

Zkoušky na čistotu

Bezpečnost. Nejméně dvěma koňům se vstříkne doporučeným způsobem dvojnásobek vakcinační dávky. Každému zvířeti se po 14 dnech podá další jedna dávka. Zvířata se pozorují dalších 10 dnů; zůstanou v dobrém zdravotním stavu a neprojevují se nadměrné místní ani systémové reakce.

Inaktivace. Do alantoidní dutiny deseti kuřecích embryí se naočkuje po 0,2 ml vakcíny a embrya se inkubují 3 až 4 dny při teplotě 33 °C až 37 °C. Zkoušku lze hodnotit, pokud přežije nejméně osm z deseti embryí. Z každého embrya, které přežilo, se odebere 0,5 ml alantoidní tekutiny a připraví se směsný vzorek. Dalším deseti kuřecím embryím se naočkuje po 0,2 ml směsi alantoidní tekutiny a inkubují se 3 až 4 dny při 33 °C až 37 °C. Zkoušku lze hodnotit, pokud přežije nejméně osm z deseti embryí. Z každého embrya, které přežilo, se odebere 0,1 ml alantoidní tekutiny a každý vzorek se hemaglutinační zkouškou vyšetří na přítomnost živého viru. Jestliže se u některého vzorku zjistí pozitivní hemaglutinace, provede se s tímto vzorkem další pasáž na kuřecím embryu a zkouška hemaglutinace. Nezjistí se hemaglutinace.

Sterilita. Vyhovuje zkoušce na sterilitu předepsané v článku Vaccina ad usum veterinarium.

Stanovení účinnosti

Stanovení účinnosti se provede čelenží s kmenem, proti němuž podle označení má vakcína zajistit ochranu. Pokud je to možné, použije se čerstvý izolát.

Použije se deset koní, ve stáří nejméně 6 měsíců, bez specifických protilátek proti viru chřipky koní. Každému zvířeti se odebere krev a jednotlivě se přezkouší na protilátky proti viru chřipky koní, aby se ověřila séronegativita. Šest zvířat se vakcinuje podle doporučeného schématu. Za 7 dnů po první vakcinaci se u každého zvířete provede druhý odběr krve a zkouška na protilátky proti chřipce koní k anamnestickému určení sérologické odpovědi. Sérologicky pozitivní kusy jsou v tomto stadiu vyřazeny z pokusu. Nejméně za dva týdny po poslední vakcinaci se deseti zvířatům podá aerosolem virus chřipky koní v množství, které u vnímavých zvířat vyvolá charakteristické příznaky onemocnění - např. horečku, výtok z nosu a kašel. Zvířata se pozorují 14 dnů. Denně se od každého zvířete provádějí výtěry z nosu k izolaci viru. Vakcinovaná zvířata mají lehké příznaky, zatímco kontrolní zvířata mají charakteristické příznaky onemocnění. Průměrný počet dnů, ve kterých je virus vylučován, jakož i titr viru jsou významně nižší u vakcinovaných zvířat než u zvířat kontrolních.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum veterinarium.

Označování