Český lékopis 1997

1. A. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití vrstvy vhodného silikagelu.

   Zkoušený roztok. 1,0 mg se rozpustí v 1,0 ml vody R.

   Porovnávací roztok. Obsah lahvičky somatostatinu CRL se rozpustí ve vodě R a zředí se vhodným objemem této vody R tak, aby se získala konečná koncentrace 1 mg/ml.

   Na vrstvu se nanese odděleně po 20 μ1 každého roztoku a vyvíjí se směsí objemových dílů kyseliny octové R, pyridinu R, vody R a 1-butanolu R (10 + 15 + 20 + 45) po dráze 15 cm.

   Vrstva se usuší v proudu teplého vzduchu, postříká roztokem ninhydrinu R (1 g/l) a zahřívá se 5 min v sušárně při 110 °C. Hlavní skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku odpovídá svou polohou, zbarvením a velikostí hlavní skvrně na chromatogramu porovnávacího roztoku.

1. B. Hodnotí se chromatogramy ze zkoušky Stanovení obsahu. Retenční čas hlavního píku na chromatogramu zkoušeného roztoku odpovídá retenčnímu času hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku.

Zkoušky na čistotu

Specifická optická otáčivost (2.2.7). -37° až -47°, počítáno na látku bezvodou a prostou kyseliny octové. Měří se roztok připravený rozpuštěním 2,0 mg v 1,0 ml roztoku kyseliny octové ledové R 1% (V/V).

Absorbance (2.2.25). 5,0 mg se rozpustí v roztoku chloridu sodného R (9 g/l) a zředí se stejným roztokem na 100,0 ml. Absorbance měřená v maximu při 280 nm je nejvýše 0,20, počítáno na obsah látky ze zkoušky Stanovení obsahu.

Aminokyseliny. Stanoví se analyzátorem aminokyselin za použití norleucinu R jako vnitřního standardu. Přístroj se kalibruje směsí obsahující ekvimolární množství amoniaku, glycinu a následujících L-aminokyselin:

spolu s polovinou ekvimolárního množství L-cystinu.

Roztok vnitřního standardu. 30 mg DL-norleucinu R se rozpustí ve směsi stejných objemů kyseliny chlorovodíkové R a vody R a zředí se stejnou směsí na 100,0 ml.

Zkoušený roztok. 1,0 mg se naváží do pečlivě vymyté silnostěnné zkumavky délky 100 mm a vnitřního průměru 6 mm. Přidá se přesně odměřený objem roztoku vnitřního standardu obsahující takové množství DL-norleucinu R, které odpovídá asi polovině předpokládaného počtu molů somatostatinu. Zkumavka se vloží do chladicí směsi při -5 °C, vytvoří se podtlak nepřevyšující 133 Pa a těsně se uzavře. Poté se 16 h zahřívá na 110 °C až 115 °C. Zkumavka se po ochlazení otevře a její obsah se převede do vhodné 10ml baňky pomocí pěti dávek vody R po 0,2 ml. Za sníženého tlaku se odpaří do sucha nad hydroxidem draselným R. Zbytek se rozpustí ve vodě R a znovu se vysuší nad hydroxidem draselným R za sníženého tlaku; postup se opakuje ještě jednou. Zbytek po odpaření se rozpustí ve vhodném tlumivém roztoku (pH 2,2) a zředí se na vhodný objem stejným tlumivým roztokem.

Do analyzátoru aminokyselin se přesně odměří vhodný objem zkoušeného roztoku tak, aby pík odpovídající aminokyselině s největším obsahem obsáhl větší část záznamu zapisovače.

Obsah každé aminokyseliny se vyjádří v molech. Vypočítá se relativní zastoupení aminokyselin tak, že jedna osmina součtu molů kyseliny asparagové, alaninu, lysinu, glycinu a fenylalaninu se rovná 1. Hodnoty pro jednotlivé aminokyseliny jsou v těchto rozmezích: kyselina asparagová 0,95-1,05; glycin 0,95-1,05; alanin 0,95-1,05; fenylalanin 2,85-3,15; serin 0,7-1,05; threonin 1,4-2,1; polovina cystinu 1,4-2,1; lysin 1,9-2,1. Ostatní aminokyseliny jsou jen ve stopách.

Zkoušku lze hodnotit, jestliže nalezený počet molů norleucinu se po opravě na množství použitého roztoku neliší o více než ±5 % od množství vzatého k hydrolýze.

Příbuzné peptidy. Stanoví se kapalinovou chromatografií (2.2.29).

Zkoušený roztok. 1,5 mg se rozpustí ve 3,0 ml vody R.

Porovnávací roztok (a). 1,0 ml zkoušeného roztoku se zředí vodou R na 50,0 ml.

Porovnávací roztok (b). 1,0 ml porovnávacího roztoku (a) se přidá k 1,0 ml vody R.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

1. - nerezové ocelové kolony délky 50 mm a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné silikagelem oktadecylsilanizovaným pro chromatografii R (5 μm),
2. - mobilní fáze s průtokovou rychlostí 1,5 ml/min při tomto elučním programu:
   1. - mobilní fáze A - 11 ml kyseliny fosforečné R se zředí vodou R, pH se upraví triethylaminem R na hodnotu 2,3 a zředí se vodou R na 1000 ml,
   2. - mobilní fáze B - acetonitril R,

1. - spektrofotometrického detektoru, 215 nm.

Kolona se ustaluje směsí objemových dílů mobilní fáze B a mobilní fáze A (21 + 79).

Nastříkne se po 50 μl každého roztoku.

Nastříkne se třikrát porovnávací roztok (a); zkoušku lze hodnotit, jestliže relativní směrodatná odchylka plochy hlavního píku není větší než 2,5 %.

Na chromatogramu zkoušeného roztoku plocha žádného píku, kromě hlavního píku, není větší než plocha hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) (1,0 %); součet ploch těchto píků není větší než plocha hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) (2,0 %). Nepřihlíží se k žádnému píku rozpouštědel.

Kyselina octová. Nejvýše 15,0 %. Stanoví se plynovou chromatografii (2.2.28) za použití kyseliny propionové A jako vnitřního standardu.

Roztok vnitřního standardu. 1 ml kyseliny propionové R se zředí roztokem kyseliny mravenčí bezvodé R 1% na 100 ml.

Zkoušený roztok. 0,500 mg se rozpustí ve vodě R, přidá se 50 μl roztoku vnitřního standardu a zředí se vodou R na 1,0 ml.

Porovnávací roztok. 0,1 ml kyseliny octové R se zředí roztokem kyseliny mravenčí bezvodé R 1% na 100 ml. K 25 μl takto připraveného roztoku se přidá 50 μl roztoku vnitřního standardu a zředí se vodou A na 1,0 ml.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

1. - skleněné kolony délky 1 m a vnitřního průměru 4 mm naplněné uhlím pro chromatografii grafitizovaným R impregnovaným 0,3 % makrogolu 20 000 R a roztokem kyseliny fosforečné R 1%,
2. - helia pro chromatografii R jako nosného plynu při průtokové rychlosti 40 ml/min,
3. - plamenoionizačního detektoru.

Teplota kolony je 130 °C, detektoru 200 °C a nástřikového prostoru 170 °C. Nastříkne se odděleně 1,0 μl až 2,0 μl zkoušeného a porovnávacího roztoku.

Voda, semimikrostanovení (2.5.12). Nejvýše 8,0 %; stanoví se s 10,00 mg zkoušené látky.

Sterilita (2.6.1). Pokud je látka určena k výrobě parenterálních přípravků bez dalšího vhodného sterilizačního postupu, vyhovuje zkoušce na sterilitu.

Pyrogenní látky (2.6.8). Vyhovuje zkoušce na pyrogenní látky, při níž se na 1 kg hmotnosti králíka vstříknou 2 ml roztoku zkoušené látky (0,04 g/l) ve vodě na injekci R.

Stanovení obsahu

Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29).

Zkoušený roztok. 5,0 mg se rozpustí ve vodě R a zředí sejí na 100,0 ml.

Porovnávací roztok. Obsah lavičky somatostatinu CRL se rozpustí ve vodě R a zředí se vhodným objemem této vody tak, aby se získala konečná koncentrace 0,05 mg/ml.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

- nerezové ocelové kolony délky 50 mm a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné silikagelem oktadecylsilanizovaným pro chromatografii R (5 μm),

- mobilní fáze, která je směsí objemových dílů mobilní fáze B a mobilní fáze A (25 + 75), s průtokovou rychlostí 1,5 ml/min:

- mobilní fáze A - 11 ml kyseliny fosforečné R se zředí vodou R, pH se upraví triethylaminem R na 2,3 a zředí se vodou R na 1000 ml,

- mobilní fáze B - acetonitril R,

- spektrofotometrického detektoru, 215 nm.

Kolona se ustaluje směsí objemových dílů mobilní fáze B a mobilní fáze A (25 + 75).

Nastříkne se třikrát porovnávací roztok; zkoušku lze hodnotit, jestliže relativní směrodatná odchylka plochy hlavního píku je nejvýše 2,5 %.

Nastříkne se po 50 μ1 zkoušeného roztoku a porovnávacího roztoku a 15 min se zaznamenávají chromatogramy.

Obsah somatostatinu (C₇₆H₁₀₄N₁₈O₁₉S₂) se vypočítá z plochy píků na chromatogramech zkoušeného roztoku a porovnávacího roztoku a deklarovaného obsahu C ₇₆H₁₀₄N₁₈O₁₉S₂v somatostatinu CRL.

Uchovávání

Ve vzduchotěsných obalech, chráněn před světlem a vlhkostí, při teplotě 2 °C až 8 °C. Je-li látka sterilní, uchovává se ve sterilních vzduchotěsných zabezpečených obalech.

Separandum.

Označování

V označení na obalu se uvede, zda je látka sterilní.

† Somatropini solutio ad praeparationem

Koncentrovaný roztok somatropinu

Je to roztok obsahující bílkovinu se strukturou (191 aminokyselinových zbytků) hlavní složky růstového hormonu produkovaného lidskou hypofyzou. Může obsahovat tlumivé soli a jiné pomocné látky. Obsahuje 91,0 % až 105,0 % deklarovaného obsahu somatropinu¹) (C₉₉₀H₁₅₂₈N₂₆₂O₃₀₀S₇) Vyhovuje požadavkům článku Producta ab ADN recombinante.

Výroba

Připravuje se biotechnologicky metodou založenou na rekombinaci DNK (rDNK). Při vývoji přípravku se prokáže vhodnou validovanou metodou stanovení biologické účinnosti, založenou na stimulaci růstu a schválenou oprávněnou autoritou, že látka získaná daným výrobním postupem má biologickou účinnost nejméně 2,5 m.j. v miligramu.

Před propuštěním se na každé šarži provedou následující zkoušky, pokud oprávněná autorita neudělí výjimku.

Bílkoviny hostitelské buňky. Požadavek stanoví oprávněná autorita.

DNK hostitelské buňky a vektoru. Požadavek stanoví oprávněná autorita.

Vlastnosti

Čirý nebo slabě opalizující, bezbarvý roztok.

Zkoušky totožnosti

1. A. Hodnotí se elektroforeogramy ze zkoušky Izoelektrická fokusace. Na elektroforeogramu zkoušeného roztoku (a) odpovídá hlavní zóna polohou hlavní zóně na elektroforeogramu porovnávacího roztoku. Na elektroforeogramu zkoušeného roztoku (c) je pouze jedna hlavní zóna.
2. B. Hodnotí se chromatogramy ze zkoušky Příbuzné bílkoviny, viz Zkoušky na čistotu. Retenční čas hlavního píku na chromatogramu zkoušeného roztoku (a) odpovídá retenčnímu času hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (a).
3. C. Provede se peptidové mapování.

   Zkoušený roztok. Zkoušený přípravek se zředí tlumivým roztokem trisacetatovým o pH 8,5 tak, aby obsahoval 2,0 mg somatropinu v mililitru. Asi 1,0 ml takto připraveného roztoku se přenese do zkumavky z vhodného materiálu, např. polypropylenu. Připraví se čerstvý roztok trypsinu pro peptidové mapování R (1 g/l) ve vhodném tlumivém octanovém roztoku o pH asi 5,0 a 30 (il se přidá k roztoku zkoušené látky. Zkumavka se uzavře a vloží se na 4 h do vodní lázně 37 °C teplé. Potom se zkumavka vyjme z vodní lázně a ihned se probíhající reakce přeruší přidáním 200 μl kyseliny octové ledové R.

   Porovnávací roztok. Připraví se roztok somatropinu CRL v tlumivém roztoku trisacetatovém o pH 8,5 tak, aby v mililitru obsahoval 2,0 mg somatropinu, a dále se pokračuje současně a za stejných podmínek jako u zkoušeného roztoku.

   Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29).

   Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

   1. - nerezové ocelové kolony délky 0,25 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné silikagelem oktylsilanizovaným pro chromatografii R (5 μm až 10 μm),
   2. - mobilní fáze, která je směsí mobilní fáze A a mobilní fáze B, které se připraví následujícím způsobem: 1 ml kyseliny trifluoroctové R se zředí vodou R na 1000 ml (mobilní fáze A). Ke 100 ml vody R se přidá 1 ml kyseliny trifluoroctové R a zředí se acetonitrilem R na 1000 ml (mobilní fáze B). Průtoková rychlost je 1 ml/min. Použije se následující gradient:

   Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání Označování † Somatropini solutio ad praeparationem Výroba Vlastnosti Zkoušky totožnosti

   Čas (min)	Mobilní fáze A % (V/V)	Mobilní fáze B % (V/V)
   0	100	0
   20	80	20
   40	75	25
   65	50	50

   1. - spektrofotometrického detektoru, 214 nm.

   Kolona se nejméně 15 min ustaluje mobilní fází A. Potom se kolona promývá za použití výše uvedeného gradientu a pokračuje se s promýváním po dobu 5 min s průběžně se zvyšující koncentrací mobilní fáze B až na 80 %. Potom se kolona opět ustaluje mobilní fází A po dobu 15 min. Nastříkne se odděleně po 100 μl každého roztoku. Na konci gradientově eluce a před dalším nástřikem se zvýší koncentrace mobilní fáze B na 80 % v průběhu 5 min a poté se kolona 15 min ustaluje mobilní fází A.

   Chromatogram zkoušeného roztoku odpovídá chromatogramu porovnávacího roztoku. Zkoušku lze hodnotit, jestliže chromatogramy jednotlivých roztoků kvalitativně odpovídají porovnávacímu chromatogramu dodávanému se somatropinem CRL.

1. D. Hodnotí se chromatogramy ze zkoušky Stanovení obsahu. Retenční čas hlavního píku zkoušeného roztoku odpovídá retenčnímu času hlavního píku porovnávacího roztoku (b).

Zkoušky na čistotu

Příbuzné bílkoviny. Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29).

Zkoušený roztok (a). Zkoušený přípravek se zředí tlumivým roztokem trometamolovým o pH 7,5 (1) tak, aby v mililitru obsahoval 2,0 mg somatropinu.

Zkoušený roztok (b). 100 ul zkoušeného roztoku (a) se zředí tlumivým roztokem trometamolovým o pH 7,5 (1) na 2,0 ml.

Porovnávací roztok (a). Připraví se roztok somatropinu CRL v tlumivém roztoku trometamolovém o pH 7,5 (1) tak, aby v mililitru obsahoval 2,0 mg somatropinu.

Porovnávací roztok (b). Připraví se roztok somatropinu CRL v tlumivém roztoku trometamolovém o pH 7,5 (1) tak, aby v mililitru obsahoval 2,0 mg somatropinu. K takto připravenému roztoku se přidá čerstvě připravený koncentrovaný roztok peroxidu vodíku R tak, aby bylo dosaženo výsledné koncentrace 0,01 % (V/V), a nechá se 5 h stát při 4 °C. Potom se na mililitr roztoku přidá 4,5 mg L-methioninu R.

Roztoky se uchovávají při teplotě 2 °C až 8 °C a použijí se do 24 h. Pokud se používá automatický dávkovač, je nutno jej udržovat při 2 °C až 8 °C.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

1. - nerezové ocelové kolony délky 0,25 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné silikagelem butylsilanizovaným pro chromatografii R (5 μm až 10 μm),
2. - mobilní fáze, která je směsí objemových dílů propanolu R a tlumivého roztoku trometamolového o pH 7,5 (1) (29 + 71), s průtokovou rychlostí 0,5 ml/min,
3. - spektrofotometrického detektoru, 220 nm.

Teplota kolony se udržuje při 45 °C.

Nastříkne se 20 μl porovnávacího roztoku (a). Je-li třeba, upraví se koncentrace propanolu v mobilní fázi tak, aby retenční čas hlavního píku byl (33 ± 3) min. Nastříkne se 20 μl porovnávacího roztoku (b). Určí se píky pomocí porovnávacího chromatogramu dodávaného se somatropinem CRL. Zkoušku lze hodnotit, jestliže rozlišení mezi somatropinem a jeho oxidačním produktem je nejméně 1,0.

Nastříkne se po 20 μl každého roztoku a zaznamenávají se chromatogramy po dobu nejméně 50 min. Na chromatogramu zkoušeného roztoku (a): plocha žádného píku, kromě hlavního píku, není větší než plocha hlavního píku na chromatogramu zkoušeného roztoku (b) (5,0 %); součet ploch všech píků, kromě hlavního píku, není větší než dvojnásobek plochy hlavního píku na chromatogramu zkoušeného roztoku (b) (10,0 %). Nepřihlíží se k pikům rozpouštědel.

Dimer a příbuzné látky s vyšší molekulovou hmotností. Provede se vylučovací chromatografie (2.2.30), jak je popsána ve zkoušce Stanovení obsahu.

Nastříkne se 50 μl porovnávacího roztoku (a). Citlivost detektoru se nastaví tak, aby výška hlavního píku na získaném chromatogramu dosahovala 50 % až 70 % celé stupnice zapisovače. Rozlišení dané poměrem výšky minima mezi píky monomeru a dimeru k výšce píku dimeru je menší než 0,6 (retenční časy vztažené k monomeru jsou přibližně 0,94 pro dimer a 0,87 pro polymery). Několikrát se nastříkne porovnávací roztok (a) (nejméně třikrát); zkoušku lze hodnotit, jestliže relativní směrodatná odchylka plochy hlavního píku je menší než 2,5 %.

Nastříkne se po 50 μl zkoušeného roztoku a porovnávacího roztoku (a). Na chromatogramu zkoušeného roztoku součet ploch všech píků s retenčním časem menším, než je retenční čas hlavního píku, není větší než plocha hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) (4,0 %).

Izoelektrická fokusace. Provede se izoelektrická fokusace.

Zkoušený roztok (a). Je-li třeba, zkoušený přípravek se zředí roztokem hydrogenuhličitanu amonného R (3,95 g/l) tak, aby v mililitru obsahoval 2,0 mg somatropinu.

Zkoušený roztok (b). 0,1 ml zkoušeného roztoku (a) se zředí roztokem hydrogenuhličitanu amonného R (3,95 g/l) na 2,0 ml.

Zkoušený roztok (c). Smíchá se 0,1 ml zkoušeného roztoku (a) a 0,1 ml porovnávacího roztoku. Porovnávací roztok. Připraví se roztok somatropinu CRL ve vodě R tak, aby v mililitru obsahoval 2,0 mg.

Roztok pro kalibraci izoelektrického bodu o rozmezí pH 2,5 až 6,5. Připraví se a použije podle návodu výrobce.

Se zařízením se pracuje podle návodu výrobce. Izoelektrická fokusace se provádí na hotových deskách s vrstvou gelu o rozměrech 245 mm x 110 mm x 1 mm a pH v rozmezí 4,0 až 6,5. Na vrstvu gelu se nanese odděleně po 15 μl každého roztoku. Jako anodický roztok se použije roztok kyseliny glutamové R (147,1 g/l) v roztoku kyseliny fosforečné R (50 g H₃PO₄/l) a jako katodický roztok se použije roztok β-alaninu R (89,1 g/l). Pracovní podmínky se nastaví na 2000 V a 25 mA. Nechá se proběhnout fokusace při konstantním napětí po dobu 2,5 h. Vrstva gelu se ponoří na 30 min do roztoku obsahujícího kyselinu trichloroctovou R (115 g/l) a kyselinu sulfosalicylovou R (34,5 g/l) a potom na 5 min do směsi objemových dílů kyseliny octové R, ethanolu R a deionizované vody R (8 + 25 + 67) (odbarvovací roztok). Vrstva gelu se vybarvuje ponořením na 10 min do roztoku modře kyselé 83 R (1,15 g/l) v odbarvovacím roztoku zahřátého na 60 °C a potom se ponoří do odbarvovacího roztoku do odstranění nadbytku barviva. Zkoušku lze hodnotit, jestliže rozdělení zón roztoku pro kalibraci izoelektrického bodu odpovídá požadavkům výrobce. Na elektroforeogramu porovnávacího roztoku je viditelná hlavní zóna s izoelektrickým bodem okolo 5 a kyselejší menší zóna okolo 4,8. Na elektroforeogramu zkoušeného roztoku (a) žádná zóna, kromě hlavní zóny, nepřevyšuje svou intenzitou hlavní zónu na elektroforeogramu zkoušeného roztoku (b) (5,0 %).

Sterilita (2.6.1). Pokud je přípravek určen k výrobě parenterálních přípravků bez dalšího vhodného sterilizačního postupu, vyhovuje zkoušce na sterilitu.

Bakteriální endotoxiny (2.6.14). Pokud je přípravek určen k výrobě parenterálních přípravků bez dalšího vhodného postupu odstraňujícího bakteriální endotoxiny, vyhovuje zkoušce na bakteriální endotoxiny, obsahuje-li nejvýše 5 m.j. endotoxinu v miligramu.

Stanovení obsahu

Stanoví se vylučovací chromatografií (2.2.30).

Zkoušený roztok. Je-li třeba, zkoušený přípravek se zředí roztokem hydrogenuhličitanu amonného R (3,95 g/l) tak, aby v mililitru obsahoval 1,0 mg somatropinu.

Porovnávací roztok (a). 200 μl zkoušeného roztoku se zředí roztokem hydrogenuhličitanu amonného R (3,95 g/l) na 5,0 ml.

Porovnávací roztok (b). Připraví se roztok somatropinu CRL v roztoku hydrogenuhličitanu amonného R (3,95 g/l) tak, aby v mililitru obsahoval 1,0 mg somatropinu.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

1. - nerezové ocelové kolony délky 0,25 m a vnitřního průměru 9,4 mm naplněné silikagelem hydrofilním pro chromatografií R jakosti vhodné pro dělení globulárních bílkovin v rozmezí molekulové hmotnosti 5000 až 60 000.
2. - mobilní fáze, kterou je zfiltrovaný a odplyněný roztok hydrogenuhličitanu amonného R (3,95 g/l), s průtokovou rychlostí 0,6 ml/min,
3. - spektrofotometrického detektoru, 214 nm.

Nastříkne se 50 μl porovnávacího roztoku (b). Citlivost detektoru se nastaví tak, aby výška hlavního píku dosahovala nejméně 50 % celé stupnice zapisovače. Několikrát se nastříkne porovnávací roztok (b) (nejméně třikrát); zkoušku lze hodnotit, jestliže relativní směrodatná odchylka plochy píku somatropinu je nejvýše 2,5 %. Nastřikuje se střídavě po 50 μl zkoušeného roztoku a porovnávacího roztoku (b).

Obsah somatropinu se vypočítá z ploch píků na chromatogramu zkoušeného roztoku a na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) a deklarovaného obsahu látky C₉₉₀H₁₅₂₈N₂₆₂O₃₀₀S₇ v somatropinu CRL.

Uchovávání

Ve vzduchotěsných obalech, při teplotě -20 °C. Je třeba se vyhnout opakovanému zmrazení a rozmražení roztoku. Je-li roztok sterilní, uchovává se ve sterilních vzduchotěsných zabezpečených obalech.

Separandum.

Označování

V označení na obalu se uvede:

1. - obsah somatropinu v miligramech v mililitru roztoku,
2. - název a množství jakýchkoliv pomocných látek,
3. - zda je roztok sterilní,
4. - zda je roztok prostý bakteriálních endotoxinů.

† Somatropinum

Somatropin

Výroba

Připravuje se biotechnologicky metodou založenou na rekombinaci DNK (rDNK). Při vývoji přípravku se vhodnou validovanou metodou stanovení biologické účinnosti založenou na stimulaci růstu a schválenou oprávněnou autoritou prokáže, že látka získaná daným výrobním postupem má biologickou účinnost nejméně 2,5 m.j. v miligramu.

Před propuštěním se na každé šarži provedou následující zkoušky, pokud oprávněná autorita neudělí výjimku.

Bílkoviny hostitelské buňky. Požadavek stanoví oprávněná autorita.

DNK hostitelské buňky a vektoru. Požadavek stanoví oprávněná autorita.

Vlastnosti

Bílý nebo téměř bílý prášek.

Zkoušky totožnosti

1. A. Hodnotí se elektroforeogramy ze zkoušky Izoelektrická fokusace. Na elektroforeogramu zkoušeného roztoku (a) odpovídá hlavní zóna polohou hlavní zóně na elektroforeogramu porovnávacího roztoku. Na elektroforeogramu zkoušeného roztoku (c) je pouze jedna hlavní zóna.
2. B. Hodnotí se chromatogramy ze zkoušky Příbuzné bílkoviny, viz Zkoušky na čistotu. Retenční čas hlavního píku na chromatogramu zkoušeného roztoku (a) odpovídá retenčnímu času hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (a).
3. C. Provede se peptidové mapování.

   Zkoušený roztok. Připraví se roztok zkoušené látky v tlumivém roztoku trisacetatovém o pH 8,5 tak, aby obsahoval 2,0 mg somatropinu v mililitru. Asi 1,0 ml takto připraveného roztoku se přenese do zkumavky z vhodného materiálu, např. polypropylenu. Připraví se čerstvý roztok trypsinu pro peptidové mapování R (1 g/l) ve vhodném tlumivém octanovém roztoku o pH asi 5,0 a 30 μl se přidá k roztoku zkoušené látky. Zkumavka se uzavře a vloží se na 4 h do vodní lázně 37 °C teplé. Potom se zkumavka vyjme z vodní lázně a ihned se probíhající reakce přeruší přidáním 200 μl kyseliny octové ledové R.

   Porovnávací roztok. Současně se za stejných podmínek připraví porovnávací roztok s tím rozdílem, že zkoušená látka je nahrazena somatropinem CRL.

   Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29).

   Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

   1. - nerezové ocelové kolony délky 0,25 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné silikagelem oktylsilanizovaným pro chromatografii R (5 μm až 10 μm),
   2. - mobilní fáze, která je směsí mobilní fáze A a mobilní fáze B, které se připraví následujícím způsobem: 1 ml kyseliny trifluoroctové R se zředí vodou R na 1000 ml (mobilní fáze A). Ke 100 ml vody R se přidá 1 ml kyseliny trifluoroctové R a zředí se acetonitrilem R na 1000 ml (mobilní fáze B). Průtoková rychlost je 1 ml/min. Použije se následující gradient:

   Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání Označování † Somatropini solutio ad praeparationem Výroba Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání Označování † Somatropinum Výroba Vlastnosti Zkoušky totožnosti

   Čas (min)	Mobilní fáze A % (V/V)	Mobilní fáze B % (V/V)
   0	100	0
   20	80	20
   40	75	25
   65	50	50

   1. - spektrofotometrického detektoru, 214 nm.

   Kolona se nejméně 15 min ustaluje mobilní fází A. Potom se kolona promývá za použití výše uvedeného gradientu a pokračuje se s promýváním po dobu 5 min s průběžně se zvyšující koncentrací mobilní fáze B až na 80 % v průběhu tohoto času. Potom se kolona opět ustaluje mobilní fází A po dobu 15 min. Nastříkne se odděleně po 100 μl každého roztoku. Na konci gradientové eluce a před dalším nástřikem se zvýší koncentrace mobilní fáze B na 80 % v průběhu 5 min a poté se kolona 15 min ustaluje mobilní fází A.

   Chromatogram zkoušeného roztoku odpovídá chromatogramu porovnávacího roztoku. Zkoušku lze hodnotit, jestliže chromatogramy jednotlivých roztoků kvalitativně odpovídají porovnávacímu chromatogramu dodávanému se somatropinem CRL.

1. D. Hodnotí se chromatogramy ze zkoušky Stanovení obsahu. Retenční čas hlavního píku zkoušeného roztoku odpovídá retenčnímu času hlavního píku porovnávacího roztoku (b).

Zkoušky na čistotu

Příbuzné bílkoviny. Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29).

Zkoušený roztok (a). Připraví se roztok v tlumivém roztoku trometamolovém o pH 7,5 (1) tak, aby v mililitru obsahoval 2,0 mg somatropinu.

Zkoušený roztok (b). 100 ul zkoušeného roztoku (a) se zředí tlumivým roztokem trometamolovým o pH 7,5 (1) na 2,0 ml.

Porovnávací roztok (a). Připraví se roztok somatropinu CRL v tlumivém roztoku trometamolovém o pH 7,5 (1) tak, aby v mililitru obsahoval 2,0 mg somatropinu.

Porovnávací roztok (b). Připraví se roztok somatropinu CRL v tlumivém roztoku trometamolovém o pH 7,5 (1) tak, aby v mililitru obsahoval 2,0 mg somatropinu. K takto připravenému roztoku se přidá čerstvě připravený koncentrovaný roztok peroxidu vodíku R tak, aby bylo dosaženo výsledné koncentrace 0,01 % (V/V), a nechá se 5 h stát při 4 °C. Potom se na mililitr roztoku přidá 4,5 mg L-methioninu R.

Roztoky se uchovávají při teplotě 2 °C až 8 °C a použijí se do 24 h. Pokud se používá automatický dávkovač, je nutno jej udržovat při 2 °C až 8 °C.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

1. - nerezové ocelové kolony délky 0,25 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné silikagelem butylsilanizovaným pro chromatografii R (5 μm až 10 μm),
2. - mobilní fáze, která je směsí objemových dílů propanolu R a tlumivého roztoku trometamolového o pH 7,5 (1) (29 + 71), s průtokovou rychlostí 0,5 ml/min,
3. - spektrofotometrického detektoru, 220 nm.

Teplota kolony se udržuje při 45 °C.

Nastříkne se 20 μl porovnávacího roztoku (a). Je-li třeba, upraví se koncentrace propanolu v mobilní fázi tak, aby retenční čas hlavního píku byl (33 ± 3) min. Nastříkne se 20 μl porovnávacího roztoku (b). Určí se píky pomocí porovnávacího chromatogramu dodávaného se somatropinem CRL. Zkoušku lze hodnotit, jestliže rozlišení mezi somatropinem a jeho oxidačním produktem je nejméně 1,0.

Nastříkne se po 20 μl každého roztoku a zaznamenávají se chromatogramy po dobu nejméně 50 min. Na chromatogramu zkoušeného roztoku (a) plocha žádného píku, kromě hlavního píku, není větší než plocha hlavního píku na chromatogramu zkoušeného roztoku (b) (5,0 %); součet ploch všech píků, kromě hlavního píku, není větší než dvojnásobek plochy hlavního píku na chromatogramu zkoušeného roztoku (b) (10,0 %). Nepřihlíží se k píkům rozpouštědel.

Dimer a příbuzné látky s vyšší molekulovou hmotností. Provede se vylučovací chromatografie (2.2.30), jak je popsána ve zkoušce Stanovení obsahu.

Nastříkne se 50 μl porovnávacího roztoku (a). Citlivost detektoru se nastaví tak, aby výška hlavního píku na získaném chromatogramu dosahovala 50 % až 70 % celé stupnice zapisovače. Rozlišení dané poměrem výšky minima mezi píky monomeru a dimeru k výšce píku dimeru j e menší než 0,6 (retenční časy vztažené k monomem jsou přibližně 0,94 pro dimer a 0,87 pro polymery). Několikrát se nastříkne porovnávací roztok (a) (nejméně třikrát); zkoušku lze hodnotit, jestliže relativní směrodatná odchylka plochy hlavního píku je menší než 2,5 %.

Nastříkne se po 50 μl zkoušeného roztoku a porovnávacího roztoku (a). Na chromatogramu zkoušeného roztoku součet ploch všech píků s retenčním časem menším, než je retenční čas hlavního píku, není větší než plocha hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) (4,0 %).

Izoelektrická fokusace. Provede se izoelektrická fokusace.

Zkoušený roztok (a). Připraví se roztok zkoušené látky v roztoku hydrogenuhličitanu amonného R (3,95 g/l) tak, aby v mililitru obsahoval 2,0 mg somatropinu.

Zkoušený roztok (b). 0,1 ml zkoušeného roztoku (a) se zředí roztokem hydrogenuhličitanu amonného R (3,95 g/l) na 2,0 ml.

Zkoušený roztok (c). Smíchá se 0,1 ml zkoušeného roztoku (a) a 0,1 ml porovnávacího roztoku.

Porovnávací roztok. Připraví se roztok somatropinu CRL ve vodě R tak, aby v mililitru obsahoval 2,0 mg somatropinu.

Roztok pro kalibraci izoelektrického bodu o rozmezí pH 2,5 až 6,5. Připraví se a použije podle návodu výrobce.

Se zařízením se pracuje podle návodu výrobce. Izoelektrická fokusace se provádí na hotových deskách s vrstvou gelu o rozměrech 245 mm x 110 mm x 1 mm a pH v rozmezí 4,0 až 6,5. Na vrstvu gelu se nanese odděleně po 15 μl každého roztoku. Jako anodický roztok se použije roztok kyseliny glutamové R (147,1 g/l) v roztoku kyseliny fosforečné R (50 g H₃Po₄/l) a jako katodický roztok se použije roztokβ-alaninu R (89,1 g/l). Pracovní podmínky se nastaví na 2000 V a 25 mA. Nechá se proběhnout fokusace při konstantním napětí po dobu 2,5 h. Vrstva gelu se ponoří na 30 min do roztoku obsahujícího kyselinu trichloroctovou R (115 g/l) a kyselinu sulfosalicylovou R (34,5 g/l) a potom na 5 min do směsi objemových dílů kyseliny octové R, ethanolu R a deionizované vody R (8 + 25 + 67) (odbarvovací roztok). Vrstva gelu se vybarvuje ponořením na 10 min do roztoku modře brilantní R (1,15 g/l) v odbarvovacím roztoku zahřátého na 60 °C a potom se ponoří do odbarvovacího roztoku do odstranění nadbytku barviva. Zkoušku lze hodnotit, jestliže rozdělení zón roztoku pro kalibraci izoelektrického bodu odpovídá požadavkům výrobce. Na elektroforeogramu porovnávacího roztoku je viditelná hlavní zóna s izoelektrickým bodem okolo 5 a kyselejší menší zóna okolo 4,8. Na elektroforeogramu zkoušeného roztoku (a) žádná zóna, kromě hlavní zóny, nepřevyšuje svou intenzitou hlavní zónu na elektroforeogramu zkoušeného roztoku (b) (5,0 %).

Voda. Nejvýše 10,0 %. Stanoví se plynovou chromatografií (2.2.28) za použití methanolu bezvodého R jako vnitřního standardu. Použijí se suché skleněné pomůcky, jež mohou být s vrstvou silikonu.

Roztok vnitřního standardu. 15 μl methanolu bezvodého R se zředí 2-propanolem R1 na 100 ml.

Zkoušený roztok (a). 1,0 mg se suspenduje v 0,1 ml 2-propanolu R1, 30 min se třepe a potom se odstředí; použije se čirý odstředěný roztok.

Zkoušený roztok (b). 1,0 mg se suspenduje v 0,1 ml roztoku vnitřního standardu, 30 min se třepe a potom se odstředí; použije se čirý odstředěný roztok.

Porovnávací roztok. 10 μl vody R se přidá k 50 ml roztoku vnitřního standardu.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

1. - nerezové ocelové kolony délky 1 m a vnitřního průměru 2 mm naplněné styrendivinylbenzen-kopolymerem R (180 μm až 250 μm).
2. - helia pro chromatografii R jako nosného plynu,
3. - tepelněvodivostního detektoru.

Teplota kolony se udržuje při 120 °C a teplota detektoru při 150 °C.

Nastříkne se zvolený objem všech roztoků. Vypočítá se obsah vody za předpokladu, že hustota vody (2.2.5) je při 20 °C 0,997 g/ml, a bere se v úvahu množství vody detegovatelné v roztoku vnitřního standardu.

Sterilita (2.6.1). Pokud je látka určena k výrobě parenterálních přípravků bez dalšího vhodného sterilizačního postupu, vyhovuje zkoušce na sterilitu.

Bakteriální endotoxiny (2.6.14). Pokud je látka určena k výrobě parenterálních přípravků bez dalšího vhodného postupu odstraňujícího bakteriální endotoxiny, vyhovuje zkoušce na bakteriální endotoxiny, obsahuje-li nejvýše 5 m.j. endotoxinu v miligramu.

Stanovení obsahu

Stanoví se vylučovací chromatografií (2.2.30).

Zkoušený roztok. Připraví se roztok zkoušené látky v roztoku hydrogenuhličitanu amonného R (3,95 g/l) tak, aby v mililitru obsahoval 1,0 mg somatropinu.

Porovnávací roztok (a). 200 μl zkoušeného roztoku se zředí roztokem hydrogenuhličitanu amonného R (3,95 g/l) na 5,0 ml.

Porovnávací roztok (b). Připraví se roztok somatropinu CRL v roztoku hydrogenuhličitanu amonného R (3,95 g/l) tak, aby v mililitru obsahoval 1,0 mg somatropinu.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

1. - nerezové ocelové kolony délky 0,25 m a vnitřního průměru 9,4 mm naplněné silikagelem hydrofilním pro chromatografií R jakosti vhodné pro dělení globulárních bílkovin v rozmezí molekulové hmotnosti 5000 až 60 000,
2. - mobilní fáze, kterou je zfiltrovaný a odplyněný roztok hydrogenuhličitanu amonného R (3,95 g/l), s průtokovou rychlostí 0,6 ml/min,
3. - spektrofotometrického detektoru, 214 nm.

Nastříkne se 50 μl porovnávacího roztoku (b). Citlivost detektoru se nastaví tak, aby výška hlavního píku dosahovala nejméně 50 % celé stupnice zapisovače. Několikrát se nastříkne porovnávací roztok (b) (nejméně třikrát); zkoušku lze hodnotit, jestliže relativní směrodatná odchylka plochy hlavního píku je nejvýše 2,5 %. Nastřikuje se střídavě po 50 μl zkoušeného roztoku a porovnávacího roztoku (b).

Obsah somatropinu se vypočítá z ploch píků na chromatogramu zkoušeného roztoku a na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) a deklarovaného obsahu látky C₉₉₀H₁₅₂₈N₂₆₂O₃₀₀S₇ v somatropinu CRL.

Uchovávání

Ve vzduchotěsných obalech, při teplotě 2 °C až 8 °C. Je-li látka sterilní, uchovává se ve sterilních vzduchotěsných zabezpečených obalech.

Separandum.

Označování

V označení na obalu se uvede, zdaje látka:

1. - sterilní,
2. - prostá bakteriálních endotoxinů.

Sorbitani lauras

Sorbitanlaurat

Synonymum. Sorbitanum lauricum

Vlastnosti

Hnědavě žlutá viskózní kapalina. Je prakticky nerozpustný, ale dispergovatelný ve vodě, mísitelný s lihem 96%, těžce rozpustný v bavlníkovém oleji.

Relativní hustota je asi 0,98.

Zkoušky totožnosti

1. A. Zkouška Číslo hydroxylové, viz Zkoušky na čistotu, je zároveň zkouškou totožnosti.
2. B. Zkouška Číslo jodové, viz Zkoušky na čistotu, je zároveň zkouškou totožnosti.
3. C. Ke 4 g se přidá 40 ml roztoku hydroxidu draselného R (50 g/l) a vaří se 30 min pod zpětným chladičem. Nechá se ochladit na asi 80 °C, přidá se 20 ml kyseliny dusičné zředěné RS a vaří se asi 10 min pod zpětným chladičem do zrušení emulze. Mastné kyseliny se oddělí na povrchu jako olejová vrstva. Po ochlazení se směs převede do dělicí nálevky a mastné kyseliny se opatrným třepáním extrahují s 50 ml etheru petrolejového R1. Horní vrstva se vysuší pomocí 1 g síranu sodného bezvodého R zfiltruje se a zahřívá se na vodní lázni do vymizení pachu rozpouštědel. Číslo kyselosti (2.5.1) zbytku je 260 až 280; stanoví se s 0,30 g.

Zkoušky na čistotu

Číslo kyselosti (2.5.1). Nejvýše 7,0; stanoví se s 5,00 g zkoušené látky.

Číslo hydroxylové (2.5.3). 330 až 358 (Metoda A).

Číslo jodové (2.5.4). Nejvýše 10.

Číslo peroxidové (2.5.5). Nejvýše 5,0.

Číslo zmýdelnění (2.5.6). 158 až 170; stanoví se s 2,00 g zkoušené látky.

Těžké kovy (2.4.8). 2,0 g vyhovují limitní zkoušce D na těžké kovy (10 μg/g). Porovnávací roztok se připraví za použití 2 ml základního roztoku olova (10 μg Pb/ml).

Voda, semimikrostanovení (2.5.12). Nejvýše 1,5 %; stanoví se s 1,000 g zkoušené látky.

Celkový popel (2.4.16). Nejvýše 0,5 %.

Uchovávání

V dobře uzavřených obalech, chráněn před světlem.

Sorbitani oleas

Sorbitanoleat

Synonymum. Sorbitanum oleicum

Vlastnosti

Hnědavě žlutá viskózní kapalina. Je prakticky nerozpustný, ale dispergovatelný ve vodě, dobře rozpustný v mastných olejích za vzniku zakalených roztoků, těžce rozpustný v etheru, mísitelný s lihem 96%.

Relativní hustota je asi 0,99.

Zkoušky totožnosti

1. A. Zkouška Číslo hydroxylové, viz Zkoušky na čistotu, je zároveň zkouškou totožnosti.
2. B. Zkouška Číslo jodové, viz Zkoušky na čistotu, je zároveň zkouškou totožnosti.
3. C. Ke 4 g se přidá 40 ml roztoku hydroxidu draselného R (50 g/l) a vaří se 30 min pod zpětným chladičem. Nechá se ochladit na asi 80 °C, přidá se 20 ml kyseliny dusičné zředěné RS a vaří se asi 10 min pod zpětným chladičem do zrušení emulze. Mastné kyseliny se oddělí na povrchu jako olejová vrstva. Po ochlazení se směs převede do dělicí nálevky a mastné kyseliny se opatrným třepáním extrahují s 50 ml etheru petrolejového R1. Horní vrstva se vysuší pomocí 1 g síranu sodného bezvodého R zfiltruje se a zahřívá se na vodní lázni do vymizení pachu rozpouštědel. Číslo kyselosti (2.5.1) zbytku je 190 až 210; stanoví se s 0,30 g.

Zkoušky na čistotu

Číslo kyselosti (2.5.1). Nejvýše 8,0; stanoví se s 5,00 g zkoušené látky.

Číslo hydroxylové (2.5.3). 190 až 210 (Metoda A); stanoví se s 2,00 g zkoušené látky.

Číslo jodové (2.5.4). 62 až 76.

Číslo peroxidové (2.5.5). Nejvýše 10,0.

Číslo zmýdelnění (2.5.6). 149 až 160; stanoví se s 2,00 g zkoušené látky.

Těžké kovy (2.4.8). 2,0 g vyhovují limitní zkoušce D na těžké kovy (10 μg/g). Porovnávací roztok se připraví za použití 2 ml základního roztoku olova (10 μg Pb/ml).

Voda, semimikrostanovení (2.5.12). Nejvýše 1,5 %; stanoví se s 1,000 g zkoušené látky.

Celkový popel (2.4.16). Nejvýše 0,5 %.

Uchovávání

V dobře uzavřených obalech, chráněn před světlem.

Sorbitani palmitas

Sorbitanpalmitat

Synonymum. Sorbitanum palmiticum

Vlastnosti

Nažloutlý nebo žlutý prášek, voskové vločky nebo tvrdá hmota. Je prakticky nerozpustný ve vodě, dobře rozpustný v mastných olejích, těžce rozpustný v lihu 96%.

Zkoušky totožnosti

1. A. Teplota tání (2.2.15). 44 °C až 51 °C. Roztavená zkoušená látka se vpraví do skleněné kapiláry a ponechá se 24 h při teplotě pod 10 °C.
2. B. Zkouška Číslo hydroxylové, viz Zkoušky na čistotu, je zároveň zkouškou totožnosti.
3. C. Ke 4 g se přidá 40 ml roztoku hydroxidu draselného R (50 g/l) a vaří se 30 min pod zpětným chladičem. Nechá se ochladit na asi 80 °C, přidá se 20 ml kyseliny dusičné zředěné RS a vaří se asi 10 min pod zpětným chladičem do zrušení emulze. Mastné kyseliny se oddělí na povrchu jako olejová vrstva. Po ochlazení se směs převede do dělicí nálevky a mastné kyseliny se opatrným třepáním extrahují s 50 ml etheru petrolejového R1. Horní vrstva se vysuší pomocí 1 g síranu sodného bezvodého R zfiltruje se a zahřívá se na vodní lázni do vymizení pachu rozpouštědel. Číslo kyselosti (2.5.1) zbytku je 210 až 230; stanoví se s 0,30 g.

Zkoušky na čistotu

Číslo kyselosti (2.5.1). Nejvýše 8,0; stanoví se s 5,00 g zkoušené látky.

Číslo hydroxylové (2.5.3). 270 až 305 (Metoda A).

Číslo peroxidové (2.5.5). Nejvýše 5,0.

Číslo zmýdelnění (2.5.6). 140 až 155; stanoví se s 2,00 g zkoušené látky.