Český lékopis 1997

Síranový popel (2.4.14). Nejvýše 0,3 %; stanoví se s 1,00 g zkoušené látky.

Stanovení obsahu

Sušina. Do odvážené váženky obsahující 2 g písku R předem vysušeného do konstantní hmotnosti se přenese 1,000 g zkoušené látky a malá skleněná tyčinka. Zahřívá se 2 h na vodní lázni za častého míchání a suší se v sušárně při 100 °C až 105 °C tak dlouho, dokud rozdíl dvou po sobě následujících vážení není větší než 2,0 mg. Druhé vážení následuje po opakovaném hodinovém sušení.

Celkový amoniak. 2,50 g se rozpustí ve 25 ml teplé vody R, převede se do 250ml odměrné baňky, přidá se 200 ml chloridu sodného RS a zředí se vodou R na 250,0 ml. Roztok se zfiltruje a prvních 20 ml filtrátu se odstraní. Ke 100,0 ml čirého filtrátu se přidá 25 ml formaldehydu RS předem zneutralizovaného na fenolftalein RS1 a titruje se hydroxidem sodným 0,1 mol/l VS do slabě růžového zabarvení.

1 ml hydroxidu sodného 0,1 mol/l VS odpovídá 1,703 mg NH₃.

Organicky vázaná síra. 0,500 g se v asi 50ml porcelánové misce smíchá se 4 g uhličitanu sodného bezvodého R a s 3 ml dichlormethanu R a zahřívá se za stálého míchání, dokud se všechen dichlormethan neodpaří. Potom se přidá 10 g hrubě práškovaného dusičnanu měďnatého R, důkladně se promíchá a směs se velmi opatrně zahřívá nad malým plamenem. Po proběhnutí reakce se zvýší teplota a zahřívá se tak dlouho, až reakční směs zčerná. Po vychladnutí se miska umístí do velké kádinky a přidá se 20 ml kyseliny chlorovodíkové R Po proběhnutí reakce se přidá 100 ml vody R zahřeje se k varu a zahřívá se, dokud se všechen oxid měďnatý nerozpustí. Roztok se zfiltruje, filtrát se zředí 400 ml vody R zahřeje se k varu a přidá se 20 ml chloridu barnatého RS1. Nechá se stát 2 h a zfiltruje se. Filtr se sraženinou se po promytí vodou R usuší a žíhá při asi 600 °C, dokud se dvě následující vážení neliší o více než 0,2 % hmotnosti zbytku.

1 g zbytku odpovídá 0,1374 g celkové síry.

Vypočítá se obsah síry v procentech a odečte se procentuální obsah síry ve formě síranu.

Síra ve formě síranu. 2,000 g se rozpustí ve 100 ml vody R, přidají se 2 g chloridu měďnatého R rozpuštěné v 80 ml vody R zředí se vodou R na 200,0 ml, promíchá se a zfiltruje. 100,0 ml filtrátu se zahřeje téměř k varu, přidá se 1 ml kyseliny chlorovodíkové R a po kapkách 5 ml chloridu barnatého RS1 a zahřeje se na vodní lázni. Zfiltruje se, sraženina se promyje vodou R, vysuší se a žíhá při teplotě asi 600 °C, dokud se dvě následující vážení neliší o více než 0,2 % hmotnosti zbytku.

1 g zbytku odpovídá 0,1374 g síry ve formě síranů.

Vypočítá se obsah síry ve formě síranů v procentech.

Uchovávání

V dobře uzavřených obalech.

† Idoxuridinum

Idoxuridin

Vlastnosti

Bílý nebo téměř bílý krystalický prášek. Je těžce rozpustný ve vodě a v lihu 96%, prakticky nerozpustný v etheru. Rozpouští se ve zředěných roztocích alkalických hydroxidů.

Taje při asi 180 °C za rozkladu.

Zkoušky totožnosti

Základní sestava zkoušek: A.

Alternativní sestava zkoušek: B, C a D, viz Obecné zásady (1.2).

1. A. Infračervené absorpční spektrum (2.2.24) tablety zkoušené látky se shoduje se spektrem tablety idoxuridinu CRL. Tablety se připraví odděleně za použití 1 mg zkoušené látky a 1 mg referenční látky a po 0,3 g bromidu draselného R
2. B. Hodnotí se chromatogramy ze zkoušky Příbuzné látky, viz Zkoušky na čistotu. Hlavní skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku (b) se polohou a velikostí shoduje s hlavní skvrnou na chromatogramu porovnávacího roztoku (c).
3. C. Asi 5 mg se zahřívá ve zkumavce nad plamenem; vyvíjejí se fialové páry.
4. D. Asi 2 mg se disperguje v 1 ml vody R, přidají se 2 ml difenylaminu RS2 a 10 min se zahřívá ve vodní lázni; vzniká trvalé světle modré zbarvení.

Zkoušky na čistotu

Roztok S. 0,500 g se rozpustí v hydroxidu sodném 1 mol/l RS a zředí se jím na 50,0 ml.

Vzhled roztoku. Roztok S je čirý (2.2.1) a bezbarvý (2.2.2, Metoda II).

Hodnota pH (2.2.3). 5,5 až 6,5; měří se roztok připravený rozpuštěním 0,10 g ve vodě prosté oxidu uhličitého R a zředěním stejným rozpouštědlem na 100 ml.

Specifická optická otáčivost (2.2.7). +28° až +32°, počítáno na vysušenou látku; měří se roztok S.

Příbuzné látky. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití vrstvy vhodného silikagelu s fluorescenčním indikátorem pro detekci při 254 nm.

Zkoušený roztok (a). 0,20 g se rozpustí ve směsi objemových dílů amoniaku 26% R a methanolu R (1 + 5) a zředí se stejnou směsí na 5 ml.

Zkoušený roztok (b). 1 ml zkoušeného roztoku (a) se zředí směsí objemových dílů amoniaku 26% R a methanolu R (1 + 5) na 10 ml.

Porovnávací roztok (a). 20 mg 5-jodouracilu R, 20 mg 2ʹ-deoxyuridinu R a 20 mg 5-brom-2ʹ-de-oxyuridinu R se rozpustí ve směsi objemových dílů amoniaku 26% R a methanolu R (1 + 5) a zředí se stejnou směsí na 100 ml.

Porovnávací roztok (b). 0,20 g zkoušené látky se rozpustí v 5 ml porovnávacího roztoku (a).

Porovnávací roztok (c). 20 mg idoxuridinu CRL se rozpustí ve směsi objemových dílů amoniaku 26% R a methanolu R (1 + 5) a zředí se stejnou směsí na 5 ml.

Porovnávací roztok (d). 1 ml zkoušeného roztoku (b) se zředí směsí objemových dílů amoniaku 26% R a methanolu R (1 + 5) na 20 ml.

Na vrstvu se odděleně nanese po 5 μl každého roztoku a vyvíjí se dvakrát směsí objemových dílů amoniaku 26% R, chloroformu R a 2-propanolu R (10 + 40 + 50) po dráze 15 cm. Vrstva se po každém vyvíjení usuší v proudu studeného vzduchu a pozoruje se v ultrafialovém světle při 254 nm. Na chromatogramu zkoušeného roztoku (a) žádné skvrny odpovídající 5-jodouracilu, 2ʹ-deoxyuridinu a 5-brom-2ʹ-deoxyuridinu nejsou intenzivnější než odpovídající skvrny na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) (0,5 %); žádná skvrna, kromě hlavní skvrny a skvrn odpovídajících 5-jodouracilu, 2ʹ-deoxyuridinu a 5-brom-2ʹ-deoxyuridinu, není intenzivnější než skvrna na chromatogramu porovnávacího roztoku (d) (0,5 %). Zkoušku lze hodnotit, jestliže na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) jsou čtyři zřetelně oddělené skvrny.

Jodidy. 0,25 g se rozpustí ve 25 ml hydroxidu sodného 0,1 mol/l RS, přidá se 5 ml kyseliny chlorovodíkové zředěné RS a zředí se vodou R na 50 ml. Nechá se stát 10 min a zfiltruje se. K 25 ml filtrátu se přidá 5 ml peroxidu vodíku zředěného RS a 10 ml chloroformu R a protřepe se. Růžové zbarvení chloroformové vrstvy není intenzivnější než zbarvení chloroformové vrstvy porovnávacího roztoku připraveného současně stejným způsobem za použití 1 ml roztoku jodidu draselného R (0,33 g/l) místo zkoušené látky (0,1 %).

Ztráta sušením (2.2.32). Nejvýše 1,0 %; 1,000 g se suší ve vakuu při 60 °C.

Síranový popel (2.4.14). Nejvýše 0,1 %; stanoví se s 1,00 g zkoušené látky.

Stanovení obsahu

0,3000 g se rozpustí ve 20 ml dimethylformamidu R a titruje se tetrabutylamoniumhydroxidem 0,1 mol/l VS za potenciometrické indikace bodu ekvivalence (2.2.20).

1 ml tetrabutylamoniumhydroxidu 0,1 mol/l VS odpovídá 35,41 mg C₉H₁₁IN₂O₅.

Uchovávání

V dobře uzavřených obalech, chráněn před světlem.

Separandum.

† Imipramini hydrochloridum

Imipraminiumchlorid

Synonymum. Imipraminium chloratum

Vlastnosti

Bílý až slabě žlutý krystalický prášek. Je snadno rozpustný ve vodě a v lihu 96%, prakticky nerozpustný v etheru.

Zkoušky totožnosti

Základní sestava zkoušek: A, C a F.

Alternativní sestava zkoušek: A, B, D, E a F, viz Obecné zásady (1.2).

1. A. Teplota tání (2.2.14). 170 °C až 174 °C.
2. B. 20 mg se rozpustí v kyselině chlorovodíkové 0,01 mol/l RS a zředí se jí na 100,0 ml. 1,0 ml tohoto roztoku se zředí kyselinou chlorovodíkovou 0,01 mol/l RS na 10,0 ml. Měří se absorbance (2.2.25) při 230 nm až 350 nm; roztok vykazuje absorpční maximum při 251 nm a prodlevu při 270 nm. Specifická absorbance v maximu je asi 260.
3. C. Infračervené absorpční spektrum (2.2.24) tablety zkoušené látky se shoduje se spektrem tablety imipraminiumchloridu CRL.
4. D. Asi 5 mg se rozpustí ve 2 ml kyseliny dusičné R; vzniká intenzivně modré zbarvení.
5. E. Asi 50 mg se rozpustí ve 3 ml vody R a přidá se 0,05 ml roztoku hydrochinonu R (25 g/l) v methanolu R; během 15 min nevzniká červené zbarvení.
6. F. Asi 20 mg vyhovuje zkoušce (a) na chloridy (2.3.1).

Zkoušky na čistotu

Roztok S. Ke 3,0 g se přidá 20 ml vody prosté oxidu uhličitého R, rychle se rozpustí třepáním a rozmělněním skleněnou tyčinkou a zředí se stejným rozpuštědlem na 30 ml.

Vzhled roztoku. Roztok S je čirý (2.2.1). Ihned po přípravě se zředí stejným objemem vody R. Tento roztok není zbarven intenzivněji než porovnávací barevný roztok HŽ₆ (2.2.2, Metoda II).

Hodnota pH (2.2.3). 3,6 až 5,0; měří se roztok S ihned po přípravě.

Příbuzné látky. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití vrstvy silikagelu G R.

Zkoušený roztok. 0,25 g se rozpustí v methanolu R a zředí se jím na 10 ml. Připravuje se v čas potřeby.

Porovnávací roztok (a). 1 ml zkoušeného roztoku se zředí methanolem R na 10 ml. 1 ml tohoto roztoku se zředí methanolem R na 50 ml.

Porovnávací roztok (b). 5 mg iminodibenzylu R se rozpustí v methanolu R a zředí se jím na 100 ml. Připravuje se v čas potřeby.

Na vrstvu se odděleně nanese po 10 μl každého roztoku a vyvíjí se směsí objemových dílů kyseliny chlorovodíkové R, vody R, kyseliny octové ledové R a ethylacetatu R (5 + 5 + 35 + 55) po dráze 12 cm. Vrstva se nechá 5 min sušit a potom se postříká roztokem dichromanu draselného R (5 g/l) ve směsi objemových dílů kyseliny sírové R a vody R (1 + 4) a ihned se pozoruje. Na chromatogramu zkoušeného roztoku je modrá hlavní skvrna. Žádná skvrna odpovídající iminodibenzylu na chromatogramu zkoušeného roztoku není intenzivnější než skvrna na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) (0,2 %). Žádná skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku, kromě hlavní skvrny a skvrny odpovídající iminodibenzylu, není intenzivnější než skvrna na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) (0,2 %).

Těžké kovy (2.4.8). 2,0 g vyhovují limitní zkoušce C na těžké kovy (20 μg/g). Porovnávací roztok se připraví za použití 4 ml základního roztoku olova (10 μg Pb/ml).

Ztráta sušením (2.2.32). Nejvýše 0,5 %; 1,000 g se suší v sušárně při 100 °C až 105 °C.

Síranový popel (2.4.14). Nejvýše 0,1 %; stanoví se s 1,00 g zkoušené látky.

Stanovení obsahu

0,300 g se rozpustí v 50 ml chloroformu R a přidá se 10 ml octanu rtuťnatého RS a titruje se kyselinou chloristou 0,1 mol/l VS za použití 0,5 ml žlutí, metanilové RS jako indikátoru.

1 ml kyseliny chloristé 0,1 mol/l VS odpovídá 31,69 mg C₁₉H₂₅ClN₂.

Uchovávání

V dobře uzavřených obalech, chráněn před světlem.

Separandum.

† Indapamidum

Indapamid

Vlastnosti

Bílý nebo téměř bílý prášek. Je prakticky nerozpustný ve vodě, dobře rozpustný v lihu 96%, těžce rozpustný v etheru.

Zkoušky totožnosti

Základní sestava zkoušek: B.

Alternativní sestava zkoušek: A a C, viz Obecné zásady (1.2).

1. A. 50,0 mg se rozpustí v lihu 96% R a zředí se jím na 100,0 ml. 2,0 ml tohoto roztoku se zředí lihem 96% R na 100,0 ml. Měří se absorbance roztoku (2.2.25) při 220 nm až 350 nm; roztok vykazuje absorpční maximum při 242 nm a dvě ramena, při 279 nm a při 287 nm. Specifická absorbance v maximu je 590 až 630.
2. B. Infračervené absorpční spektrum (2.2.24) tablety zkoušené látky se shoduje se spektrem tablety indapamidu CRL. Tablety se připraví za použití bromidu draselného R
3. C. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití vrstvy silikagelu GF₂₅₄R.

   Zkoušený roztok. 20 mg se rozpustí v lihu 96% R a zředí se jím na 10 ml.

   Porovnávací roztok (a). 20 mg indapamidu CRL se rozpustí v lihu 96% R a zředí se jím na 10 ml.

   Porovnávací roztok (b). 10 mg indometacinu CRL se rozpustí v 5 ml porovnávacího roztoku (a) a zředí se lihem 96% R na 10 ml.

   Na vrstvu se nanese 10 μl každého roztoku. Vyvíjí se směsí objemových dílů kyseliny octové ledové R, acetonu R a toluenu R (1 + 20 + 79) po dráze 15 cm. Vrstva se usuší na vzduchu a pozoruje se v ultrafialovém světle při 254 nm. Hlavní skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku odpovídá polohou a velikostí hlavní skvrně na chromatogramu porovnávacího roztoku (a). Zkoušku lze hodnotit, jestliže na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) jsou dvě zřetelně od sebe oddělené skvrny.

Zkoušky na čistotu

Optická otáčivost (2.2.7). -0,02° až +0,02°. 0,250 g se rozpustí v ethanolu R a zředí se jím na 25,0 ml.

Příbuzné látky. Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29) způsobem popsaným ve Stanovení obsahu.

Nastaví se citlivost systému tak, aby výška hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) nebyla menší než 15 % rozsahu celé stupnice zapisovače.

Nastříkne se po 10 μl každého roztoku a chromatogramy se zaznamenávají po dobu odpovídající 2,5násobku retenčního času hlavního píku. Zkoušku lze hodnotit, jestliže na chromatogramu porovnávacího roztoku (d) je rozlišení mezi píkem indapamidu a píkem methylnitrosoindolinu nejméně 4,0 a na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) je poměr signálu hlavního píku k šumu nejméně 6.

Na chromatogramu zkoušeného roztoku není plocha žádného píku indapamidu nečistoty B větší než plocha hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) (0,3 %); plocha žádného píku, kromě hlavního píku a píku indapamidu nečistoty B, není větší než plocha hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) (0,1 %); součet ploch všech píku, kromě hlavního píku, není větší než 5násobek plochy hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) (0,5 %). Nepřihlíží se k píkům s plochou menší než 0,5násobek plochy hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b).

Methylnitrosoindolin. Nejvýše 5 μg/g; provede se kapalinová chromatografie (2.2.29). Zkouška se provede za ochrany před světlem.

Zkoušený roztok. 25,0 mg se rozpustí v 1 ml acetonitrilu R a zředí se vodou R na 10,0 ml. Protřepává se 15 min, nechá se stát 1 h při 4 °C a pak se zfiltruje.

Porovnávací roztok. 25,0 mg se rozpustí v 1,0 ml roztoku methylnitrosoindolinu CRL (0,125 mg/l) v acetonitrilu R a zředí se vodou R na 10,0 ml. Protřepává se 15 min, nechá se stát 1 h při 4 °C a pak se zfiltruje.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

1. - nerezové ocelové kolony délky 0,15 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné silikagelem oktadecysilanizovaným pro chromatografii R (5 μm),
2. - mobilní fáze, která je směsí objemových dílů acetonitrilu R tetrahydrofuranu R a roztoku triethanolaminu R (1,5 g/l), jehož hodnota pH byla upravena na 2,8 kyselinou fosforečnou R, (7 + 20 + 73). Průtoková rychlost je 1,4 ml/min,
3. - spektrofotometrického detektoru, 305 nm,

Teplota kolony se udržuje na 30 °C.

Nastřikuje se po 0,1 ml roztoků.

Na chromatogramu porovnávacího roztoku se změří od základny výška A píku methylnitrosoindolinu, který je těsně před hlavním píkem, a výška B nejnižšího bodu křivky mezi píkem methylnitrosoindolinu a hlavního píku. Zkoušku lze hodnotit, jestliže na chromatogramu porovnávacího roztoku rozdíl mezi A a B je nejméně 85 % výšky A a poměr signálu píku methylnitrosoindolinu, který je těsně před hlavním píkem, k šumu je nejméně 3.

Na chromatogramu zkoušeného roztoku plocha žádného píku odpovídajícího methylnitrosoindolinu není větší než rozdíl mezi plochami píků methylnitrosoindolinu na chromatogramech porovnávacího roztoku a zkoušeného roztoku.

Těžké kovy (2.4.8). 2,0 g vyhovují limitní zkoušce C na těžké kovy (10 μg/g). Porovnávací roztok se připraví za použití 2 ml základního roztoku olova (10 μg Pb/ml).

Voda, semimikrostanovení (2.5.12). Nejvýše 3,0 %; stanoví se s 0,10 g zkoušené látky.

Síranový popel (2.4.14). Nejvýše 0,1 %, stanoví se s 1,00 g zkoušené látky.

Stanovení obsahu

Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29).

Zkouška se provede za ochrany před světlem a roztoky se připravují v čas potřeby nebo se uchovávají při teplotě do 4 °C.

Zkoušený roztok. 20,0 mg se rozpustí v 7 ml směsi stejných objemových dílů acetonitrilu R a methanolu R a zředí se roztokem edetanu disodného R (0,2 g/l) na 20,0 ml.

Porovnávací roztok (a). 30,0 mg indapamidu nečistoty B CRL se rozpustí ve 35 ml směsi stejných objemových dílů acetonitrilu R a methanolu R a zředí se roztokem edetanu disodného R (0,2 g/l) na 100,0 ml. K 1,0 ml tohoto roztoku se přidá 35 ml stejných objemových dílů acetonitrilu R a methanolu R a zředí se roztokem edetanu disodného R (0,2 g/ml) na 100,0 ml.

Porovnávací roztok (b). 1,0 ml zkoušeného roztoku se zředí směsí objemových dílů acetonitrilu R methanolu R a roztoku edetanu disodného R (0,2 g/l) (17,5 + 17,5 + 65) na 50,0 ml. 1,0 ml tohoto roztoku se zředí směsí objemových dílů acetonitrilu R methanolu R a roztoku edetanu disodného R (0,2 g/ml) (17,5 + 17,5 + 65) na 20,0 ml.

Porovnávací roztok (c). 20,0 mg indapamidu CRL se rozpustí v 7 ml směsi stejných objemových dílů acetonitrilu R a methanolu R a zředí se roztokem edetanu disodného R (0,2 g/l) na 20,0 ml. Porovnávací roztok (d). 25,0 mg indapamidu CRL a 45,0 mg methylnitrosoindolinu CRL se rozpustí v 17,5 ml směsi stejných objemových dílů acetonitrilu R a methanolu R a zředí se roztokem edetanu disodného R (0,2 g/l) na 50,0 ml.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

1. - nerezové ocelové kolony délky 0,20 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné silikagelem oktadecylsilanizovaným pro chromatografii R (5 μm),
2. - mobilní fáze, která je směsí objemových dílů kyseliny octové ledové R acetonitrilu R methanolu R a roztoku edetanu disodného R (0,2 g/l) (0,1 + 17,5 + 17,5 + 65). Průtoková rychlost je 2 ml/min,
3. - spektrofotometrického detektoru, 254 nm.

Teplota kolony se udržuje na 40 °C.

Při zaznamenání chromatogramů za předepsaných podmínek je retenční čas hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (c) asi 11 min. Porovnávací roztok (c) se nastříkne šestkrát. Zkoušku lze hodnotit, jestliže relativní směrodatná odchylka plochy píku indapamidu je nejvýše 1,0 %. V případě potřeby se upraví parametry integrátoru. Nastřikuje se střídavě zkoušený roztok a porovnávací roztok (c).

Obsah bezvodé látky se vypočítá v procentech.

Uchovávání

V dobře uzavřených obalech, chráněn před světlem.

Separandum.

Nečistoty

1. A. 2-methyl-1-nitrosoindolin,

1. B. 4-chlor-3-(sulfamoyl)-N-(2-methyl-1H-indol-1-yl)benzamid.

† Indometacinum

Indometacin

Synonymum. Indomethacinum

Vlastnosti

Bílý nebo nažloutlý krystalický prášek. Je prakticky nerozpustný ve vodě, mírně rozpustný v lihu 96%.

Zkoušky totožnosti

Základní sestava zkoušek: A a C.

Alternativní sestava zkoušek: A, B, D a E, viz Obecné zásady (1.2).

1. A. Teplota tání (2.2.14). 158 °C až 162 °C.
2. B. 25 mg se rozpustí ve směsi objemových dílů kyseliny chlorovodíkové 1 mol/l RS a methanolu R (1 + 9) a zředí se stejnou směsí na 100,0 ml. 10,0 ml tohoto roztoku se zředí stejnou směsí na 100,0 ml. Měří se absorbance (2.2.25) při 300 nm až 350 nm; roztok vykazuje absorpční maximum při 318 nm. Specifická absorbance v maximu je asi 170 až 190.
3. C. Infračervené absorpční spektrum (2.2.24) zkoušené látky se shoduje se spektrem indometaci-nu CRL. Zkouší se látky v pevném stavu bez rekrystalizace.
4. D. 0,1 g se rozpustí, je-li třeba zahřátím, v 10 ml lihu 96% R. K 0,1 ml tohoto roztoku se přidají 2 ml čerstvě připravené směsi objemových dílů roztoku hydroxylamoniumchloridu R (250 g/l) a hydroxidu sodného zředěného RS (1 + 3), přidají se 2 ml kyseliny chlorovodíkové zředěné RS a 1 ml chloridu železitého RS2 a promíchá se; vzniká fialovorůžové zbarvení.
5. E. K 0,5 ml lihového roztoku ze zkoušky D se přidá 0,5 ml dimethylaminobenzaldehydu RS2; vznikne sraženina, která se po protřepání rozpustí. Zahřeje se na vodní lázni; roztok se zbarví modrozeleně. Pokračuje se v zahřívání po dobu 5 min a potom se 2 min chladí v ledové vodě; vznikne sraženina a barva roztoku se změní na světle šedozelenou. Přidají se 3 ml lihu 96% R; roztok je čirý a fialovorůžového zbarvení.

Zkoušky na čistotu

Příbuzné látky. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití vrstvy silikagelu HF₂₅₄R. Vrstva se připraví za použití roztoku dihydrogenfosforečnanu sodného R (46,8 g/l).

Zkoušený roztok. 0,2 g se rozpustí v methanolu R a zředí se jím na 10 ml. Připravuje se v čas potřeby.

Porovnávací roztok. 1 ml zkoušeného roztoku se zředí methanolem R na 200 ml.

Na vrstvu se odděleně nanese po 10 μl každého roztoku a vyvíjí se směsí objemových dílů etheru petrolejového R a etheru R (30 + 70) po dráze 15 cm. Vrstva se usuší na vzduchu a pozoruj e se v ultrafialovém světle při 254 nm. Žádná skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku, kromě hlavní skvrny, není intenzivnější než skvrna na chromatogramu porovnávacího roztoku (0,5 %).

Těžké kovy (2.4.8). 2,0 g vyhovují limitní zkoušce C na těžké kovy (20 μg/g). Porovnávací roztok se připraví za použití 4 ml základního roztoku olova (10 μg Pb/ml).

Ztráta sušením (2.2.32). Nejvýše 0,5 %; 1,000 g se suší v sušárně při 100 °C až 105 °C.

Síranový popel (2.4.14). Nejvýše 0,1 %; stanoví se s 1,00 g zkoušené látky.

Stanovení obsahu

0,300 g se rozpustí v 75 ml acetonu R, který byl 15 min probubláván dusíkem R prostým oxidu uhličitého a za stálého probublávání konstantním proudem dusíku se titruje hydroxidem sodným 0,1 mol/l VS za použití 0,1 ml fenolftaleinu RS jako indikátoru. Současně se provede slepá zkouška.

1 ml hydroxidu sodného 0,1 mol/l VS odpovídá 35,78 mg C₁₉H₁₆ClNO₄.

Uchovávání

V dobře uzavřených obalech, chráněn před světlem.

Separandum.

Nečistoty

1. A. kyselina 4-chlorbenzoová.

† Insulinum

Insulin

Výroba

Insulin je vyráběn za podmínek minimalizujících mikrobiální znečištění.

Vlastnosti

Bílý nebo téměř bílý prášek. Je prakticky nerozpustný ve vodě, v ethanolu a v etheru. Rozpouští se ve zředěných minerálních kyselinách a za rozkladu ve zředěných alkalických hydroxidech.

Zkoušky totožnosti

1. A. Hodnotí se chromatogramy získané ve zkoušce Stanovení obsahu. Retenční čas hlavního píku na chromatogramu zkoušeného roztoku se shoduje s retenčním časem hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku.
2. B. Hodnotí se chromatogramy získané ve zkoušce Nečistoty s molekulovou hmotností větší než insulin, viz Zkoušky na čistotu. Retenční čas hlavního píku na chromatogramu zkoušeného roztoku se shoduje s retenčním časem hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b).

Zkoušky na čistotu

Absorbance (2.2.25). 5,0 mg se rozpustí v kyselině chlorovodíkové 0,01 mol/l RS a zředí se jí na 10,0 ml. Specifická absorbance v maximu při 276 nm je 9,6 až 11,2, počítáno na vysušenou látku.

Nečistoty s molekulovou hmotností větší než insulin. Provede se vylučovací chromatografie (2.2.30).

Zkoušený roztok. 10 mg se rozpustí v 1,0 ml mobilní fáze.

Porovnávací roztok (a). 100 μl zkoušeného roztoku se zředí mobilní fází na 10,0 ml.

Porovnávací roztok (b). Rozpustí se obsah lahvičky prasečího insulinu CRL nebo hovězího insulinu CRL v mobilní fázi tak, aby byla získána koncentrace 10 mg/ml.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

1. - kolony délky 0,6 m a vnitřního průměru nejméně 7,5 mm naplněné silikagelem pro chromatografii R (10 μm; velikost pórů asi 13 nm),
2. - mobilní fáze, kterou je zfiltrovaná a odplyněná směs připravená takto: 20 objemových dílů kyseliny octové ledové R se smíchá s 50 objemovými díly vody R, nastaví se pH na hodnotu 3,0 roztokem amoniaku R (25% V/V), přidá se 30 objemových dílů acetonitrilu R a promíchá. Průtoková rychlost je 0,5 ml/min,
3. - spektrofotometrického detektoru, 276 nm.

Nastříkne se odděleně po 50 μl každého roztoku. Citlivost detektoru se nastaví tak, aby velikost hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) byla 50 % až 70 % rozsahu celé stupnice zapisovače. Na chromatogramu zkoušeného roztoku součet ploch píků eluovaných před hlavním píkem není větší než plocha hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) (1,0%).

Příbuzné bílkoviny. Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29).

Zkoušený roztok. 40,0 mg se rozpustí v 10,0 ml kyseliny chlorovodíkové 0,01 mol/l RS.

Porovnávací roztok (a). Obsah lahvičky prasečího insulinu CRL se rozpustí v kyselině chlorovodíkové 0,01 mol/l RS tak, aby výsledný roztok obsahoval 4,0 mg/ml.

Porovnávací roztok (b). Obsah lahvičky lidského insulinu CRL se rozpustí v kyselině chlorovodíkové 0,01 mol/l RS tak, aby výsledný roztok obsahoval 4,0 mg/ml.

Porovnávací roztok (c). Je-li třeba použít hovězí insulin, rozpustí se 40,0 mg hovězího insulinu CRL v 10,0 ml kyseliny chlorovodíkové 0,01 mol/l RS.

Porovnávací roztok (d). 1,0 ml porovnávacího roztoku (a) se smíchá s 1,0 ml porovnávacího roztoku (b).

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

1. - ocelové nerezové kolony délky 0,25 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné silikagelem oktadecylsilanizovaným pro chromatografii R (5 μm),
2. - mobilní fáze s průtokovou rychlostí 1 ml/min, kterou jsou následující roztoky připravené a uchováné při teplotě nepřevyšující 20 °C:
   1. - mobilní fáze A - 28,4 g síranu sodného bezvodého R se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 1000 ml. Přidá se 2,7 ml kyseliny fosforečné R, a je-li třeba, upraví se pH na hodnotu 2,3 ethanolaminem R, zfiltruje se a roztok se odvzdušní probubláváním helia pro chromatografii R,
   2. - mobilní fáze B - smíchá se 500 ml mobilní fáze A s 500 ml acetonitrilu R Zfiltruje se a roztok se odvzdušní probubláváním helia pro chromatografii R,

1. - spektrofotometrického detektoru, 214 nm.

Teplota kolony se udržuje na 40 °C.

Nastříkne se 20 μl porovnávacího roztoku (d) a 20 μl porovnávacího roztoku (a). Zaznamená se chromatogram porovnávacího roztoku (d), dokud pík odpovídající hlavnímu píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) je zřetelně viditelný. Zkoušku lze hodnotit, jestliže rozlišení mezi píky odpovídajícími lidskému insulinu a prasečímu insulinu není menší než 1,2. Je-li třeba, upraví se koncentrace acetonitrilu v mobilní fázi, aby bylo dosaženo požadovaného rozlišení.

Nastříkne se 20 μl porovnávacího roztoku (a) nebo, je-li třeba, porovnávacího roztoku (c) a 20 μl zkoušeného roztoku. Na chromatogramu porovnávacího roztoku se objeví desamidoinsulin jako malý pík za hlavním píkem a jeho relativní retenční čas vzhledem k hlavnímu píku je asi 1,3. Na chromatogramu zkoušeného roztoku plocha píku odpovídajícího desamidoinsulinu není větší než 3,0 % celkové plochy všech píků; součet ploch všech píků, kromě píku insulinu a desamidoinsulinu, není větší než 3,0 % celkové plochy všech píků.

Imunoreaktivita proinsulinu (PLI). Nejvýše 10 μg/g; počítáno na vysušenou látku. Imunoreaktivita proinsulinu se zkouší vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1), jako je radioimunoanalýza za použití mezinárodního referenčního prasečího nebo hovězího proinsulinu ke kalibraci metody.

Zinek. Nejvýše 1,0 %, počítáno na vysušenou látku; stanoví se atomovou absorpční spektrometrií (2.2.23, Metoda I).

Zkoušený roztok. 50,0 mg se rozpustí v kyselině chlorovodíkové 0,01 mol/l RS a zředí se jí na 25,0 ml. Je-li třeba, zředí se kyselinou chlorovodíkovou 0,01 mol/l RS na koncentraci např. 0,4 μg Zn/ml až 1,6 μg Zn/ml.

Porovnávací roztoky. Připraví se roztoky obsahující 0,40 μg Zn/ml, 0,80 μg Zn/ml, 1,00 μg Zn/ml, 1,20 μg Zn/ml, 1,60 μg Zn/ml za použití čerstvě připraveného základního roztoku zinku (5 mg Zn/ml) zředěním kyselinou chlorovodíkovou 0,01 mol/l RS.

Měří se absorbance při 213,9 nm za použití zinkové lampy s dutou katodou jako zdroje záření a plamene vzduch-acetylen vhodného složení (např. 2 l acetylenu a 11 l vzduchu/min).

Ztráta sušením (2.2.32). Nejvýše 10,0 %; 0,200 g se suší 24 h při 100 °C až 105 °C.

Síranový popel (2.4.14). Nejvýše 2,5 %, počítáno na vysušenou látku; stanoví se s 0,20 g zkoušené látky.

Bakteriální endotoxiny (2.6.14). Pokud je látka určena k výrobě parenterálních přípravků bez dalšího vhodného postupu odstraňujícího bakteriální endotoxiny, vyhovuje zkoušce na bakteriální endotoxiny, obsahuje-li nejvýše 10 m.j. endotoxinu v miligramu.

Stanovení obsahu

Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29).

Zkoušený roztok (a). 40,0 mg se rozpustí v kyselině chlorovodíkové 0,01 mol/l RS a zředí se jí na 10,0 ml.

Zkoušený roztok (b). Ke 100 μl zkoušeného roztoku (a) se přidá 900 μl kyseliny chlorovodíkové 0,01 mol/l RS a dobře se promíchá.

Porovnávací roztok (a). Obsah lahvičky prasečího insulinu CRL nebo hovězího insulinu CRL, dle potřeby, se rozpustí v kyselině chlorovodíkové 0,01 mol/l RS a zředí se jí tak, aby výsledný roztok obsahoval 4,0 mg/ml.

Porovnávací roztok (b). 1,0 ml roztoku obsahujícího 4,0 mg lidského insulinu CRL v 1 ml kyseliny chlorovodíkové 0,01 mol/l RS a 1,0 ml roztoku obsahujícího 4,0 mg parsečího insulinu CRL v 1 ml kyseliny chlorovodíkové 0,01 mol/l VS se smíchají.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

1. - ocelové nerezové kolony délky 0,25 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné silikagelem oktadecylsilanizovaným pro chromatografii R (5 μm),
2. - mobilní fáze s průtokovou rychlostí 1 ml/min, kterou jsou následující roztoky připravené a uchovávané při teplotě nepřevyšující 20 °C:
3. - mobilní fáze A - 28,4 g síranu sodného bezvodého R se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 1000 ml. Přidá se 2,7 ml kyseliny fosforečné R, a je-li třeba, upraví se pH na hodnotu 2,3 ethanol-aminem R, zfiltruje se a roztok se odvzdušní probubláváním helia pro chromatografii R,
4. - mobilní fáze B - smíchá se 500 ml mobilní fáze A s 500 ml acetonitrilu R Zfíltruje se a roztok se odvzdušní probubláváním helia pro chromatografii R,
5. - spektrofotometrického detektoru, 214 nm.

Teplota kolony se udržuje na 40 °C.

Zaznamenají se chromatogramy mobilní fáze obsahující směs objemových dílů mobilní fáze A a mobilní fáze B (48 + 52). V případě potřeby se upraví složení mobilní fáze.

Nastříkne se 10 μl porovnávacího roztoku (b) a zaznamená se chromatogram. Zkoušku lze hodnotit, jestliže rozlišení mezi píky odpovídajícími lidskému insulinu a prasečímu insulinu není menší než 1,2. Je-li třeba, upraví se koncentrace acetonitrilu v mobilní fázi tak, aby bylo dosaženo požadovaného rozlišení.

Nastříkne se porovnávací roztok (a) šestkrát. Zkoušku lze hodnotit, jestliže relativní směrodatná odchylka pro plochu hlavního píku je menší než 2 %.

Nastříkne se 10 μl zkoušeného roztoku (a) a (b) a 10 μl porovnávacího roztoku (a) stejného druhu insulinu jako zkoušená látka.

Zkoušku lze hodnotit, jestliže plocha hlavního píku na chromatogramu zkoušeného roztoku (a) je (10 ± 0,5)krát větší než plocha hlavního píku na chromatogramu zkoušeného roztoku (b).

Vypočítá se obsah insulinu (C₂₅₆H₃₈₁N₆₅O₇₆S₆ nebo C₂₅₄H₃₇₇N₆₅O₇₅S₆) za použití plochy píku na chromatogramu zkoušeného roztoku (a), plochy píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) a deklarovaného obsahu C₂₅₆H₃₈₁N₆₅O₇₆S₆ v prasečím insulinu CRL nebo C₂₅₄H₃₇₇N₆₅O₇₅S₆ v hovězím insulinu CRL, jak je potřeba.

Uchovávání

Ve vzduchotěsných obalech, chráněn před světlem, při -20 °C do uvolnění pro výrobu. Po rozpuštění se insulin uchovává při (5 ± 3) °C po krátkou dobu, než bude použit pro výrobu přípravku.

Separandum.

Označování

V označení na obalu se uvede:

1. - zvíře, z kterého byla látka získána,
2. - zda je látka prostá bakteriálních endotoxinů.

† Insulinum humanum

Lidský insulin

Výroba

Lidský insulin je vyráběn za podmínek minimalizujících mikrobiální znečištění.

Pro lidský insulin vyráběný enzymatickou přeměnou insulinu získaného z prasečí slinivky se ve validovaném výrobním procesu odstraňuje zbytková proteolytická účinnost. Oprávěná autorita může požadovat dodatečné zkoušky.

Pro lidský insulin vyráběný rDNK technologií lze vypustit následující zkoušku u každé šarže konečného výrobku, pokud oprávněná autorita neudělila výjimku.

Bílkoviny hostitelské buňky. Nejvýše 10 μg/g; stanoví se postupem uvedeným v článku Producta ab ADN recombinante.

Vlastnosti

Bílý nebo téměř bílý prášek. Je prakticky nerozpustný ve vodě, v ethanolu a v etheru. Rozpouští se ve zředěných minerálních kyselinách a za rozkladu ve zředěných alkalických hydroxidech.

Zkoušky totožnosti

1. A. Hodnotí se chromatogramy získané ve zkoušce Stanovení obsahu. Retenční čas hlavního píku na chromatogramu zkoušeného roztoku (a) se shoduje s retenčním časem hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku.
2. B. Hodnotí se chromatogramy získané ve zkoušce Nečistoty s molekulovou hmotností větší než insulin, viz Zkoušky na čistotu. Retenční čas hlavního píku na chromatogramu zkoušeného roz-toku se shoduje s retenčním časem hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (b).

Zkoušky na čistotu

Absorbance (2.2.25). 5,0 mg se rozpustí v kyselině chlorovodíkové 0,01 mol/l RS a zředí se jí na 10,0 ml. Specifická absorbance v maximu při 276 nm je 9,6 až 11,2, počítáno na vysušenou látku.

Nečistoty s molekulovou hmotností větší než insulin. Provede se vylučovací chromatografie (2.2.30).

Zkoušený roztok. 10 mg se rozpustí v 1,0 ml mobilní fáze.

Porovnávací roztok (a). 100 μl zkoušeného roztoku se zředí mobilní fází na 10,0 ml.

Porovnávací roztok (b). Rozpustí se obsah lahvičky lidského insulinu CRL v mobilní fázi tak, aby výsledný roztok obsahoval 10 mg/ml.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

1. - kolony délky 0,6 m a vnitřního průměru nejméně 7,5 mm naplněné silikagelem pro chromatografii R (10 μm; velikost pórů asi 13 nm),
2. - mobilní fáze, kterou je zfiltrovaná a odplyněná směs připravená takto: 20 objemových dílů kyseliny octové ledové R se smíchá s 50 objemovými díly vody R, upraví se pH na hodnotu 3,0 roztokem amoniaku 17,5% RS 25% (V/V), přidá se 30 objemových dílů acetonitrilu R a promíchá.

Průtoková rychlost je 0,5 ml/min,

1. - spektrofotometrického detektoru, 276 nm.

Nastříkne se odděleně po 50 μl každého roztoku. Citlivost detektoru se nastaví tak, aby velikost hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) byla 50 % až 70 % celé stupnice zapisovače. Na chromatogramu zkoušeného roztoku součet ploch píků eluovaných před hlavním píkem není větší než plocha hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) (1,0 %).