Český lékopis 1997

Acetyl

Do zkumavky délky asi 180 mm a vnějšího průměru 18 mm se přenese asi 15 mg nebo předepsané množství zkoušené látky a 0,15 ml kyseliny fosforečné R. Zkumavka se uzavře zátkou, kterou prochází malá zkumavka délky asi 100 mm a vnějšího průměru 10 mm obsahující vodu R, která působí jako chladič. Na povrch malé zkumavky se zavěsí kapka dusičnanu lanthanitého RS. Kromě látek těžko hydrolyzovatelných se aparatura postaví do vodní lázně na 5 min, potom se vyjme malá zkumavka a kapka se smíchá na kapkovací desce s 0,05 ml jodu 0,01 mol/l RS. K okraji směsi se přidá 0,05 ml amoniaku zředěného RS2; po 1 min až 2 min vznikne na styku dvou kapek modré zbarvení, které zesílí a po krátkém čase zmizí.

U látek těžko hydrolyzovatelných se směs pomalu zahřívá k varu nad otevřeným plamenem a potom se postupuje stejně, jak je uvedeno výše.

Alkaloidy

Několik mg nebo předepsané množství zkoušené látky se rozpustí v 5 ml vody R a přidává se kyselina chlorovodíková zředěná RS do vzniku kyselé reakce (2.2.4). Potom se přidá 1 ml jodobismutitanu draselného RS; ihned vznikne oranžová nebo oranžově červená sraženina.

Aminy, primární aromatické

Předepsaný roztok se okyselí kyselinou chlorovodíkovou zředěnou RS a přidá se 0,2 ml dusitanu sodného RS. Po 1 min až 2 min se přidá 1 ml 2-naftolu RS; vznikne intenzivní oranžové až červené zbarvení, případně sraženina stejné barvy.

Amoniové soli

K předepsanému roztoku se přidá 0,2 g oxidu hořečnatého R. Směs se probublává proudem vzduchu, který ústí k povrchu směsi obsahující 1 ml kyseliny chlorovodíkové 0,1 mol/l RS a 0,05 ml červeně methylové RS; zbarvení indikátoru se změní na žluté. Přidá se 1 ml čerstvě připraveného roztoku hexanitrokobaltitanu sodného R (100 g/l); vznikne žlutá sraženina.

Amoniové soli a soli těkavých bází

Asi 20 mg zkoušené látky se rozpustí ve 2 ml vody R nebo se použijí 2 ml předepsaného roztoku. Přidají se 2 ml hydroxidu sodného zředěného RS. Zahříváním se z roztoku uvolňují páry, které mohou být identifikovatelné svým pachem a zásaditou reakcí (2.2.4).

Antimon

Asi 10 mg zkoušené látky se rozpustí mírným zahříváním v 10 ml roztoku obsahujícího 0,5 g vínanu draselno-sodného R a nechá se ochladit. K 2 ml tohoto roztoku nebo ke 2 ml předepsaného roztoku se po kapkách přidá sulfid sodný RS; vznikne oranžově červená sraženina rozpustná v hydroxidu sodném zředěném RS.

Arsen

5 ml předepsaného roztoku se zahřívá na vodní lázni se stejným objemem zkoumadla fosfornanového R; vznikne hnědá sraženina.

Barbituráty nesubstituované na dusíku

Asi 5 mg zkoušené látky se rozpustí ve 3 ml methanolu R, přidá se 0,1 ml roztoku obsahujícího dusičnan kobaltnatý R (100 g/l) a chlorid vápenatý R (100 g/l). Promíchá se a za protřepávání se přidá 0,1 ml hydroxidu sodného zředěného RS; vznikne fialově modré zbarvení a sraženina.

Benzoany

1. a) K 1 ml předepsaného roztoku zkoušené látky se přidá 0,5 ml chloridu železitého RS1; vznikne sytě žlutá sraženina rozpustná v etheru R.
2. b) Jestliže není předepsáno jinak, převede se 0,2 g zkoušené látky do zkumavky, navlhčí se 0,2 ml až 0,3 ml kyseliny sírové R a mírně se zahřívá spodní část zkumavky; na vnitřní straně zkumavky se usazuje bílý sublimát.
3. c) 0,5 g zkoušené látky se rozpustí v 10 ml vody R nebo se použije 10 ml předepsaného roztoku. Přidá se 0,5 ml kyseliny chlorovodíkové R; tvoří se sraženina, která po krystalizaci z vody R a vysušení ve vakuu taje při 120 °C až 124 °C (2.2.14).

Bismut

1. a) K 0,5 g zkoušené látky se přidá 10 ml kyseliny chlorovodíkové zředěné RS nebo se použije 10 ml předepsaného roztoku. Směs se zahřívá 1 min k varu, nechá se ochladit a v případě potřeby se zfiltruje. K 1 ml takto získaného roztoku se přidá 20 ml vody R; vznikne bílá nebo slabě žlutá sraženina, která po přidání 0,05 ml až 0,1 ml sulfidu sodného RS se barví hnědě.
2. b) K asi 45 mg zkoušené látky se přidá 10 ml kyseliny dusičné zředěné RS nebo se použije 10 ml předepsaného roztoku a 1 min se vaří. Nechá se ochladit a v případě potřeby se zfiltruje. K 5 ml takto získaného roztoku se přidají 2 ml roztoku thiomočoviny R (100 g/l); vznikne žlutavě oranžové zbarvení nebo oranžová sraženina. Přidají se 4 ml roztoku fluoridu sodného R (25 g/l); po dobu 30 min se roztok neodbarví.

Bromidy

1. a) Množství zkoušené látky odpovídající asi 3 mg bromidů (Br-) se rozpustí ve 2 ml vody R nebo se použijí 2 ml předepsaného roztoku. Okyselí se kyselinou dusičnou zředěnou RS, přidá se 0,4 ml dusičnanu stříbrného RS1 a po protřepání se nechá stát; vznikne tvarohovitá, světle žlutá sraženina. Po odstřeďování se sraženina rychle promyje třikrát 1 ml vody R za chránění před přímým světlem. Supernatantní tekutina nemusí být úplně čirá. Sraženina se suspenduje do 2 ml vody R a přidá se 1,5 ml amoniaku 17,5% RS; sraženina se těžce rozpouští.
2. b) Množství zkoušené látky odpovídající asi 5 mg bromidů (Br-) nebo její předepsané množství se převede do malé zkumavky. Přidá se 0,25 ml vody R, asi 75 mg oxidu olovičitého R, 0,25 ml kyseliny octové R a mírně se protřepe. Horní vnitřní část zkumavky se vysuší kouskem filtračního papíru a směs se ponechá 5 min v klidu. Špička proužku filtračního papíru vhodné velikosti se impregnuje namočením do fuchsinu RS a vloží se ihned do zkumavky. Počínaje špičkou vznikne do 10 s fialové zbarvení dobře rozlišitelné od červeného zbarvení fuchsinu, které může být viditelné na horní části papírového proužku.

Citronany

Množství zkoušené látky obsahující asi 50 mg kyseliny citrónové se rozpustí v 5 ml vody A nebo se použije 5 ml předepsaného roztoku. Přidá se 0,5 ml kyseliny sírové R a 1 ml manganistanu draselného RS a zahřívá se tak dlouho, dokud barva manganistanu draselného nezmizí. Přidá se 0,5 ml roztoku nitroprussidu sodného R (100 g/l) v kyselině sírové zředěné RS a 4 g kyseliny amidosírové R. Alkalizuje se po kapkách amoniakem 26% R tak dlouho, až se kyselina amidosírová rozpustí. Přidá se nadbytek amoniaku; vzniká fialové zbarvení, které se mění na fialově modré.

Draslík

1. a) 0,1 g zkoušené látky se rozpustí ve 2 ml vody R nebo se použijí 2 ml předepsaného roztoku. Přidá se 1 ml uhličitanu sodného RS a zahřívá se. Ani po zahřátí, ani po přidání 0,05 ml sulfidu sodného RS k ještě horkému roztoku nevznikne sraženina. Po ochlazení v ledové vodě se přidají 2 ml roztoku kyseliny vinné R (150 g/l) a nechá se stát; vznikne bílá krystalická sraženina.
2. b) 40 mg zkoušené látky se rozpustí v 1 ml vody R nebo se použije 1 ml předepsaného roztoku. Přidá se 1 ml kyseliny octové zředěné RS a 1 ml čerstvě připraveného roztoku hexanitrokobaltitanu sodného R (100 g/l); ihned vzniká žlutá nebo oranžově žlutá sraženina.

Dusičnany

Ke směsi 0,1 ml nitrobenzenu R a 0,2 ml kyseliny sírové R se přidá množství zkoušené upráškované látky odpovídající asi 1 mg dusičnanů (NO₃^-) nebo její předepsané množství. Po 5minutovém stání se ochladí ledovou vodou a pomalu, za neustálého míchání se přidá 5 ml vody R, potom 5 ml hydroxidu sodného koncentrovaného RS. Po přidání 5 ml acetonu R se protřepe a nechá stát; horní vrstva se zbarví tmavě fialově.

Estery

K asi 30 mg zkoušené látky nebo k jejímu předepsanému množství se přidá 0,5 ml roztoku hydroxylamoniumchloridu R (70 g/l) v methanolu R a 0,5 ml roztoku hydroxidu draselného R (100 g/l) v lihu 96% R. Zahřívá se k varu, po ochlazení se okyselí kyselinou chlorovodíkovou zředěnou RS a přidá se 0,2 ml desetkrát zředěného chloridu železitého RS1; vznikne modravě červené nebo červené zbarvení.

Fosforečnany (orthofosforečnany)

1. a) 5 ml předepsaného roztoku se v případě potřeby neutralizuje a přidá se 5 ml dusičnanu stříbrného RS1; vznikne žlutá sraženina, jejíž barva se varem nezmění. Sraženina se rozpustí po přidání amoniaku 17,5% R.
2. b) 1,0 ml předepsaného roztoku se smíchá s 2 ml zkoumadla molybdenan-vanadičného R; vzniká žluté zbarvení.

Hliník

Asi 15 mg zkoušené látky se rozpustí ve 2 ml vody R nebo se použijí 2 ml předepsaného roztoku. Přidá se asi 0,5 ml kyseliny chlorovodíkové zředěné RS a asi 0,5 ml zkoumadla thioacetamidového R; sraženina nevznikne. Potom se přidává po kapkách hydroxid sodný zředěný RS; tvoří se bílá gelovitá sraženina, která se dalším přidáváním hydroxidu sodného zředěného RS rozpouští. Postupně se přidává chlorid amonný RS; znovu se tvoří bílá gelovitá sraženina.

Hořčík

Asi 15 mg zkoušené látky se rozpustí ve 2 ml vody R nebo se použijí 2 ml předepsaného roztoku a přidá se 1 ml amoniaku zředěného RS1. Tvoří se bílá sraženina, která se rozpustí po přidání 1 ml chloridu amonného RS. Přidá se 1 ml hydrogenfosforečnanu sodného RS; tvoří se bílá krystalická sraženina.

Chloridy

1. a) Zkoušená látka obsahující asi 2 mg chloridů (Cl ^-) se rozpustí ve 2 ml vody R nebo se použijí 2 ml předepsaného roztoku a okyselí se kyselinou dusičnou zředěnou RS. Přidá se 0,4 ml dusičnanu stříbrného RS1, protřepe se a nechá stát; vylučuje se tvarohovitá bílá sraženina. Odstřeďuje se a sraženina se rychle promyje třikrát 1 ml vody R za chránění před přímým světlem. Supenatantní tekutina nemusí být úplně čirá. Sraženina se suspenduje ve 2 ml vody R a přidá se 1,5 ml amoniaku 17,5% RS; sraženina se velmi snadno rozpustí, kromě velkých částic, které se rozpouštějí pomaleji.
2. b) Ke zkoušené látce obsahující asi 15 mg chloridů (Cl ^-) nebo k jejímu předepsanému množství se přidá do zkumavky 0,2 g dichromanu draselného R a 1 ml kyseliny sírové R. Proužek filtračního papíru impregnovaný 0,1 ml difenylkarbazidu RS se barví nad otevřenou zkumavkou fialově červeně. Impregnovaný papír nesmí přijít do styku s dichromanem draselným.

Jodidy

1. a) Množství zkoušené látky obsahující asi 4 mg jodidů (I^-) se rozpustí ve 2 ml vody R nebo se použijí 2 ml předepsaného roztoku, okyselí se kyselinou dusičnou zředěnou RS, přidá se 0,4 ml dusičnanu stříbrného RS1, protřepe se a nechá stát. Vznikne tvarohovitá, světle žlutá sraženina. Odstřeďuje se, sraženina se rychle promyje třikrát 1 ml vody R za chránění před přímým světlem. Supernatantní tekutina nemusí být úplně čirá. Sraženina se suspenduje ve 2 ml vody R, přidá se 1,5 ml amoniaku 17,5% RS; sraženina se nerozpustí.
2. b) K 0,2 ml roztoku zkoušené látky obsahující asi 5 mg jodidů (I ^-) v 1 ml nebo k 0,2 ml předepsaného roztoku se přidá 0,5 ml kyseliny sírové zředěné RS, 0,1 ml dichromanu draselného RS, 2 ml vody R a 2 ml chloroformu R. Několik sekund se třepe, potom se nechá stát; chloroformová vrstva se barví fialově nebo fialově červeně.

Křemičitany

Předepsané množství zkoušené látky se v olověném nebo platinovém kelímku pomocí měděného drátku smíchá s asi 10 mg fluoridu sodného R a s několika kapkami kyseliny sírové R na řídkou kaši. Přikryje se průhlednou plastovou deskou, na jejíž spodní straně visí kapka vody R. Mírně se zahřívá a za krátký čas se vytvoří kolem kapky vody R bílý prstenec.

Mléčnany

Množství zkoušené látky obsahující asi 5 mg kyseliny mléčné se rozpustí v 5 ml vody R nebo se použije 5 ml předepsaného roztoku, přidá se 1 ml bromové vody R a 0,5 ml kyseliny sírové zředěné RS. Zahřívá se na vodní lázni do odbarvení a opatrně se míchá skleněnou tyčinkou. Přidají se 4 g síranu amonného R a promíchá se. Po kapkách a bez míchání se přidá 0,2 ml roztoku nitroprussidu sodného R (100 g/l) v kyselině sírové zředěné RS, potom se bez míchání přidá 1 ml amoniaku 26% RS a nechá se 30 min stát; na rozhraní dvou kapalin se objeví tmavozelený prstenec.

Octany

1. a) Zkoušená látka se zahřívá se stejným množstvím kyseliny šťavelové R. Uvolňují se páry s charakteristickým pachem kyseliny octové, které dávají kyselou reakci (2.2.4).
2. b) Asi 30 mg zkoušené látky se rozpustí ve 3 ml vody R nebo se použijí 3 ml předepsaného roztoku. Přidá se postupně 0,25 ml dusičnanu lanthanitého RS, 0,1 ml jodu 0,1 mol/l RS, 0,05 ml amoniaku zředěného RS2 a zahřívá se opatrně k varu; během několika minut vznikne modrá sraženina nebo tmavě modré zbarvení.

Olovo

1. a) 0,1 g zkoušené látky se rozpustí v 1 ml kyseliny octové R nebo se použije 1 ml předepsaného roztoku a přidají se 2 ml chromanu draselného RS; tvoří se žlutá sraženina, která se rozpustí po přidání 2 ml hydroxidu sodného koncentrovaného RS.
2. b) 50 mg zkoušené látky se rozpustí v 1 ml kyseliny octové R nebo se použije 1 ml předepsaného roztoku, přidá se 10 ml vody R a 0,2 ml jodidu draselného RS; tvoří se žlutá sraženina, která se zahříváním k varu po dobu 1 min až 2 min rozpustí. Po ochlazení se sraženina tvoří znovu v podobě lesklých žlutých destiček.

Rtuť

1. a) 0,1 ml roztoku zkoušené látky se kápne na oškrabaný, lesklý měděný plíšek. Tvoří se tmavě šedá skvrna, která třením zjasní. Plíšek se vysuší a zahřívá ve zkumavce; skvrna zmizí.
2. b) K předepsanému roztoku se přidá hydroxid sodný zředěný RS do silně alkalické reakce (2.2.4); tvoří se hustá žlutá sraženina (soli rtuťnaté).

Salicylany

1. a) K 1 ml předepsaného roztoku se přidá 0,5 ml chloridu železitého RS1; vznikne fialové zbarvení, které se přidáním 0,1 ml kyseliny octové R nezmění.
2. b) 0,5 g zkoušené látky se rozpustí v 10 ml vody R nebo se použije 10 ml předepsaného roztoku a přidá se 0,5 ml kyseliny chlorovodíkové R. Vzniklá sraženina po překrystalizování z horké vody R a vysušení ve vakuu taje při 156 °C až 161 °C (2.2.14).

Sírany

1. a) Asi 45 mg zkoušené látky se rozpustí v 5 ml vody R nebo se použije 5 ml předepsaného roztoku. Přidá se 1 ml kyseliny chlorovodíkové zředěné RS a 1 ml chloridu barnatého RS1; vznikne bílá sraženina.
2. b) K suspenzi získané zkouškou a) se přidá 0,05 ml jodu 0,1 mol/l RS. Suspenze zůstává žlutá (rozdíl od siřičitanů a hydrogensiřičitanů), ale odbarvuje se, jestliže se po kapkách přidává chlorid cínatý RS (rozdíl od jodičnanů). Směs se povaří; barevná sraženina nevzniká (rozdíl od selenanů a wolframanů).

Sodík

1. a) Asi 0,1 g zkoušené látky se rozpustí ve 2 ml vody R nebo se použijí 2 ml předepsaného roztoku. Přidají se 2 ml roztoku uhličitanu draselného R (150 g/l) a zahřívá se k varu. Sraženina se netvoří. Přidají se 4 ml hexahydroxoantimoničnanu draselného RS a zahřívá se k varu. Ochladí se v ledové vodě a dle potřeby se tře vnitřní stěna zkumavky tyčinkou; tvoří se hustá bílá sraženina.
2. b) Množství zkoušené látky obsahující asi 2 mg sodíku (Na ⁺) se rozpustí v 0,5 ml vody R nebo se použije 0,5 ml předepsaného roztoku, přidá se 1,5 ml zkoumadla methoxyfenyloctového R a 30 min se chladí v ledové vodě. Tvoří se objemná bílá krystalická sraženina, která se nerozpustí ve vodě R při 20 °C ani po pětiminutovém míchání. Přidá se 1,0 ml amoniaku zředěného RS1; sraženina se rozpustí a ani po přidání 1 ml uhličitanu amonného RS znovu nevznikne.

Stříbro

Asi 10 mg zkoušené látky se rozpustí v 10 ml vody R nebo se použije 10 ml předepsaného roztoku a přidá se 0,3 ml kyseliny chlorovodíkové RS; vzniká tvarohovitá bílá sraženina, která se rozpustí po přidání 3 ml amoniaku zředěného RS1.

Uhličitany a kyselé uhličitany

K suspenzi 0,1 g zkoušené látky ve 2 ml vody R nebo k 2 ml předepsaného roztoku se přidají 3 ml kyseliny octové zředěné RS. Zkumavka se rychle uzavře provrtanou zátkou, ve které je skleněná trubička ohnutá dvakrát do pravého úhlu. Roztok šumí, vyvíjí se plyn bez barvy a pachu. Po mírném nahřátí se plyn zavádí do 5 ml hydroxidu barnatého RS; tvoří se bílá sraženina, která se rozpouští po přidání nadbytku kyseliny chlorovodíkové RS.

Vápník

1. a) K 0,2 ml neutrálního roztoku zkoušené látky obsahujícího asi 0,2 mg vápníku (Ca²⁺) v 1 ml nebo k 0,2 ml předepsaného roztoku se přidá 0,5 ml glyoxalbishydroxyanilu R (2 g/l) v lihu 96% R, 0,2 ml hydroxidu sodného zředěného RS a 0,2 ml uhličitanu sodného RS. Protřepe se s 1 ml až 2 ml chloroformu R a přidá se 1 ml až 2 ml vody R; chloroformová vrstva se zbarví červeně.
2. b) Asi 20 mg zkoušené látky nebo její předepsané množství se rozpustí v 5 ml kyseliny octové R a přidá se 0,5 ml hexakyanoželeznatanu draselného RS; roztok zůstane čirý. Po přidání asi 50 mg chloridu amonného R vzniká bílá krystalická sraženina.

Vínany

1. a) Asi 15 mg zkoušené látky se rozpustí v 5 ml vody R nebo se použije 5 ml předepsaného roztoku. Přidá se 0,05 ml roztoku síranu železnatého R (10 g/l) a 0,05 ml peroxidu vodíku RS; vznikne nestálé žluté zabarvení. Po vymizení zabarvení se po kapkách přidává hydroxid sodný zředěný RS; vznikne intenzivní modré zbarvení.
2. b) K 0,1 ml roztoku zkoušené látky obsahujícího asi 15 mg kyseliny vinné v 1 ml nebo k 0,1 ml předepsaného roztoku se přidá 0,1 ml roztoku bromidu draselného R (100 g/l), 0,10 ml roztoku resorcinolu R (20 g/l) a 3 ml kyseliny sírové R. Zahřívá se na vodní lázni 5 min až 10 min; vznikne tmavě modré zbarvení. Nechá se ochladit a roztok se naleje do vody R; zbarvení se změní na červené.

Xanthiny

K několika mg zkoušené látky nebo k jejímu předepsanému množství se přidá 0,1 ml peroxidu vodíku koncentrovaného R a 0,3 ml kyseliny chlorovodíkové zředěné RS. Odpařuje se na vodní lázni do sucha, až se objeví žlutavě červený zbytek. Přidá se 0,1 ml amoniaku zředěného RS2; zbarvení zbytku se změní na fialově červené.

Zinek

0,1 g zkoušené látky se rozpustí v 5 ml vody R nebo se použije 5 ml předepsaného roztoku. Přidá se 0,2 ml hydroxidu sodného koncentrovaného RS; vznikne bílá sraženina, která se po přidání dalších 2 ml hydroxidu sodného koncentrovaného RS rozpustí. Přidá se 10 ml chloridu amonného RS; roztok zůstává čirý. Přidá se 0,1 ml sulfidu sodného RS; tvoří se vločkovitá bílá sraženina.

Železo

1. a) Množství zkoušené látky obsahující asi 10 mg železa (Fe²⁺) se rozpustí vl ml vody R nebo se použije 1 ml předepsaného roztoku. Přidá se 1 ml roztoku hexakyanoželezitanu draselného RS; tvoří se modrá sraženina, která se nerozpouští v kyselině chlorovodíkové zředěné RS.
2. b) Množství zkoušené látky obsahující asi 1 mg železa (Fe³⁺) se rozpustí ve 30 ml vody R. Ke 3 ml tohoto roztoku nebo ke 3 ml předepsaného roztoku se přidá 1 ml kyseliny chlorovodíkové zředěné RS a 1 ml thiokyanatanu draselného RS; roztok se zbarví červeně. Z roztoku se oddělí dvě části, každá obsahuje 1 ml. K první části takto získaného roztoku se přidá 5 ml isoamylalkoholu R nebo etheru R, protřepe se a nechá se stát; organická vrstva se zbarví růžově. K druhé části roztoku se přidají 2 ml chloridu rtuťnatého RS; červené zbarvení zmizí.
3. c) Množství zkoušené látky obsahující nejméně 1 mg železa (Fe³⁺) se rozpustí v 1 ml vody R nebo se použije 1 ml předepsaného roztoku. Přidá se 1 ml hexakyanoželeznatanu draselného RS; tvoří se modrá sraženina, která se přidáním 5 ml kyseliny chlorovodíkové zředěné RS nerozpouští.

Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití vhodného oktadecylsilanizovaného silikagelu pro vysokoúčinnou tenkovrstvou chromatografii.

Zkoušený roztok. Není-li předepsáno jinak, rozpustí se asi 20 mg (1 kapka) mastného oleje ve 3 ml dichlormethanu R.

Porovnávací roztok. Rozpustí se asi 20 mg (1 kapka) oleje kukuřičného R ve 3 ml dichlormethanu R.

Na vrstvu se nanese po 1 μl každého roztoku a vyvíjí se dvakrát etherem R po dráze 0,5 cm. Pak se vyvíjí dvakrát směsí objemových dílů dichlormethanu R, kyseliny octové ledové R a acetonu R (20 + 40 + 50) po dráze 8 cm. Vrstva se vysuší volně na vzduchu, postříká se roztokem kyseliny fosfomolybdenové R (100 g/l) v lihu 96% R, zahřívá se 3 min při 120 °C a pozoruje se v denním světle.

Na chromatogramu jsou charakteristické skvrny odpovídající obrázku 2.3.2-1.

Obr. 2.3.2-1 Charakteristické chromatogramy k určení totožnosti mastných olejů

Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití vrstvy křemeliny G R impregnované následovně.

Deska s vrstvou se postaví v uzavřené chromatografické komoře do potřebného množství směsi obsahující fenoxyethanol R 10 % (V/V) a makrogol 300 R (50 g/l) v acetonu R tak, aby vrstva byla ponořena asi 5 mm pod povrch směsi. Když impregnační směs dosáhne nejméně 17 cm od spodního okraje vrstvy, deska s vrstvou se vyjme a ihned se použije. Vyvíjení chromatogramů při zkoušce se provede ve stejném směru jako impregnace.

Zkoušený roztok. 20 mg zkoušené látky se rozpustí v chloroformu R a zředí se jím na 10 ml. Porovnávací roztok. 20 mg odpovídající referenční látky (CRL) se rozpustí v chloroformu R a zředí se jím na 10 ml.

Na vrstvu se nanesou 2 μl každého roztoku a vyvíjí se ve tmě po dráze 15 cm směsí objemových dílů etheru petrolejového R a diethylaminu R (50 +1) nasycenou fenoxyethanolem R (tj. 3 ml až 4 ml fenoxyethanolu R se přidají k výše uvedené směsi rozpouštědel, protřepe se a po oddělení se použije horní vrstva, i když je zakalená). Po vyjmutí z komory se vrstva vystaví na několik minut působení ultrafialového světla při 365 nm a potom se hodnotí.

Skvrna na chromatogramů zkoušeného roztoku se shoduje polohou, fluorescencí a velikostí se skvrnou na chromatogramů porovnávacího roztoku. Vrstva se postříká roztokem kyseliny sírové R 10% (V/V) v lihu 96% R. Skvrna na chromatogramů zkoušeného roztoku se shoduje zbarvením se skvrnou na chromatogramů porovnávacího roztoku. Zbarvení skvrn je stálé po dobu nejméně 20 min.

0,5 g až 2,0 g zkoušené látky se rozetřou v tenké vrstvě na hodinové sklíčko o průměru 6 cm až 8 cm. Po 15 min se určí pach nebo se ověří jeho nepřítomnost.

Jestliže není předepsáno jinak, použije se metoda A.

Metoda A

Předepsané množství zkoušené látky se ve zkumavce rozpustí ve 14 ml vody R, je-li potřeba, upraví se pH roztoku do alkalické reakce přidáním hydroxidu sodného zředěného RS a zředí se vodou R na 15 ml. K roztoku se přidá 0,3 ml tetrajodortuťnatanu draselného zásaditého RS. Současně se připraví porovnávací roztok za použití 10 ml základního roztoku amonia (1 μg NH₄/ml), 5 ml vody R a 0,3 ml tetrajodortuťnatanu draselného zásaditého RS. Zkumavky se uzavřou.

Po 5 min se zkoušený roztok nezbarví intenzivněji žlutě než současně připravený porovnávací roztok.

Metoda B

Předepsané množství jemně upráškované zkoušené látky se ve vhodné 25ml skleněné nádobce s polyethylenovým uzávěrem rozpustí nebo suspenduje v 1 ml vody R a přidá se 0,30 g oxidu hořečnatého těžkého R. Pod uzávěr se umístí papír se síranem manganatým a dusičnanem stříbrným R velikosti 5 mm² navlhčený několika kapkami vody R a ihned se uzavře. Opatrně se promíchá krouživým pohybem tak, aby tekutina nevystříkla, a nechá se 30 min stát při 40 °C.

Jestliže se papír se síranem manganatým a dusičnanem stříbrným R zbarví šedě, není toto zbarvení intenzivnější než zbarvení papíru se síranem manganatým a dusičnanem stříbrným R u porovnávacího roztoku připraveného současně stejným způsobem za použití předepsaného objemu základního roztoku amonia (1 μg NH₄/ml), 1 ml vody R a 0,30 g oxidu hořečnatého těžkého R.

Metoda A

Přístroj na stanovení arsenu, viz obr. 2.4.2-1, se skládá ze 100ml kuželové baňky se zabroušenou skleněnou zátkou, kterou prochází skleněná trubice délky 200 mm a vnitřního průměru 5 mm. Spodní část této trubice je zúžena na vnitřní průměr 1,0 mm a 15 mm od jejího konce je otvor, který je umístěn nejméně 3 mm pod spodním okrajem zátky a má průměr 2 mm až 3 mm. Horní část této trubice je zakončena dokonale rovnou plochou kolmou k ose. K této části je přiložena 30 mm dlouhá skleněná trubice o stejném průměru a se stejně upraveným zakončením. Obě části jsou k sobě přitisknuty pomocí dvou spirálových pružin. Ve spodní trubici je vloženo 50 mg až 60 mg vaty s octanem olovnatým R nebo 50 mg až 60 mg stočeného proužku papíru s octanem olovnatým R, který je umístěn na malé vatové zátce. Do prostoru mezi skleněnými trubicemi se vloží kolečko nebo čtvereček papíru s bromidem rtuťnatým R tak, aby byl zakryt otvor trubice (15 mm x 15 mm).

Předepsané množství zkoušené látky se v kuželové baňce rozpustí ve 25 ml vody R nebo se předepsané množství roztoku zředí vodou R na 25 ml. Přidá se 15 ml kyseliny chlorovodíkové R 0,1 ml chloridu cínatého RS a 5 ml jodidu draselného RS. Po 15min stání se přidá 5 g zinku aktivovaného R, ihned se spojí obě části přístroje a kuželová baňka se ponoří do vodní lázně o teplotě, která umožňuje udržovat stejnoměrný vývoj plynu.

Stejným způsobem se připraví porovnávací roztok za použití 1 ml základního roztoku arsenu (1 ug As/ml) zředěného vodou R na 25 ml.

Nejdříve po dvou hodinách se porovnají skvrny zkoušeného roztoku a porovnávacího roztoku vzniklé na papíru s bromidem rtuťnatým R. Skvrna zkoušeného roztoku není intenzivněji zbarvena než skvrna porovnávacího roztoku.

Metoda B

Do zkumavky se 4 ml kyseliny chlorovodíkové R a asi 5 mg jodidu draselného R se přidá předepsané množství zkoušené látky a 3 ml zkoumadla fosfornanového R. Směs se zahřívá 15 min na vodní lázni za občasného protřepání. Stejným způsobem se připraví porovnávací roztok za použití 0,5 ml základního roztoku arsenu (10 μg As/ml).

Po zahřátí na vodní lázni není zbarvení zkoušeného roztoku intenzivnější než zbarvení porovnávacího roztoku.

Obr. 2.4.2-1 Přístroj pro limitní zkoušku A na arsen

Rozměry v milimetrech

Všechny roztoky použité v této zkoušce se připravují z vody destilované R.

K 0,2 ml základního roztoku vápníku (100 μg Ca/ml) v lihu se přidá 1 ml šťavelanu amonného RS. Po 1 min se přidá směs 1 ml kyseliny octové zředěné RS a 15 ml roztoku obsahujícího předepsané množství zkoušené látky a protřepe se.

Současně se stejným způsobem připraví porovnávací roztok za použití směsi 10 ml základního roztoku vápníku (10 μg Ca/ml), 1 ml kyseliny octové zředěné RS a 5 ml vody destilované R.

Po 15 min se zkoušený roztok nezakalí intenzivněji než porovnávací roztok.

K 15 ml zkoušeného roztoku se přidá 1 ml kyseliny dusičné zředěné RS a směs se najednou přelije do zkumavky obsahující 1 ml dusičnanu stříbrného RS2.

Stejným způsobem se připraví porovnávací roztok za použití 10 ml základního roztoku chloridů (5 μg Cl/ml) a 5 ml vody R. Roztoky se nechají stát za chránění před světlem.

Po 5 min zkoušený roztok neopalizuje nebo se nezakalí intenzivněji než porovnávací roztok. Opalescence nebo zákal se pozoruje ze strany proti černému matnému pozadí.

Do vnitřní zkumavky přístroje na stanovení fluoridů, viz obrázek 2.4.5-1, se vpraví předepsané množství zkoušené látky, 0,1 g kyselinou promytého písku R a 20 ml směsi složené ze stejných objemových dílů kyseliny sírové R a vody R. Pak se zahřeje vnější zkumavka obsahující tetrachlorethan R k varu (146 °C) a při této teplotě se udržuje.

Obr. 2.4.5-1 Přístroj pro limitní zkoušku na fluoridy

Rozměry v milimetrech

Zahřívá se vyvíječ páry, destiluje se a destilát se zachytává ve 100ml odměrné baňce obsahující 0,3 ml hydroxidu sodného 0,1 mol/l RS a 0,1 ml fenolftaleinu RS. Během destilace se ve vnitřní zkumavce udržuje konstantní objem (20 ml) a zajistí se v případě potřeby přídavkem hydroxidu sodného 0,1 mol/l VS, aby destilát zůstal alkalický. Destilát se zředí vodou R na 100 ml (zkoušený roztok).

Stejným způsobem se připraví porovnávací roztok za použití 5 ml základního roztoku fluoridů (10 μg F/ml) místo zkoušené látky. Do dvou skleněných odměrných válců se zabroušenou skleněnou zátkou se vpraví po 20 ml zkoušeného a porovnávacího roztoku a po 5 ml zkoumadla aminomethylalizarindioctového R.

Po 20 min se zkoušený roztok nezbarví intenzivněji modře (původní zbarvení je červené) než porovnávací roztok.

K 10 ml předepsaného roztoku se přidá 0,1 g tetraboritanu sodného R. Jestliže je třeba, upraví se pH roztoku na 8,8 až 9,2 kyselinou chlorovodíkovou zředěnou RS nebo hydroxidem sodným zředěným RS. Potom se roztok převede do dělicí nálevky a vytřepává se postupně dvakrát vždy po dobu 1 min 5 ml roztoku hydroxychinolinu R (1 g/l) v chloroformu R a nechá se oddělit. Po oddělení se organická vrstva odstraní a k vodné vrstvě se přidá 0,4 ml butylaminu R a 0,1 ml triethanolaminu R. Jestliže je třeba, upraví se pH roztoku na 10,5 až 11,5, pak se přidají 4 ml roztoku hydroxychinolinu R (1 g/l) v chloroformu R, opět se vytřepává po dobu 1 min a nechá se oddělit. K hodnocení se použije spodní vrstva.

Současně se stejným způsobem připraví porovnávací roztok za použití 1 ml základního roztoku hořčíku (10 /μg Mg/ml) a 9,0 ml vody R.

Zkoušený roztok se nezbarví intenzivněji než porovnávací roztok.

Ke 200 ml vody R se přidá 0,1 g hydroxylamoniumchloridu R, 10 ml tlumivého roztoku s chloridem amonným o pH 10,0,1 ml síranu zinečnatého 0,1 mol/l VS a asi 15 mg černi eriochromové T s chloridem sodným R. Zahřeje se asi na 40 °C a titruje se edetanem disodným 0,01 mol/l VS z fialového do jasně modrého zbarvení. Pak se přidá předepsané množství zkoušené látky rozpuštěné ve 100 ml vody R nebo předepsané množství zkoušeného roztoku. Jestliže se zbarvení roztoku po přidání zkoušené látky změnilo zpět na fialové, titruje se dále edetanem disodným 0,01 mol/l VS opět do modrého zbarvení.

Spotřeba roztoku edetanu disodného 0,01 mol/l PS při druhé titraci není vyšší, než je předepsáno.

Metoda A

Ke 12 ml předepsaného vodného roztoku se přidají 2 ml tlumivého roztoku o pH 3,5 a 1,2 ml zkoumadla thioacetamidového R a směs se ihned promíchá (zkoušený roztok). Stejným způsobem se připraví porovnávací roztok za použití 10 ml základního roztoku olova (1 μg nebo 2 μg Pb/ml), jak je předepsáno, a přidají se 2 ml zkoušeného roztoku. Současně se připraví kontrolní roztok za použití 10 ml vody R a 2 ml zkoušeného roztoku. V porovnání s kontrolním roztokem vykazuje porovnávací roztok slabě hnědé zbarvení.

Po 2 min hnědé zbarvení zkoušeného roztoku není intenzivnější než zbarvení porovnávacího roztoku.

Metoda B

Zkoušená látka se rozpustí v organickém rozpouštědle obsahujícím minimální procento vody (např. dioxan obsahující 15 % vody nebo aceton obsahující 15 % vody).

Ke 12 ml předepsaného roztoku se přidají 2 ml tlumivého roztoku o pH 3,5. Promíchá se a přidá se 1,2 ml zkoumadla thioacetamidového a směs se ihned promíchá (zkoušený roztok). Stejným způsobem se připraví porovnávací roztok za použití 10 ml roztoku olova (1 μg nebo 2 μg Pb/ml), jak je předepsáno, a 2 ml zkoušeného roztoku. Roztok olova (1 μg nebo 2 μg Pb/ml) se připraví zředěním základního roztoku olova (100 μg Pb/ml) rozpouštědlem použitým pro zkoušenou látku.

Současně se připraví kontrolní roztok smícháním 10 ml použitého rozpouštědla a 2 ml zkoušeného roztoku. V porovnání s kontrolním roztokem vykazuje porovnávací roztok slabě hnědé zbarvení.

Po 2 min není hnědé zbarvení zkoušeného roztoku intenzivnější než zbarvení porovnávacího roztoku.

Metoda C

Předepsané množství zkoušené látky (nejvýše 2 g) se převede do křemenného kelímku se 4 ml roztoku síranu horečnatého R (250 g/l) v kyselině sírové zředěné RS. Směs se promíchá tenkou skleněnou tyčinkou a opatrně se zahřívá, až se směs roztaví. Jestliže je směs tekutina, šetrně se odpaří do sucha na vodní lázni. Za stoupající teploty se zahřívá a spaluje tak dlouho, až je zbytek bílý nebo pouze slabě šedý. Spalování se provádí při teplotě nepřevyšující 800 °C. Po vychladnutí se zbytek zvlhčí několika kapkami kyseliny sírové zředěné RS, odpaří se, znovu se spálí a nechá vychladnout. Doba spalování nesmí přesáhnout 2 hod. Zbytek se převede dvakrát 5 ml kyseliny chlorovodíkové zředěné RS do zkumavky. Přidá se 0,1 ml fenolftaleinu RS a amoniak 26% R do vzniku růžového zbarvení. Po ochlazení se přidá kyselina octová ledová R do odbarvení a ještě navíc 0,5 ml. Je-li potřeba, zfíltruje se a filtr se promyje. Zředí se vodou R na 20 ml. Ke 12 ml takto získaného roztoku se přidají 2 ml tlumivého roztoku o pH 3,5 a směs se promíchá. Přidá se 1,2 ml zkoumadla thioacetamidového R a ihned se promíchá (zkoušený roztok).

Současně se připraví porovnávací roztok za použití 4 ml roztoku síranu hořečnatého R (250 g/l) v kyselině sírové zředěné RS a předepsaného objemu základního roztoku olova (10 μg Pb/ml). Stejným způsobem, jako je předepsáno u zkoušeného roztoku, se spálí, rozpustí v kyselině chlorovodíkové, přidá se roztok amoniaku, kyselina octová a zředí se vodou R na 20 ml. K 10 ml tohoto roztoku se přidají 2 ml zkoušeného roztoku, 2 ml tlumivého roztoku o pH 3,5 a promíchá se. Přidá se 1,2 ml zkoumadla thioacetamidového R a ihned se promíchá.

Současně se připraví kontrolní roztok smícháním 10 ml vody R a 2 ml zkoušeného roztoku. V porovnání s kontrolním roztokem vykazuje porovnávací roztok slabě hnědé zbarvení.

Po 2 min není hnědé zbarvení zkoušeného roztoku intenzivnější než zbarvení porovnávacího roztoku.

Metoda D

Do křemenného kelímku se naváží předepsané množství zkoušené látky a smíchá se s 0,5 g oxidu horečnatého R1. Žíhá se do slabě červeného žáru, až vznikne homogenní bílá nebo šedobílá hmota. Pokud ještě po 30 min spalování zůstává směs barevná, nechá se vychladnout, promíchá se tenkou skleněnou tyčinkou a spalování se opakuje. Je-li nutné, postup se opakuje. Dále se žíhá asi 1 h při 800 °C. Zbytek se převede dvakrát 5 ml směsi stejných objemových dílů kyseliny chlorovodíkové RS a vody R do zkumavky. Přidá se 0,1 ml fenolftaleinu R a roztok amoniaku 26% R do růžového zbarvení. Po ochlazení se přidá kyselina octová ledová R do odbarvení a ještě 0,5 ml navíc. Je-li potřeba, zfiltruje se a filtr se promyje. Zředí se vodou R na 20 ml. Ke 12 ml takto získaného roztoku se přidají 2 ml tlumivého roztoku o pH 3,5 a promíchá se. Přidá se 1,2 ml zkoumadla thioacetamidového R a ihned se promíchá (zkoušený roztok).

Porovnávací roztok se připraví následujícím postupem. K 0,5 g oxidu horečnatého R1 se přidá předepsané množství základního roztoku olova (10 μg Pb/ml) a vysuší se při 100 °C až 105 °C v sušárně. Stejným způsobem, jako je předepsáno u zkoušeného roztoku, se spálí, přidá se kyselina chlorovodíková, roztok amoniaku, kyselina octová a zředí se vodou R na 20 ml. K 10 ml tohoto roztoku se přidají 2 ml zkoušeného roztoku, 2 ml tlumivého roztoku o pH 3,5 a promíchá se. Přidá se 1,2 ml zkoumadla thioacetamidového R a ihned se promíchá.

Současně se připraví kontrolní roztok smícháním 10 ml vody R a 2 ml zkoušeného roztoku. V porovnání s kontrolním roztokem vykazuje porovnávací roztok slabě hnědé zbarvení.

Po 2 min není hnědé zbarvení zkoušeného roztoku intenzivnější než zbarvení porovnávacího roztoku.

Metoda E

Předepsané množství zkoušené látky se rozpustí ve 30 ml vody R nebo v jiném předepsaném objemu. Filtrační zařízení se připraví z válce 50ml injekční stříkačky bez pístu připojením k nástavci, v němž na rovné ploše je membránový filtr (rozměr pórů 3 μm) a na něm předfiltr, viz obr. 2.4.8-1A.

Zkoušeným roztokem se naplní válec injekční stříkačky, vloží se píst a jeho stlačením se všechna tekutina zfiltruje. Po otevření podložky a odejmutí předfiltru se zkontroluje membránový filtr. Je-li znečištěn, vymění se za nový a postup se opakuje stejným způsobem.

K předfiltrátu nebo k předepsanému objemu předfiltrátu se přidají 2 ml tlumivého roztoku o pH 3,5 a 1,2 ml zkoumadla thioacetamidového R. Po promíchání se nechá 10 min stát a znovu se zfiltruje stejným způsobem. Filtry při této filtraci jsou umístěny opačně, na rovné ploše předfiltr a na něm membránový filtr, viz obr. 2.4.8-1B. Filtrace se provádí pomalu a rovnoměrně mírným a stálým tlakem na píst injekční stříkačky. Po skončení filtrace se podložka otevře, membránový filtr se vyjme a usuší pomocí filtračního papíru.

Stejným způsobem se připraví porovnávací roztok za použití předepsaného objemu základního roztoku olova (1 μg Pb/ml).

Zbarvení skvrny na membránovém filtru zkoušeného roztoku není intenzivnější než zbarvení skvrny na membránovém filtru porovnávacího roztoku.

Obr. 2.4.8.-1 Zařízení pro limitní zkoušku na těžké kovy (metoda E)

Rozměry v milimetrech

1. A - předfiltrace roztoku
2. B - filtrace roztoku po přidání zkoumadel

Předepsané množství zkoušené látky se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 10 ml nebo se použije 10 ml předepsaného roztoku. Přidají se 2 ml roztoku kyseliny citronové R (200 g/l) a 0,1 ml kyseliny thioglykolové R. Promíchá se, zalkalizuje se amoniakem 17,5% RS a zředí se vodou R na 20 ml (zkoušený roztok). Současně se stejným způsobem připraví porovnávací roztok za použití 10 ml základního roztoku železa (1 μg. Fe/ml).

Po 5 min není růžové zbarvení zkoušeného roztoku intenzivnější než zbarvení porovnávacího roztoku.

Stanovení olova se provede atomovou absorpční spektrometrií (2.2.23, Metoda II).

Zkoušený roztok. 20,0 g zkoušené látky se rozpustí ve směsi stejných objemových dílů kyseliny octové zředěné RS a vody R a touto směsí se zředí na 100,0 ml. Přidají se 2,0 ml nasyceného roztoku pyrrolidinyldithiokarbamatu amonného R (asi 10 g/l) a 10,0 ml isobutylmethylketonu R a potom se 30 s třepe, přičemž se směs chrání před světlem. Po oddělení vrstev se dále použije vrstva isobutylmethylketonu.

Porovnávací roztoky. Tři porovnávací roztoky se připraví stejným způsobem jako zkoušený roztok s tím rozdílem, že se k 20,0 g zkoušené látky navíc přidá 0,5 ml, 1,0 ml a 1,5 ml základního roztoku olova (10 μg Pb/ml).

Nulová poloha přístroje se nastaví pomocí isobutylmethylketonu R, který byl připraven stejným způsobem jako zkoušený roztok bez zkoušené látky. Měří se absorbance roztoků při 283,3 nm za použití olověné lampy s dutou katodou jako zdroje záření a plamene vzduch-acetylen.

Zkoušená látka obsahuje nejvýše 0,5 μg Pb/g, není-li uvedeno jinak.

Ke 100 ml zkoušeného roztoku připraveného a v případě potřeby zneutralizovaného tak, jak je předepsáno v jednotlivých článcích, se přidají 4 ml molybdenan-kyseliny sírové RS3. Protřepe se a přidá se 0,1 ml chloridu cínatého RS1.

Současně se stejným způsobem připraví porovnávací roztok za použití 2 ml základního roztoku fosforečnanů (5 μg PO₄/ml) a 98 ml vody R. Po 10 min se hodnotí zbarvení 20 ml každého roztoku. Zbarvení zkoušeného roztoku není intenzivnější než zbarvení porovnávacího roztoku.

K 10 ml předepsaného roztoku se přidají 2 ml čerstvě připraveného roztoku tetrafenylboritanu sodného R (10 g/l).

Současně se stejným způsobem připraví porovnávací roztok za použití 5 ml základního roztoku draslíku (20 μg K/ml) a 5 ml vody R.

Po 5 min zkoušený roztok neopalizuje intenzivněji než porovnávací roztok.

Všechny roztoky použité v této zkoušce se připravují z vody destilované R.

K 1,5 ml základního roztoku síranů (10 μg SO₄/ml) (1) se přidá 1 ml roztoku chloridu barnatého R (250 g/l). Protřepe se a nechá se 1 min stát. Pak se přidá 15 ml zkoušeného roztoku a 0,5 ml kyseliny octové R. Současně se stejným způsobem připraví porovnávací roztok za použití 15 ml základního roztoku síranů (10 μg SO₄/ml) místo zkoušeného roztoku.

Po 5 min zkoušený roztok neopalizuje intenzivněji než porovnávací roztok.

Křemenný nebo platinový kelímek se žíhá 30 min do červeného žáru, nechá se vychladnout v exsikátoru a zváží se. Zkoušená látka se naváží do kelímku, přidají se 2 ml kyseliny sírové zředěné RS, zahřívá se nejdříve na vodní lázni, pak opatrně nad plamenem a potom postupně až do asi 600 °C. V zahřívání se pokračuje, až zmizí všechny černé částice. K vychladlému zbytku se přidá několik kapek kyseliny sírové zředěné RS a stejným způsobem se znovu zahřívá a spaluje. K vychladlému zbytku se přidá několik kapek uhličitanu amonného RS, odpaří se, opatrně se žíhá, nechá se vychladnout, zváží se a žíhání se opakuje po 15 min až do konstantní hmotnosti.

Stanovení niklu se provede atomovou absorpční spektrometrií (2.2.23, Metoda II).

Zkoušený roztok. 20,0 g zkoušené látky se rozpustí ve směsi stejných objemových dílů kyseliny octové zředěné RS a vody R a touto směsí se zředí na 100,0 ml. Přidají se 2,0 ml nasyceného roztoku pyrrolidinyldithiokarbamatu amonného R (asi 10 g/l) a 10,0 ml isobutylmethylketonu R a potom se 30 s třepe za chránění před světlem. Po oddělení vrstev se dále použije vrstva isobutylmethylketonu.

Porovnávací roztoky. Tři porovnávací roztoky se připraví stejným způsobem jako zkoušený roztok s tím rozdílem, že se k 20,0 g zkoušené látky navíc přidá 0,5 ml, 1,0 ml a 1,5 ml základního roztoku niklu (10 μg Ni/ml).

Nulová poloha přístroje se nastaví pomocí isobutylmethylketonu R, připraveného stejným způsobem jako zkoušený roztok bez zkoušené látky. Měří se absorbance při 232,0 nm za použití niklové lampy s dutou katodou jako zdroje záření a plamene vzduch-acetylen.

Zkoušená látka obsahuje nejvýše 1 μg Ni/g, není-li uvedeno jinak.

Křemenný nebo platinový kelímek se žíhá 30 min do červeného žáru, nechá se vychladnout v exsikátoru a zváží se. Není-li předepsáno jinak, naváží se do kelímku 1,000 g zkoušené látky nebo upráškované rostlinné drogy. Kelímek se suší 1 h při 100 °C až 105 °C a potom se žíhá do konstantní hmotnosti v muflové peci při (600 ± 25) °C. Po každém žíhání se nechá vychladnout v exsikátoru. Během zkoušky se nemá objevit plamen. Pokud ještě po opakovaném žíhání obsahuje popel černé částice, přidá se horká voda R, přefiltruje se přes bezpopelný filtrační papír a papír se zbytkem se spálí a vyžíhá. K popelu se přidá filtrát, opatrně se odpaří do sucha a vyžíhá do konstantní hmotnosti.

Stanoví se fluorimetrickou metodou (2.2.21).

Zkoušený roztok. Předepsaný roztok se v dělicí nálevce protřepe dvakrát s 20 ml a potom jednou s 10 ml roztoku hydroxychinolinu R (5 g/l) v chloroformu R. Spojené chloroformové roztoky se převedou do odměrné baňky a zředí se chloroformem R na 50,0 ml.

Porovnávací roztok. Za použití předepsaného roztoku se postupuje stejně jako u zkoušeného roztoku.

Kontrolní roztok. Za použití předepsaného roztoku se postupuje stejně jako u zkoušeného roztoku.

Měří se intenzita fluorescence (2.2.21) zkoušeného roztoku (I₁), porovnávacího roztoku (I₂)a kontrolního roztoku (I₃) za použití excitačního záření o vlnové délce 392 nm a sekundárního filtru s maximem propustnosti při 518 nm nebo s monochromátorem nastaveným na tuto vlnovou délku.

Fluorescence (I₁ - I₃) zkoušeného roztoku není větší než fluorescence (I₂ - I₃) porovnávacího roztoku.

Pokud není předepsáno jinak, použije se Metoda A. Metoda B je vhodná pro vakcíny, ke kterým byl přidán disiřičitan sodný k neutralizaci nadbytku formaldehydu.

Metoda A

1,0 ml humánní vakcíny se zředí předepsaným rozpouštědlem na 10,0 ml. 1,0 ml veterinárního bakteriálního toxoidu se zředí předepsaným rozpouštědlem na 25,0 ml (zkoušený roztok).

K 1 ml zkoušeného roztoku se přidají 4 ml vody R a 5 ml acetylacetonu RS1 a zkumavka s roztokem se ponechá 40 min ve vodní lázni při 40 °C.

Roztok není zbarven intenzivněji než porovnávací roztok připravený současně stejným způsobem za použití 1 ml zředěného formaldehydu RS obsahujícího 20 μg formaldehydu (CH₂O) v 1 ml místo zředěné vakcíny. Hodnotí se zkumavky ve směru jejich vertikální osy.

Metoda B

1,0 ml zkoušené vakcíny se zředí předepsaným rozpouštědlem na 100,0 ml. K 0,5 ml této zředěné vakcíny se přidá 5 ml roztoku methylbenzothiazolinonhydrazonhydrochloridu R (0,5 g/l) a 0,05 ml polysorbátu 80 R. Zkumavka se uzavře, protřepe a nechá stát 60 min. Po přidání 1 ml zkoumadla chlorid železitý-kyselina amidosirová R se nechá stát dalších 15 min. Potom se měří absorbance (2.2.25) zkoušeného roztoku při 628 nm proti kontrolnímu roztoku.

Absorbance zkoušeného roztoku není vyšší než absorbance porovnávacího roztoku připraveného současně a za stejných podmínek za použití 0,5 ml roztoku připraveného zředěním formaldehydu R obsahujícího 5 μg formaldehydu (CH₂O) v 1 ml.

Jestliže zkoušená vakcína je ve formě emulze, je nutno oddělit vodnou fázi následujícím způsobem:

K vakcíně se přidá stejný objemový díl isopropylmyristatu R a promíchá se. Ke 3 objemovým dílům této směsi se přidají 2 objemové díly kyseliny chlorovodíkové 1 mol/l RS, 3 objemové díly chloroformu R a 4 objemové díly roztoku chloridu sodného R (9 g/l). Směs se důkladně promíchá a odstřeďuje se 60 min při 15 000 g_n. Oddělí se vodná vrstva a změří se její objem. Tato vrstva se použije k výše popsané zkoušce na formaldehyd.

Koncentrace formaldehydu v porovnávacím roztoku se upraví podle zředění vakcíny při oddělení vodné vrstvy. Jestliže se popsaným postupem vodná vrstva neoddělí, je nutné k roztoku chloridu sodného přidat roztok polysorbátu 20 R (100 g/l) a postup opakovat s tím rozdílem, že se odstřeďuje při 22 500 g_n.

Ve zkumavce se smíchá 10 ml čerstvě předestilovaného acetonu R a 0,3 ml vody R a přidá se 0,05 ml roztoku modři bromfenolové R (0,4 g/l) v lihu 96% R. Je-li to potřebné, roztok se neutralizuje kyselinou chlorovodíkovou 0,01 mol/l RS nebo hydroxidem sodným 0,01 mol/l VS.

Potom se přidá 10 ml zkoušeného oleje, protřepe se a nechá se stát. Na změnu zbarvení horní vrstvy do žluta se spotřebuje nejvýše 0,1 ml kyseliny chlorovodíkové 0,01 mol/l VS.

Zkouší se tenkovrstvou chromatografií (2.2.27) za použití vrstvy silikagelu G R. Před použitím se desky s vrstvami suší 2 h při 130 °C.

Zkoušený roztok (a). K 20 g zkoušené látky odebrané ze středu vzorku nebo k 20 g oleje se přidá 50 ml etheru petrolejového R a vytřepává se dvakrát 30 ml roztoku methanolu R 75% (V/V).

Spodní methanolová vrstva se oddělí a spojené methanolové vrstvy se odpaří za sníženého tlaku, při co nejnižší teplotě a dle možnosti v atmosféře dusíku. Zbytek po odpaření se rozpustí v 5 ml chloroformu prostého ethanolu R. Uchovává se v dobře uzavřeném obalu.

Zkoušený roztok (b). Petroletherová vrstva získaná při přípravě zkoušeného roztoku (a) se opatrně odpaří do sucha. Přidá se 0,5 g pyrogallolu R rozpuštěného ve 100 ml ethanolu R 15 ml čerstvě připraveného roztoku hydroxidu draselného R (330 g/l) a vaří se 30 min pod zpětným chladičem. Po vychladnutí se přidá 250 ml vody R a nezmýdelnitelné látky se vytřepávají třikrát 100 ml etheru petrolejového R. Spojené petroletherové výtřepky se promývají vodou R do odstranění alkálií a odpaří se do sucha. Zbytek po odpaření se rozpustí v 5 ml chloroformu prostého ethanolu R. Uchovává se v dobře uzavřeném obalu.

1. A. Nepolyhydroxylované antioxidanty

   Deska s vrstvou se vloží do chromatografické komory a vyvíjí se chloroformem prostým ethanolu R po dráze 12 cm a potom se suší 20 min na vzduchu a 20 min v exsikátoru ve vakuu. Na takto připravenou vrstvu se nanese:

   Bod 1, viz obr. 2.4.20-1, zkoušený roztok (a) se nanese do skvrny o průměru nejvýše 5 mm. Nanášené množství je závislé na koncentraci zkoušeného roztoku, obvykle 2 μl až 10 μl.

   Body 2 a 3, viz obr. 2.4.20-1, 2 μl barevného roztoku obsahujícího po 0,1 g/l žluti dimethylové R, červeně sudanové G R a modři indofenolové R v benzenu R.

   Vyznačí se dráha 10 cm v obou směrech vyvíjení a vyvíjí se nejdříve chloroformem prostým ethanolu R. Po 10 min vysušení na vzduchu se deska s vrstvou otočí o 90° a vyvíjí se v druhém směru benzenem R. Po 5 min vysušení na vzduchu se vrstva postříká roztokem kyseliny fosfomolybdenové R (200 g/l) v ethanolu R do vzniku trvale žluté barvy. Během 2 min se začnou objevovat modré skvrny. Potom se vrstva vystaví na 5 min až 10 min parám amoniaku do odbarvení pozadí na čistě bílé. Vzniklé skvrny mají modrou, slabě fialovou nebo nazelenalou barvu.

   Chromatogram se hodnotí podle obr. 2.4.20-1. Objeví-li se modré skvrny na startu, provede se rozdělení a identifikace polyhydroxyantioxidantů (viz B).

1. B. Polyhydroxyantioxidanty

   Na vrstvu se odděleně nanese 1 μl, 2 μl, 4 μl a 6 μl zkoušeného roztoku (a) a 1 μl až 2 μl barevného roztoku. Vyvíjí se směsí objemových dílů kyseliny octové ledové R etheru petrolejového R a benzenu R (30 + 60 + 60) po dráze 13 cm. Vrstva se vysuší na vzduchu, postříká se roztokem kyseliny fosfomolybdenové R (200 g/l) v ethanolu R a pokračuje se stejně, jak je popsáno v odstavci A. Polyhydroxyantioxidanty se identifikují polohou skvrn v porovnání se skvrnami barevného roztoku na obr. 2.4.20-2.

1. C. Antioxidanty neextrahovatelné methanolem

   Provede se tenkovrstvá chromatografie na druhé vrstvě za použití zkoušeného roztoku (b). Postupuje se stejně, jak je uvedeno v odstavci A, s tím rozdílem, že se vrstva postříká roztokem dichlorchinonchlorimidu R (10 g/l) v ethanolu R. Skrvny se objeví během 15 min po postříkání. Chromatogram se hodnotí v porovnání s obr. 2.4.20-1.

   Tečkované skvrny odpovídají α-tokoferolu a butylhydroxytoluenu. Skvrny β- a γ-tokoferolu se objeví v místě odpovídajícím 2-terc.butyl-4-methoxyfenolu.

   Jestliže je butylhydroxytoluen přítomný ve velkém množství, může být detegovaný i způsobem A.

   

   Obr. 2.4.20-1 Typické chromatogramy antioxidantů (Metoda A a Metoda C).

   1. a - bod startu č. 1 + skvrna gallatů + skvrna kyseliny nordihydroquajaretové
   2. b - bod startu č. 2
   3. c - bod startu č. 3
   4. 1 - guajaková pryskyřice
   5. 2 - 3-terc.butyl-4-methoxyfenol
   6. 3 - 2-terc.butyl-4-methoxyfenol
   7. 4 - 2,2,5,7,8-pentamethyl-6-chromanol
   8. 5 - tetraethylthiuramdisulfid
   9. 6 - α-tokoferol
   10. 7 - dibutylhydroxyanisol
   11. 8 - hydroxytoluen
   12. A - žlutá
   13. B - červená
   14. C - modrá
   15. Metoda A - plná čára
   16. Metoda C - tečkovaná čára
   

   Obr. 2.4.20-2 Typické chromatogramy polyhydroxyantioxidantů (Metoda B)

   1. 1 - barevný roztok
   2. 2 - butylhydroxyanisol
   3. 3 - guajaková pryskyřice
   4. 4 - kyselina nordihydroguajaretová
   5. 5 - methylgallat
   6. 6 - ethylgallat
   7. 7 - propylgallat
   8. 8 - oktylgallat
   9. 9 - dodecylgallat
   10. A - žlutá
   11. B - červená
   12. C - modrá

Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití vrstvy křemeliny G R. Vrstva se impregnuje v chromatografické komoře vhodným množstvím směsi objemových dílů parafinu tekutého R a etheru petrolejového R (10 + 90) vyvíjením po dráze 12 cm od spodního okraje desky, přičemž hladina směsi sahá 5 mm nad spodní okraj desky. Potom se deska s vrstvou nechá volně na vzduchu do vytékání rozpouštědel, asi 5 min. Chromatogram je třeba vyvíjet ve stejném směru jako impregnace.

Příprava směsi mastných kyselin. 2 g zkoušeného oleje se zahřívají 45 min s 30 ml hydroxidu draselného 0,5 mol/l v lihu R pod zpětným chladičem. Pak se přidá 50 ml vody R, ochlazená směs se převede do dělicí nálevky a vytřepává se třikrát 50 ml etheru R. Etherová vrstva se odstraní, vodná vrstva se okyselí kyselinou chlorovodíkovou R a vytřepává se znovu třikrát 50 ml etheru R. Spojené etherové výtřepky se promyjí třikrát 10 ml vody R, promývací tekutiny se odstraní, vysuší se nad síranem sodným bezvodým R a zfiltrují se. Ether se odpaří na vodní lázni do sucha a odparek se použije k přípravě roztoku zkoušené látky. Mastné kyseliny mohou být také získány z roztoku připraveného při stanovení nezmýdelnitelných látek.

Zkoušený roztok. 40 mg směsi mastných kyselin získané výše uvedeným postupem se rozpustí ve 4 ml chloroformu R.

Porovnávací roztok. 40 mg směsi mastných kyselin získané ze směsi kukuřičného oleje R a řepkového oleje R (19 + 1) se rozpustí ve 4 ml chloroformu R.

Na vrstvu se odděleně nanese po 3 μl každého roztoku a vyvíjí se směsí objemových dílů vody R a kyseliny octové ledové R (10 + 90) po dráze 8 cm. Vrstva se suší 10 min při 110 °C. Po ochlazení, není-li předepsáno jinak, se deska s vrstvou vloží do dobře těsnící komory nasycené parami jodu R umístěného na dně komory na odpařovací misce. Po nějakém čase jsou na vrstvě patrny hnědé nebo žlutohnědé skvrny. Deska s vrstvou se vyjme z komory a nechá se několik min stát. Když hnědé zbarvení pozadí zmizí, postříká se vrstva škrobem RS. Objeví se modré skvrny, které se mohou změnit na hnědé a po postříkání vodou R se změní zpět na modré.

Na chromatogramu zkoušené látky jsou patrny skvrny o R_F asi 0,5 (kyselina olejová) a R_F asi 0,65 (kyselina linolová) odpovídající svojí polohou a zabarvením skvrnám na chromatogramu porovnávacího roztoku. U některých olejů může být na chromatogramu zkoušené látky patrna ještě skvrna s R_F asi 0,75 (kyselina linolenová). Porovnáním skvrn na chromatogramu zkoušeného roztoku se skvrnami na chromatogramu porovnávacího roztoku se ověří nepřítomnost skvrny s hodnotou R_F asi 0,25 (kyselina eruková) na chromatogramu zkoušeného roztoku.

Cizí oleje se stanoví jako methylestery mastných kyselin přítomných ve zkoušených olejích.

Tato metoda není použitelná pro oleje obsahující acylglyceroly mastných kyselin s epoxy-, hydroepoxy-, cyklopropyl- a cyklopropenylovými skupinami nebo pro oleje s velkým podílem mastných kyselin s kratším řetězcem než 8 uhlíkových atomů nebo pro oleje s vyšším číslem kyselosti než 2. Provede se plynová chromatografie (2.2.28) (náplňová kolona nebo kapilární kolona).

Zkoušený roztok. Je-li v článku předepsáno, zkoušená látka se před methylací suší. Naváží se 4,0 g zkoušeného oleje do 100ml zabroušené baňky s kulatým dnem opatřené zpětným chladičem a upravené k zavádění plynu. Přidá se 40 ml methanolu bezvodého R, 0,5 ml roztoku hydroxidu draselného R (60 g/l) v methanolu R a za míchání se pod zpětným chladičem zahřívá k varu za současného probublávání dusíkem R rychlostí asi 100 ml/min. Když je roztok čirý (asi po 10 min), pokračuje se v zahřívání ještě 5 min. Baňka se ochladí pod tekoucí vodou a obsah se převede do dělicí nálevky. Vnitřek baňky se opláchne 20 ml heptanu R, který se přidá do dělicí nálevky. Přidá se asi 40 ml vody R a opatrně se protřepe. Vytvoří-li se emulze, přidá se po kapkách heptan R nebo voda R. Po rozdělení vrstev se oddělí vodná vrstva a třepe se s dalšími 20 ml heptanu R. Obě organické vrstvy se spojí, promyjí se dvakrát 20 ml vody R, vysuší se síranem sodným bezvodým R a zfiltrují se. V případě potřeby se zmenší objem roztoku odpařením na vodní lázni v proudu dusíku R. V případě kapilární plynové chromatografie se zkoušený roztok zředí heptanem R tak, aby se získal roztok obsahující 5 g/l až 10 g/l směsi methylesterů mastných kyselin.

Porovnávací roztok (a). Podle tab. 2.4.22-1 se připraví 0,50 g směsi kalibračních látek, rozpustí se v heptanu R a zředí se jím na 50,0 ml.

Porovnávací roztok (b). 1,0 ml porovnávacího roztoku (a) se zředí heptanem R na 10,0 ml.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

1. - skleněné kolony nebo kolony z nerezové oceli délky 2 m až 3 m a vnitřního průměru 2 mm až 4 mm naplněné křemelinou pro chromatografii R (125 μm až 200 μm) impregnovanou 5 % až 15 % makrogolsukcinatu R nebo makrogoladipatu R,
2. - dusíku pro chromatografii R jako nosného plynu s průtokovou rychlostí 25 ml/min,
3. - plamenoionizačního detektoru.

Teplota kolony se udržuje na 180 °C, teplota nástřikového prostoru a detektoru na 200 °C, pokud je to nutné nebo předepsané, zvyšuje se teplota kolony rychlostí 5 °C/min ze 120 °C na 200 °C.

Tab. 2.4.22-1 Kalibrační látky^*