Český lékopis 1997

1. A. Roztok S, viz Zkoušky na čistotu, je silně alkalický (2.2.4).
2. B. Teplota tání (2.2.14): 168 °C až 174 °C.
3. C. Infračervené absorpční spektrum (2.2.24) zkoušené látky se shoduje se spektrem trometamolu CRL.
4. D. Hodnotí se chromatogramy získané při zkoušce Příbuzné látky, viz Zkoušky na čistotu. Hlavní skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku (b) se shoduje polohou, zbarvením a velikostí s hlavní skvrnou na chromatogramu porovnávacího roztoku (a).

Zkoušky na čistotu

Roztok S. 2,5 g se rozpustí ve vodě prosté oxidu uhličitého R a zředí se jí na 50 ml.

Vzhled roztoku. Roztok S je čirý (2.2.1) a bezbarvý (2.2.2, Metoda II).

Hodnota pH (2.2.3). 10,0 až 11,5; měří se čerstvě připravený roztok S.

Příbuzné látky. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití vrstvy silikagelu G R. Před nanášením roztoků se vrstva promyje methanolem R.

Zkoušený roztok (a). 0,20 g se zahřátím rozpustí v 1 ml vody R a zředí se methanolem R na 10 ml.

Zkoušený roztok (b). 1 ml zkoušeného roztoku (a) se zředí methanolem R na 10 ml.

Porovnávací roztok (a). 20 mg trometamolu CRL se rozpustí v methanolu R a zředí se jím na 10 ml.

Porovnávací roztok (b). 1 ml zkoušeného roztoku (a) se zředí methanolem R na 100 ml.

Na vrstvu se nanese odděleně po 10 μl každého roztoku. Vyvíjí se směsí objemových dílů amoniaku zředěného RS1 a 2-propanolu R (10 + 90) po dráze 10 cm. Vrstva se usuší při 100 °C až 105 °C a postříká se roztokem manganistanu draselného R (5 g/l) v roztoku uhličitanu sodného R (10 g/l). 10 min se nechá stát a potom se pozoruje v denním světle. Žádná skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku (a), kromě hlavní skvrny, není intenzivnější než skvrna na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) (1,0 %).

Chloridy (2.4.4). K 10 ml roztoku S se přidá 2,5 ml kyseliny dusičné zředěné RS a zředí se vodou R na 15 ml. Roztok vyhovuje limitní zkoušce na chloridy (100 (μg/g).

Těžké kovy (2.4.8). 2,0 g se rozpustí v 10 ml vody R. Roztok se zneutralizuje kyselinou chlorovodíkovou RS a zředí se vodou R na 20 ml. 12 ml tohoto roztoku vyhovuje limitní zkoušce A na těžké kovy (10 μg/g). Připraví se porovnávací roztok za použití základního roztoku olova (1 μg Pb/ml).

Železo (2.4.9). 1,0 g se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 10 ml. Roztok vyhovuje limitní zkoušce na železo (10 μg/g).

Ztráta sušením (2.2.32). Nejvýše 0,5 %; suší se 1,000 g v sušárně při 100 °C až 105 °C.

Síranový popel (2.4.14). Nejvýše 0,1 %, stanoví se s 1,00 g zkoušené látky.

Sterilita (2.6.1). Pokud je látka určena k výrobě parenterálních přípravků bez dalšího vhodného sterilizačního postupu, vyhovuje zkoušce na sterilitu.

Bakteriální endotoxiny (2.6.14). Pokud je látka určena k výrobě parenterálních přípravků bez dalšího vhodného postupu odstraňujícího bakteriální endotoxiny, vyhovuje zkoušce na bakteriální endotoxiny, obsahuje-li nejvýše 0,03 m.j. endotoxinu v miligramu.

Stanovení obsahu

0,100 g se rozpustí ve 20 ml vody R. Přidá se 0,2 ml červeně methylové RS a titruje se kyselinou chlorovodíkovou 0,1 mol/l VS do změny žlutého zbarvení roztoku na červené.

1 ml kyseliny chlorovodíkové 0,1 mol/l VS odpovídá 12,11 mg C₄H₁₁NO₃.

Uchovávání

V dobře uzavřených obalech.

Označování

V označení na obalu se uvede, zda je látka:

1. - sterilní,
2. - prostá bakteriálních endotoxinů.

Nečistoty

1. A. 2-nitro-2-(hydroxymethyl)-1,3-propandiol.

† Tropicamidum

Tropikamid

Vlastnosti

Bílý nebo téměř bílý krystalický prášek. Je těžce rozpustný ve vodě, snadno rozpustný v lihu 96% a v dichlormethanu.

Zkoušky totožnosti

Základní sestava zkoušek: C.

Alternativní sestava zkoušek: A, B, D a E, viz Obecné zásady (1.2).

1. A. Teplota tání (2.2.14). 95 C až 98 C.
2. B. 20,0 mg se rozpustí v kyselině chlorovodíkové 0,1 mol/l RS a zředí se jí na 50,0 ml. 2,0 ml tohoto roztoku se zředí kyselinou chlorovodíkovou 0,1 mol/l RS na 20,0 ml. Měří se absorbance tohoto roztoku (2.2.25) při 230 nm až 350 nm; roztok vykazuje absorpční maximum při 254 nm. Specifická absorbance v maximuje 170 až 190.
3. C. Infračervené absorpční spektrum (2.2.24) tablety zkoušené látky se shoduje se spektrem tablety tropikamidu CRL.
4. D. Hodnotí se chromatogramy získané ve zkoušce Příbuzné látky, viz Zkoušky na čistotu. Hlavní skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku (b) se polohou a velikostí shoduje s hlavní skvrnou na chromatogramu porovnávacího roztoku (a).
5. E. Asi 5 mg se rozpustí ve 3 ml směsi obsahující 9 ml acetanhydridu R, 1 ml kyseliny octové R a 0,1 g kyseliny citrónové R a zahřívá se 5 min až 10 min na vodní lázni; vznikne červenožluté zbarvení.

Zkoušky na čistotu

Vzhled roztoku. 0,1 g se rozpustí v lihu 96% R a zředí se jím na 10 ml. Roztok je čirý (2.2.1) a bezbarvý (2.2.2, Metoda II).

Optická otáčivost (2.2.7). -0,1 až +0,1; měří se roztok připravený rozpuštěním 2,5 g v ethanolu R a zředěním stejným rozpouštědlem na 25,0 ml.

Příbuzné látky. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití vrstvy vhodného silikagelu s fluorescenčním indikátorem pro detekci při 254 nm.

Zkoušený roztok (a). 0,10 g se rozpustí v dichlormethanu R a zředí se jím na 5 ml.

Zkoušený roztok (b). 1 ml zkoušeného roztoku (a) se zředí dichlormethanem R na 20 ml.

Porovnávací roztok (a). 10 mg tropikamidu CRL se rozpustí v dichlormethanu R a zředí se jím na 10 ml.

Porovnávací roztok (b). 1 ml zkoušeného roztoku (b) se zředí dichlormethanem R na 10 ml.

Porovnávací roztok (c). 2 ml porovnávacího roztoku (b) se zředí dichlormethanem R na 5 ml.

Porovnávací roztok (d). 20 mg (4-pyridylmethyl)ethylaminu R se rozpustí v dichlormethanu R a zředí se jím na 20 ml. 1 ml tohoto roztoku a 1 ml porovnávacího roztoku (a) se zředí dichlormethanem R na 10 ml.

Na vrstvu se nanese odděleně po 10 μl každého roztoku a vyvíjí se směsí objemových dílů amoniaku 26% R, methanolu R a dichlormethanu R (0,5 + 5 + 95) po dráze 15 cm. Vrstva se usuší na vzduchu a pozoruje se v ultrafialovém světle při 254 nm. Na chromatogramu zkoušeného roztoku (a) žádná skvrna, kromě hlavní skvrny, není intenzivnější než skvrna na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) (0,5 %) a nejvýše jedna taková skvrna je intenzivnější než skvrna na chromatogramu porovnávacího roztoku (c) (0,2 %). Zkoušku lze hodnotit, jestliže na chromatogramu porovnávacího roztoku (d) jsou dvě zřetelně oddělené skvrny.

Kyselina tropová. K 10,0 mg se přidá 5 mg tetraboritanu sodného R a 0,35 ml čerstvě připraveného roztoku dimethylaminobenzaldehydu R (100 g/l) ve směsi objemových dílů vody R a kyseliny sírové R (1 + 9). Zahřívá se 3 min na vodní lázni, pak se ochladí v ledové lázni a přidá se 5 ml acetanhydridu R; nevzniká fialovočervené zbarvení (0,05 %).

Chloridy. (2.4.4). 1,0 g se zahřátím rozpustí v 8 ml kyseliny octové R, ochladí se a zředí se stejnou kyselinou na 10 ml. 5 ml tohoto roztoku se zředí vodou R na 15 ml. Tento roztok vyhovuje limitní zkoušce na chloridy (100 μg/g).

Ztráta sušením (2.2.32). Nejvýše 0,5 %; 1,000 g se suší 4 h v sušárně při 80 °C a při tlaku nepřevyšujícím 0,7 kPa.

Síranový popel (2.2.14). Nejvýše 0,1 %; stanoví se s 1,00 g zkoušené látky.

Stanovení obsahu

0,200 g se rozpustí v 50 ml kyseliny octové ledové R, přidá se 0,2 ml naftolbenzeinu RS a titruje se kyselinou chloristou 0,1 mol/l VS do změny oranžového zbarvení na zelené.

1 ml kyseliny chloristé 0,1 mol/l VS odpovídá 28,44 mg C₁₇H₂₀N₂O₂.

Uchovávání

V dobře uzavřených obalech, chráněn před světlem.

Separandum.

Nečistoty

1. A. (4-pyridylmethyl)ethylamin,

1. B. N-ethyl-2-fenyl-N-(4-pyridylmethyl)-2-propenamid,

1. C. kyselina (RS)-2-fenyl-3-hydroxypropionová(kyselina tropová).

Troxerutinum

Troxerutin

Vlastnosti

Žlutý slabě hygroskopický prášek. Je snadno rozpustný ve vodě, těžce rozpustný v methanolu a v lihu 96 %, prakticky nerozpustný v ethylacetatu.

Zkoušky totožnosti

1. A. Hodnotí se chromatogramy získané ve zkoušce Deriváty hydroxyethyletheru rutinu a příbuzné látky, viz Zkoušky na čistotu. Na chromatogramu zkoušeného roztoku retenční čas a velikost hlavního píku odpovídají retenčnímu času a velikosti hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku.
2. B. Asi 0,1 g se rozpustí ve 2 ml vody R, zředí se jí na 20 ml a přidají se 2 ml roztoku chloridu železitého R (0,5 g/l); roztok se zbarví červenohnědě. K 10 ml tohoto roztoku se přidá 0,2 ml roztoku hydroxidu sodného R (150 g/l); zbarvení roztoku se změní na oranžově žluté. Přidá se 1 ml kyseliny chlorovodíkové RS; zbarvení roztoku se změní na zelenožluté.
3. C. Asi 50 mg se rozpustí v 10 ml methanolu R, přidá se 1 ml kyseliny chlorovodíkové R a 0,2 g zinku R práškovaného; vznikne fialově červené zbarvení.

Zkoušky na čistotu

Hodnota pH (2.2.4) 6,0 až 7,2; měří se roztok zkoušené látky (50 g/l) ve vodě prosté oxidu uhličitého R.

Deriváty hydroxyethyletheru rutinu a příbuzné látky. Stanoví se kapalinovou chromatografií (2.2.29).

Zkoušený roztok. 0,25 g se rozpustí v mobilní fázi a zředí se jí na 50,0 ml. 1 ml roztoku se zředí mobilní fází na 10,0 ml.

Porovnávací roztok. 0,25 g troxerutinu CRL se rozpustí v mobilní fázi a zředí se jí na 50,0 ml. 1 ml roztoku se zředí mobilní fází na 10,0 ml.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

1. - ocelové nerezové kolony délky 0,25 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné silikagelem oktadecylsilanizovaným pro chromatografií R (např. Inertsil nebo Hyperosil ODS 5 μm),
2. - mobilní fáze, která je směsí objemových dílů acetonitrilu R a dihydrogenfosforečnanu sodného 0,01 mol/l RS, jehož pH bylo upraveno na hodnotu 7 hydroxidem sodným 1 mol/l RS, (13 + 87) s průtokovou rychlostí 1,5 ml/min,
3. - spektrofotometrického detektoru, 210 nm.

Teplota kolony se udržuje na 60 °C. Nastříkne se 20 μl porovnávacího roztoku a chromatogram se zaznamenává po dobu nejméně 80 min. Na chromatogramu porovnávacího roztoku při dodržení předepsaných podmínek je hlavní pík odpovídající 7,3´,4´-tris[O-(2-hydroxyethyl)]rutinu s retenčním časem asi 30 min a vedlejší píky, viz obrázek 1, z nichž pík odpovídající 5,7,3´,4´-tetrakis[O-(2-hydroxyethyl)]rutinu má relativní retenční čas vztažený k hlavnímu píku asi 0,50 a pík odpovídající 7,4´-bis[O-(2-hydroxyethyl)]rutinu má relativní retenční čas vztažený k hlavnímu píku asi 0,92. Je-li třeba, upraví se obsah acetonitrilu v mobilní fázi.

Zkoušku lze hodnotit, jestliže rozlišení mezi hlavním píkem (7,3´,4´-tris[O-(2-hydroxyethyl)]rutin) a píkem 7,4´-bis[0-(2-hydroxyethyl)]rutinu je nejméně 1,2 a rozlišení mezi hlavním píkem a píkem č. 5, viz obrázek 1, je nejméně 1,1.

Nastříkne se 20 μl zkoušeného roztoku a zaznamenávají se chromatogramy po dobu nejméně 80 min. Na chromatogramu zkoušeného roztoku plocha hlavního píku (7,3´,4´-tris[O-(2-hydroxyethyl)]rutinu) je nejméně 80,0 % celkové plochy všech píků. Nepřihlíží se k píku rozpouštědla.

Chloridy (2.4.4). Nejvýše 0,2 %. 1,000 g se rozpustí ve 30 ml vody R, přidá se 30 ml kyseliny sírové R (300 g/l) a titruje se dusičnanem stříbrným 0,1 mol/l VS za potenciometrické indikace bodu ekvivalence (2.2.20).

1 ml dusičnanu stříbrného 0,1 mol/l VS odpovídá 3,55 mg Cl.

Těžké kovy (2.4.8). 2,0 g zkoušené látky vyhovují zkoušce D na těžké kovy (10 μg/g). K přípravě porovnávacího roztoku se použije základní roztok olova (10 μg Pb/ml).

Ztráta sušením (2.2.32). Nejvýše 4,0 %; 0,500 g se suší v sušárně při 125 °C.

1. Obr. 1. Vzorový chromatogram

Síranový popel (2.4.14). Nejvýše 0,2 %; stanoví se s 1,000 g zkoušené látky.

Mikrobiální znečištění (2.6.12). Nejvýše 102 živých mikroorganismů v 1 gramu. Stanoví se plotnovou metodou. Vyhovuje zkoušce na nepřítomnost Escherichia coli (2.6.13).

Stanovení obsahu

0,250 g se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 1000,0 ml. 10,0 ml tohoto roztoku se zředí stejným rozpouštědlem na 100,0 ml. Změří se absorbance (2.2.25) roztoku v maximu při 349 nm.

Vypočítá se celkový obsah derivátů rutinu, vyjádřený jako C₃₃H₄₂O₁₉, za použití zjištěné hodnoty absorbance a specifické absorbance, jejíž hodnota je 250.

Uchovávání

V dobře uzavřených obalech, chráněn před vlhkostí.

Nečistoty

1. A. 5,7,3´,4´-tetrakis[O-(2-hydroxyethyl)]rutin,
2. B. 7,4´ -bis[O-(2-hydroxyethyl)]rutin.

Trypsinum

Trypsin

Výroba

Zvířata, ze kterých je trypsin získáván, musí splňovat požadavky oprávněné autority na zdravá zvířata určená pro humánní konzumaci. Pokud se pro výrobu použije hovězí tkáň, má být zvířecí zdroj prostý bovinní spongiformní encefalopatie a neměl být nikdy vystaven rizikovým faktorům, jako je výkrm bílkovinami přežvýkavců. K dosažení tohoto cíle mají zvířata pocházet z ověřených zdrojů. Při výběru zdroje zvířecí tkáně, jež se má použít, se má vzít v úvahu relativní nakažlivost a možné riziko spojené s různými tkáněmi. Různé kategorie rizika popisují platná pravidla Evropské unie "Směrnice pro snížení na minimum rizika přenosu původců spongiformní encefalopatie prostřednictvím léčivých přípravků" (Guidelines for minimising the risk of transmission of agents causing spongiform encephalopathies via medicinal products) a platné pokyny Světové zdravotnické organizace.

Trypsin se vyrábí validovanými metodami extrakce a purifikace v podmínkách zajišťujících minimální mikrobiologickou kontaminaci; výrobní metody musí prokazatelně redukovat jakoukoliv kontaminaci viry nebo jinými známými původci infekce na přijatelné limity.

Vlastnosti

Bílý nebo téměř bílý krystalický nebo amorfní prášek. Je mírně rozpustný ve vodě. Amorfní forma je hygroskopická.

Zkoušky totožnosti

1. A. 1 ml roztoku S, viz Zkoušky na čistotu, se zředí vodou R na 100 ml. Na bílé kapkovací destičce se smíchá 0,1 ml tohoto roztoku s 0,2 ml tosylarginiummethylesterchloridu RS; do 3 min vznikne červenofíalové zabarvení.
2. B. 0,5 ml roztoku S se zředí vodou R na 5 ml, přidá se 0,1 ml roztoku tosyllysylchloromethanhydrochloridu R (20 g/l). Upraví se pH na hodnotu 7, 2 h se třepe a pak se zředí vodou R na 50 ml. V důlku bílé kapkovací destičky se smíchá 0,1 ml tohoto roztoku s 0,2 ml tosylarginiummethylesterchloridu RS; do 3 min nevznikne červenofíalové zabarvení.

Zkoušky na čistotu

Roztok S. 0,10 g se rozpustí ve vodě prosté oxidu uhličitého R a zředí se jí na 10,0 ml.

Vzhled roztoku. Roztoku S neopalizuje intenzivněji než porovnávací suspenze III (2.2.1).

Hodnota pH (2.2.3). 3,0 až 6,0; měří se roztok S.

Absorbance (2.2.25). 30,0 mg se rozpustí v kyselině chlorovodíkové 0,001 mol/l RS a zředí se jí na 100,0 ml. Roztok vykazuje absorpční maximum při 280 nm a minimum při 250 nm. Specifická absorbance v maximuje 13,5 až 16,5 a v minimu není větší než 7,0.

Chymotrypsin. K 1,8 ml tlumivého roztoku o pH 8,0 se přidá 7,4 ml vody R a 0,5 ml roztoku acetyltyrosinethylesteru 0,2 mol/l RS. Během míchání se přidá 0,3 ml roztoku S a sleduje se čas. Přesně po 5 min se změří pH (2.2.3) (zkoušený roztok). Současně se za stejných podmínek připraví porovnávací roztok nahrazením roztoku S 0,3 ml roztoku chymotrypsinu BRP (0,5 g/l) a měří se pH (2.2.3) přesně 5 min po přidání chymotrypsinu. Hodnota pH zkoušeného roztoku je vyšší než hodnota pH porovnávacího roztoku.

Histamin (2.6.10). Nejvýše 1 μg báze histaminu na 0,2 mikrokatalu trypsinové účinnosti. Použije se roztok zkoušené látky (10 g/l) v tlumivém roztoku boritanovém o pH 8,0 (0,0015 mol/l) inaktivovaný zahříváním na vodní lázni po dobu 30 min. Pro ředění se použije roztok chloridu sodného R (9 g/l).

Ztráta sušením (2.2.32). Nejvýše 5,0 %; 0,500 g se suší 2 h při 60 °C a tlaku nepřevyšujícím 670 Pa.

Mikrobiální znečistění (2.6.12). Celkový počet živých mikroorganismů je nejvýše 10⁴ v 1g stanoví se plotnovou metodou. Vyhovuje zkoušce na nepřítomnost Escherichia coli a Salmonella (2.6.13).

Stanovení účinnosti

Účinnost trypsinu se stanoví porovnáním rychlosti, s jakou hydrolyzuje benzoylargininethylesterhydrochlorid R s rychlostí, s jakou hydrolyzuje trypsin BRP stejný substrát za stejných podmínek.

Přístrojové vybavení. Reakční nádoba o objemu 30 ml vybavená:

1. - zařízením, které udržuje teplotu na (25,0 ± 0,1) °C,
2. - zařízením na míchání (např. magnetická míchačka),
3. - víkem s otvory pro elektrody, pro hadici na přívod dusíku, pro konec byrety a pro přidávání zkoumadel.

Lze použít automatické nebo manuální titrační zařízení. U manuálního zařízení je byreta dělená po 0,005 ml a pH-metr s velkým rozsahem je vybaven skleněnou a kalomelovou elektrodou.

Zkoušený roztok. Dostatečné množství zkoušené látky se rozpustí v kyselině chlorovodíkové 0,001 mol/l RS a zředí se jí na 25,0 ml tak, aby výsledný roztok obsahoval asi 700 nanokatalů/ml.

Porovnávací roztok. 25,0 mg trypsinu BRP se rozpustí v kyselině chlorovodíkové 0,001 mol/l RS a zředí se jí na 25,0 ml.

Roztoky se uchovávají při 0 °C až 5 °C. 1 ml každého roztoku se zahřívá 15 min při asi 25 °C a použije se po 50 μl každého roztoku pro každou titraci, která se provádí v dusíkové atmosféře. K 10,0 ml tlumivého roztoku boritanového o pH 8,0 (0,0015 mol/l) v titrační nádobě se během míchání přidá 1,0 ml čerstvě připraveného roztoku benzoylargininethylesterhydrochloridu R (6,86 g/l). Po ustálení teploty na hodnotě (25,0 ± 0,1) °C (tj. asi po 5 min) se nastaví pH přesně na hodnotu 8,0 pomocí hydroxidu sodného 0,1 mol/l VS. Přidá se 50 μl zkoušeného roztoku a začne se měřit čas (stopky). Hodnota pH 8,0 se udržuje přidáváním hydroxidu sodného 0,1 mol/l VS mikrobyretou ponořenou do roztoku; přidaný objem se zaznamenává každých 30 s a reakce probíhá 8 min. Vypočítá se spotřeba hydroxidu sodného 0,1 mol/l VS za 1 sekundu. Stejným způsobem se provede titrace porovnávacího roztoku a vypčítá se spotřeba hydroxidu sodného 0,1 mol/l VS za 1 sekundu.

Účinnost v mikrokatalech v miligramu se vypočítá podle vztahu:

v němž značí:

1. m - navážku zkoušené látky v miligramech,
2. m´ - navážku trypsinu BRP v miligramech,
3. V - spotřebu hydroxidu sodného 0,1 mol/l VS za sekundu u zkoušeného roztoku,
4. Vʹ - spotřebu hydroxidu sodného 0,1 mol/l VS za sekundu u porovnávacího roztoku,
5. A - účinnost trypsinu BRP v mikrokatalech na miligram.

Uchovávání

Ve vzduchotěsných obalech, chráněn před světlem, při teplotě 2 °C až 8 °C.

Označení

V označení na obalu se uvede účinnost v mikrokatalech v miligramu.

Tryptophanum

Tryptofan

Synonymum. L-Tryptophanum

Vlastnosti

Bílý nebo téměř bílý krystalický nebo amorfní prášek. Je mírně rozpustný ve vodě, těžce rozpustný v lihu 96%, prakticky nerozpustný v etheru. Rozpouští se ve zředěných roztocích alkalických hydroxidů a minerálních kyselin.

Zkoušky totožnosti

Základní sestava zkoušek: A a B.

Alternativní sestava zkoušek: A, C a D, viz Obecné zásady (1.2).

1. A. Zkouška Specifická optická otáčivost, viz Zkoušky na čistotu, je zároveň zkouškou totožnosti.
2. B. Infračervené absorpční spektrum (2.2.24) tablety zkoušené látky se shoduje se spektrem tablety tryptofanu CRL.
3. C. Hodnotí se chromatogramy získané ve zkoušce Látky reagující s ninhydrinem, viz Zkoušky na čistotu. Hlavní skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku (b) se polohou, zbarvením a velikostí shoduje s hlavní skvrnou na chromatogramu porovnávacího roztoku (a).
4. D. Asi 20 mg se rozpustí v 10 ml vody R, přidá se 5 ml dimethylaminobenzaldehydu RS6 a 2 ml kyseliny chlorovodíkové RS a zahřeje se na vodní lázni; vzniká nachově modré zbarvení.

Zkoušky na čistotu

Vzhled roztoku. 0,1 g se rozpustí v kyselině chlorovodíkové 1 mol/l RS a zředí se jí na 10 ml. Roztok je čirý (2.2.1) a není zbarven intenzivněji než porovnávací barevný roztok HŽ₆ (2.2.2, Metoda II).

Specifická optická otáčivost (2.2.7). -30,0° až -33,0°, počítáno na vysušenou látku. Měří se následující roztok: 0,25 g se rozpustí, je-li třeba zahřátím na vodní lázni, ve vodě R a zředí se jí na 25,0 ml.

Látky reagující s ninhydrinem. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití vrstvy vhodného silikagelu.

Zkoušený roztok (a). 0,10 g se rozpustí ve směsi stejných objemových dílů kyseliny octové ledové R a vody R a zředí se stejnou směsí na 10 ml.

Zkoušený roztok (b). 1 ml zkoušeného roztoku (a) se zředí směsí stejných objemových dílů kyseliny octové ledové R a vody R na 50 ml.

Porovnávací roztok (a). 10 mg tryptofanu CRL se rozpustí ve směsi stejných objemových dílů kyseliny octové ledové R a vody R a zředí se stejnou směsí na 50 ml.

Porovnávací roztok (b). 5 ml zkoušeného roztoku (b) se zředí směsí stejných objemových dílů kyseliny octové ledové R a vody R na 20 ml.

Porovnávací roztok (c). 10 mg tryptofanu CRL a 10 mg tyrosinu CRL se rozpustí ve směsi stejných objemových dílů kyseliny octové ledové R a vody R a zředí se stejnou směsí na 25 ml.

Na vrstvu se nanese po 5 μl každého roztoku a vyvíjí se směsí objemových dílů kyseliny octové ledové R, vody R a 1-butanolu R (20 + 20 + 60) po dráze 15 cm. Vrstva se usuší na vzduchu, postříká se ninhydrinem RS a zahřívá se 15 min při 100 °C až 105 °C. Žádná skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku (a), kromě hlavní skvrny, není intenzivnější než skvrna na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) (0,5 %). Zkoušku lze hodnotit, jestliže na chromatogramu porovnávacího roztoku (c) jsou dvě zřetelně oddělené skvrny.

1,1´-Ethylidenbistryptofan a jiné příbuzné látky. Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29). Tlumivý roztok o pH 2,3. 3,90 g dihydrogenfosforečnanu sodného R se rozpustí v 1000 ml vody R, přidá se asi 700 ml roztoku kyseliny fosforečné R (2,9 g/l) a stejnou kyselinou se upraví pH na hodnotu 2,3.

Následující roztoky se připraví těsně před použitím.

Standardní roztok. 10,0 mg N-acetyltryptofanu R se rozpustí ve směsi objemových dílů acetonitrilu R a vody R (10 + 90) a zředí se stejnou směsí na 100,0 ml. 2,0 ml tohoto roztoku se zředí stejnou směsí na 100,0 ml.

Zkoušený roztok (a). 0,10 g se rozpustí ve směsi objemových dílů acetonitrilu R a vody R (10 + 90) a zředí se stejnou směsí na 10,0 ml.

Zkoušený roztok (b). 0,10 g se rozpustí ve standardním roztoku a zředí se jím na 10,0 ml.

Porovnávací roztok (a). 1,0 mg 1,1´-ethylidenbistryptofanu R se rozpustí ve směsi objemových dílů acetonitrilu R a vody R (10 + 90) a zředí se stejnou směsí na 100,0 ml.

Porovnávací roztok (b). 10,0 ml porovnávacího roztoku (a) se zředí standardním roztokem na 50,0 ml.

Porovnávací roztok (c). 10,0 ml porovnávacího roztoku (a) se zředí směsí objemových dílů acetonitrilu R a vody R (10 + 90) na 50,0 ml.

Porovnávací roztok (d). 0,10 g zkoušené látky se rozpustí v porovnávacím roztoku (c) a zředí se jím na 10,0 ml.

Porovnávací roztok (e). 1,0 ml porovnávacího roztoku (c) se zředí směsí objemových dílů acetonitrilu R a vody R (10 + 90) na 10,0 ml.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

1. - nerezové ocelové kolony délky 0,25 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné silikagelem oktadecylsilanizovaným pro chromatografii R (5 μm),
2. - mobilní fáze s průtokovou rychlostí 0,7 ml/min, kterou jsou následující roztoky:
   1. - mobilní fáze A - směs objemových dílů acetonitrilu R a tlumivého roztoku o pH 2,3 (115 + 885),
   2. - mobilní fáze B - směs objemových dílů acetonitrilu R a tlumivého roztoku o pH 2,3 (350 + 650),

1. - gradientového programu za použití následujících podmínek:

   Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání Označování Nečistoty † Tropicamidum Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání Nečistoty Troxerutinum Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení obsahu Uchovávání Nečistoty Trypsinum Výroba Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu Stanovení účinnosti Uchovávání Označení Tryptophanum Vlastnosti Zkoušky totožnosti Zkoušky na čistotu

   Čas (min)	Mobilní fáze A % (V/V)	Mobilní fáze B % (V/V)	Poznámky
   0- 10	100	0	izokraticky
   10 - 45	100 → 0	0 → 100	lineární gradient
   45 - 65	0	0	izokraticky
   65 - 66	0 → 100	100 → 0	lineární gradient
   66 - 80	100	100	ustalování

1. - spektrofotometrického detektoru, 220 nm.

Teplota kolony se udržuje na 40 °C.

Nastříkne se 20 μl porovnávacího roztoku (b), 20 μl porovnávacího roztoku (d) a 20 μl porovnávacího roztoku (e). Jsou-li chromatogramy zaznamenány za předepsaných podmínek, retenční časy látek jsou: tryptofanu asi 8 min, N-acetyltryptofanu asi 29 min a 1,1´-ethylidenbistryptofanu asi 34 min. Nastaví se citlivost systému tak, aby výška píku N-acetyltryptofanu na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) nebyla menší než 50 % celé stupnice zapisovače.

Zkoušku lze hodnotit, jestliže:

1. - na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) rozlišení mezi píky N-acetyltryptofanu a 1,1-ethylidenbistryptofan je nejméně 8,0. Zvýšením mobilní fáze A v průběhu eluce se prodlouží retenční časy a zlepší se rozlišení,
2. - na chromatogramu porovnávacího roztoku (e) je signál píku k šumu nejméně 15.

Nastříkne se 20 μl zkoušeného roztoku (a) a 20 μl zkoušeného roztoku (b). Zjistí se, není-li na chromatogramu zkoušeného roztoku (a) pík se stejným retenčním časem, jako má pík N-acetyltryptofanu (v takovém případě se provede korekce píku N-acetyltryptofanu). Na chromatogramu zkoušeného roztoku (b) plocha píku odpovídajícího 1,1´ -ethylidenbistryptofanu není větší než 0,5násobek plochy hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (e) (10 μg/g). Součet ploch všech píků s retenčním časem menším, než má tryptofan, není větší než 0,5násobek plochy píku odpovídajícího N-acetyltryptofanu na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) (100 μg/g). Součet ploch všech píků s retenčním časem větším, než má tryptofan, kromě píku N-acetyltryptofanu a píku do 1,8násobku retenčního času N-acetyltryptofanu, není větší než 1,5násobek plochy píku odpovídajícího N-acetyltryptofanu na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) (300 μg/g). Nepřihlíží se k píkům s plochou menší než 0,02násobek plochy píku odpovídajícího N-acetyltryptofanu na chromatogramu porovnávacího roztoku (b).

Chloridy (2.4.4). 0,25 g se rozpustí ve 3 ml kyseliny dusičné zředěné RS a zředí se vodou R na 15 ml. Tento roztok vyhovuje limitní zkoušce na chloridy (200 μg/g) bez dalšího přidání kyseliny dusičné.

Sírany (2.4.13). 0,5 g se rozpustí ve směsi objemových dílů kyseliny chlorovodíkové zředěné RS a vody destilované R (5 + 25) a zředí se stejnou směsí na 15 ml. Tento roztok vyhovuje limitní zkoušce na sírany (300 μg/g).